Summary
혈액 뇌 장벽 (BBB) 단단히 뇌 항상성을 조절 하는 다세포 신경 혈관 단위. 인간 iPSCs와 오르간 온 칩 기술을 결합하여 질병 모델링 및 CNS 약물 침투성 예측에 적합한 맞춤형 BBB 칩을 생성했습니다. BBB 칩의 생성 및 작동에 대해 상세한 프로토콜이 설명된다.
Abstract
혈액 뇌 장벽 (BBB) 신경 혈관 단위에 의해 형성 된다 (NV) 그 중추 신 경계를 보호 (CNS) 미묘한 뇌 기능을 방해할 수 있는 혈액에서 발견 하는 요인의 범위에서. 이와 같이, BBB는 CNS에 치료제의 전달에 주요 장애물이다. 축적 된 증거는 BBB가 신경 질환의 발병과 진행에 중요한 역할을한다는 것을 시사합니다. 따라서, CNS 표적 약물의 침투를 예측할 수 있을 뿐만 아니라 건강과 질병에 있는 BBB의 역할을 해명할 수 있는 BBB 모형을 위한 엄청난 필요가 있습니다.
우리는 최근에 인간에게 완전히 개인화된 BBB 칩을 생성하기 위하여 기관 온 칩 및 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC) 기술을 결합했습니다. 이 새로운 플랫폼은 인간 BBB를 통해 약물 및 분자 수송의 예측에 적합한 세포, 분자 및 생리학적 특성을 표시합니다. 또한 환자 별 BBB 칩을 사용하여 신경 질환 모델을 생성하고 개인화 된 예측 의학 응용 프로그램의 잠재력을 입증했습니다. 여기에 제공된 iPSC 유래 BBB 칩을 생성하는 방법을 보여주는 상세한 프로토콜이 제공되며, iPSC 유래 뇌 미세 혈관 내피 세포(iBMECs)의 분화로 시작하여 신경 전구를 함유하는 혼합 신경 배양물의 결과로 시작되며, 차별화 된 뉴런, 및 성상 세포. 또한 조절된 층류 하에서 장기 칩 내로 세포를 시드하고 BBB 칩을 배양하는 절차도 기술되어 있다. 마지막으로, BBB 칩 분석에 대한 상세한 설명은 칩 내의 세포 유형의 조성을 결정하기 위한 면역세포화학적 방법뿐만 아니라 약물 및 분자 투과성을 평가하기 위한 파라셀룰러 투과성 분석법을 포함한다.
Introduction
BBB는 순환 혈액에서 CNS를 분리하는 높게 선택적인 방벽입니다. 그것은 잠재적으로 파괴적인 물질에서 중요 한 뇌 기능을 보호, 요인, 그리고 또한 영양소와 뇌 항상성을 유지 하는 데 필요한 다른 대사 산물의 유입을 허용 하는 동안1. BBB는 다세포 NVU로서 골상세포, 성상세포 종보 및 신경 과정이 뇌 미세 혈관 내피 세포(BMECs)와 직접 접촉합니다. 이러한 상호 작용을 통해 BMECs는접합부2,3에의해 지지되는 특수 장벽 특성을 형성할 수 있습니다. 이 방벽의 대형은 분자의 paracellular 통행을 제한합니다, 그러나 능동적으로 CNS로 분자를 수송하기 위하여 편광한 수송자를 포함합니다 또는 혈액으로 다시1. 이러한 독특한 장벽 특성으로 인해 BBB는 바이오 의약품을 뇌로 전달하는 데 큰 장애가 되며 FDA 승인 소분자의 5% 미만이 CNS4에도달할 수 있는 것으로 추정됩니다.
동물 모델은 BBB 개발5에관여하는 BBB 침투 및 분자 메커니즘을 연구하는 데 널리 사용되어 왔다. 동물 모델은 생체 내 복잡한 다세포 환경을 충실하게 나타내지만, BBB 수송기의 발현 및 활성의 차이뿐만 아니라 종에 걸친 기질 특이성의 차이는 종종 인간에게 동물 데이터의 정확한 외삽을배제한다 6. 따라서, 인간 기반 모델은 인간 BBB를 연구하고 CNS를 표적으로 하도록 설계된 약물의 개발에 사용하기 위해 중요하다. 이러한 필요성은 제약 개발 분야에서 생물학적, 인간 특이적 약물의 지배력이 증가함에 따라 더욱 명백해집니다. 축적된 증거는 손상된 BBB가 뇌종양 및 신경질환을 포함하는 다수의 중증 CNS 질환과 연관되어 있음을 시사한다7,8,9. 이러한 질병을 충실하게 반영하는 인간 모델은 1) 약물 개발을 목표로 할 수 있는 새로운 경로를 식별하고 2) CNS 침투를 예측하여 전임상 연구에서 시간과 자원을 줄이고 임상 시험에서 실패율을 감소시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.
시험관내 모델은 BMECs와 NVU의 다른 세포 들 사이의 상호 작용을 연구하고 장래 BBB 투과성 약물에 대한 스크린을 수행하기 위해 널리 구현되어 왔다10. 인간 BBB의 주요 측면을 재현하기 위해, 시험관 내 모델은 생리학적으로 관련된 특성을 표시해야 합니다(즉, 낮은 파라셀세포 투과성 및 생리학적으로 관련된 형벌 전기 저항 [TEER] 내피 단층에 걸쳐). 또한, 시험관내 시스템의 분자 프로파일은 대표적인 기능적 수송 시스템의 발현을 포함해야 한다. 전형적으로, 시험관내 모델은 BBB특성(11)을향상시키기 위해 다른 NVU 세포의 조합과 함께 반투과성 막 상에서 배양되는 내피 세포로 구성된다. 이 접근법은 장벽 기능과 분자 투과성을 간단하고 비교적 신속하게 평가할 수 있게 합니다. 이러한 세포 기반 BBB 모델은 외과 적 절제 또는 불멸의 BMEC 라인으로부터 분리된 세포를 포함하는 동물 또는 인간 세포 공급원으로 확립될 수 있다.
최근, 인간 다능성 세포를 BMECs로 분화하는 프로토콜이 시험관 내 인간 BBB모델(12,13)에대한 매력적인 공급원으로 도입되었다. 유도된 만능 줄기 세포(iPSC)-유래 BMECs(iBMECs)는 확장성이 높고, 인간 BBB의 중요한 형태학적 및 기능적 특성을 입증하고, 환자의 유전학을 수행한다. 문화에서 iBMECs는 단단한 접합 마커를 표현하고 생체내 접합 단지에 표시하는 단층을 형성합니다. 이들 세포는 또한 BBB 포도당 수송기, 포도당 수송기 1(GLUT1)을 포함하는 BBB 마커를 발현한다. 중요한 것은, 인간 BMECs에 대한 다른 대체 세포 소스와는 달리, iBMECs는 생체 내 측정값과 높은 값으로 장벽 특성을획득,basolateral 축을 따라 편광, 및 기능성 유출 펌프를 표현. 더욱이, 다양한 피험자들로부터의 iPSCs의 사용은 모두 1) 개인화된 의학 방식으로 BBB의 양상을 시험할 수 있는 기회를 환영하고 2) NVU의 추가적인 세포 유형을 생성하기 위한 유연한 공급원을 제공한다. 개인화된 BBB 칩을 만들기 위하여 이 세포를 동위 원성 세포 근원에서 생성하는 것은 또한 임상 연구 결과에서 관찰된 처리에 저항 또는 손상한 반응에 대한 주요 원인인 약 반응에 있는 개별적인 다름을 이해하는 것을 도울 것입니다.
접시 나 반 투과성 트랜스웰 인서트에 단일 레이어로 iBMECs를 사용하는 것은 BBB 모델링을위한 강력한 접근 방식을 나타냅니다. 이러한 시스템은 견고하고 재현 가능하며 비용 효율적인 경향이 있습니다. 또한 TEER 및 투과성과 같은 기능 분석은 비교적 간단하게 수행할 수 있습니다. 그러나, 2차원(2D) 시스템은 생체 내 조직의 3D 특성을 재현하지 못하고, 혈액 및 혈액 세포를 순환시킴으로써 제공되는 생리학적 전단 응력이 부족하다. 이것은 본질적인 BBB 속성 및 기능을 개발하고 유지하기 위하여 이 모형에 있는 관 내피의 기능을 제한합니다.
살아있는 세포에 의해 줄 지어 있는 마이크로 엔지니어링 시스템은 오르간 온 칩에게 불린 개념에 있는 각종 기관 기능을 모델링하기 위하여 실행되었습니다. 생체외 다세포 구조, 조직-조직 인터페이스, 물리 화학 적 미세 환경 및 혈관 관류를 재현함으로써 이러한 마이크로 엔지니어링 플랫폼은 조직 및 장기 기능 수준을 생성할 수 없습니다. 기존의 2D 배양 시스템. 그(것)들은 또한 생체 내 조직 및 기관 문맥에 있는 살아있는 세포와 유사한 생화확적인, 유전 및 신진 대사 단면도의 고해상도, 실시간 화상 진찰 및 분석을 가능하게 합니다. 그러나 오르간 온 칩의 특별한 과제는 이러한 마이크로 엔지니어링 칩의 설계, 제작 및 적용에는 생물학적 지향적인 학술 실험실에서 일반적으로 부족한 전문 엔지니어링 전문 지식이 필요하다는 것입니다.
우리는 최근에 개인화 된 BBB 칩 모델15,16을생성하기 위해 iPSC 및 오르간 온 칩 기술을 결합했습니다. 기술적인 과제를 극복하기 위해 시판되는 Chip-S1은 간단하고 견고한 방식으로 칩의 유지관리를 자동화하도록 설계된 계측기인 배양 모듈과 함께 사용됩니다(Emulate Inc.). BBB 칩은 신경 세포와 내피 세포 사이의 상호 작용을 재현하고 통합 금 전극17과사용자 정의 만든 장기 칩에 의해 측정되는 생리적으로 관련된 TEER 값을 달성한다. 또한 BBB 칩은 낮은 세포 투과성을 표시하고, 기관 수준에서 염증 신호에 반응하고, 활성 유출 펌프를 표현하며, 수용성 바이오마커 및 바이오 의약품의 예측 수송을 나타냅니다. 특히, 여러 개인으로부터 생성된 BBB 칩은 건강한 개인과 신경질환 환자 사이의 예상 기능적 차이를포착한다 15.
아래에 자세히 설명된 프로토콜은 동적 흐름 조건에서 인간 iPSC 기반 BBB 칩의 생성을 위한 신뢰할 수 있고 효율적이며 재현 가능한 방법을 설명합니다. BBB 칩또는 샘플링 유출물에서 직접 수행할 수 있는 분석 유형 및 종점 분석에 대한 지침이 제공됩니다. 따라서, 프로토콜은 인간 관련 모델에서 생물학적 및 기능적 특성 및 반응을 평가하기 위해 적용될 수 있는 기술의 스펙트럼을 보여준다.
iPSC 기반 BBB 칩에 대한 간략한 설명은 여기에 제공됩니다. 인간 iPSCs는 처음에 조직 배양 플라스크에서 EZ 구라고 불리는 신경 전구의 자유 부동 응집체로서 분화되고 전파됩니다. Chip-S116,18,19의 최상위 채널은 칩의 "뇌 측"을 형성하는 해리된 EZ 구체로 시드되며, 세포는 7일 동안 신경 전구 세포(iNPC), iAstrocytes 및 iNeurons의 혼합 배양으로 분화됩니다. 인간 iPSCs는 또한 iBMECs로 조직 배양 판에서 분화됩니다. 칩의 하단 채널은 iBMECs로 시드되어 내피 튜브를 형성하기 위해 발달함에 따라 "혈액 측"을 형성합니다(그림 1). 상하 채널 1을 분리하는 다공성 세포 외 매트릭스(ECM) 코팅 멤브레인은 채널과 2 사이의 세포 간 상호 작용의 형성을 허용하며, 사용자는 기존의 광 현미경을 사용하여 어느 채널에서든 투과성 세포 및 이미지 세포를 실행할 수 있습니다.
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Protocol
1. iPSC 유래 신경 전구 세포 (iNPC)의 생성
- 아래에 설명된 바와 같이 iPSC 콜로니에서 EZ 구를 생성하고 이전에 출판된20,21,22.
- 배양 iPSC 콜로니는 mTESR1 또는 기타 상용 매체에서 지하 막 매트릭스 코팅 6 웰 플레이트(0.5 mg/플레이트)에 대한 합류를 한다(재료 표참조).
- iPSC 배지를 제거하고 EZ 구 배지의 2 mL로 교체 [ESM; DMEM:F12 7:3 100 ng/mL 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 100 ng/mL 표피 성장 인자, 5 μg/mL 헤파린, 2% B27 보충제]로 보충되었습니다.
- 멸균 1000 μL 파이펫 팁 또는 셀 스크레이퍼의 뒷면으로 각 수량의 바닥을 잘 긁어냅니다.
- 모든 세포를 수집하고 자유 부동 구체의 자발적형성을 허용하기 위해 초저 부착 T25 플라스크에 배치합니다. 37 °C에서 하룻밤 배양.
- 매개체가 노란색으로 변할 때 매 번 2-3일마다 매 개체의 절반을 신선한 ESM으로 대체하여 구체에 먹이를 주어 먹이세요. 이를 통해 구체가 조절된 매체에 남아 있어 성장 및 유지 관리에 매우 중요합니다.
- 튜브 랙에 플라스크를 숙이고 구체가 플라스크의 구석까지 1-2분 동안 중력에 의해 정착되도록 합니다.
- 일단 정착되면, 5 mL 또는 10 mL 혈청학적 파이펫으로 상판의 절반을 흡인하고 신선한, 미리 따뜻하게 ESM으로 교체합니다.
- 통로 EZ-구는 앞서 설명한 바와 같이 200 μm 직경으로 구체를 자르는 것으로 매주23,20,21. EZ 구체는 최대 25개의 구절을 유지할 수 있으며 8-25개 구절 사이에 사용할 때 이상적입니다.
- iNPC의 단일 셀 현탁액 준비:
- 신경 분화를 유도하기 위해 EZ-구를 단일 세포로 해리시다.
- T75 플라스크에서 3-4 일 후 구를 수집하고 15 mL 원추형으로 전송한 다음 2 분 동안 또는 모든 구가 바닥에 정착 될 때까지 방치하십시오.
- 안정된 구체를 방해하지 않고 5mL 파이펫으로 ESM을 천천히 제거합니다. 해리 액 1 mL을 추가하고 (재료 표참조) 37 °C에서 10 분 동안 배양하십시오.
- 인큐베이션 5분 후에 해리 솔루션과 구를 소용돌이치면 안정된 구가 처리되도록 합니다.
- 해리 액을 천천히 제거하십시오. 신경 분화 배지의 1 mL을 추가 [NDM; DMEM: F12 와 2% B27 마이너스 비타민 A, 1% N2 보충, 그리고 인간의 두뇌 파생 신경 영양 요인 (hBDNF, 20 ng/mL)].
- 모든 구가 해리될 때까지 1mL 파이펫을 사용하여 파이펫팅하고 200 μL 파이펫을 사용하여 구를 단일 셀로 삼각화합니다. 삼중 절차 중에 거품 형성을 피하십시오.
- 혈세포계를 사용하여 해리 된 세포를 계산하고 세포를 1 x 106 세포 / mL의 최종 밀도로 희석하십시오. 용도에 따라 밀도를 변경할 수 있습니다.
참고: 밀도가 높을수록(최대 6 x 106 셀/mL)은 최대 3일의 단기 배양에 권장되며, 밀도가 낮은 경우 최대 3주까지 장기 적용이 권장됩니다.
참고 : 세포는 이제 "뇌 측"을 형성하기 위해 칩의 상단 채널에 시드 할 준비가되어 있습니다.
2. iBMECs로의 iPSC 차별화
- 통로 iPSCs는 6 개의 웰 웰 플레이트에서 1:6 비율로 6 개의 웰 멤브레인 매트릭스 코팅 플레이트로. 세포가 24 시간 동안 부착시키십시오. 매일 iPSC 배지를 변경하십시오.
- 혈세포계를 사용하여 매일 세포를 계산합니다.
- 세포가 1.5-3.0 x 105 세포/웰의 밀도에 도달하면, iPSC 배지를 bFGF 없이 3 mL로 대체 [DMEM:F12 1:1, 10% 녹아웃 혈청 교체(KOSR), 1% 비필수 아미노산(NEAA), 0.5% 글루타민보충제(재료 표),및 10μg/10μtom. 6 일 동안 매일 매체를 교체24.
- 6일째에 배지를 내피세포(EC) 배지[인간 내피 혈청 자유 배지(hESFM)]로 1% 혈소판 유래 소 혈청, 20 ng/mL bFGF 및 10 μM 올 트랜스 레티노산(RA)]으로 보충하였다. 2 일 동안 중간을 둡니다.
- EC 배지를 제거하고 웰당 1 mL의 해리 액을 추가합니다. 37°C에서 35분 동안 배양합니다.
참고: 이것은 여기에서 사용된 해리 액에 있는 긴 배양 시간으로 여겨지지만, iBMECs는 90% 이상 세포 생존율로 이 처리를 견딜 수 있습니다. - 셀 현탁액을 부드럽게 파이펫팅하고 모든 세포를 15 mL 원추형 튜브로 수집하여 웰에서 세포를 분리합니다.
참고: 가혹한 파이펫팅을 피하십시오. 세포가 쉽게 분리되지 않으면 추가로 5 분 동안 배양하십시오. - 15 mL 원엽에 1 부피의 EC 배지를 추가하여 Accutase를 비활성화하고, 5 분 동안 200 x g의 원심 분리를 제거하고, 중간을 제거하고 EC 배지 1 mL로 대체하십시오 (bFGF 및 RA 제외).
- 혈세포계를 사용하여 세포를 카운트하고 세포 밀도를 14-20 x 106 세포 /mL로 조정합니다.
참고 : 세포는 이제 "혈액 측"을 형성하기 위해 칩의 하단 채널에 시드 할 준비가되어 있습니다.
3. 오르간 칩의 미세 가공
- BBB 칩 모델과 이전에 수행 된 대로 생산에 대한 오르간 칩을 사용하여16,18,19. 키가 큰 채널 오르간 칩 (재료 표참조)은 유연한 다공성 멤브레인으로 분리 된 두 개의 중첩 및 병렬 마이크로 스케일 채널을 포함하는 매우 유연한 다각적 인 다각성 화합체 (PDMS)에서 제조됩니다. 상하 마이크로채널 크기는 각각 1mm x 1mm 및 1.0mm x 0.2mm입니다. 두 채널은 50 μm 두께의 PDMS로 만든 유연한 다공성 멤브레인으로 분리되며, 40 μm 간격으로 7 μm 직경의 기공을 함유합니다. 채널을 분리하는 다공성 멤브레인의 표면적은 0.171 cm2입니다.
4. 칩 준비
- 오르간 칩은 칩 캐리어 내에 미리 포장되어 제공되므로 취급 중에 칩 정렬을 방해하거나 왜곡할 필요가 없습니다. 또한, 칩 캐리어는 배양 모듈과 칩 사이의 인터페이스로서 작용하는 휴대용 모듈("Pod")에 안전하게 연결된다.
- 칩의 포장에 70% 에탄올을 뿌리고 생물 안전 성 캐비닛 (BSC)에 넣습니다.
- 포장을 열고 멸균 페트리 접시에 오르간 칩을 배치합니다. 칩과의 직접적인 접촉을 피하기 위해 측면에 의해서만 칩 캐리어를 처리하십시오.
- 캐리어의 탭이 오른쪽을 향하고 있는지확인합니다(그림 2)여러 칩을 사용하는 경우 모두 동일한 방향으로 정렬합니다.
- 캐리어 탭의 각 칩에 레이블을 지정합니다(전체 칩 준비 및 워크플로우가 그림 3에표시됨).
5. 표면 활성화 및 ECM 코팅
- 표면 활성화 솔루션 의 준비
- 에뮬레이트 시약 1(ER-1)은 5 mg을 함유하는 바이알에 구비되어, 빛에 민감하다. 사용 직전에 신선한 ER-1 용액을 준비하십시오. ER-1 무결성은 칩의 성공적인 준비에 매우 중요합니다.
- ER-1을 취급할 때 BSC의 표시등을 끕니다.
참고: ER-1은 눈 자극제이며 적절한 장갑과 눈 보호 기능을 갖춘 BSC에서 처리해야 합니다. - 사용하기 전에 ER-1 및 ER-2 시약이 실온(RT)에 평형되도록 하십시오.
- 빈 멸균 15mL 원추형 튜브를 호일로 감아 빛으로부터 용액을 보호하십시오.
- BSC에서 ER-1 바이알을 짧게 눌러 바닥에 파우더를 정착시다.
- 유리병에 ER-2 버퍼 1 mL을 추가하고 15 mL 래핑 된 원엽 튜브의 바닥에 즉시 그 함량을 전송합니다. 파이펫을 섞지 마십시오. 원유관으로 전달되는 용액의 색상은 빨간색입니다.
- 5.1.6 3x 단계를 반복합니다. 마지막 라운드에서, ER-1 바이알을 캡과 뚜껑에서 남아있는 분말을 수집하는 반전, 다음 원추형 튜브에 용액을 전송; 이렇게 하면 총 부피가 4 mL의 ER-1 솔루션으로 나타납니다.
- 15 mL 원엽 튜브의 4 mL ER-1 용액에 ER-2 용액 6 mL을 추가하여 최종 농도0.5 mg/mL을 추가합니다. ER-1은 ER-2 용액 내에 완전히 용해되어야 한다.
- 표면 활성화
- P200 파이펫과 멸균 200 μL 여과 된 파이펫 팁을 활용하여 ER-1 혼합물의 200 μL을 차지합니다.
- 파이펫을 바닥 입구에 놓고 혼합물이 하단 채널 출구에서 흘러 나오기 시작할 때까지 아래 채널에 ER-1 혼합물 20 μL을 밀어 넣습니다.
- ER-1 혼합물의 약 50 μL을 추가하고 상단 채널 입구에 놓습니다. 상단 채널 출구에서 흐름을 시작할 때까지 혼합물을 상단 채널을 통해 밀어 넣습니다.
- 부드러운 포부로 칩 표면에서 여분의 ER-1 혼합물을 모두 제거합니다. ER-1 혼합물이 채널에서 제거되지 않고 칩 표면에서만 제거되었는지 확인합니다.
- 자외선(UV) 활성화 전에 채널에 기포가 없는지 확인합니다. 기포가 감지되면 ER-1 혼합물로 채널을 세척하여 기포를 제거하십시오.
- 칩이 들어 있는 열린 접시를 UV 라이트 박스에 넣습니다(에뮬레이트 Inc.에서 제공).
- UV 라이트 상자 뒷면의 스위치를 "일관된" 설정으로 설정합니다. 전원을 켜고 UV 활성화를 시작합니다. 칩을 자외선 아래에 20분 동안 둡니다.
참고: 자외선에 인력이 노출되지 않도록 하십시오. - 두 채널에서 ER-1 혼합물을 제거합니다.
- 각 채널에 ER-2 용액 200 μL로 세척하십시오.
- 두 채널에서 ER-2를 제거합니다.
- 멸균 콜드 덜베코의 인산완충식염수(DPBS)로 각 채널을 200μL로 세척합니다.
- 다음 단계로 진행할 때까지 채널 내부에 콜드 DPBS를 둡니다.
- 세포외 매트릭스(ECM) 준비 및 코팅
- 개별 ECM 구성 요소를 콜드 DPBS, 물 또는 기타 용매와 최종 작업 농도에 결합하여 ECM 솔루션을 준비합니다. ECM 용액은 사용될 때마다 신선하여 제조되어야 한다.
- 칩의 상부 및 하부 채널을 ECM으로 코팅하고 시드할 셀 유형에 의해 결정된 조성물을 사용하여 코팅합니다. ECM 혼합물은 사용 될 때까지 얼음에 유지해야합니다.
- 라미닌(50 μg/mL)을 사용하여 "뇌 측"을 코팅하고, 콜라겐 IV및 피브로넥틴을 4:1 비율로 혼합(320:80 μg/mL)하여 섹션 5.6에 설명된 바와 같이 "혈액 측"을 코팅한다.
- ECM 알리쿼트의 준비
- 차가운 DPBS에서 1 mg/mL 라미닌을 50 μg/mL의 최종 농도로 희석합니다. 알리쿼트 및 사용 전까지 -20°C에서 보관하십시오.
- 콜라겐 IV를 0.1% 아세트산에 1 mg/mL의 농도로 용해시. 용액을 밤새 2-8°C에서 또는 RT에서 1-3시간 동안 또는 완전히 용해될 때까지 배양합니다.
- 콜라겐 IV: 피브로넥틴 1 mL 혼합물을 준비합니다(콜라겐 IV 320 μL, 피브로넥틴 80 μL, 멸균 이중 증류 H2O600 μL). 혼합물은 -20°C에서 보관할 수 있다.
- ECM으로 칩 코팅
- 두 채널에서 차가운 DPBS를 완전히 흡인합니다. P200 파이펫을 설정하여 콜라겐 IV:피브로넥틴 용액의 100 μL을 차지합니다.
- 하단 채널 입구를 통해 출구에 작은 물방울이 형성될 때까지 솔루션을 소개합니다. 파이펫 팁을 제거한 후 입구에 작은 물방울을 놓습니다.
- 상부 채널 입구를 통해 라미닌 용액을 배출구에 작은 물방울이 형성될 때까지 도입한다. 파이펫 팁을 제거한 후 입구에 작은 물방울을 놓습니다.
- 채널을 자세히 살펴보면 거품이 없는지 확인합니다. 기포가 있는 경우 모든 기포가 제거될 때까지 적절한 ECM 용액으로 채널을 세척합니다.
- 각 칩에 대해 5.5.1-5.5.4 단계를 반복합니다.
- 15 mL 원엽 튜브의 캡에 1.5 mL의 DPBS를 추가합니다. DPBS 캡을 칩과 함께 150mm 배양 접시에 놓아 습도를 높이고 파라필름으로 접시를 밀봉합니다. 최상의 결과를 얻으려면 칩을 밤새 4°C에서 배양합니다.
참고 : 원하는 경우, 밤새 배양하는 것이 바람직하지만, 세포는 칩 활성화 및 ECM 코팅과 같은 날 시드 될 수있다. 칩은 ECM을 첨가하고 37°C에서 칩을 인큐베이팅한 후 4시간 파종할 수 있다.
6. "뇌 측"채널을 시드하고 EZ 구체를 혼합 신경 문화로 차별화
- 준비된 칩이 들어 있는 접시를 BSC에 가져온다. 200 μL의 NDM으로 두 채널을 부드럽게 세척하십시오.
- 포트와의 접촉을 피하고 칩 표면에서 과도한 매체 방울을 조심스럽게 흡인합니다. 균일 한 셀 현탁액을 보장하기 위해 각 칩을 파종하기 전에 셀 현탁액을 부드럽게 교반
- iNPC를 최상위 채널에 시드하여 "뇌 쪽"을 생성합니다.
- 셀(1 x 10 6 셀/mL)을 칩의 상단 채널에 시드합니다. 30-100 μL의 셀 서스펜션이 포함된 P200 팁을 상단 채널 입구에 추가하고 파이펫에서 팁을 부드럽게 분리합니다. 빈 P200 파이펫을 가지고 플런저를 누르고 상단 채널 출구에 삽입하고 조심스럽게 칩을 통해 단일 셀 현탁액을 당깁니다.
- 접시를 덮고 현미경으로 옮겨 최상위 채널 내에서 세포의 시드 밀도 및 균질한 분포를 확인합니다. 칩 입구와 출구 포트에서 파이펫 팁을 부드럽게 제거합니다.
- 시드 밀도는 20% 커버리지로 나타납니다. 시드 밀도가 예상보다 높거나 낮거나 고르지 않은 경우 칩을 BSC로 되돌리고 신선한 배지의 200 μL로 채널 2x를 세척하고 6.3.1 단계를 반복합니다.
- 올바른 세포 밀도를 확인한 후, 칩의 각 배치를 파종한 후 즉시 칩을 37°C에서 2시간 동안 인큐베이터에 놓습니다. 신선한 NDM으로 부착하지 않는 세포를 씻어 내주세요.
- 흐름을 시작하기 전에 적어도 48 시간 동안 매일 NDM 교체로 37 °C에서 정적 조건하에서 세포를 유지하십시오. iBMECs는 iNPC가 부착된 후 또는 iNPC 시드 다음 날에 시드할 수 있습니다.
7. "혈액 측"을 생성하기 위해 하단 채널에 iBMECs를 시딩
- 준비된 칩이 들어 있는 접시를 BSC에 가져온다. EC 배지의 200 μL로 바닥 채널을 부드럽게 세척하십시오.
- 포트와의 접촉을 피하고 칩 표면에서 과도한 EC 매체의 방울을 조심스럽게 흡인하여 두 채널에 매체를 남겨 두십시오. 균일 한 세포 현탁액을 보장하기 위해 각 칩을 파종하기 전에 셀 현탁액을 부드럽게 교반하십시오.
- P200 파이펫을 사용하여 iBMEC 셀 서스펜션(14-20 x 106 셀/mL)의 30-100 μL을 그리고 팁을 하단 채널 입구에 넣습니다. 피펫에서 팁을 부드럽게 분리하여 셀 함유 팁을 입구 포트에 남겨 둡습니다.
- 빈 팁으로 P200 파이펫의 플런저를 누르고, 하단 채널 출구에 삽입하고, 피펫 플런저를 천천히 풀어 내어 하단 채널을 통해 단일 셀 서스펜션을 조심스럽게 당깁니다.
- 칩 표면에서 과잉 셀 현탁액을 흡인합니다. 흡입구 및 출구 포트와 직접 접촉하지 않도록 하여 셀 서스펜션이 채널 밖으로 흡인되지 않도록 하십시오.
- 칩을 덮고 시드 밀도를 관찰하기 위해 현미경으로 옮김을 옮김을 합니다. 하단 채널은 현미경하에서 4x 또는 10x에서 관찰될 때 세포 들 사이의 관찰 가능한 간격으로 채워져야합니다(그림 4).
- 시드 밀도가 커버리지 90% 미만이거나 고르지 않게 분포된 경우, 그에 따라 셀 밀도를 조정하고 채널 내에서 올바른 밀도가 달성될 때까지 7.2-7.6단계를 반복합니다. 올바른 세포 밀도를 확인한후(도 4),종자 세포를 나머지 칩에. 하단 채널의 상단에있는 다공성 멤브레인에 세포를 부착하려면 각 칩을 반전시키고 칩 크래들에서 휴식을 취하십시오.
- 150mm 접시 안에 작은 저장소(멸균 DPBS를 포함하는 15mL 원점 튜브 캡)를 놓아 세포에 습도를 제공합니다. 약 3시간 동안 또는 하단 채널의 세포가 부착될 때까지 37°C에서 칩을 인큐베이트합니다. iBMECs가 부착되면(~3시간 후 시드) 칩을 다시 수직 위치로 뒤집어 하단 채널의 하단 부분에 셀 부착을 허용합니다.
8. 흐름의 개시
- 흐름은 전형적으로 iBMECs의 48시간 포스트 시드를 시작한다. 이번에는 iBMECs가 칩에 단단히 부착해야 합니다.
- 칩을 통해 층류 흐름을 유지하려면 매체의 온도를 탈기하고 평형화하는 것이 중요합니다. 배지는 1시간 동안 37°C 수조에서 미리 데워야 합니다.
- 최대 50 mL의 온난화 배지는 진공 구동 여과 시스템에서 15 분 동안 인큐베이션에 의해 탈기 될 수 있습니다.
- 휴대용 모듈 프라이밍
- 70% 에탄올로 휴대용 모듈 포장 및 트레이의 외관을 소독하고 닦아내고 BSC로 옮긴다. 포장을 열고 모듈을 트레이에 넣습니다. 트레이 뒤쪽으로 저수지를 향하게 합니다.
- 각 입구 저장소에 미리 평형, 따뜻한 매체의 파이펫 3 mL. 상부 채널의 상부 채널 입구 저장소에 하단 채널 및 NDM의 입구 저장소에 EC 배양 배지를 추가합니다(그림5).
- 각 출구 포트 위에 직접 평형, 따뜻한 매체의 파이펫 300 μL(그림 5).
- 각 트레이에 최대 6개의 휴대용 모듈을 놓습니다. 트레이를 인큐베이터에 가져와 트레이 핸들을 바깥쪽을 향하도록 배양 모듈로 완전히 밀어 넣습니다.
- 문화모듈에서 "프라임" 주기를 선택하고 실행합니다. 인큐베이터 도어를 닫고 배양 모듈이 휴대용 모듈을 프라이밍할 수 있도록 하십시오(~1분 소요). 상태 표시줄에 "준비됨"이 표시되면 프라이밍 주기가 완료됩니다. 배양 모듈에서 트레이를 제거하고 BSC로 가져옵니다.
- BSC의 각 휴대용 모듈의 밑면을 검사하여 휴대용 모듈이 성공적으로 프라이밍되었는지 확인합니다. 4개의 포트 모두에 작은 물방울이 있는 것을 찾으세요.
- 휴대용 모듈에 물방울이 나타나지 않으면 해당 모듈에서 프라임 사이클을 다시 실행합니다. 용지함에 용지가 떨어지면(콘센트 포트에서 더 자주 발생할 수 있음) 70% 에탄올로 트레이를 청소하십시오.
- 칩과 휴대용 모듈의 연결, 흐름의 조절 및 개시
- 각 칩의 두 채널을 따뜻하고 평형된 세포 특이적 배양 매체로 부드럽게 세척하여 채널의 가능한 기포를 제거하고 각 입구 및 출구 포트 의 상단에 작은 액적(채널내 의 미디어)을 놓습니다.
- 캐리어가 있는 칩을 휴대용 모듈에 삽입하고 각 트레이에 최대 6개까지 놓습니다. 배양 모듈에 트레이를 삽입합니다. 배양 모듈에 적절한 오르간 칩 배양 조건(유량 및 스트레치)을 프로그래밍합니다.
- 프로그램된 조건은 "규제" 주기가 완료되는 즉시 시작됩니다.
참고: 각 채널의 유량은 독립적으로 제어할 수 있으며 0-1,000 μL/h 범위의 속도로 설정할 수 있습니다. BBB 칩은 일반적으로 30 μL/h에서 배양됩니다. EC 매체 또는 ESM과 같은 매체를 30 μL/h 및 1000 μL/h로 흐르는 경우 전단력은 각각 0.01 dyn/cm2 및 0.33 dyn/cm2입니다. - 배양 모듈이 미리 설정된 기관 칩 배양 조건에서 흐름을 시작하는 약 2 시간이 걸리는 "조절" 주기를 실행합니다.
9. 혈액 대 뇌 파라세포 투과성 평가
- 10 μg/mL 덱스란-FITC(4 kDa)로 보충된 NDM을 준비합니다. 이 용액은 "혈액 측" 채널에 대한 입력으로서 사용될 것이다.
- dextran-FITC가 보충된 NDM으로 휴대용 모듈의 하단 채널 저장소를 채웁니다. 트레이서 없이 NDM으로 상단 채널 저장소를 채웁니다.
- 플레이트 판독기에서 형광의 평가를 위해 수집될 충분한 매체가 축적될 때까지 적어도 4시간 동안 30 μL/h의 유량으로 상하 채널을 침전시한다(전형적으로 100 μL).
- 상부 및 하부 채널의 입력 및 출력 저장소에서 미디어 샘플을 수집합니다. 빛으로부터 시료를 보호하십시오.
- 트레이서 없이 NDM을 사용하여 10 μg/mL dextran-FITC 1:1로 보충된 NDM을 연속적으로 희석하여 10-12포인트 교정 곡선을 생성합니다.
- 교정 곡선을 포함한 각 샘플의 100 μL을 검정 96 웰 플레이트에 넣고 플레이트 리더(485 nm 여기, 530 nm 방출)를 사용하여 형광을 판독합니다.
- 측정된 값을 사용하여 다음과 같이 P앱 값을 계산합니다.
- 매일 측정을 수행하여 장벽 특성을 평가하고 BBB 칩이 여전히 작동하고 있는지 확인합니다.
10. 면역 세포 화학
- 화학 연기 후드에 칩을 가져옵니다. P200 파이펫을 사용하여 DPBS에서 200 μL의 파라포름알데히드(PFA)로 두 채널을 교합하고 RT에서 10분 동안 배양하여 세포를 고정시.
- 고정 후, 각 채널에 200 μL의 DPBS를 주입하고 5 분 동안 배양하십시오.
- 1 차 차단 용액 (PBS, 5 % 정상 당나귀 혈청 및 0.1 % 트리톤 X-100으로 보충)을 정성하여 칩에 세포를 차단하고 투과시. RT에서 1 시간 동안 배양하십시오.
- 1차 차단 용액에서 1차 항체를 희석하고 4°C에서 밤새 배양한다. BMECs 마커는 GLUT-1 (1:100 희석), ZO-1 (1:300), PECAM-1 (1:250; CD31), VE-카데린 (1:200). 신경 마커는 βIII-tubulin (1:1000; Tuj1α), S100β (1:500), 네스팅 (1:1000) 및 GFAP (1:1000).
- 차가운 DPBS로 칩을 3배 씻으세요.
- 이차 차단 용액에서 이차 항체를 희석하십시오 (Triton-X가없는 5 % 정상 당나귀 혈청이있는 DPBS).
- 두 채널을 통해 이차 항체 용액을 침투시다. 전형적으로, 형광 이차 항체는 1:1000 희석된다. 빛으로부터 보호된 RT에서 1시간 동안 배양하십시오.
- DPBS로 칩을 3배 씻으세요.
- DAPI 용액의 100 μL로 칩을 정중시킴으로써 세포 핵을 염색한다. RT에서 5분 동안 배양합니다.
- DPBS로 칩을 3배 씻으세요.
- 칩은 직립 또는 반전형광 현미경을 사용하여 이미징할 준비가 되어 있습니다. PDMS 투명성은 손상되지 않은 기관 칩의 이미징을 허용합니다. 10배 이상의 배율은 오르간 칩의 두께로 인해 장거리 목표가 필요할 수 있습니다.
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Representative Results
그림 6A, B,C는 "혈액 측"하단 채널에 "뇌 측"상단 채널및 iBMECs에 EZ 구체시드 BBB 칩을 나타냅니다. iBMECs는 먼저 시드하고 EZ 구체를 시드 한 후 하룻밤 부착 할 수 있었습니다. 칩은 7 일 동안 매일 미디어 교체와 정적 조건에서 배양되었다. BBB 칩은 RT에서 4% PFA를 사용하여 10분 동안 고정하고 DPBS로 3x 세척하였다. 면역세포화학은 1) 신경 전구 세포에 대한 마커로서 1) 네스테인을 사용하여 BBB 칩상에서 수행되었고, 2) S100β 또는 GFAP를 성상세포에 대한 마커로서, 3) βIII-tubulin을 뉴런에 대한 마커로서 수행하였다. GLUT-1 및 페캄-1은 BMECs에 대한 마커로서 사용하였다. 이미징은 공초점 현미경을 사용하여 20x에서 수행되었고 이미지는 ImageJ 소프트웨어용 피지를 사용하여 처리되었습니다.
도 6D는 iBMECs 및 EZ 구체, iBMECs 단독(EZ-구체 없음) 또는 EZ 구체(iBMECs 제외)로 채워진 오르간 칩에서 수행된 파라셀룰러 투과성 분석(iBMECs 제외)을 나타낸다. "조절" 주기에 따라, 4 kDa Dextran-FITC 트레이서를 "혈액 측"의 저장소에 10 μg/mL의 최종 농도로 첨가하고 칩을 하룻밤 동안 30 μL/h로 관류시켰습니다. 다음으로, 상부 및 하부 채널의 입구 및 출구 저장소로부터 미디어를 수집했다. 각 시료의 100 μL을 수집하고 플레이트 리더를 사용하여 형광을 조사하였다.
중요한 것은 형광 값을 Dextran FITC의 농도 값으로 변환하기 위해 1:1 교정 곡선을 사용했다는 것입니다. 그런 다음 값을 사용하여 투과성(P앱)을계산했습니다. 이러한 결과는 iBMECs가 EZ 구체와 공동 배양될 때 더욱 강화되는 기능적 장벽 특성을 형성한다는 것을 보여줍니다. EZ-구로만 배양된 칩은 장벽을 형성하지 못합니다. 유사한 접근법은 사용 가능한 측정 방법(예를 들어, 형광, ELISA 또는 질량 분광도법)에 따라 BBB 칩을 통해 임의의 분자의 수송을 검사하는 데 사용될 수 있다.
그림 1: iPSC 기반 BBB 칩의 회로도. 칩에 파종하기 전에, iPSCs는 (i) EZ 구체(신경 전구 세포, iNPC)로 배양플레이트에서 분화되며, 이는 구체로서 현탁액에서 성장하고, (ii) 뇌 미세 혈관 내피 세포(iBMECs)로 성장한다. EZ 구체는 단일 세포로 해리되고, 장기 칩의 상단 채널에 시드되며, 여기서 그들은 "뇌 측"을 형성하기 위해 혼합 신경 배양으로 더 분화합니다. iBMECs는 장기 칩의 하단 채널에 시드되어 "혈액 측"에 혈관과 같은 구조를 형성합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 레이블이 부착된 포트가 있는 칩 캐리어내의 상단 뷰의 회로도입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: iPSC 기반 BBB 칩 준비 및 워크플로의 순서도입니다. iPSCs로부터의 신경 및 내피 세포의 사전 분화는 워크플로우를 시작하기 전에 필요합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 하단 채널에서 iBMECs의 시드. iBMECs의 브라이트필드 이미지는 시딩 직후(A) 또는(B)24시간 후 파종 후, 세포가 부착된 후 하단채널(A)에시드한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 라벨이 부착된 입구 및 출구 미디어 저장소가 있는 연결된 칩 및 휴대용 모듈의 회로도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 대표적인 결과. iPSC 계 BBB 칩상에서의 면역세포화학은 7일 후 시드. EZ-구체는(A)S100β+(녹색) 성상세포, 네스티네틴+(적색) 신경 전구 세포뿐만 아니라(B)GFAP+(적색) 성상세포 및 βIII-튜불린+(적색) 뉴런을 포함하는 상부 "뇌 측" 채널에서 혼합된 신경 세포 집단으로 분화된다. 스케일 바 = 200 μm.(C)iBMECs는 바닥 "혈액 측" 채널에서 시드하여 GLUT-1 및 (녹색) PECAM-1(CD31, 적색)을 발현하였다. 스케일 바 = 200 μm.(D)BBB 칩 투과성의 평가는 dextran-FITC(4 kDa)를 하단 채널의 저장소내로 첨가하여 수행하였다. 결과는 iBMECs와 EZ-spheres로 시드된 오르간 칩이 iBMECs만으로 시드된 오르간 칩에 비해 단단한 장벽을 표시한다는 것을 보여줍니다(*p & 0.05). EZ 구체로 시드된 오르간 칩만으로는 장벽 특성이 표시되지 않습니다(***p & 0.001; Tukey의 다중 비교 테스트를 통해 편도 ANOVA). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
NVU의 장기 온 칩 기술과 iPSC 유래 세포의 조합은 인간 BBB의 정확한 모델링에 대한 약속을 보유하고 있습니다. 여기서는 최근에 게시된 iPSC 기반 BBB 칩16의간단하고 강력한 응용을 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 시드 패러다임의 개요와 타이밍은 그림 3에나와 있습니다. BBB 모델링에 적합한 장벽 함수를 획득하고 유지관리하려면 균일한 iBMEC 단층을 생성하고 무결성을 유지하는 것이 중요합니다. 기능성 단층의 생성을 향한 첫 번째 단계는 ECM 단백질의 부착을 허용하는 비극성 PDMS 표면의 화학적 활성화를 포함한다. 표면 활성화 시약은 재구성 시 급격히 저하되어 결국 세포의 최적이 아닌 부착을 초래할 수 있습니다. 따라서 시약을 신선하고 공정 전반에 걸쳐 빛으로부터 보호하는 것이 중요합니다.
UV 활성화(섹션 5.2) 동안, 시약은 일관된 ECM 코팅과 균질한 세포 부착을 달성하기 위해 각 채널 내에 고르게 분포되어야 합니다. 본 프로토콜에 제공되는 ECM 조성물 및 농도는 특정 유형의세포(즉, iBMECs 및 EZ-구 유래 신경 전구 세포)에 최적화되었다. 세포 조성물을 변경하는 것은 가능하지만, 최적화가 필요한 차동 ECM 조건이 필요할 수 있다. ECM 코팅에 이어 iBMECs를 제대로 시드하는 것이 중요합니다. 높은 셀 시딩 밀도(>14 x 106 셀/mL)는 완전한 단층을 얻는 데 필수적입니다. 전체 세포 합류를 달성 하지 못하는 경우, 더 세포 현탁액의 밀도 증가 하는 것이 좋습니다 20 x 106 세포/mL 시딩 하는 동안.
라미나 흐름은 이전에 iBMEC성숙도(15)를 향상시키기 위해 제안되었으며 미세 유체 플랫폼에서 제공하는 이점을 이행하는 데 필수적입니다. 그러나 칩의 채널을 통해 흐르는 마이크로 버블은 상주 세포를 물리적으로 응력하고 분리할 수 있으며, 이는 BBB 칩 무결성의 파괴로 이어질 수 있습니다. 층류 흐름 동안 마이크로 버블 형성을 피하려면 관류가 시작되기 전에 배지를 평형화하는 것이 중요합니다. 평형화는 사용하기 전에 배지의 사전 온난화 및 탈기가 필요합니다.
개인화된 칩의 생성은 인간 iPSC 유래 iBMECs및 iNPC를 모두 사용하여 가능합니다. iBMECs의 분화는 짧고 다소 단순하지만24,22,iPSCs를신경세포(21,25)로 분화하는 것은 더 어렵다. 그러나, 칩의 "뇌 측"에 상주하는 신경 세포는 1차 신경 세포 또는 iPSC 유래 운동뉴런(16)과같은 임의의 신경 세포 유형으로 대체될 수 있다. 유사하게 "선의의" 내피 세포, iBMECs는 상이한 신경 공동 배양에 응하여 유전자 발현에 있는 가소성을 표시합니다. 따라서 이러한 유연성은 향후 칩상에서 다양한 NV의 개발을 초래할 수 있습니다. 셀 시드 타이밍 및 순서를 조정하여 시스템의 추가적인 유연성을 얻을 수 있습니다. iBMECs는 신경 세포 이전 또는 후에 시드할 수 있으므로 신경 세포의 파종 및 부착 직후 또는 EZ-구가 칩 환경에서 보다 성숙한 신경 배양으로 분화한 직후iBMECs를 시드할 수 있습니다. 이것은 iPSC 유래 신경 세포의 미성숙한 특성을 감안할 때 특히 중요합니다. EZ 구체가 초기 신경 전구라는 점을 감안할 때, 더 긴 분화 기간은 또한 성상 세포와 뉴런의 증가 된 비율을 초래할 수 있습니다.
프로토콜에서 누락된 한 가지 성분은 생리적 NVU에서 중요한 구성 요소를 제공하는 경막 파독입니다. iPSCs의 최근 발전은 pericyte 유사세포(26)및27로의 분화로 이 추가 세포 유형의 도입을 허용할 것이며, 이에 의하여 개인화된 본성을 유지하면서 BBB의 향상된 복제본을 제공할 것이다.
IBMECs는 이전에 셀룰러 마커의 발현, TEER의 확립 및 유출 펌프의 기능적 활성을 포함하여 BBB 모델링에 중요한 다양한 특성을 입증하는 것으로 나타났다28,24,5. 그러나, 분자 분석은 이 세포가 또한 몇몇 상피마커15를발현한다는 것을 밝혔습니다. iBMEC 생성의 발전은 향상된 기능 및 내피 마커 발현을 나타내는 것으로, 최근에는29,30을기재하였다. 여기에 제시된 패러다임에 따라 이러한 잠재적으로 개선된 셀은 향후 응용을 위해 BBB 칩 모델에 쉽게 통합될 수 있습니다. 여기에 설명된 유연하면서도 견고한 플랫폼은 질병 모델링과 새로운 CNS 약물의 개발 및 평가를 촉진할 수 있습니다.
이 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 특정 제품에 의존하지만, 추가적인 상용 기업은 다양한 미생물 학적 플랫폼을 제공하며, 이는 대체 이점을 제공할 수 있다31. 또한, 미세유체 오르간 칩의 "사내" 제조를 위한 프로토콜도32로 제공되며, 여기에 사용되는 플랫폼에서 누락된 TEER전극(17)의통합을 포함하여 더 많은 모듈성을 제공할 수 있다.
장기-온칩은 현재 세포 배양체(33)의 생리적맥락을 개선하기 위한 대안적 접근법으로 도입되었다. 그러나, 이 기술의 적용은 생물학 지향적인 실험실에서 수시로 결여되는 전문화한 공학 기술을 요구합니다. 여기에 사용되는 칩 플랫폼과 같이 상용 칩 플랫폼은 모듈성을 높이고 견고성과 재현성을 높여 더 넓은 사용자 배열에 의해 적용될 수 있습니다. 또한, 미세 유체 칩에 층류 흐름의 응용 프로그램은 복잡성의 또 다른 수준을 도입 주사기 또는 연동 펌프의 응용 프로그램에 의존한다. 이 장애물은 이제 여러 칩의 동시 관류를 용이하게 배양 모듈의 응용 프로그램과 함께 극복하기 쉽습니다.
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Disclosures
시더스-시나이는 연구의 미세 유체 기관 칩을 생산하는 회사인 에뮬레이트(Emulate)에 소수 주식 지분을 소유하고 있습니다. 시더스-시나이의 임원은 에뮬레이트 이사회에서 근무하고 있습니다. 에뮬레이트는 이 연구에 대한 재정적 지원을 제공하지 않았습니다. 시더스-시나이와 에뮬레이트는 이 작품과 관련된 특허를 출원했습니다.
Acknowledgments
중요한 편집에 대해 소샤나 스벤센 박사님께 감사드립니다. 이 작품은 이스라엘 과학 재단 보조금 에 의해 지원되었다 1621/18, 과학 기술부 (MOST), 이스라엘 3-15647, 재생 의학 교부금 ID ID1-08800, 셔먼 가족 재단, NIH-NINDS 교부금 1UG3NS105703, 및 ALS 협회 보조금 18-SI-389. AH는 발렌베르크 재단(교부금 번호 2015.0178)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | EMD Millipore | SCR005 | Dissociation solution |
| B27 | Gibco | 12587010 | |
| Bfgf | Peprotech | 100-18B | |
| Chip-S1 | Emulate Inc | Chip-S1 | Organ-Chip |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| Dextran-FITC | Sigma | 46944 | |
| DMEM: F12 | Thermo Fisher Scientific | 31330038 | |
| Donkey serum | Sigma | D9663 | |
| Emulate Reagent 1 (ER-1) | Emulate Inc | ER-1 | |
| Emulate Reagent 2 (ER-2) | Emulate Inc | ER-2 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako | Z0334 | |
| GLUT-1 | Invitrogen | MA5-11315 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050038 | Glutamine supplement |
| hBDNF | Peprotech | 450-02 | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| mTeSR1 | StemCell Technologies, Inc. | 85851 | |
| NEAA | Biological industries | 01-340-1B | |
| Nestin | Millipore | MAB353 | |
| NutriStem | Biological industries | 05-100-1A | Alternate media |
| PECAM-1 | Thermo Fisher Scientific | 10333 | |
| Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP) | Biomedical Technologies | J64483AB | |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | |
| S100β | Abcam | ab6602 | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | SCGP00525 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| ZO-1 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 33-9100 | |
| βIII-tubulin (Tuj1α) | Sigma | T8660 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350010 |
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