Summary
Her utviklet vi en ny flerlags modifisert strategi for væskelignende bioinks (gelatin metakryloyl med lav viskositet) for å forhindre sedimentering av innkapslede celler.
Abstract
Under ekstruderingsbasert tredimensjonal bioprintingprosess kan væskelignende bioinks med lav viskositet beskytte celler mot membranskader forårsaket av skjærstress og forbedre overlevelsen av de innkapslede cellene. Imidlertid kan rask gravitasjonsdrevet cellesedimentering i reservoaret føre til en inhomogen cellefordeling i biotrykte strukturer og dermed hindre bruk av væskelignende bioinks. Her utviklet vi en ny flerlags modifisert strategi for væskelignende bioinks (f.eks gelatin methacryloyl med lav viskositet) for å forhindre sedimentering av innkapslede celler. Flere flytende grensesnitt ble manipulert i flerlags bioink for å gi interfacial oppbevaring. Følgelig ble cellesedimenteringshandlingen som gikk over tilstøtende lag i flerlagssystemet, tilbakestående i bioinkreservoaret. Det ble funnet at interfacial oppbevaring var mye høyere enn sedimental trekk av celler, viser en kritisk rolle av interfacial oppbevaring i å hindre celle sedimentering og fremme en mer homogen spredning av celler i flerlags bioink.
Introduction
Tredimensjonal (3D) bioprinting har vært en lovende metode for å produsere komplekse arkitektoniske og funksjonelle kopier av innfødte vev i biofabrikasjon og regenerativ medisin1,,2,3. De vanlige strategiene for bioprinting, inkludert inkjet, ekstrudering og stereolitografiutskrift, har fordeler og ulemper fra ulike perspektiver4. Blant disse teknikkene brukes ekstruderingsprosedyren oftest på grunn av kostnadseffektiviteten. Bioink spiller en nøkkelrolle i prosessen stabilitet av ekstrudering bioprinting. Den ideelle celle-laden bioink bør ikke bare være biokompatibel, men også være egnet for mekaniske egenskaper5. Bioinks med lav viskositet er vanligvis presentert som en flytende-lignende tilstand. Disse bioinks kan enkelt og raskt deponeres og unngå cellemembranskader forårsaket av høy skjærstress under ekstrudering. Men i komplekse tilfeller som krever langsiktige utskriftsperioder, gir lav viskositet ofte opphav til den uunngåelige sedimenteringen av de innkapslede cellene i bioinkreservoaret, som vanligvis drives av tyngdekraften og fører til en uforstyrret cellespredning i bioink6,7. Følgelig hindrer en bioink med inhomogen celledispergering in vitro bioprinting av en funksjonell vevskonstruksjon.
Flere nyere studier med fokus på bioinks har rapportert fremme av homogen dispersitet av innkapslede celler. En modifisert alginat bioink basert på dual-stage krysskobling ble brukt for ekstrudering bioprinting8. En alginatpolymer ble modifisert med peptider og proteiner i denne studien. Celler presenterte en mer homogen fordeling i denne modifiserte alginat enn i den vanlige alginat på grunn av festestedene som tilbys av peptidene og proteinene. Alternativt har blandede bioinks blitt brukt for å løse sedimentering av celler i bioink. En blandet bioink som inneholder polyetylenglykol (PEG) og gelatin eller gelatin metakryloyl (GelMA) med forbedret mekanisk robusthet ble brukt i en annen studie9. De innkapslede cellene presenterte en homogen fordeling hovedsakelig fordi viskositeten til den blandede bioinken ble forbedret. Generelt er det flere faktorer som påvirker dispergering av innkapslede celler i bioink, for eksempel viskositeten til bioink, tyngdekraften av cellene, tettheten av cellene, og varigheten av arbeidsperioden. Blant disse faktorene spiller tyngdekraften av celler en kritisk rolle i å fremme sedimentering. Oppdrift og friksjon gitt av viskøse bioink har blitt undersøkt som de viktigste kreftene mot tyngdekraften til dags dato10.
Her utviklet vi en ny strategi for å fremme homogen spredning av de innkapslede cellene i bioink ved å manipulere flere flytende grensesnitt i bioinkreservoaret. Disse flytende grensesnittene som er opprettet av flerlagsmodifisering av bioink, kan ikke bare gi interfacial oppbevaring, som forsinker sedimenteringen av celler, men opprettholder også en passende biokompatibilitet og reologisk oppførsel av bioink. I praksis endret vi vandig GelMA-løsning (5%, w/v) med silkefibroin (SF) på en flerlags måte for å langsgående produsere fire grensesnitt, noe som gir interfacial spenninger i blandet bioink. Som et resultat ble tyngdekraften som lastet på cellene motvirket av den menneskeskapte interfaciale spenningen, og en nesten homogen spredning av de innkapslede cellene i bioink ble oppnådd på grunn av mindre sedimentering over de tilstøtende lagene av celler. Ingen lignende protokoll for å bremse sedimenteringen av innkapslede celler ved å manipulere interfacial oppbevaring i flytende bioinks har blitt rapportert til dags dato. Vi presenterer vår protokoll her for å demonstrere en ny måte å løse cellesedimentering på bioprinting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av celle-laden SF-GelMA
- Steriliser alle materialene ved hjelp av 0,22 μm sprøytefilterenheter. Utfør alle trinnene i et biologisk sikkerhetsskap.
- Varm 1x PBS til 50 °C, og oppløs gelatin i den oppvarmede 1x PBS med omrøring. Den endelige konsentrasjonen av gelatin i PBS bør være 10 % (m/v).
- Tilsett metakrylmatanhydrid i gelatinoppløsningen (vektforholdet mellom metakrylmaganhydrid til gelatin på 0,6 til 1) langsomt med omrøring, og bland komplekset i minst 1 timer (50 °C). Vanligvis forberede 200 ml av 10% gelatin løsning med 12 g metakrylmaganhydrid; volumet avhenger av behovene til studien.
- Overfør den blandede oppløsningen som inneholder gelatin og metakrylmaylanhydrid til et 50 ml sterilt rør.
- Sentrifuger den blandede oppløsningen ved 3500 x g. Det tar vanligvis 3-5 min å få to lag. Samle det øvre laget (GelMA) og kast det nederste laget (uredigert metakrylmaylanhydrid).
- Fortynn den øvre lagløsningen oppnådd i trinn 1,5 med to mengder deionisert vann (40 –50 °C).
- Dialyser oppløsningen oppnådd i trinn 1.6 med en 12-14 kDa molekylvekt cutoff dialysemembran mot deionisert vann i 5-7 dager (40-50 ° C). Bytt vann to ganger hver dag.
- Samle opp og frys GelMA-oppløsningen ved −80 °C over natten.
- GelMA-oppløsningen i 3-5 dager i en frysetørker med temperaturen satt til -45 °C og trykket satt til 0,2 mbar.
- Oppløs den lyofiliserte GelMA (grad av substitusjon på ca. 75 %) i 1x PBS som inneholder 10 % FBS (føtal storfeserum, v/v), 25 mM HEPES (N-2-hydroksyetyletypiperazine-N-etansulfonsyre) og fotoinitiator (0,5 %, m/v) for å få gelma-bioinkpreparatet.
MERK: Graden av substitusjon av GelMA kan beregnes med en ninhydrinanalyse3. - Bland GelMA-oppløsningen (10 %, w/v) med forskjellige volumer av den første SF-løsningen (5 %, w/v) og forskjellige volumer på 1x PBS for å få SF-GelMA bioinks med forskjellige konsentrasjoner av SF. Andelen per 1 ml GelMA og SF-løsning i de ulike bioinks presenteres i tabell 1.
MERK: Alle bioinks må inneholde en endelig konsentrasjon på 5% (w / v) GelMA, men konsentrasjonen av SF varierer: 0,5, 0,75, 1,0, 1,25 og 1,5% (w / v) i de forskjellige SF-GelMA bioinks. Bruk SF-M-Layered-GelMA til å betegne GelMA bioink modifisert med SF på en lag-for-lag måte. Bruk SF-X-GelMA til å betegne de GelMA modifisert med SF på en homogen måte (f.eks GelMA med modifikasjon på 1% SF ble kalt SF-1-GelMA). - Sonicate alle bioinks for 10-20 min.
- Vokse NIH3T3 celler ved hjelp av DMEM (Dulbecco modifisert Eagle medium) som inneholder 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin i en inkubator (37 °C med 5% CO2). Passer cellene i forholdet 1:3 når tettheten når 80%.
- Sentrifuger suspensjonen av NIH3T3-celler ved 1500 o/min i 5 min. Fjern supernatanten med suge- og resuspend cellenpellet med frisk bioinkoppløsning i et 15 ml sterilt rør.
MERK: Konsentrasjonen av de innkapslede cellene i bioinken skal være 1 x 106 celler/ml, og konsentrasjonen må beregnes med et cytometer. - Bruk 2 ml forskjellige SF-GelMA bioinks for å suspendere cellepellets for å få ulike celle-laden bioinks.
2. Lasting, oppvarming og bioprinting av SF-M-Lagdelt-GelMA
- Legg 0,4 ml cellelastet SF-0,5-GelMA inn i det nederste laget av sprøyten.
MERK: Bruk en 2 ml sprøyte som bioinkreservoaret i denne studien. Legg forskjellige SF-GelMA bioinks inn i sprøyten på en lag-for-lag måte. - Plasser sprøyten i isvannbad (0 °C) i 5 min for å få den nederste bioinken til å forvandles til en geltilstand.
- Last 0,4 ml celle-laden SF-0.75-GelMA bioink over det nederste laget.
- Plasser sprøyten med de to lagene av bioinks i et isvannbad (0 °C) i 5 min for å få de to lagene av bioinks til å forvandle seg til en geltilstand.
- Sykle laste- og kjøletrinnene ytterligere 3 ganger med de resterende 3 typer bioinks (SF-1-GelMA, SF-1.25-GelMA, SF-1.5-GelMA) for å få et flerlags bioinksystem med forskjellige konsentrasjoner av SF i de forskjellige lagene. Volumet som brukes til lasting av alle bioinks bør være 0,4 ml.
- Oppvarme flerlagsbioinken på nytt ved å plassere sprøyten i en inkubator (37 °C) i 30 minutter før biotrykking.
- Bruk en 2 ml sprøyte som bioinkreservoaret med en 27 G-utskriftsdyse. Still inn strømningshastigheten ved 50 μL/min, dysens bevegelige hastighet ved 2 mm/s, og høyden på munnstykket ved 1 mm. Utfør biotrykkprosedyren ved romtemperatur (ca. 20 °C).
- Skriv ut vevskonstruksjonen på en ekstruderingsmåte ved hjelp av en skreddersydd bioprinter under parametrene tilpasset fra våre tidligere studier11,,12.
- Bruk ultrafiolett lys (365 nm, 800 mW) for 40 s for å krysskoble den biotrykte vevskonstruksjonen.
- Kultur den krysskoblede vev konstruksjonen i DMEM (Dulbeccos modifiserte Eagle medium) som inneholder 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin i en inkubator (37 °C med 5% CO2). Mediet ble endret hver 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En skjematisk for utarbeidelse av celle-laden bioinks er vist i figur 1. Etter utarbeidelse av de forskjellige bioinks, lasting, oppvarming og bioprinting ble utført (Figur 2). For å evaluere fordelingen av de innkapslede cellene i bioinkreservoaret, ble det utført en biotrykkingsprosedyre ved hjelp av tre forskjellige cellebelastede bioinks i tre 96-brønnplater (figur 3A). To kontrollgrupper (uberørte GelMA og SF-1-GelMA bioinks) og den eksperimentelle gruppen (SF-M-Layered-GelMA bioink) ble brukt til å undersøke dispergeringscellene (Figur 3B). Seksti mikroliter av celle-laden bioink ble ekstrudert i hver brønn av de tre 96-brønnplater. Det totale volumet av de tre typer bioink var 2 ml, og som et resultat var perioden med bioprinting mer enn 30 min. Med ekstra inkubasjon før utskrift (30 min) var den totale arbeidsperioden mer enn 1 timer og ble ansett som en passende fabrikasjonsvarighet for bioprinting av store vev og organer. Antall celler i målbrønnene, merket i figur 3A,i de tre platene ble talt. Antallet av cellene i forskjellige brønner kan gjenspeile dispergeringsevnen til de innkapslede cellene blant de ulike gruppene. Resultatene viste at etter hvert som biotrykkprosedyren utviklet seg, gikk tettheten av celler i målbrønnene ned i alle grupper. I SF-0-GelMA-gruppen ble omtrent 70 % av cellene deponert i det nederste laget etter den totale prosedyren. I SF-1-GelMA-gruppen ble omtrent 40 % av cellene deponert i det nederste laget, og omtrent 5 % av cellene ble deponert i det øverste laget. I SF-M-Layered-GelMA-gruppen var avsetningen av innkapslede celler mer homogen enn kontrollgruppene (figur 3C og 3D).
Figur 1: Skjematisk av SF-GelMA bioink forberedelse. SF-GelMA ble utarbeidet ved å blande silkefibroin (SF) og GelMA / photoinitiator (PI) kompleks etterfulgt av ultralydbehandling i 10-20 min. Deretter ble målcellene i SF-GelMA-blandingen suspendert for å forberede cellen laden SF-GelMA bioink. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Prosedyren for lasting, oppvarming og biotrykk. Cellen lastet SF-GelMA, som bioink (aq), ble lastet inn i bioink reservoaret og forvandlet til gel tilstand fra kjøleprosedyren. Lasting og kjøling prosedyren ble gjentatt 5 ganger ved hjelp av bioinks (aq) med ulike konsentrasjoner av SF (0,5, 0,75, 1,0, 1,25, og 1,5%) for å få SF-Multilayered-GelMA (SF-M-Lagdelt-GelMA). Geltilstanden SF-M-Layered-GelMA ble oppvarmet ved å plassere bioink i en inkubator i 30 min. Den gel tilstand bioink omgjort til en flytende tilstand etter inkubasjon. Deretter ble den tilberedte bioinken brukt til utskrift ved hjelp av en 2 ml sprøyte som bioinkreservoaret med en 27 G-utskriftsdyse. Den trykte vevskonstruksjonen ble krysskoblet ved hjelp av UV-lys. Aq betyr vandig løsning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Bioprinting prosedyren brukte tre forskjellige celle-laden bioinks. (A), Seksti mikroliter av bioink ble ekstrudert inn i tilsvarende 96-brønnplate per minutt, og det tok mer enn 30 minutter å oppnå bioprinting prosedyren i 96-brønn plate. (B), Tre forskjellige typer bioinks ble brukt til å undersøke dispergering av innkapslede celler i bioprinting prosedyre: to kontrollgrupper (uberørte GelMA og SF-1-GelMA bioinks) og eksperimentgruppen (SF-M-Layered-GelMA bioink). (C-D), Celletettheter i nr. 1, 5, 10, 15, 20, 25 og 30 brønner i de tre platene ble oppdaget med flekker, som viser fordelingen av innkapslede celler i de tre bioinks, og avsetningen av de innkapslede cellene i SF-M-Layered-GelMA-gruppen var mer homogen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Bioinks (andre) | Materialer (ml) | ||
| Gelma (andre) | Sf | Pbs | |
| SF-0.5-GelMA | 0.5 | 0.1 | 0.4 |
| SF-0.75-GelMA | 0.5 | 0.15 | 0.35 |
| SF-1.0-GelMA | 0.5 | 0.2 | 0.3 |
| SF-1.25-GelMA | 0.5 | 0.25 | 0.25 |
| SF-1.5-GelMA | 0.5 | 0.3 | 0.2 |
Tabell 1: Utarbeidelse av SF-GelMA bioinks
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stabiliteten til flerlagssystemet er et nøkkelpunkt for å utføre denne protokollen med hell. Vi beregnet teoretisk diffusjon av SF-molekyler i GelMA-løsningen basert på Naumans studie13. Det ble funnet at spredningen av proteiner i løsningen var relatert til deres molekylvekt. Gjennomsnittlig molekylvekt (MW) av storfe serum albumin (BSA) er 66,5 kDa, og dens diffusjonskoeffisient er 64-72 μm2/ s. Gjennomsnittlig MW fibrinogen er 339,7 kDa, og diffusjonskoeffisienten er 23-34 μm2/s. Gjennomsnittlig MW av SF molekyler i vår studie er ca 100 kDa. Basert på resultatene av Naumans studie er diffusjonskoeffisienten til et enkelt SF-molekyl mellom 23-72 μm2/si vann ved 25 °C. Ifølge Stokes-Einstein-ligningen er diffusjonskoeffisienten definert som følger:
hvor D er diffusjonskoeffisienten, K er konsistensen, T er den absolutte temperaturen, η er viskositeten til løsningen, og d er diameteren. Det kan konkluderes med at forskjellen i diffusjonskoeffisient av SF-molekyler i vann og i GelMA-løsningen bestemmes av forskjellen i viskositet av disse to omkringliggende løsningene. Videre kan diffusjonsradiusen beregnes som følger:
der R er diffusjonsradiusen, er D diffusjonskoeffisienten, og T er diffusjonstiden. Rent vann presenterer en viskositet på 8,9 x 10-4 Pa·s, og viskositeten til GelMA ved null skjærhastighet i studien vår var høyere enn 1000 Pa·s. Derfor er diffusjonsradiusen til et enkelt SF-molekyl ved 25 °C mindre enn 0,66-1,18 μm/time i GelMA-løsningen. Dette indikerer at SF knapt kan spre seg over de tilstøtende lagene i SF-M-Layered-GelMA-systemet, som demonstrerer stabiliteten til det flerlagssystemet.
Gravitasjonsdrevet sedimentering av de innkapslede cellene er uunngåelig når bioprinting med væskelignende bioinks. I vår studie utviklet vi en ny modifikasjon av lav viskositet GelMA bioink med syklisk lasting-kjøling for å forsinke sedimentering av celler ved å skape interfacial oppbevaring. Den flerlags interfacial oppbevaring er ment å oppveie virkningen av tyngdekraften av innkapslede celler og dermed hindre sedimentering av innkapslede celler over de tilstøtende lagene i bioink reservoaret. Den interfaciale oppbevaring ble presentert langsgående i bioink reservoaret mellom hvert tilstøtende lag på grunn av forskjellen mellom den reologiske oppførselen til ulike bioinks lastet i forskjellige lag. Disse interfaciale spenningene begynte å virke så snart de innkapslede cellene sedimenterte til grensesnittet. Som et resultat ble tyngdekraften trukket, og sedimentering ble stoppet. Selv om denne protokollen er ny, bør flere applikasjoner som bruker denne protokollen i andre væskelignende bioinksystemer studeres for markedsføring og optimalisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (81771971, 81970442, 81703470 og 81570422), National Key R&D Program of China (2018YFC1005002), Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (17JC1400200), Shanghai kommunale vitenskap og teknologi store prosjekt (Grant nr. 2017SHZDZX01), og Shanghai kommunale utdanningskommisjon (Innovasjonsprogram 2017-01-07 -00-07-E00027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (PI2959) | TCI | M64BK-QD | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco | 15630080 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 10569044 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10091 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | V900863MSDS | |
| Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 276685MSDS | |
| Penicillin–streptomycin antibiotics | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010049 | |
| Silk fibroin | Advanced BioMatrix | 5154 |
References
- Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nature Protocol. 11 (10), 1775-1781 (2016).
- Heinrich, M. A., et al. 3D bioprinting: from benches to translational applications. Small. , 1805510 (2019).
- Daniela, L., et al. Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
- Pedde, R. D., et al. Emerging biofabrication strategies for engineering complex tissue constructs. Advanced Materials. 29 (19), (2017).
- Holzl, K., Lin, S., Tytgat, L., Van Vlierberghe, S., Gu, L., Ovsianikov, A. Bioink properties before, during and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).
- Guillotin, B., Guillemot, F. Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication. Trends in Biotechnology. 29 (4), 183-190 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32, 773-785 (2014).
- Dubbin, K., Hori, Y., Lewis, K. K., Heilshorn, S. C. Dual-stage crosslinking of a gel-phase bioink improves cell viability and homogeneity for 3D bioprinting. Advanced Healthcare Materials. 5 (19), 2488-2492 (2016).
- Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Advanced Materials. 27 (9), 1607-1614 (2015).
- Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions. Biotechnology and Bioengineering. 109 (11), 2932-2940 (2012).
- Chen, N., et al. Hydrogel bioink with multilayered interfaces improves dispersibility of encapsulated cells in extrusion bioprinting. ACS Applied Materials & Interfaces. 11, 30585-30595 (2019).
- Zhu, K., et al. A general strategy for extrusion bioprinting of bio-macromolecular bioinks through alginate-templated dual-stage crosslinking. Macromolecular Bioscience. 18 (9), 1800127 (2018).
- Nauman, J. V., Campbell, P. G., Lanni, F., Anderson, J. L. Diffusion of insulin-like growth factor-I and ribonuclease through fibrin gels. Biophysical Journal. 92 (12), 4444-4450 (2007).
