Summary
血脑屏障（BBB）是一种多细胞神经血管单元，严密调节大脑平衡。通过结合人类 iPSC 和芯片上器官技术，我们生成了个性化的 BBB 芯片，适用于疾病建模和 CNS 药物渗透性预测。介绍了BBB芯片的生成和运行的详细方案。
Abstract
血脑屏障 （BBB） 由神经血管单元 （NUS） 形成，这些单元保护中枢神经系统 （CNS） 免受血液中发现的一系列可能破坏大脑功能的因素的影响。因此，BBB是向国家癌症系统提供治疗药物的主要障碍。积累的证据表明，BBB在神经系统疾病的发病和进展中起着关键作用。因此，非常需要BBB模型，该模型可以预测中枢神经系统靶向药物的渗透，并阐明BBB在健康和疾病中的作用。
我们最近将芯片上的器官和诱导多能干细胞（iPSC）技术相结合，以产生完全个性化对人类的BBB芯片。该新平台显示细胞、分子和生理特性，适用于预测药物和分子在人体BBB中的传输。此外，我们使用患者特有的BBB芯片，生成了神经系统疾病模型，并展示了个性化预测医学应用的潜力。这里提供了一个详细的协议，演示如何生成iPSC衍生的BBB芯片，从iPSC衍生的脑微血管内皮细胞（iBMECs）的分化开始，并产生包含神经祖子的混合神经培养，分化神经元和星形细胞。还描述了将细胞播种到器官芯片和在受控层流下培养BBB芯片的过程。最后，对BBB芯片分析进行了详细说明，包括用于评估药物和分子渗透性的准细胞渗透性测定，以及用于测定芯片内细胞类型成分的免疫细胞化学方法。
Introduction
BBB是一种高度选择性的屏障，将中枢神经系统与循环血液分离。它保护关键的大脑功能免受潜在的破坏性物质，因子和异种生物，同时也允许营养物质和其他代谢物的流入，以保持大脑平衡1。BBB 是一种多细胞 NVU，其中圆细胞、星形细胞端脚和神经元过程直接接触脑微血管内皮细胞 （BMECs）。这些交互允许 BMEC 形成由紧密和附着点2、3支持的专用屏障属性。这种屏障的形成限制了分子的准细胞通道，但它含有偏振的传输器，以主动将分子输送到CNS或回到血液1。由于这些独特的屏障特性，BBB是生物药物输送到大脑的主要障碍，据估计，不到5%的FDA批准的小分子可以达到CNS4。
动物模型已广泛用于研究BBB渗透和BBB开发中涉及的分子机制5。虽然动物模型忠实地表现了复杂的多细胞在体内环境，BBB运输者的表情和活性的差异，以及不同物种的基质特异性往往排除了动物数据准确地推断给人类6。因此，基于人的模型对于研究人类BBB和用于开发针对CNS的药物至关重要。随着生物、人类专用药物在制药开发领域的日益占据主导地位，这种需求变得更加明显。累积的证据表明，受损的BBB与一些严重的中枢神经系统疾病有关，包括脑肿瘤和神经系统疾病7，8，9。忠实地反映这些疾病的人类模型有可能1）确定可能针对药物开发的新途径，2）预测CNS渗透，从而减少临床前研究的时间和资源，并可能降低临床试验的失败率。
体外模型已被广泛应用，以研究BMEC与NVU其他细胞之间的相互作用，并为潜在的BBB渗透药物10进行筛选。为了重建人类BBB的关键方面，体外模型必须显示生理相关特性（即，低副细胞渗透性和生理相关的跨端面电阻[TEER]穿过内皮单层）。此外，体外系统的分子轮廓必须包括代表性功能传输系统的表达。通常，体外模型由内皮细胞组成，这些细胞在半渗透膜上与其他NVU细胞的组合共同培养，以增强BBB特性11。这种方法允许对阻隔功能和分子渗透性进行简单和相对快速的评估。这种基于细胞的BBB模型可以建立与动物或人类细胞源，包括从手术切除或永生BMEC线分离的细胞。
最近，将人类多能细胞分化为BMEC的协议被引入，作为体外人类BBB模型12、13的诱人来源。诱导多能干细胞（iPSC）衍生的BMECs（iBMECs）具有高度的可扩展性，表现出人类BBB的关键形态和功能特征，并携带患者的遗传学。在文化中，iBMECs 形成一个单层，表示紧密的交汇点标记，并在体内显示类似紧密的交汇点复合物。这些细胞也表达BBB标记，包括BBB葡萄糖转运器，葡萄糖转运器1（GLUT1）。重要的是，与人类BMECs的其他替代细胞源不同，iBMECs获取的屏障特性与在体内14测量的值一样高，沿巴索边轴极化，并表达功能外泄泵。此外，使用不同科目的 iPSC 1） 欢迎有机会以个性化医学方式测试 BBB 的各个方面，2） 为生成 NVU 的其他细胞类型提供了灵活的来源。从异源细胞源生成这些细胞以产生个性化的BBB芯片也有助于了解药物反应的个体间差异，这是导致抗药性或对临床研究中观察到的治疗反应受损的主要原因。
在盘式或半透射式跨井插入物中，将 iBMEC 用作单层，是 BBB 建模的有力方法。这些系统往往坚固、可重复且经济高效。此外，TEER 和渗透性等功能分析执行起来相对简单。然而，二维（2D）系统无法概括体内组织的3D特性，它们缺乏循环血液和血细胞提供的生理剪切应激力量。这限制了这些模型中血管内皮开发和维护内在BBB特性和功能的能力。
由活细胞排列的微工程系统已经实现，以模型各种器官功能的概念称为器官在芯片上。通过重建体内类似多细胞的架构、组织-组织界面、物理化学微环境和血管灌注，这些微工程平台产生无法与传统的 2D 文化系统。它们还支持高分辨率、实时成像和分析与体内组织和器官环境中的活细胞相似的生化、遗传和代谢特征。然而，芯片上器官的一个特别挑战是，这些微工程芯片的设计、制造和应用需要专业工程专业知识，而这些专业知识在生物学学术实验室中通常缺乏。
我们最近将iPSC和器官芯片技术相结合，生成了15、16的个性化BBB芯片型号。为了克服上述技术挑战，商用Chip-S1与培养模块一起使用，该仪器旨在以简单可靠的方式自动维护芯片（Emulate Inc.）。BBB芯片再现了神经细胞和内皮细胞之间的相互作用，并实现了生理相关的TEER值，该值由定制的器官芯片与集成的金电极17测量。此外，BBB芯片显示低副细胞渗透性，响应器官级别的炎症提示，表示活性排泄泵，并表现出可溶性生物标志物和生物药物的预测传输。值得注意的是，由几个人产生的BBB芯片捕获了健康个体与神经系统疾病患者之间的预期功能差异15。
下面详述的协议描述了一种可靠、高效和可重复的方法，用于在动态流条件下生成基于 iPSC 的 BBB 芯片。提供有关可以直接在 BBB 芯片或从取样流出物中执行的测定和端点分析类型的指导。因此，该协议演示了可用于评估人类相关模型中的生物和功能特性和响应的技术范围。
此处简要介绍了基于 iPSC 的 BBB 芯片。人类iPSC最初在组织培养瓶中作为神经祖体的自由浮动聚集体（称为EZ球体）进行分化和繁殖。芯片-S116，18，19的顶部通道被种子与分离的EZ球，形成芯片的"大脑侧"，因为细胞分化在7天的神经祖细胞（iNPCs），iAstrocyt和iNeurons的混合培养。人类 iPSC 在组织培养板中也区分为 iBMEC。芯片的底部通道与iBMECs一起播种，形成"血侧"，形成内皮管（图1）。多孔细胞外基质 （ECM） 涂层膜可分离顶部和底部通道 1），允许通道和 2 之间形成细胞与细胞之间的相互作用，允许用户使用传统的光学显微镜在任一通道中运行渗透性测定和图像单元。
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Protocol
1. 生成 iPSC 衍生神经祖细胞 （iNPC）
- 生产EZ球从iPSC殖民地如下所述，并如先前出版的20，21，22。
- 培养 iPSC 菌落在 mTESR1 或其他商业介质中，在基底膜基质涂层 6 孔板 （0.5 mg/板） 上汇合（参见材料表）。
- 取出 iPSC 介质，用 2 mL 的 EZ 球介质 [ESM] 替换;DMEM：F12 7：3 补充100纳克/mL基本成纤维细胞生长因子（bFGF）、100纳克/mL表皮生长因子、5微克/mL肝素和2%B27补充剂*。
- 用无菌 1000 μL 移液器尖端或电池刮刀的背面刮擦每个汇液的底部。
- 收集所有细胞，并放置在超低附件T25烧瓶中，以便自由浮动球体的自发形成。在37°C下孵育过夜。
- 当介质变为黄色时，每 2⁄3 天喂球体一次，用新鲜的 ESM 替换一半的介质。这使得球体保持在有条件的介质中，这对它们的生长和维护非常重要。
- 将烧瓶倾斜在管架上，让球体通过重力沉降 1⁄2 分钟，向下到烧瓶的角落。
- 一旦稳定，用5 mL或10 mL血清移液器吸出一半的上清液，并替换为新鲜、预热的ESM。
- 每周通过切球到200微米直径的EZ球，如前所述23，20，21。EZ 球体可维护多达 25 个通道，非常适合在通道 8-25 之间使用。
- 准备 iNPCs 的单细胞悬浮液：
- 为了诱导神经分化，将EZ球分离成单个细胞。
- 从 T75 烧瓶切入 3⁄4 天后收集球体，并转移到 15 mL 圆锥形中，然后让它站立 2 分钟或直到所有球体都位于底部。
- 使用 5 mL 移液器缓慢地去除 ESM，而不会破坏固定的球体。加入1 mL的解散溶液（见材料表），在37°C下孵育10分钟。
- 孵育5分钟后，将分离溶液和球体旋转，以确保处理任何固定球体。
- 慢慢去除解散溶液。添加1 mL的神经分化介质[NDM;DMEM： F12与2%B27减去维生素A，1%N2补充剂，和人脑衍生神经营养因子（hBDNF，20纳克/mL）*。
- 使用 1 mL 移液器，然后是 200 μL 移液器，将球体三聚到单个单元中，直到所有球体分离。在三角化过程中避免气泡形成。
- 使用血细胞计计数分离细胞，将细胞稀释到1 x 106细胞/mL的最终密度。可根据应用情况更改密度。
注：对于长达 3 天的短期培养，建议更高的密度（高达 6 x 106细胞/mL），对于长达 3 周的长期应用，建议降低密度。
注：细胞现在准备种子到芯片的顶部通道，形成"大脑侧"。
2. 将 iPSC 分化为 iBMEC
- 以 1：6 的比例将 6 口井板的单个汇入孔的 iPSC 送入 6 孔基底膜基质涂层板。让细胞粘附24小时，每天改变iPSC介质。
- 每天使用血细胞计对细胞进行计数。
- 当细胞密度达到1.5-3.0 x 105细胞/孔时，用3 mL的无条件培养基（不含bFGF[DMEM：F12 1：1，10%敲除血清置换（KOSR）、1%非必需氨基酸（NEAA）、0.5%谷氨酰胺补充剂（材料表）和100μM=-mercaptob-乙醇]取代iPSC培养基。每天更换中等，6天24日。
- 在第6天，用内皮细胞（EC）介质[人类内皮血清游离培养基（hESFM）补充1%血小板贫乏血浆衍生牛血清、20纳克/mL bFGF和10μM全透反视网膜酸（RA）]。离开介质2天。
- 去除EC介质，每口井加入1mL解索溶液。在37°C孵育35分钟。
注意：虽然这被认为是这里使用的解散溶液中很长的孵育时间，但iBMEC可以忍受这种治疗，细胞活力高于90%。 - 通过轻轻移液细胞悬浮液并将所有细胞收集到15 mL锥形管中，将细胞从井中分离出来。
注：避免剧烈移液。如果细胞不易分离，则再孵育5分钟。 - 将1卷EC介质加入15 mL锥形，以灭活Accutase，在200 x g下离心5分钟，去除介质，并更换1mL的EC介质（不含bFGF和RA）。
- 使用血细胞计对细胞进行计数，并将细胞密度调整到 14-20 x 106细胞/mL。
注：细胞现在准备种子到芯片的底部通道，形成"血侧"。
3. 器官芯片的微制造
- 使用器官芯片的BBB芯片模型及其生产如之前所做的16，18，19。高通道器官芯片（见材料表）由高度灵活的聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体制成，含有两个叠加的平行微尺度通道，由柔性多孔膜分离。顶部和底部微通道尺寸分别为 1 mm x 1 mm 和 1.0 mm x 0.2 mm。两个通道由 50 μm 厚的 PDMS 柔性多孔膜分隔，该膜包含 7 μm 直径、间距为 40 μm 的孔隙。分离通道的多孔膜的表面面积为0.171 cm2。
4. 芯片制备
- 器官芯片在芯片载体内预包装，无需在搬运过程中干扰或扭曲芯片对准。此外，芯片载波可安全地连接到便携式模块（"Pod"），该模块充当培养模块和芯片之间的接口。
- 用 70% 乙醇喷涂芯片的包装，并放入生物安全柜 （BSC）。
- 打开包装，将器官芯片放在无菌培养皿中。仅通过侧面处理芯片托架，以避免与芯片直接接触。
- 确保载波的卡舌朝右（图2），当使用多个芯片时，将它们都对齐为相同的方向。
- 在载波标签上标记每个芯片（完整的芯片制备和工作流程如图3所示）。
5. 表面活化和ECM涂层
- 表面活化溶液的制备
- 模拟试剂1（ER-1）在含有5毫克的瓶中提供，对光敏感。在使用前立即准备新鲜的ER-1溶液。ER-1完整性对于成功制备芯片至关重要。
- 处理 ER-1 时，请关闭 BSC 中的灯。
注：ER-1 是一种眼睛刺激物，必须在 BSC 中使用适当的手套和眼睛保护进行处理。 - 在使用前，让ER-1和ER-2试剂与室温（RT）平衡。
- 用箔包装空无菌 15 mL 锥形管，保护溶液免受光线照射。
- 在 BSC 中，短暂点击 ER-1 小瓶，将粉末稳定在底部。
- 将 1 mL 的 ER-2 缓冲液添加到小瓶中，并立即将其内容转移到 15 mL 包裹的锥形管的底部。请勿移液器混合。转移到圆锥管的溶液的颜色将是红色的。
- 重复步骤 5.1.6 3x。在最后一轮，盖上ER-1小瓶并反转从盖子中收集任何剩余的粉末，然后将溶液转移到锥形管中;这将使ER-1溶液的总体积达到4 mL。
- 在15 mL锥形管中的4 mL ER-1溶液中加入6 mL ER-2溶液，最终浓度为0.5 mg/mL。ER-1 应完全溶解在 ER-2 溶液中。
- 表面激活
- 使用 P200 移液器和无菌 200 μL 过滤移液器尖端，吸收 200 μL 的 ER-1 混合物。
- 将移液器放在底部入口，并通过底部通道推动 20 μL 的 ER-1 混合物，直到混合物开始流出底部通道出口。
- 加入大约 50 μL 的 ER-1 混合物并将其放置在顶部通道入口。将混合物推入顶部通道，直到其开始流出顶部通道插座。
- 通过柔和的吸气从芯片表面去除所有多余的 ER-1 混合物。确保 ER-1 混合物仅从芯片表面去除，而不是从通道中取出。
- 在紫外线 （UV） 激活之前，验证通道是否无气泡。如果检测到气泡，则使用 ER-1 混合物清洗通道以清除气泡。
- 将装有芯片的开放式盘子放入紫外线灯箱（由 Emulate Inc.提供）。
- 将 UV 灯箱背面的开关设置为"一致"设置。打开电源并启动 UV 激活。将芯片放在紫外线下 20 分钟。
注：避免人员暴露在紫外线下。 - 从两个通道中取出 ER-1 混合物。
- 用 200 μL 的 ER-2 溶液清洗每个通道。
- 从两个通道中取出 ER-2。
- 用200 μL无菌冷Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）清洗每个通道。
- 将冷 DPBS 留在通道内，直到继续执行下一步。
- 细胞外基质 （ECM） 制备和涂层
- 通过将单个 ECM 组件与冷 DPBS、水或其他溶剂结合到最终工作浓度，准备 ECM 溶液。每次使用 ECM 解决方案时都应新鲜准备。
- 用 ECM 涂抹芯片的顶部和底部通道，其成分由要播种的电池类型决定。ECM 混合物必须在冰上保持，直到使用。
- 使用拉米宁 （50 μg/mL） 涂覆"大脑侧"，胶原蛋白 IV 和纤维蛋白以 4：1 的比例（320：80 μg/mL）混合，以涂覆第 5.6 节中所述的"血侧"。
- ECM 等分的制备
- 在冷DPBS中稀释1mg/mL层宁，最终浓度为50微克/mL。在-20°C下等待使用。
- 将胶原蛋白IV溶解在0.1%醋酸中，浓度为1mg/mL。在2~8°C过夜或在RT孵育溶液1-3小时或直至完全溶解。
- 制备1mL胶原蛋白IV：纤维蛋白（320 μL胶原蛋白IV，80μL纤维蛋白，600μL无菌双蒸馏H2O）。混合物可储存在-20°C。
- 用 ECM 喷涂芯片
- 从两个通道完全吸出冷 DPBS。设置 P200 移液器以占用 100 μL 的胶原蛋白 IV：纤维蛋白溶液。
- 通过底部通道入口引入溶液，直到出口上形成一个小液滴。取出移液器尖端后，在入口上留下一个小液滴。
- 通过顶部通道入口引入层压宁溶液，直到出口上形成一个小液滴。取出移液器尖端后，在入口上留下一个小液滴。
- 仔细观察通道，确保不存在气泡。如果存在气泡，则使用适当的 ECM 溶液清洗通道，直到所有气泡都取下。
- 对每个芯片重复步骤 5.5.1~5.5.4。
- 将 1.5 mL 的 DPBS 添加到 15 mL 锥形管的盖中。将 DPBS 盖与切屑放在 150 mm 培养盘中，以提供额外的湿度，并用副膜密封盘。为获得最佳效果，在4°C下孵育芯片过夜。
注：如果需要，细胞可以在芯片激活和ECM涂层的同一天播种，但最好进行隔夜孵化。在添加 ECM 并在 37°C 下孵化芯片后，芯片可以准备播种 4 小时。
6. 播种"大脑侧"通道，将EZ球体区分为混合神经培养物
- 将包含已制备的薯片的菜带到 BSC。用 200 μL 的 NDM 轻轻清洗两个通道。
- 避免与端口接触，小心地从芯片表面吸出多余的介质液滴。在播种每个芯片之前轻轻搅拌细胞悬浮液，以确保均匀细胞悬浮液
- 将 iNPC 播种到顶部通道中，以生成"大脑侧"
- 将细胞（1 x 106 6 细胞/mL）播种到芯片的顶部通道中。将含有30~100μL细胞悬浮液的P200尖端添加到顶部通道入口，然后轻轻地从移液器中释放吸头。取空的 P200 移液器，按下柱塞，插入顶部通道插座，并小心地将单个电池悬架拉过芯片。
- 盖上盘子并转移到显微镜上，检查顶部通道内细胞的播种密度和均匀分布。轻轻地从芯片入口和出口口中取出移液器尖端。
- 播种密度应显示为 20% 的覆盖率。如果播种密度高于或低于预期或不均匀，则将芯片返回 BSC，用 200 μL 的新鲜介质清洗通道 2x，然后重复步骤 6.3.1。
- 确认正确的细胞密度后，在播种每批芯片后，立即将芯片放入培养箱2小时，在37°C下。洗去不附着与新鲜 NDM 的细胞。
- 在37°C的静态条件下，每天更换NDM至少48小时，然后再启动流量。iBMEC 可在 iNPC 附加后或 iNPC 播种后的次日进行种子。
7. 将 iBMEC 播种到底部通道中，以生成"血侧"
- 将包含已制备的薯片的菜带到 BSC。用 200 μL 的 EC 介质轻轻清洗底部通道。
- 避免与端口接触，小心地从芯片表面吸入过量的EC介质液滴，确保两个通道中保持介质。在播种每个芯片之前轻轻搅拌细胞悬浮液，以确保均匀细胞悬浮液。
- 使用 P200 移液器，绘制 30~100 μL 的 iBMEC 细胞悬浮液（14⁄20 x 106细胞/mL），并将尖端放入底部通道入口。轻轻地将吸头从移液器上断开，将包含单元格的吸头留在入口端口中。
- 用空尖端压压 P200 移液器上的柱塞，插入底部通道出口，然后通过缓慢释放移液器柱塞，小心地通过底部通道拉动单单元悬架。
- 从芯片表面吸出多余的电池悬浮液。避免直接接触入口和出口口，以确保通道内没有单元悬架。
- 盖住芯片并将其转移到显微镜上，以观察播种密度。在显微镜下以4倍或10倍观察时，底部通道应填充细胞之间没有可观察到的间隙（图4）。
- 如果播种密度低于 90% 的覆盖率或分布不均匀，请相应地调整细胞密度并重复步骤 7.2-7.6，直到通道内达到正确的密度。确认正确的细胞密度（图4）后，在剩余的芯片中植入细胞。将电池连接到位于底部通道顶部的多孔膜上，反转每个芯片并固定在芯片底座中。
- 在 150 mm 盘内放置一个小储液罐（15 mL 锥形管盖，包含无菌 DPBS），为电池提供湿度。在37°C孵育芯片约3小时，或直到底部通道中的细胞连接。iBMEC 连接后（播种后约 3 小时），将芯片翻转回直立位置，以允许细胞连接到底部通道的底部。
8. 启动流动
- 流通常在 iBMEC 播种后 48 小时启动。这一时间需要 iBMEC 牢固地连接到芯片。
- 为了保持层流通过芯片，重要的是去气和平衡介质的温度。介质必须在 37°C 水浴中预加热 1 小时。
- 在真空驱动过滤系统下孵育15分钟，可孵化高达50 mL的加热介质。
- 便携式模块的启动
- 用 70% 乙醇对便携式模块包装和托盘的外部进行消毒，擦拭并转移到 BSC。打开包装并将模块放入托盘中。将储液罐与托盘背面定向。
- 移液器 3 mL 的预平衡、暖介质到每个入口储液罐。将EC培养介质添加到底部通道的进气罐，将NDM添加到顶部通道的顶通道入口储液罐中（图5）。
- 移液器 300 μL 的预平衡、加热介质直接通过每个出口端口（图 5）。
- 在每个托盘上放置最多六个便携式模块。将托盘带到培养箱，并完全滑入培养模块，托盘手柄朝外。
- 选择并在区域性模块上运行"Prime"周期。关闭培养箱门，让培养模块为便携式模块注进电源（需要 ±1 分钟）。当状态栏显示"就绪"时，启动周期完成。从培养模块中取出托盘并将其带到 BSC。
- 通过检查 BSC 中每个便携式模块的底面，验证便携式模块是否已成功注底。在所有四个端口中查找是否存在小液滴。
- 如果任何便携式模块未显示液滴，则重新运行这些模块的主循环。如果任何介质滴入托盘（出口口可能更频繁地出现这种情况），请使用 70% 乙醇清洁托盘。
- 芯片与便携式模块的连接、调节和启动流量
- 用温暖、平衡的细胞特异性培养介质轻轻清洗每个芯片的两个通道，以去除通道中任何可能的气泡，并将介质小滴（根据通道中的介质）放置在每个入口和出口端口的顶部。
- 将带托架的芯片插入便携式模块，并在每个托盘上放置最多 6 个。将纸盒插入培养模块。在培养模块上规划适当的器官芯片培养条件（流速和拉伸）。
- 一旦"调节"周期完成，编程条件即开始。
注： 每个通道的流速可以独立控制，并可设置为 0~1，000 μL/h 的速率。BBB 芯片通常在 30 μL/h 下培养。当流动介质（如 EC 介质或 ESM 在 30 μL / h 和 1000 μL / h ）动时，剪切力分别为 0 . 01 dyn / cm2和 0 . 33 dyn / cm2 。 - 运行"调节"周期，大约需要 2 小时，之后培养模块将在预设的器官芯片培养条件下开始流动。
9. 血对脑对脑渗透性评估
- 准备 NDM 辅以 10 μg/mL dextran-FITC （4 kDa）。此解决方案将用作"血侧"通道的输入。
- 使用 NDM 加装 dextran-FITC 填充便携式模块的底部通道储液罐。使用无示踪剂的 NDM 填充顶部通道储液罐。
- 以 30 μL/h 的流速将顶部和底部通道注入至少 4 小时，直到收集足够的介质以评估板读取器中的荧光（通常为 100 μL）。
- 从顶部和底部通道的输入和输出储液罐中收集介质样本。保护样品免受光线照射。
- 使用无示踪剂的 NDM 以 10 μg/mL dextran-FITC 1：1 进行串行稀释 NDM，以生成 10±12 点校准曲线。
- 将每个样品（包括校准曲线）的 100 μL 放入黑色 96 孔板中，并使用板读取器（485 nm 激发、530 nm 发射）读取荧光。
- 使用测量值计算 P应用值，如下所示：
- 进行每日测量以评估阻隔性能，并确认 BBB 芯片仍然正常工作。
10. 免疫细胞化学
- 将芯片带到化学烟气罩。使用 P200 移液器，在 DPBS 中用 200 μL 的 4% 甲醛 （PFA） 注入两个通道，并在 RT 孵育 10 分钟，从而修复细胞。
- 固定后，将每个通道注入 200 μL 的 DPBS，孵育 5 分钟，重复 DPBS 洗涤 2 次。
- 通过注入初级阻滞溶液（PBS，辅以5%正常驴血清和0.1%Triton X-100）在芯片上阻断和渗透细胞。在 RT 孵育 1 小时。
- 稀释原发性阻滞溶液中的原抗体，并在4°C孵育过夜。BC 标记为 GLUT-1 （1：100 稀释）、ZO-1 （1：300）、PECAM-1 （1：250;CD31）和VE-卡瑟林（1：200）。神经标记是 +III-图布林 （1：1000;Tuj1+）、S100+（1：500）、内丁（1：1000）和GFAP（1：1000）。
- 用冷 DPBS 清洗薯片 3 倍。
- 在二次阻断溶液中稀释二次抗体（DPBS与5%正常驴血清无Triton-X）。
- 通过两个通道注入二级抗体溶液。通常，荧光二级抗体被稀释1：1000。在RT保护下孵育1小时，防止光线照射。
- 用 DPBS 清洗 3 倍的芯片。
- 通过注入100μLDAPI溶液的芯片染色细胞核。在 RT 孵育 5 分钟。
- 用 DPBS 清洗 3 倍的芯片。
- 该芯片可以使用直立或倒置荧光显微镜进行成像。PDMS 透明度允许在完整的器官芯片中成像。由于器官芯片的厚度，超过 10 倍的放大倍数可能需要长工作距离目标。
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Representative Results
图6A，B，C表示一个BBB芯片，在"大脑侧"顶部通道上播种EZ球体，在"血侧"底部通道上使用iBMEC。iBMEC 先播种，并可在一夜之间附加，之后 EZ 球体被播种。然后，在静态条件下培养芯片，每天更换介质7天。然后，在 RT 下使用 4% PFA 固定 BBB 芯片 10 分钟，并用 DPBS 清洗 3 倍。免疫细胞化学在BBB芯片上进行，使用1）内丁作为神经祖细胞的标记，2）S100+或GFAP作为星形细胞的标记，3）βIII-图布林作为神经元的标记。GLUT-1和Pecam-1被用作BMEC的标记。使用共聚焦显微镜在 20 倍时进行成像，并使用斐济 ImageJ 软件处理图像。
图 6D表示在填充 iBMEC 和 EZ 球体的器官芯片、仅 iBMEC（无 EZ 球体）或单独 EZ 球体（不含 iBMECs）的器官芯片上执行的准细胞渗透性测定。经过"调节"周期后，在"血侧"的储液罐中加入4 kDa Dextran-FITC示踪剂，最终浓度为10微克/mL，芯片在30μL/h内注入。接下来，从顶部和底部通道的入口和出口储层收集介质。使用板读器收集并检查每个样品的100 μL荧光。
重要的是，使用1：1校准曲线将荧光值转换为Dextran FITC的浓度值。然后，使用值计算渗透性 （P应用）。这些结果表明，iBMECs形成功能屏障特性，当iBMEC与EZ球体共同培养时，这些特性会进一步收紧。只用EZ球体培养的芯片，无法形成屏障。根据可用的测量方法（例如荧光、ELISA 或质谱光度），可以使用类似的方法检查 BBB 芯片上任何分子的传输情况。
图1：基于iPSC的BBB芯片的原理图。在芯片上播种之前，iPSC在培养板中分化为（i）EZ球体（神经祖细胞，iNPCs），这些细胞在悬浮体中作为球体生长，并（ii）脑微血管内皮细胞（iBMECs）生长。EZ球体被分离成单个细胞，种子在器官芯片的顶部通道上，在那里它们进一步分化成混合神经培养体，形成"大脑侧"。iBMECs被播种在器官芯片的底部通道，在"血侧"形成血管状结构。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：芯片载波中芯片顶视图的图解，带有标记的端口。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：基于iPSC的BBB芯片制备和工作流程流程图。在开始工作流程之前，需要从iPSC对神经细胞和内皮细胞进行预分化。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4：在底部通道中播种 iBMEC。在种子播种后或（B） 24 h 播种后，在底部通道 （A） 中播种的 iBMECs 的明亮场图像在细胞附着后立即进行。请点击此处查看此图的较大版本。
图 5：连接芯片和便携式模块的架构，带有标记的入口和出口介质储液罐。请点击此处查看此图的较大版本。
图 6：代表性结果。基于iPSC的BBB芯片在播种后7天进行免疫细胞化学。EZ球体分化成顶部"大脑侧"通道的混合神经细胞群，包括（A）S100+（绿色）星形细胞、Nestin®（红色）神经祖细胞以及（B）GFAP®（红色）星形细胞和βIII-tubulin®（红色）神经元。刻度条 = 200 μm. （C） iBMECs 种子在底部"血侧"通道表示 GLUT-1 和 （绿色） PECAM-1 （CD31， 红色）。比例条 = 200 μm. （D） BBB 芯片渗透性评估通过向底部通道的储液罐中添加 dextran-FITC （4 kDa） 来评估。结果表明，与仅用iBMEC播种的器官芯片相比，用iBMECs和EZ球体的器官芯片表现出紧密的屏障（#p <0.05）。单独用EZ球体播种的器官芯片不显示任何阻隔特性（\p < 0.001;单向方差分析与 Tukey 的多重比较测试）。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
NVU 中的器官片上技术和 iPSC 衍生细胞的结合为人类 BBB 的精确建模带来了希望。在这里，我们提供了一个详细的协议，用于简单和稳健地应用最近发布的基于iPSC的BBB芯片16。种子设定范式的概述和时间如图3所示。要获得和维护适合 BBB 建模的屏障函数，生成均质 iBMEC 单层并保持其完整性至关重要。迈向功能单层的第一步包括非极性PDMS表面的化学激活，允许ECM蛋白的附着。表面活化试剂在重组后迅速降解，最终可能导致细胞不理想的附着。因此，在整个过程中保持试剂新鲜并防止光线照射非常重要。
在紫外线激活期间（第 5.2 节），试剂必须均匀分布在每个通道内，以实现一致的 ECM 涂层和均质细胞附着。本协议提供的ECM组合物和浓度针对特定类型的细胞（即iBMECs和EZ球源神经祖细胞）进行了优化。更改电池组成是可能的，但可能需要不同的 ECM 条件，这需要优化。在 ECM 涂层之后，正确播种 iBMEC 至关重要。高细胞播种密度（>14 x 106细胞/mL）对于获得完整的单层至关重要。如果未能实现全细胞融合，建议在播种期间进一步增加细胞悬浮密度至20 x 106细胞/mL。
拉米纳流量以前曾被建议用于增强iBMEC成熟15，对于实现微流体平台提供的优势是必不可少的。然而，流经芯片通道的微气泡会对驻留电池造成物理应力和分离，从而导致BBB芯片完整性的破坏。为了避免层压流期间形成微泡，在开始灌注之前对介质进行平衡至关重要。平衡要求在使用前对介质进行预热和脱气。
使用人类 iPSC 衍生的 iBMEC 和 iNDC 实现个性化芯片的生成。虽然iBMECs的分化是短的，相当简单的24，22，但iPSC分化为神经细胞21，25更具挑战性。然而，驻留在芯片"大脑侧"的神经细胞可以被任何神经细胞类型所取代，如主神经细胞或iPSC衍生的运动神经元16。与"善意"内皮细胞类似，iBMECs在基因表达中表现出可塑性，以响应不同的神经共性。因此，这种灵活性可能导致芯片上各种 NVUs 的未来发展。通过调整细胞播种时间和顺序，可以获得系统的额外灵活性。iBMEC 可以在神经细胞之前或之后播种，从而有可能在神经细胞的种子和附着后立即播种 iBMEC，或者在 EZ 球体分化成芯片环境中更成熟的神经培养物之后。鉴于iPSC衍生神经细胞的不成熟性质，这一点特别重要。鉴于EZ球体是早期神经祖细胞，较长的分化期也可能导致星形细胞和神经元的百分比增加。
协议中缺少的一个成分是血管内围细胞，它是生理NVU中的关键成分。最近iPSCs分化成类似围细胞的进展26，27将允许引入这种额外的细胞类型，从而提供BBB的改进副本，同时保持其个性化性质。
IBMEC 之前已经证明了对 BBB 建模至关重要的各种属性，包括细胞标记的表达、TEER 的建立和排泄泵28、24、5的功能活性。然而，分子分析显示，这些细胞也表达几个上皮标记15。iBMEC生成的进步显示改善的功能和内皮标记表达最近被描述为29，30。按照此处介绍的范例，这些可能改进的单元可以很容易地集成到 BBB 芯片模型中，以便将来应用。此处描述的灵活而强大的平台可能促进疾病建模以及新中枢神经系统药物的开发和评估。
虽然该协议依赖于特定的商业产品，但更多的商业公司提供了不同的微生理平台，这可能提供替代优势31。此外，微流体器官芯片的"内部"制造协议也提供32种，并可提供更多的模块化，包括TEER电极17的集成，这是这里使用的平台上缺少的。
引入芯片上的器官作为改善当前细胞培养的生理环境的替代方法33。然而，这项技术的应用需要专门的工程技能，而生物导向实验室往往缺乏这些技能。商用芯片平台（如此处采用的芯片平台）提供较少的模块化、增强的鲁棒性和可重复性，可供更广泛的用户应用。此外，层压流在微流体芯片上的应用依赖于注射器或蠕动泵的应用，这带来了另一个复杂程度。现在，随着文化模块的应用，这一障碍更容易克服，这有利于同时灌注多个芯片。
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Disclosures
雪松-西奈拥有生产该研究微流体器官芯片的Emulate的少数股权。雪松-西奈的一名官员也在模拟公司的董事会任职。模拟没有为这项研究提供财政支持。雪松-西奈和模拟已经申请了与这项工作相关的专利。
Acknowledgments
我们要感谢索沙娜·斯文德森博士的批判性编辑。这项工作得到以色列科学基金会第1621/18年赠款、科学和技术部（MOST）、以色列3-15647、加州再生医学研究所IDDISC1-08800、谢尔曼家庭基金会、NIH-NINDS赠款1UG3NS105703和ALS协会赠款18-SI-389的支持。AH由瓦伦堡基金会资助（赠款编号2015.0178）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | EMD Millipore | SCR005 | Dissociation solution |
| B27 | Gibco | 12587010 | |
| Bfgf | Peprotech | 100-18B | |
| Chip-S1 | Emulate Inc | Chip-S1 | Organ-Chip |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| Dextran-FITC | Sigma | 46944 | |
| DMEM: F12 | Thermo Fisher Scientific | 31330038 | |
| Donkey serum | Sigma | D9663 | |
| Emulate Reagent 1 (ER-1) | Emulate Inc | ER-1 | |
| Emulate Reagent 2 (ER-2) | Emulate Inc | ER-2 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako | Z0334 | |
| GLUT-1 | Invitrogen | MA5-11315 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050038 | Glutamine supplement |
| hBDNF | Peprotech | 450-02 | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| mTeSR1 | StemCell Technologies, Inc. | 85851 | |
| NEAA | Biological industries | 01-340-1B | |
| Nestin | Millipore | MAB353 | |
| NutriStem | Biological industries | 05-100-1A | Alternate media |
| PECAM-1 | Thermo Fisher Scientific | 10333 | |
| Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP) | Biomedical Technologies | J64483AB | |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | |
| S100β | Abcam | ab6602 | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | SCGP00525 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| ZO-1 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 33-9100 | |
| βIII-tubulin (Tuj1α) | Sigma | T8660 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350010 |
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