Summary
Aquí, desarrollamos una novedosa estrategia modificada multicapa para bioenergitis similares a líquidos (gelatina con baja viscosidad) para evitar la sedimentación de células encapsuladas.
Abstract
Durante el proceso de bioimpresión tridimensional basado en la extrusión, los bioenergientes similares a líquidos con baja viscosidad pueden proteger las células del daño de la membrana inducido por el estrés de cizallamiento y mejorar la supervivencia de las células encapsuladas. Sin embargo, la rápida sedimentación celular impulsada por gravedad en el depósito podría conducir a una distribución celular inhomogénea en estructuras bioimpresas y, por lo tanto, obstaculizar la aplicación de bioenergías similares a líquidos. Aquí, desarrollamos una novedosa estrategia modificada multicapa para bioinks similares a líquidos (por ejemplo, metacriloilo de gelatina con baja viscosidad) para evitar la sedimentación de células encapsuladas. Múltiples interfaces líquidas fueron manipuladas en el bioenergía multicapa para proporcionar retención interfacial. En consecuencia, la acción de sedimentación celular que atravesaba capas adyacentes en el sistema multicapa se retrasó en el depósito de bioenlatado. Se encontró que la retención interfacial era mucho mayor que el tirón sedimentario de las células, demostrando un papel crítico de la retención interfacial en la prevención de la sedimentación celular y la promoción de una dispersión más homogénea de células en el bioenlaz multicapa.
Introduction
La bioimpresión tridimensional (3D) ha sido un método prometedor para fabricar réplicas arquitectónicas y funcionales complejas de tejidos nativos en biofabricación y medicina regenerativa1,,2,,3. Las estrategias comunes de bioimpresión, incluyendo inyección de tinta, extrusión e impresión estereolitografía, tienen pros y contras desde diferentes perspectivas4. Entre estas técnicas, el procedimiento de extrusión se utiliza más comúnmente debido a su rentabilidad. Bioink desempeña un papel clave en la estabilidad del proceso de la bioimpresión de extrusión. El bioenlace celular ideal no sólo debe ser biocompatible, sino también adecuado para las propiedades mecánicas5. Los bioinks con baja viscosidad se presentan típicamente como un estado de forma líquida. Estos bioenergiendos se pueden depositar fácil y rápidamente y evitar daños en la membrana celular inducidos por alta tensión de cizallamiento durante la extrusión. Sin embargo, en casos complejos que requieren períodos de impresión a largo plazo, la baja viscosidad a menudo da lugar a la sedimentación inevitable de las células encapsuladas en el depósito de bioenlace, que generalmente es impulsada por la gravedad y conduce a una dispersión celular inhomogénea en el bioenlace6,7. En consecuencia, un bioenlace con dispersión celular inhomogénea obstaculiza la bioimpresión in vitro de una construcción de tejido funcional.
Varios estudios recientes centrados en bioenergicos han reportado la promoción de la dispersión homogénea de células encapsuladas. Para la bioimpresión de extrusión se utilizó un bioenergiente de alginato modificado basado en el reticulación8de doble etapa. Un polímero de alginato fue modificado con péptidos y proteínas en este estudio. Las células presentaban una distribución más homogénea en este alginato modificado que en el alginato comúnmente utilizado debido a los sitios de unión proporcionados por los péptidos y las proteínas. Alternativamente, bioinks mezclados se han utilizado para resolver la sedimentación de células en el bioenergía. En otroestudiose utilizó un bioenlace mezclado que contiene polietilenglicol (PEG) y gelatina o gelatina de metacriloilo (GelMA) con mayor robustez mecánica. Las células encapsuladas presentaban una distribución homogénea principalmente porque se mejoró la viscosidad del bioenergía mezclado. En general, hay varios factores que influyen en la dispersión de las células encapsuladas en el bioendo, como la viscosidad del bioenlociente, la gravedad de las células, la densidad de las células y la duración del período de trabajo. Entre estos factores, la gravedad de las células desempeña un papel crítico en la promoción de la sedimentación. La flotabilidad y fricción proporcionadas por el bioenergía viscosa se han investigado como las principales fuerzas contra la gravedad hasta la fecha10.
Aquí, desarrollamos una estrategia novedosa para promover la dispersión homogénea de las células encapsuladas en el bioenergía mediante la manipulación de múltiples interfaces líquidas en el depósito de bioenergía. Estas interfaces líquidas creadas por la modificación multicapa del bioenlaz no sólo pueden proporcionar retención interfacial, lo que retrasa la sedimentación de las células, sino que también mantienen una biocompatibilidad adecuada y un comportamiento reológico del bioenlatado. En la práctica, modificamos la solución GelMA acuosa (5%, p/v) con fibroína de seda (SF) de forma multicapa para producir longitudinalmente cuatro interfaces, proporcionando tensiones interfaciales en el bioenergía mezclado. Como resultado, la carga por gravedad en las células fue compensada por la tensión interfacial artificial, y se obtuvo una dispersión casi homogénea de las células encapsuladas en el bioenlaz debido a una menor sedimentación a través de las capas adyacentes de las células. Hasta la fecha no se ha notificado ningún protocolo similar para frenar la sedimentación de células encapsuladas manipulando la retención interfacial en bioenquisas líquidas. Aquí presentamos nuestro protocolo para demostrar una nueva forma de resolver la sedimentación celular en la bioimpresión.
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Protocol
1. Preparación de SF-GelMA cargado de células
- Esterilice todos los materiales utilizando unidades de filtro de jeringa de 0,22 m. Realice todos los pasos en un armario de seguridad biológica.
- Caliente 1x PBS a 50oC, y disuelva la gelatina en el 1x PBS calentado con agitación. La concentración final de gelatina en PBS debe ser del 10% (p/v).
- Añadir anhídrido metacrílico en la solución de gelatina (relación de peso del anhídrido metacrílico a gelatina de 0,6 a 1) lentamente con la agitación, y mezclar el complejo durante al menos 1 h (50 oC). Típicamente, preparar 200 ml de 10% solución de gelatina con 12 g de anhídrido metacrílico; el volumen depende de las necesidades del estudio.
- Transfiera la solución mixta que contiene gelatina y anhídrido metacrílico a un tubo estéril de 50 ml.
- Centrifugar la solución mixta a 3.500 x g. Por lo general, se tarda 3-5 minutos para obtener dos capas. Recoger la capa superior (GelMA) y desechar la capa inferior (anhídrido metacrílico no reaccionado).
- Diluir la solución de capa superior obtenida en el paso 1.5 con dos volúmenes de agua desionizada (40-50 oC).
- Dialyze la solución obtenida en el paso 1.6 con una membrana de diálisis de peso molecular de 12-14 kDa contra agua desionizada durante 5 x 7 días (40-50 oC). Cambie el agua dos veces al día.
- Recoja y congele la solución de GelMA a 80 oC durante la noche.
- Liofilizar la solución de GelMA durante 3 x 5 días en un secador de congelación con la temperatura ajustada a -45 oC y la presión ajustada a 0,2 mbar.
- Disolver el GelMA liofilizado (grado de sustitución de aproximadamente 75%) en 1x PBS que contiene 10% de FBS (suero bovino fetal, v/v), 25 mM HEPES (N-2-hidroxietitilpiperazina-N-ácido etano-sulfónico) y fotoiniciador (0,5%, p/v) para obtener la preparación de bioendorgido GelMA.
NOTA: El grado de sustitución de GelMA se puede calcular mediante un ensayo de ninhidrina3. - Mezclar la solución GelMA (10%, p/v) con diferentes volúmenes de solución SF inicial (5%, p/v) y diferentes volúmenes de 1x PBS para obtener bioenergitos SF-GelMA con diferentes concentraciones de SF. La proporción por 1 ml de solución de GelMA y SF en los diferentes bioenergitos se presenta en la Tabla 1.
NOTA: Todos los bioenergitos deben contener una concentración final de 5% (p/v) GelMA, pero la concentración de SF varía: 0.5, 0.75, 1.0, 1.25 y 1.5% (p/v) en los diferentes bioenergiendos SF-GelMA. Utilice SF-M-Layered-GelMA para denominar el bioenlatado GelMA modificado con SF de una manera capa por capa. Utilice SF-X-GelMA para denominar a aquellos GelMA modificados con SF de manera homogénea (por ejemplo, GelMA con modificación de 1% SF fue llamado SF-1-GelMA). - Sonicar todos los bioenergitos durante 10-20 min.
- Cultivar células NIH3T3 usando DMEM (medio águila modificado de Dulbecco) que contiene 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina en una incubadora (37oC con 5% DE CO2). Pasaje de las celdas a una proporción de 1:3 cuando la densidad alcanza el 80%.
- Centrifugar la suspensión de las células NIH3T3 a 1500 rpm durante 5 min. Retire el sobrenadante con succión y resuspenda el pellet celular con solución de bioenergía fresca en un tubo estéril de 15 ml.
NOTA: La concentración de las células encapsuladas en el bioenlatado debe ser de 1 x 106 células/ml, y la concentración debe calcularse con un citómetro. - Utilice 2 ml de diferentes bioenergitis SF-GelMA para suspender los gránulos celulares para obtener diversos bioenergitis cargados de células.
2. Carga, recalentamiento y bioimpresión del SF-M-Layered-GelMA
- Cargue 0,4 ml de SF-0.5-GelMA cargado de células en la capa inferior de la jeringa.
NOTA: Utilice una jeringa de 2 ml como depósito de bioenlacús en este estudio. Cargue diferentes bioenergidos SF-GelMA en la jeringa de una manera capa por capa. - Colocar la jeringa en un baño de agua helada (0 oC) durante 5 minutos para hacer que el bioenergía de la capa inferior se transforme en un estado de gel.
- Cargue 0,4 ml de bioenlace SF-0.75-GelMA cargado de células por encima de la capa inferior.
- Coloque la jeringa con las dos capas de bioenergidos en un baño de agua helada (0 oC) durante 5 minutos para hacer que las dos capas de bioenergitos se transformen en un estado de gel.
- Ciclo de los pasos de carga y refrigeración otras 3 veces con los 3 tipos restantes de bioenergientes (SF-1-GelMA, SF-1.25-GelMA, SF-1.5-GelMA) para obtener un sistema de bioenlatado multicapa con diferentes concentraciones de SF en las diferentes capas. El volumen utilizado para la carga de todos los bioenergidos debe ser de 0,4 ml.
- Recalentar el bioenergía multicapa colocando la jeringa en una incubadora (37oC) durante 30 minutos antes de la bioimpresión.
- Utilice una jeringa de 2 ml como depósito de bioenlacús con una boquilla de impresión de 27 G. Ajuste la velocidad de flujo a 50 ml/min, la velocidad de movimiento de la boquilla a 2 mm/s y la altura de la boquilla a 1 mm. Realice el procedimiento de bioimpresión a temperatura ambiente (aproximadamente 20 oC).
- Imprima la construcción de tejido de forma extrusión utilizando una bioimpresora a medida bajo los parámetros adaptados de nuestros estudios anteriores11,12.
- Utilice luz ultravioleta (365 nm, 800 mW) durante 40 s para reticular la construcción del tejido bioimpreso.
- Cultivo de la construcción de tejido reticulado en DMEM (medio águila modificado de Dulbecco) que contiene 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina en una incubadora (37 oC con 5% de CO2). El medio se cambió cada 8 h durante los primeros 2 días y cada 2-3 días a partir de entonces.
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Representative Results
En la Figura 1se muestra un esquema de la preparación de bioenergitis cargados de células. Después de la preparación de los diferentes bioenergías, se realizaron la carga, el recalentamiento y la bioimpresión (Figura 2). Para evaluar la distribución de las células encapsuladas en el depósito de bioenlaces, se realizó un procedimiento de bioimpresión utilizando tres bioenergitis diferentes cargados de células en tres placas de 96 pozos (Figura 3A). Se utilizaron dos grupos de control (bioenergías prístinos GelMA y SF-1-GelMA) y el grupo experimental (bioenergía SF-M-Layered-GelMA) para investigar la dispersión de las células encapsuladas (Figura 3B). Sesenta microlitros de bioenergía cargados de células se extruyó en cada pozo de las tres placas de 96 pozos. El volumen total de los tres tipos de bioenlaz fue de 2 ml, y como resultado, el período de bioimpresión fue de más de 30 min. Con la incubación adicional antes de la impresión (30 min), el período de trabajo total fue superior a 1 h y se consideró una duración de fabricación adecuada para la bioimpresión de tejidos y órganos grandes. Se contó el número de celdas en los pozos de destino, etiquetados en la Figura 3A,en las tres placas. Los recuentos de las células en diferentes pozos podrían reflejar la dispersión de las células encapsuladas entre los diversos grupos. Los resultados mostraron que a medida que avanzaba el procedimiento de bioimpresión, la densidad de células en los pozos objetivo disminuyó en todos los grupos. En el grupo SF-0-GelMA, aproximadamente el 70% de las células fueron depositadas en la capa inferior después del procedimiento total. En el grupo SF-1-GelMA, aproximadamente el 40% de las células fueron depositadas en la capa inferior, y aproximadamente el 5% de las células fueron depositadas en la capa superior. En el grupo SF-M-Layered-GelMA, la deposición de celdas encapsuladas era más homogénea que la de los grupos de control(Figura 3C y 3D).
Figura 1: Esquema de la preparación del bioenlaque SF-GelMA. El SF-GelMA se preparó mezclando el complejo de fibroína de seda (SF) y GelMA/fotoiniciador (PI) seguido de un tratamiento ultrasónico durante 10-20 min. Luego, las células diana de la mezcla SF-GelMA fueron suspendidas para preparar el bioenlace SF-GelMA cargado de células. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: El procedimiento de carga, recalentamiento y bioimpresión. El SF-GelMA cargado de células, como el bioenlace (aq), se cargó en el depósito de bioenlatado y se transformó en el estado de gel a partir del procedimiento de enfriamiento. El procedimiento de carga y refrigeración se repitió 5 veces utilizando los bioenergitos (aq) con diferentes concentraciones de SF (0,5, 0,75, 1,0, 1,25 y 1,5%) para obtener SF-Multilayered-GelMA (SF-M-Layered-GelMA). El estado de gel SF-M-Layered-GelMA se recalentó colocando el bioenergía en una incubadora durante 30 min. El bioenergido estado de gel se convirtió en un estado líquido después de la incubación. A continuación, el bioenergiendo preparado se utilizó para imprimir utilizando una jeringa de 2 ml como depósito de bioenlaciendo con una boquilla de impresión de 27 G. La construcción del tejido impreso fue reticulada mediante el uso de luz UV. Aq significa solución acuosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: El procedimiento de bioimpresión utilizó tres bioenergitis diferentes cargados de células. (A), Sesenta microlitros de bioenlaz se extruyó en la placa correspondiente de 96 pozos por minuto, y se tardó más de 30 minutos en lograr el procedimiento de bioimpresión en la placa de 96 pozos. (B), se utilizaron tres tipos diferentes de bioenergías para investigar la dispersión de las células encapsuladas en el procedimiento de bioimpresión: dos grupos de control (bioenergientes GelMA y SF-1-GelMA) y el grupo de experimentos (bioenergiente SF-M-Layered-GelMA). (C-D), las densidades celulares de los pozos No 1, 5, 10, 15, 20, 25 y 30 en las tres placas se detectaron con tinción, mostrando la distribución de células encapsuladas en los tres bioenculos, y la deposición de las células encapsuladas en el grupo SF-M-Layered-GelMA fue más homogénea. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Bioinks | Materiales (ml) | ||
| GelMA | Sf | Pbs | |
| SF-0.5-GelMA | 0.5 | 0.1 | 0.4 |
| SF-0.75-GelMA | 0.5 | 0.15 | 0.35 |
| SF-1.0-GelMA | 0.5 | 0.2 | 0.3 |
| SF-1.25-GelMA | 0.5 | 0.25 | 0.25 |
| SF-1.5-GelMA | 0.5 | 0.3 | 0.2 |
Tabla 1: Preparación de bioenergitos SF-GelMA
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Discussion
La estabilidad del sistema multicapa es un punto clave para realizar este protocolo con éxito. Teóricamente calculamos la difusión de moléculas SF en la solución GelMA basada en el estudiode Nauman 13. Se encontró que la difusión de proteínas en solución estaba relacionada con su peso molecular. El peso molecular medio (MW) de la albúmina sérica bovina (BSA) es de 66,5 kDa, y su coeficiente de difusión es de 64-72 m2/s. El MW medio de fibrinógeno es de 339,7 kDa, y su coeficiente de difusión es de 23-34 m2/s. El MW medio de moléculas SF en nuestro estudio es de aproximadamente 100 kDa. Sobre la base de los resultados del estudio de Nauman, el coeficiente de difusión de una sola molécula de SF está entre 23-72 m2/s en agua a 25 oC. Según la ecuación Stokes-Einstein, el coeficiente de difusión se define de la siguiente manera:
donde D es el coeficiente de difusión, K es la consistencia, T es la temperatura absoluta, es la viscosidad de la solución, y d es el diámetro. Se puede concluir que la diferencia en el coeficiente de difusión de las moléculas SF en el agua y en la solución GelMA está determinada por la diferencia en la viscosidad de estas dos soluciones circundantes. Además, el radio de difusión puede calcularse de la siguiente manera:
donde R es el radio de difusión, D es el coeficiente de difusión, y T es el tiempo de difusión. El agua pura presenta una viscosidad a 8,9 x10 -4 Pa's, y la viscosidad de GelMA a velocidad de cizallamiento cero en nuestro estudio fue superior a 1000 Pa s. Por lo tanto, el radio de difusión de una sola molécula SF a 25 oC es inferior a 0,66-1,18 m/hora en la solución GelMA. Esto indica que SF difícilmente puede difundir a través de las capas adyacentes en el sistema SF-M-Layered-GelMA, que demuestra la estabilidad del sistema multicapa.
La sedimentación impulsada por la gravedad de las células encapsuladas es inevitable cuando se bioimpresión con bioenergientes similares a líquidos. En nuestro estudio, desarrollamos una nueva modificación del bioenergía GelMA de baja viscosidad con refrigeración de carga cíclica para retardar la sedimentación de las células mediante la creación de retención interfacial. Se supone que la retención interfacial multicapa compensa la acción de gravedad de las células encapsuladas y, en consecuencia, evitar la sedimentación de las células encapsuladas a través de las capas adyacentes en el depósito de bioendonimiento. La retención interfacial se presentó longitudinalmente en el depósito de bioenferidos entre cada capa adyacente debido a la diferencia entre el comportamiento reológico de diferentes bioenergitis cargados en diferentes capas. Estas tensiones interfaciales comenzaron a funcionar tan pronto como las células encapsuladas se asaron a la interfaz. Como resultado, el tirón de gravedad se desenfjó, y la sedimentación se detuvo. Aunque este protocolo es novedoso, se deben estudiar más aplicaciones que utilicen este protocolo en otros sistemas de bioenergía similares a líquidos para su promoción y optimización.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores reconocen las subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81771971, 81970442, 81703470 y 81570422), National Key I&D Program of China (2018YFC1005002), Comisión de Ciencia y Tecnología del Municipio de Shanghái (17JC1400200), Shanghai Municipal Science and Technology Major Project (Grant No. 2017SHZDZX01) y Shanghai Municipal Education Commission (Programa de Innovación 2017-01-0 7-00-07-E00027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (PI2959) | TCI | M64BK-QD | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco | 15630080 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 10569044 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10091 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | V900863MSDS | |
| Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 276685MSDS | |
| Penicillin–streptomycin antibiotics | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010049 | |
| Silk fibroin | Advanced BioMatrix | 5154 |
References
- Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nature Protocol. 11 (10), 1775-1781 (2016).
- Heinrich, M. A., et al. 3D bioprinting: from benches to translational applications. Small. , 1805510 (2019).
- Daniela, L., et al. Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
- Pedde, R. D., et al. Emerging biofabrication strategies for engineering complex tissue constructs. Advanced Materials. 29 (19), (2017).
- Holzl, K., Lin, S., Tytgat, L., Van Vlierberghe, S., Gu, L., Ovsianikov, A. Bioink properties before, during and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).
- Guillotin, B., Guillemot, F. Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication. Trends in Biotechnology. 29 (4), 183-190 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32, 773-785 (2014).
- Dubbin, K., Hori, Y., Lewis, K. K., Heilshorn, S. C. Dual-stage crosslinking of a gel-phase bioink improves cell viability and homogeneity for 3D bioprinting. Advanced Healthcare Materials. 5 (19), 2488-2492 (2016).
- Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Advanced Materials. 27 (9), 1607-1614 (2015).
- Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions. Biotechnology and Bioengineering. 109 (11), 2932-2940 (2012).
- Chen, N., et al. Hydrogel bioink with multilayered interfaces improves dispersibility of encapsulated cells in extrusion bioprinting. ACS Applied Materials & Interfaces. 11, 30585-30595 (2019).
- Zhu, K., et al. A general strategy for extrusion bioprinting of bio-macromolecular bioinks through alginate-templated dual-stage crosslinking. Macromolecular Bioscience. 18 (9), 1800127 (2018).
- Nauman, J. V., Campbell, P. G., Lanni, F., Anderson, J. L. Diffusion of insulin-like growth factor-I and ribonuclease through fibrin gels. Biophysical Journal. 92 (12), 4444-4450 (2007).
