Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

جيل من iPSC الإنسان القائم على الدم في الدماغ حاجز رقاقة

Published: March 2, 2020 doi: 10.3791/60925
Automatic Translation
1,2,3, 4, 5,6, 4, 1,2,3
1The Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, 2The Regenerative Medicine and Stem Cell (RMSC) Research Center, Ben-Gurion University of the Negev, 3The Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, 4The Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 5Division of Micro and Nanosystems, KTH Royal Institute of Technology, 6AIMES, Department of Neuroscience, Karolinska Institutet

Summary

حاجز الدم في الدماغ (BBB) هو وحدة متعددة الخلايا العصبية الوعائية تنظم بإحكام التوازن الدماغي. من خلال الجمع بين iPSCs الإنسان والتكنولوجيات الجهاز على رقاقة، قمنا بتوليد رقاقة BBB شخصية، ومناسبة لنمذجة المرض وCNS التنبؤات اختراق المخدرات. يتم وصف بروتوكول مفصل لتوليد وتشغيل رقاقة BBB.

Abstract

يتشكل حاجز الدم في الدماغ (BBB) من وحدات الأعصاب الوعائية (NVUs) التي تحمي الجهاز العصبي المركزي (CNS) من مجموعة من العوامل الموجودة في الدم التي يمكن أن تعطل وظيفة الدماغ الحساسة. على هذا النحو ، فإن BBB هو عقبة رئيسية أمام تقديم العلاجات إلى الجهاز العصبي المركزي. تشير الأدلة المتراكمة إلى أن BBB يلعب دورًا رئيسيًا في ظهور وتطور الأمراض العصبية. وبالتالي، هناك حاجة هائلة لنموذج BBB التي يمكن التنبؤ بتغلغل الأدوية التي تستهدف الجهاز العصبي المركزي وكذلك توضيح دور BBB في الصحة والمرض.

لقد قمنا مؤخرًا بدمج تقنيات الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (iPSC) لتوليد شريحة BBB مخصصة تمامًا للبشر. تعرض هذه المنصة الجديدة الخصائص الخلوية والجزيئية والفسيولوجية المناسبة للتنبؤ بنقل الأدوية والجزيئات عبر BBB البشري. وعلاوة على ذلك، وباستخدام رقائق BBB الخاصة بالمريض، قمنا بتوليد نماذج من الأمراض العصبية وأظهرنا إمكانية تطبيقات الطب التنبؤي الشخصية. ويرد هنا بروتوكول مفصل يوضح كيفية توليد رقائق BBB المشتقة من iPSC، بدءا ً من تمايز الخلايا البوائية الدقيقة الوعائية المشتقة من iPSC في الدماغ (iBMECs) وينتج عنه ثقافات عصبية مختلطة تحتوي على السلف العصبية، الخلايا العصبية المتباينة، والخلايا الفلكية. كما وصف إجراء لزرع الخلايا في رقاقة الجهاز وزراعة رقائق BBB تحت تدفق laminar التي تسيطر عليها. وأخيراً، يتم تقديم أوصاف تفصيلية لتحليلات رقاقة BBB، بما في ذلك الاختبارات التفصيلية شبه الخلوية لتقييم نفاذية الدواء والجزيء وكذلك الطرق المناعية الكيميائية لتحديد تكوين أنواع الخلايا داخل الشريحة.

Introduction

BBB هو حاجز انتقائي للغاية يفصل الجهاز العصبي المركزي عن الدم المتداول. فهو يحمي وظائف الدماغ الحرجة من المواد والعوامل والمواد المدمرة المحتملة ، مع السماح أيضًا بتدفق العناصر الغذائية والأيض الأخرى المطلوبة للحفاظ على التوازن الدماغي1. وBBB هو NVU متعددة الخلايا التي pericytes، الخلايا الفلكية endfeet، والعمليات العصبية الاتصال مباشرة الدماغ الخلايا الفيوائية الدقيقة (BMECs). تسمح هذه التفاعلات لـ BMECs بتشكيل خصائص حاجز متخصصة مدعومة بتقاطعات ضيقة والتقيدية2و3. يحدد تشكيل هذا الحاجز مرور الجزيئات دون الخلايا ، ولكنه يحتوي على ناقلات مستقطبة لنقل الجزيئات بنشاط إلى الجهاز العصبي المركزي أو العودة إلى الدم1. بسبب هذه الخصائص الحاجز فريدة من نوعها، وBBB يشكل عقبة رئيسية أمام تسليم المستحضرات الصيدلانية الحيوية في الدماغ، ويقدر أن أقل من 5٪ من الجزيئات الصغيرة المعتمدة من ادارة الاغذية والعقاقير يمكن أن تصل إلى CNS4.

وقد استخدمت على نطاق واسع نماذج الحيوانات لدراسة BBB penetrance والآليات الجزيئية المشاركة في تطوير BBB5. في حين أن النماذج الحيوانية تمثل بأمانة الخلايا المتعددة المعقدة في بيئة الجسم الحي ، فإن الاختلافات في التعبير والنشاط من ناقلات BBB وكذلك خصوصية الركيزة عبر الأنواع غالبًا ما تحول دون الاستقراء الدقيق للبيانات الحيوانية للبشر6. وبالتالي، فإن النماذج القائمة على الإنسان حاسمة لدراسة BBB البشري وللاستخدام في تطوير الأدوية المصممة لاستهداف الجهاز العصبي المركزي. وتزداد هذه الحاجة وضوحا مع تزايد هيمنة العقاقير البيولوجية الخاصة بالإنسان في مجال التطوير الصيدلاني. تشير الأدلة المتراكمة إلى أن BBB للخطر يرتبط بعدد من اضطرابات الجهاز العصبي المركزي الحادة ، بما في ذلك أورام الدماغ والأمراض العصبية7،8،9. النماذج البشرية التي تعكس بأمانة هذه الأمراض لديها القدرة على حد سواء 1) تحديد مسارات جديدة التي يمكن أن تستهدف لتطوير المخدرات و 2) التنبؤ CNS penetrance، وبالتالي تقليل الوقت والموارد في الدراسات قبل السريرية وربما خفض معدل الفشل في التجارب السريرية.

وقد تم تنفيذ نماذج في المختبر على نطاق واسع لدراسة التفاعلات بين BMECs والخلايا الأخرى من NVU وإجراء شاشات للأدوية المحتملة BBB نفاذة10. لإعادة الجوانب الرئيسية للBBB الإنسان، يجب أن تظهر النماذج المختبرية في الخصائص ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية (أي نفاذية شبه خلوية منخفضة والمقاومة الكهربائية العابرة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية [TEER] عبر الطبقة الأحادية البطانية). وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن يتضمن التوصيف الجزيئي لنظام في المختبر التعبير عن نظم نقل وظيفية تمثيلية. عادة، تتكون النماذج المختبرية من الخلايا البطانية التي تشارك في الاستزراع على غشاء شبه نفاذ مع مجموعات من خلايا NVU الأخرى لتعزيز خصائص BBB11. يسمح هذا النهج بتقييم بسيط وسريع نسبيًا لوظائف العوائق ونفاذية الجزيء. ويمكن إنشاء نماذج BBB هذه القائمة على الخلايا مع مصادر الخلايا الحيوانية أو البشرية، بما في ذلك الخلايا المعزولة عن الختان الجراحي أو خطوط BMEC الخالدة.

في الآونة الأخيرة ، تم إدخال بروتوكولات للتمييز بين الخلايا البشرية متعددة القدرات في BMECs كمصدر جذاب لنماذج BBB البشرية في المختبر12،13. الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) المشتقة من BMECs (iBMECs) قابلة للتطوير بشكل كبير ، وتظهر الخصائص المورفولوجية والوظيفية الحاسمة لـ BBB البشري ، وتحمل علم الوراثة للمريض. في الثقافة ، تشكل iBMECs طبقة أحادية تعبر عن علامات التقاطع الضيقة وشاشات العرض في مجمعات التقاطع الضيقة الشبيهة بالجسم الحي. هذه الخلايا أيضا التعبير عن علامات BBB، بما في ذلك ناقل الجلوكوز BBB، نقل الجلوكوز 1 (GLUT1). الأهم من ذلك ، وعلى عكس مصادر الخلايا البديلة الأخرى لBMECs الإنسان ، iBMECs الحصول على خصائص الحاجز مع قيم عالية مثل تلك التي تقاس في الجسم الحي14، الاستقطاب على طول المحور البافولياني ، ومضخات efflux وظيفية صريحة. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام iPSCs من مختلف المواضيع على حد سواء 1) يرحب بفرصة لاختبار جوانب BBB بطريقة الطب الشخصي و 2) يوفر مصدرا مرنا لتوليد أنواع إضافية من الخلايا NVU. توليد هذه الخلايا من مصدر خلية isogenic لإنشاء رقائق BBB شخصية من شأنه أن يساعد أيضا في فهم الاختلافات بين الأفراد في استجابات المخدرات، وهو سبب رئيسي للمقاومة أو الاستجابة للخطر للعلاج لوحظ في الدراسات السريرية.

استخدام iBMECs كأحادية في طبق أو على إدراج transwell شبه نفاذية يمثل نهجًا قويًا لنمذجة BBB. وتميل هذه النظم إلى أن تكون قوية وقابلة للاستنساخ وفعالة من حيث التكلفة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن التحليلات الوظيفية مثل TEER ونفاذية بسيطة نسبيا ً. ومع ذلك ، تفشل الأنظمة ثنائية الأبعاد (2D) في تلخيص الطبيعة ثلاثية الأبعاد في الأنسجة العضوية ، وتفتقر إلى قوى إجهاد القص الفسيولوجية التي توفرها الدم المتداولو وخلايا الدم. وهذا يحد من قدرة بطانة الأوعية الدموية في هذه النماذج لتطوير والحفاظ على خصائص BBB الجوهرية والوظائف.

وقد تم تنفيذ أنظمة دقيقة تصطف من قبل الخلايا الحية لنموذج وظائف الجهاز المختلفة في مفهوم يسمى الجهاز على رقائق. من خلال إعادة إنشاء في الهندسة المعمارية متعددة الخلايا مثل الجسم الحي ، واجهات الأنسجة والأنسجة ، والبيئات الدقيقة الفيزيائية الكيميائية ، والتسريب الوعائي ، تولد هذه المنصات المجهرية مستويات من وظائف الأنسجة والأعضاء غير ممكن مع أنظمة الثقافة 2D التقليدية. كما أنها تمكن عالية الدقة، والتصوير في الوقت الحقيقي، وتحليل الملامح البيوكيميائية والوراثية والأيضية مماثلة للخلايا الحية في الأنسجة العضوية وسياق الجهاز. ومع ذلك ، فإن التحدي الخاص للجهاز على رقاقة هو أن تصميم وتصنيع وتطبيق هذه الرقائق الدقيقة يتطلب خبرة هندسية متخصصة تفتقر عادة إلى المختبرات الأكاديمية الموجهة بيولوجيا.

لقد قمنا مؤخرا الجمع بين iPSC والتكنولوجيات الجهاز على رقاقة لتوليد شخصية BBB رقاقة نموذج15،16. من أجل التغلب على التحديات التكنولوجية الموصوفة ، يتم استخدام Chip-S1 المتاحة تجاريًا مع وحدة الثقافة ، وهي أداة مصممة لأتمتة صيانة الرقائق بطريقة بسيطة وقوية (Emulate Inc.). تعيد رقاقة BBB التفاعلات بين الخلايا العصبية والخلايا الانبوبيلية وتحقق قيم TEER ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ، والتي تقاس برقائق الأعضاء المصنوعة خصيصًا مع أقطاب ذهبية متكاملة17. بالإضافة إلى ذلك ، تعرض رقاقة BBB نفاذية منخفضة دون خلوية ، وتستجيب للإشارات الالتهابية على مستوى الأعضاء ، وتعبر عن مضخات efflux نشطة ، وتعرض النقل التنبؤي للعلامات الحيوية القابلة للذوبان والمستحضرات الصيدلانية الحيوية. وتجدر الإشارة إلى أن رقائق BBB المتولدة من عدة أفراد تلتقط الاختلافات الوظيفية المتوقعة بين الأفراد الأصحاء والمرضى الذين يعانون من أمراض عصبية15.

يصف البروتوكول المفصل أدناه طريقة موثوقة وفعالة وقابلة للاستنساخ لتوليد رقائق BBB البشرية المستندة إلى iPSC في ظل ظروف التدفق الديناميكي. وتقدم إرشادات بشأن نوع التحاليل وتحاليل نقاط النهاية التي يمكن إجراؤها مباشرة في رقاقة BBB أو من النفايات السائلة لأخذ العينات. وهكذا، يبين البروتوكول مجموعة التقنيات التي يمكن تطبيقها لتقييم الخصائص والاستجابات البيولوجية والوظيفية في نموذج ذي صلة بالإنسان.

يتم تقديم وصف موجز لشريحة BBB المستندة إلى iPSC هنا. يتم تمييز iPSCs الإنسان في البداية ونشرها في قوارير زراعة الأنسجة كمجاميع عائمة حرة من السلف العصبية ، ويسمى EZ- المجالات. القناة العليا من رقاقة-S116,18,19 هو المصنف مع المنفصلة EZ-المجالات التي تشكل "الجانب الدماغي" من رقاقة, كما الخلايا التفريق على مدى 7 أيام في ثقافة مختلطة من الخلايا السلف العصبية (iNPCs), iAstrocytes, وiNeurons. كما يتم تمييز iPSCs الإنسان في لوحات زراعة الأنسجة في iBMECs. يتم بذر القناة السفلية للرقاقة مع iBMECs لتشكيل "جانب الدم" لأنها تتطور لتشكيل أنبوب الفيوثيوليلي(الشكل 1). يسمح الغشاء المطلي بالمصفوفة خارج الخلية المسامية (ECM) الذي يفصل بين القنوات العلوية والسفلية 1) بتكوين تفاعلات بين الخلية وبين القنوات و2) يسمح للمستخدم بتشغيل المقالات الدقيقة وخلايا الصور في أي من القناة باستخدام مجهر الضوء التقليدي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1- توليد خلايا السلف العصبي المستمدة من المركز الدولي للحماية من الحماية (iNPCs)

  1. إنتاج EZ-المجالات من مستعمرات iPSC كما هو موضح أدناه وكما نشرت سابقا20،21،22.
    1. المستعمرات iPSC الثقافة إلى التقاء على غشاء الطابق السفلي مصفوفة المغلفة 6 لوحات بئر (0.5 ملغ / لوحة) في mTESR1 أو وسائل الإعلام التجارية الأخرى (انظر جدول المواد).
    2. إزالة iPSC المتوسطة واستبدالها مع 2 مل من المنطقة EZ المتوسطة [ESM; DMEM: F12 7:3 تكملمع 100 نانوغرام / مل عامل نمو الليفية الأساسية (bFGF), 100 نانوغرام/مل عامل نمو البشرة, 5 ميكروغرام/مل الهيبارين, و 2% B27 الملحق].
    3. كشط الجزء السفلي من كل متشنج جيدا مع الجزء الخلفي من طرف ماصة معقمة 1000 ميكرولتر أو مكشطة الخلية.
    4. جمع جميع الخلايا ووضعها في القارورة T25 المرفق منخفضة للغاية للسماح بتشكيل عفوية من المجالات العائمة الحرة. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
    5. تغذية المجالات كل 2-3 أيام عندما يتحول الوسط إلى اللون الأصفر عن طريق استبدال نصف المتوسط مع ESM الطازجة. وهذا يسمح للمجالات أن تبقى في وسط مشروط، وهو أمر مهم للغاية لنموها وصيانتها.
      1. انحني بالقارورة على رف أنبوب واسمح للمجالات بالاستقرار بالجاذبية لمدة 1-2 دقيقة إلى زاوية القارورة.
      2. مرة واحدة استقر, تستنشق نصف supernatant مع 5 مل أو 10 مل ماصة المصلية واستبدالها الطازجة, ESM ما قبل الحارة.
    6. مرور EZ-المجالات أسبوعيا عن طريق تقطيع المجالات إلى 200 ميكرون أقطار كما سبقوصفها 23،20،21. يمكن الحفاظ على مجالات EZ لمدة تصل إلى 25 مقطعًا وهي مثالية عند استخدامها بين الممرات 8-25.
  2. إعداد تعليق خلية واحدة من iNPCs:
    1. للحث على التمايز العصبي، فصل EZ-المجال في خلايا واحدة.
    2. جمع المجالات 3-4 أيام بعد التقطيع من قارورة T75 ونقلها إلى مخروطية 15 مل، ثم السماح لها بالوقوف لمدة 2 دقيقة أو حتى يتم تسوية جميع المجالات في الجزء السفلي.
    3. إزالة ESM ببطء مع ماصة 5 مل دون تعطيل المجالات المستقرة. إضافة 1 مل من حل الانفصام (انظر جدول المواد)واحتضان لمدة 10 دقيقة في 37 درجة مئوية.
    4. دوامة حل التفكك والمجالات بعد 5 دقيقة من الحضانة لضمان أن يتم التعامل مع أي مجالات مستقرة.
    5. إزالة ببطء حل التفكك. إضافة 1 مل من الوسط التمايز العصبي [NDM; DMEM: F12 مع 2% B27 ناقص فيتامين A, 1% N2 الملحق, وعامل التغذية العصبية المستمدة من الدماغ البشري (hBDNF, 20 نانوغرام/مل)].
    6. تثّيّر المجالات في خلايا مفردة عن طريق الأنابيب باستخدام ماصة 1 مل متبوعة بـ 200 ميكرولتر، حتى تنفصل جميع المجالات. تجنب تشكيل فقاعة أثناء إجراء الترجيط.
    7. عد الخلايا المنفصلة باستخدام مقياس الهيوسيد وخلايا تمييع إلى كثافة نهائية من 1 × 106 خلايا / مل. من الممكن تغيير الكثافة اعتمادًا على التطبيق.
      ملاحظة: يوصى بكثافات أعلى (تصل إلى 6 × 106 خلايا/مل) للثقافات قصيرة الأجل تصل إلى 3 أيام، ويوصى بكثافات أقل للتطبيقات طويلة الأجل تصل إلى 3 أسابيع.
      ملاحظة: الخلايا الآن على استعداد للبذور في القناة العليا للرقاقة لتشكيل "الجانب الدماغ".

2- تمايز الـ iPSCs في مراكز iBMECs

  1. مرور iPSCs من بئر واحد confluent من لوحة بئر 6 في نسبة 1:6 إلى 6 غشاء غشاء الطابق السفلي لوحة مغلفة جيدا. اسمحوا الخلايا الانضمام لمدة 24 ساعة تغيير iPSC المتوسطة يوميا.
  2. عد الخلايا يوميا باستخدام مقياس الهيموكيتومتر.
  3. عندما تصل الخلايا إلى كثافة 1.5-3.0 × 105 خلايا / جيد ، استبدل وسيط iPSC بـ 3 مل من الوسط غير المكيف دون bFGF [DMEM: F12 1:1 ، مع استبدال مصل خروج المغلوب بنسبة 10٪ (KOSR) ، 1٪ الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA) ، 0.5٪ مكمل الجلوتامين(جدول المواد)، و 100 ميكرومتر α-mercapto استبدال المتوسطة يوميا لمدة 6 أيام24.
  4. في اليوم 6، استبدال المتوسطة مع الخلية البذادية (EC) المتوسطة [الإنسان الانبوبي الفيذيلي الحرة المتوسطة (hESFM) تستكمل مع 1٪ الصفائح الدموية الفقيرة البلازما المشتقة من المصل البقري، 20 نانوغرام / مل bFGF، و 10 ميكرومتر حمض الريتينويك جميع عبر (RA)]. اترك الوسط لمدة يومين.
  5. إزالة EC المتوسطة وإضافة 1 مل من حل التفكك في البئر. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 35 دقيقة.
    ملاحظة: في حين أن هذا يعتبر وقتا ً طويلاً للحضانة في محلول التفكك المستخدم هنا، يمكن أن تتحمل iBMECs هذا العلاج مع صلاحية الخلية أعلى من 90٪.
  6. فصل الخلايا من البئر عن طريق الأنابيب بلطف تعليق الخلية وجمع جميع الخلايا في أنبوب مخروطي 15 مل.
    ملاحظة: تجنب الأنابيب القاسية. إذا لم تنفصل الخلايا بسهولة، فقم باحتضانها لمدة 5 دقيقة إضافية.
  7. إضافة 1 حجم من وسط EC إلى مخروطية 15 مل لتعطيل Accutase، والطرد المركزي في 200 × ز لمدة 5 دقيقة، وإزالة المتوسطة، واستبدال مع 1 مل من وسط الجماعة الأوروبية (دون bFGF وRA).
  8. عد الخلايا باستخدام مقياس الهيوكتومتر وضبط كثافة الخلايا إلى 14-20 × 106 خلايا / مل.
    ملاحظة: الخلايا الآن جاهزة للبذر في القناة السفلية للرقاقة لتشكيل "جانب الدم".

3. microfabrication من رقاقة الجهاز

  1. استخدام رقاقة الجهاز لنموذج رقاقة BBB وإنتاجها كما فعلت سابقا16،18،19. رقاقة الجهاز قناة طويل القامة (انظر جدول المواد)هو ملفقة من البوليديميثيلسيلوكسان مرنة للغاية (PDMS) elastomer الذي يحتوي على اثنين من القنوات الصغيرة فرضه وموازية مفصولة غشاء مسامية مرنة. أحجام القنوات الصغيرة العلوية والسفلية هي 1 مم × 1 مم و 1.0 مم × 0.2 مم، على التوالي. يتم فصل القناتين بواسطة غشاء مسامي مرن من صنع PDMS بسماكة 50 ميكرومتر، يحتوي على مسام قطرها 7 ميكرومتر مع تباعد 40 ميكرومتر. تبلغ مساحة الغشاء المسامي الذي يفصل القنوات 0.171 سم2.

4. إعداد رقاقة

  1. يتم توفير رقائق الجهاز المعبأة مسبقا داخل الناقل رقاقة، مما يلغي الحاجة إلى إزعاج أو تشويه محاذاة رقاقة أثناء التعامل معها. بالإضافة إلى ذلك، يتصل حامل الشريحة بشكل آمن بوحدة محمولة ("Pod") تعمل كواجهة بين وحدة الثقافة والشريحة.
    1. رش التعبئة والتغليف من رقائق مع الإيثانول 70٪ وجلب إلى مجلس الوزراء السلامة البيولوجية (BSC).
    2. فتح التعبئة والتغليف ووضع رقاقة الجهاز في طبق بيتري معقمة. التعامل مع الناقل رقاقة فقط من قبل الجانبين لتجنب الاتصال المباشر مع رقاقة.
    3. تأكد من أن علامة التبويب الناقل تواجه إلى اليمين(الشكل 2)، وعند استخدام رقائق متعددة ، ومحاذاتها جميعا في نفس الاتجاه.
    4. تسمية كل شريحة على علامة التبويب الناقل (يتم عرض إعداد رقاقة كاملة وسير العمل في الشكل 3).

5. تنشيط السطح وطلاء ECM

  1. إعداد حل تنشيط السطح
    1. محاكاة كاشف 1 (ER-1)، المقدمة في قارورة تحتوي على 5 ملغ، حساسة للضوء. إعداد حل ER-1 جديد مباشرة قبل الاستخدام. سلامة ER-1 أمر بالغ الأهمية في الإعداد الناجح للرقائق.
    2. قم بإيقاف تشغيل الضوء في BSC عند التعامل مع ER-1.
      ملاحظة: ER-1 هو مهيج للعين ويجب التعامل معها في BSC مع القفازات المناسبة وحماية العين.
    3. اسمح للكواشف ER-1 و ER-2 بالتوازن إلى درجة حرارة الغرفة (RT) قبل الاستخدام.
    4. حماية الحل من الضوء عن طريق التفاف أنبوب مخروطي معقم فارغ 15 مل مع احباط.
    5. في BSC، اضغط لفترة وجيزة على قارورة ER-1 لتسوية المسحوق في الأسفل.
    6. أضف 1 مل من المخزن المؤقت ER-2 إلى القارورة، ونقل محتواها على الفور إلى الجزء السفلي من الأنبوب المخروطي الملفوفة 15 مل. لا ماصة لخلط. لون الحل المنقول إلى أنبوب مخروطي اللون سيكون أحمر.
    7. كرر الخطوة 5.1.6 3x. في الجولة الأخيرة، قم بتغطية قارورة ER-1 وعكسها لجمع أي مسحوق متبقي من الغطاء، ثم قم بنقل المحلول إلى الأنبوب المخروطي؛ هذا سوف يصل الحجم الإجمالي إلى 4 مل من حل ER-1.
    8. أضف 6 مل من محلول ER-2 إلى محلول ER-1 4 مل في الأنبوب المخروطي 15 مل إلى تركيز نهائي قدره 0.5 ملغم/مل. يجب حل ER-1 بالكامل ضمن حل ER-2.
  2. تنشيط السطح
    1. استخدام ماصة P200 وطرف ماصة مصفاة 200 ميكرولتر معقم، يستغرق 200 ميكرولتر من خليط ER-1.
    2. ضع الماصة في الجزء السفلي من التهول وادفع 20 ميكرولتر من خليط ER-1 من خلال القناة السفلية حتى يبدأ الخليط في التدفق من منفذ القناة السفلي.
    3. أضف ما يقرب من 50 ميكرولتر من خليط ER-1 ووضعه في مقبل القناة العلوية. ادفع الخليط من خلال القناة العلوية حتى يبدأ في التدفق من منفذ القناة العلوي.
    4. إزالة جميع خليط ER-1 الزائدة من سطح الشريحة عن طريق الطموح لطيف. تأكد من إزالة خليط ER-1 فقط من سطح الشريحة وليس من القنوات.
    5. تحقق من خلو القنوات من فقاعات الهواء قبل تنشيط الأشعة فوق البنفسجية(UV). إذا تم الكشف عن فقاعات الهواء، وإزالة فقاعات عن طريق غسل القناة مع خليط ER-1.
    6. ضع الطبق المفتوح الذي يحتوي على الرقائق في صندوق الأشعة فوق البنفسجية (مقدمة من شركة Emulate Inc.).
    7. قم بتعيين المفتاح الموجود في الجزء الخلفي من مربع الأشعة فوق البنفسجية إلى الإعداد "متناسق". قم بتشغيل الطاقة وبدء تنشيط الأشعة فوق البنفسجية. ترك رقائق تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 دقيقة.
      ملاحظة: تجنب تعرض الموظفين للأشعة فوق البنفسجية.
    8. إزالة خليط ER-1 من كلتا القناتين.
    9. غسل كل قناة مع 200 ميكرولتر من محلول ER-2.
    10. إزالة ER-2 من كلتا القناتين.
    11. Wash each channel with 200 μL of sterile cold Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS).
    12. ترك DPBS الباردة داخل القنوات حتى المتابعة إلى الخطوة التالية.
  3. إعداد وطلاء مصفوفة خارج الخلية (ECM)
    1. إعداد حل ECM من خلال الجمع بين مكونات ECM الفردية مع DPBS الباردة، والمياه، أو غيرها من المذيبات إلى تركيزات العمل النهائي. يجب إعداد حل ECM طازجًا في كل مرة يتم استخدامها.
    2. معطف كل من القنوات العلوية والسفلية من رقاقة مع ECM، مع تكوين كما يحددها نوع الخلية لتكون المصنف. يجب الحفاظ على خليط ECM على الجليد حتى الاستخدام.
    3. استخدام اللامينين (50 ميكروغرام / مل) لمعطف "الجانب الدماغي"، والكولاجين الرابع والليفينكتين مختلطة بنسبة 4:1 (320:80 ميكروغرام/مل) لمعطف "الجانب الدم" كما هو موضح في القسم 5.6.
  4. إعداد aliquots ECM
    1. تمييع 1 ملغ/مل لامينين في DPBS الباردة إلى تركيز نهائي قدره 50 ميكروغرام/مل. Aliquot وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    2. حل الكولاجين الرابع في 0.1٪ حمض الخليك إلى تركيز 1 ملغ / مل. احتضان الحل في 2-8 درجة مئوية بين عشية وضحاها أو في RT لمدة 1-3 ساعة أو حتى تذوب تماما.
    3. إعداد خليط 1 مل من الكولاجين الرابع: ليفينكتين (320 ميكرولتر من الكولاجين الرابع، 80 ميكرولتر من الليفينكتين، 600 ميكرولتر من العقيمة مزدوجة المقطر H2O). يمكن تخزين الخليط عند -20 درجة مئوية.
  5. طلاء الرقائق مع ECM
    1. يستنشق تماما DPBS الباردة من كلتا القناتين. تعيين P200 ماصة لاتخاذ ما يصل 100 ميكرولتر من الكولاجين الرابع: محلول ليفينكتين.
    2. تقديم الحل من خلال منفذ القناة السفليحتى يتم وضع قطرة صغيرة على منفذ. اترك قطرة صغيرة على المنصّة بعد إزالة طرف الماصة.
    3. تقديم حل لامينين من خلال منفذ القناة العلوية حتى يتم وضع قطرة صغيرة على المنفذ. اترك قطرة صغيرة على المنصّة بعد إزالة طرف الماصة.
    4. انظر عن كثب إلى القنوات لضمان عدم وجود فقاعات. إذا كانت الفقاعات موجودة، اغسل القناة بحل ECM المناسب حتى تتم إزالة جميع الفقاعات.
    5. كرر الخطوات 5.5.1-5.5.4 لكل شريحة.
    6. أضف 1.5 مل من DPBS إلى غطاء أنبوب مخروطي 15 مل. ضع غطاء DPBS في طبق الثقافة 150 مم مع الرقائق لتوفير رطوبة إضافية وختم الطبق بالبارافيلم. للحصول على أفضل النتائج، احتضان رقائق في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، يمكن أن تزرع الخلايا في نفس اليوم كما تفعيل رقاقة وطلاء ECM، على الرغم من أن الحضانة بين عشية وضحاها هو المفضل. رقائق يمكن أن تكون جاهزة للبذر 4 ساعة بعد إضافة رقائق ECM واحتضان في 37 درجة مئوية.

6. بذر قناة "جانب الدماغ" والتمييز بين مجالات EZ في الثقافات العصبية المختلطة

  1. أحضر الطبق الذي يحتوي على الرقائق المعدة إلى BSC. غسل بلطف كلا القناتين مع 200 ميكرولتر من NDM.
  2. تجنب الاتصال مع الموانئ، واستنشاق بعناية قطرات وسائل الإعلام الزائدة من سطح الشريحة. هياج بلطف تعليق الخلايا قبل البذر كل رقاقة لضمان تعليق خلية متجانسة
  3. البذر iNPCs في القناة العليا لتوليد "الجانب الدماغ"
    1. البذور الخلايا (1 × 106 خلايا / مل) في القناة العليا للرقاقة. أضف طرف P200 يحتوي على 30-100 ميكرولتر من تعليق الخلايا إلى مقدمة القناة العلوية وحرر الطرف برفق من الماصة. اتخاذ فارغة P200 ماصة، والاكتئاب المكبس، إدراج في منفذ القناة العليا وسحب بعناية تعليق الخلايا واحدة من خلال رقاقة.
    2. تغطية الطبق ونقلها إلى المجهر للتحقق من كثافة البذر والتوزيع المتجانس للخلايا داخل القناة العليا. قم بإزالة طرف الماصة برفق من منافذ الدخول والمنفذ للشريحة.
    3. يجب أن تظهر كثافة البذر كتغطية بنسبة 20٪. إذا كانت كثافة البذر أعلى أو أقل من المتوقع أو غير متساوية، أعد الرقائق إلى BSC، واغسل القناة 2x بـ 200 ميكرولتر من المتوسط الطازج، وكرر الخطوة 6.3.1.
    4. بعد التأكد من كثافة الخلية الصحيحة، ضع على الفور رقائق في الحاضنة لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية بعد البذر كل دفعة من رقائق. غسل الخلايا التي لا نعلق مع NDM الطازجة.
    5. الحفاظ على الخلايا تحت ظروف ثابتة في 37 درجة مئوية مع استبدال NDM يوميا لمدة 48 ساعة على الأقل قبل بدء تدفق. يمكن أن تكون بذر iBMECs بعد iNPCs قد تعلق أو في يوم لاحق بعد البذر iNPC.

7. البذر iBMECs في القناة السفلية لتوليد "جانب الدم"

  1. أحضر الطبق الذي يحتوي على الرقائق المعدة إلى BSC. غسل بلطف القناة السفلية مع 200 ميكرولتر من وسط EC.
  2. تجنب الاتصال مع الموانئ، وشقوق بعناية قطرات من وسط EC الزائدة من سطح الشريحة، مع التأكد من ترك المتوسطة في كلتا القناتين. تحريك بلطف تعليق الخلية قبل البذر كل رقاقة لضمان تعليق خلية متجانسة.
  3. باستخدام ماصة P200، قم بوضع 30-100 ميكرولتر من تعليق الخلايا iBMEC (14-20 × 106 خلايا/مل) ووضع الطرف في مقبل القناة السفلية. افصل الطرف برفق عن الماصة، تاركًا الطرف الذي يحتوي على الخلية في منفذ المنفذ.
  4. الاكتئاب المكبس على P200 ماصة مع طرف فارغ، إدراج في منفذ القناة السفلي، وسحب بعناية تعليق خلية واحدة من خلال القناة السفلية عن طريق الإفراج ببطء المكبس ماصة.
  5. اسشق تعليق الخلايا الزائدة من سطح الشريحة. تجنب الاتصال المباشر مع منافذ الدخول والمنفذ لضمان عدم استنشاق أي تعليق للخلايا خارج القنوات.
  6. تغطية رقاقة ونقلها إلى المجهر لمراقبة كثافة البذر. يجب ملء القناة السفلية مع عدم وجود فجوات ملحوظة بين الخلايا عند ملاحظتها عند 4x أو 10x تحت المجهر(الشكل 4).
  7. إذا كانت كثافة البذر أقل من تغطية 90٪ أو موزعة بشكل غير متساوٍ، فقم بضبط كثافة الخلايا وفقًا لذلك وكرر الخطوات 7.2-7.6 حتى يتم تحقيق الكثافة الصحيحة داخل القناة. بعد التأكد من كثافة الخلية الصحيحة(الشكل 4)،خلايا البذور في رقائق المتبقية. لإرفاق الخلايا على الغشاء المسامي ، الذي يقع في الجزء العلوي من القناة السفلية ، عكس كل رقاقة والراحة في مهد رقاقة.
  8. ضع خزانًا صغيرًا (15 مل غطاء أنبوبي مخروطي يحتوي على DPBS معقم) داخل الطبق عيار 150 مم لتوفير الرطوبة للخلايا. رقائق احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعة تقريبا، أو حتى الخلايا في القناة السفلية قد تعلق. مرة واحدة وقد تعلق iBMECs (~ 3 ح بعد البذر)، والوجه رقائق مرة أخرى إلى وضع تستقيم للسماح مرفق الخلية إلى الجزء السفلي من القناة السفلية.

8- بدء التدفق

  1. وعادة ما يبدأ تدفق 48 ساعة بعد البذر من iBMECs. هذا الوقت مطلوب لiBMECs لإرفاق بحزم إلى رقاقة.
  2. للحفاظ على تدفق اللاصف من خلال رقاقة، من المهم أن degas وequilibrate درجة حرارة الوسط. يجب أن تكون متوسطة مسبقا ً في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
  3. يمكن إزالة الغازات حتى 50 مل من المتوسطة الدافئة عن طريق الحضانة تحت نظام ترشيح يحركه التفريغ لمدة 15 دقيقة.
  4. فتيلة من وحدات المحمولة
    1. قم بتعقيم الجزء الخارجي من عبوة الوحدة المحمولة والصواني باستخدام الإيثانول بنسبة 70٪ والمسح والنقل إلى BSC. افتح الحزمة ووضع الوحدات النمطية في الدرج. توجيهها مع الخزانات نحو الجزء الخلفي من الدرج.
    2. ماليت 3 مل من وسائل الإعلام الدافئة قبل التوازن إلى كل خزان للداخل. إضافة EC ثقافة المتوسطة إلى خزان الدخول من القناة السفلية وNDM إلى خزان القناة العلوية من القناة العليا(الشكل 5).
    3. ماصة 300 ميكرولتر من وسائل الإعلام الدافئة قبل التوازن إلى كل خزان منفذ، مباشرة فوق كل منفذ(الشكل 5).
    4. ضع ما يصل إلى ست وحدات محمولة على كل صينية. جلب الصواني إلى الحاضنة والانزلاق تماما في وحدة الثقافة مع مقبض علبة تواجه الخارج.
    5. حدد دورة "Prime" وتشغيلها على وحدة الثقافة. إغلاق باب الحاضنة والسماح لوحدة الثقافة لرئيس وحدات المحمولة (يأخذ ~ 1 دقيقة). يتم إكمال دورة الفتيل ة عندما يقرأ شريط الحالة "جاهز". قم بإزالة الدرج من وحدة الثقافة وإحضاره إلى BSC.
    6. تحقق من أن الوحدات النمطية المحمولة تم إعدادها بنجاح عن طريق فحص الجانب السفلي من كل وحدة نمطية محمولة في BSC. ابحث عن وجود قطرات صغيرة في جميع المنافذ الأربعة.
      1. إذا لم تظهر أي وحدة نمطية محمولة قطرات، أعد تشغيل دورة الوزراء على تلك الوحدات. إذا كان أي وسائل الإعلام مقطر على الدرج (وهذا قد يحدث في كثير من الأحيان من قبل منافذ منفذ)، علبة نظيفة مع الإيثانول 70٪.
  5. توصيل الرقائق بالوحدات المحمولة والتنظيم وبدء التدفق
    1. غسل بلطف كل من قنوات كل رقاقة مع دافئة، وتوازنها خلية محددة وسيطة ثقافة لإزالة أي فقاعات ممكنة في القناة ووضع قطرات صغيرة من وسائل الإعلام (وفقا لوسائل الإعلام في القناة) على الجزء العلوي من كل منفذ منفذ ومنفذ.
    2. أدخل رقائق مع حاملات في وحدات المحمولة ووضع ما يصل إلى ستة على كل علبة. إدراج الصواني في وحدة الثقافة. برنامج الظروف المناسبة ثقافة رقاقة الجهاز (معدل التدفق وتمتد) على وحدة الثقافة.
    3. ستبدأ الشروط المبرمجة بمجرد اكتمال دورة "التنظيم".
      ملاحظة: يمكن التحكم في معدلات التدفق لكل قناة بشكل مستقل ويمكن تعيينها إلى معدلات تتراوح بين 0-1000 ميكرولتر/ساعة. عادة ما يتم استزراع شريحة BBB بمعدل 30 ميكرولتر/ساعة. عندما تتدفق الوسائط مثل وسائل الإعلام الأوروبية أو ESM عند 30 ميكرولتر / ساعة و 1000 ميكرولتر / ساعة ، فإن قوى القص هي 0.01 dyn /cm2 و 0.33 dyn/cm2، على التوالي.
    4. تشغيل دورة "تنظيم"، الذي يأخذ ما يقرب من 2 ساعة، وبعد ذلك سوف تبدأ وحدة الثقافة تدفق في ظروف ثقافة رقاقة الجهاز مسبقا.

9- تقييم نفاذية ما لا الخلايا من الدم إلى الدماغ

  1. إعداد NDM تستكمل مع 10 ميكروغرام / مل dextran-FITC (4 كيلو دا). سيتم استخدام هذا الحل كمدخل لقناة "جانب الدم".
  2. ملء خزانات القناة السفلية من وحدات المحمولة مع NDM تكملها dextran-FITC. ملء خزانات القناة العلوية مع NDM دون التتبع.
  3. يُفشي كل من القنوات العلوية والسفلية بمعدل تدفق 30 ميكرولتر/ساعة لمدة 4 ساعات على الأقل حتى تتراكم وسائط كافية لجمعها لتقييم الفلورسينس في قارئ الصفيحة (عادة 100 ميكرولتر).
  4. جمع عينات الوسائط من خزانات المدخلات والمخرجات في القنوات العلوية والسفلية. حماية العينات من الضوء.
  5. تمييع NDM بشكل متسلسل مع 10 ميكروغرام /mL dextran-FITC 1:1 باستخدام NDM بدون التتبع لتوليد منحنى معايرة 10-12 نقطة.
  6. خذ 100 ميكرولتر من كل عينة، بما في ذلك منحنى المعايرة، إلى لوحة بئر سوداء 96 واقرأ الفلورسينس باستخدام قارئ لوحة (485 نانومتر الإثارة، 530 نانومتر الانبعاثات).
  7. استخدم القيم المقاسة لحساب قيمتطبيق P على النحو التالي:

Equation 1

  1. أخذ القياسات اليومية لتقييم خصائص الحاجز والتأكد من أن رقاقة BBB لا تزال تعمل.

10- الكيمياء المناعية

  1. جلب رقائق لغطاء الدخان الكيميائية. باستخدام P200 ماصة، إصلاح الخلايا عن طريق الخوض في كل من القنوات مع 200 ميكرولتر من 4٪ paraformaldehyde (PFA) في DPBS واحتضان لمدة 10 دقيقة في RT.
  2. بعد التثبيت، يُفص كل قناة بـ 200 ميكرولتر من DPBS واحتضانها لمدة 5 دقيقة. كرر غسل DPBS 2x.
  3. كتلة وpermeabilize الخلايا على رقاقة عن طريق perfusing حل الحجب الأولية (PBS، تستكمل مع 5٪ مصل حمار عادي و 0.1٪ تريتون X-100). احتضان في RT لمدة 1 ساعة.
  4. تمييع الأجسام المضادة الأولية في محلول الحجب الأساسي واحتضانها بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. علامات BMECs هي GLUT-1 (1:100 تخفيف)، ZO-1 (1:300)، PECAM-1 (1:250; CD31) ، وVE - cadherin (1:200). العلامات العصبية هي αIII-tubulin (1:1000; Tuj1α) ، S100α (1:500) ، نستورين (1:1000) وGFAP (1:1000).
  5. غسل رقائق 3x مع DPBS الباردة.
  6. تمييع الأجسام المضادة الثانوية في محلول الحجب الثانوي (DPBS مع مصل حمار عادي بنسبة 5٪ بدون Triton-X).
  7. افرز محلول الأجسام المضادة الثانوي من خلال كلتا القناتين. عادة، يتم تخفيف الأجسام المضادة الثانوية الفلورية 1:1000. احتضان لمدة 1 ساعة في RT محمية من الضوء.
  8. غسل رقائق 3x مع DPBS.
  9. نواة الخلية وصمة عار عن طريق perfusing رقاقة مع 100 ميكرولتر من محلول DAPI. احتضان في RT لمدة 5 دقيقة.
  10. غسل رقائق 3x مع DPBS.
  11. الشريحة جاهزة للتصوير باستخدام إما مجهر فلوري مقلوب أو مقلوب. تسمح شفافية PDMS بالتصوير في شريحة الأعضاء السليمة. التكبير فوق 10x قد تتطلب أهداف مسافة العمل الطويل بسبب سمك رقاقة الجهاز.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الشكل 6A, B, C يمثل رقاقة BBB المصنفة مع EZ-spheres على القناة العلوية "الجانب الدماغي" وiBMECs على القناة السفلية "جانب الدم". تم بذر iBMECs أولاً وسمح لها بالتعلق بين عشية وضحاها ، وبعد ذلك تم بذر مجالات EZ. ثم تم استزراع الرقائق في ظل ظروف ثابتة مع استبدال الوسائط اليومية لمدة سبعة أيام. ثم تم إصلاح رقاقة BBB باستخدام 4٪ PFA في RT لمدة 10 دقيقة وغسلها 3x مع DPBS. تم إجراء الكيمياء المناعية على رقاقة BBB باستخدام 1) النستور كعلامة لخلايا السلف العصبية، 2) S100α أو GFAP كعلامات للخلايا الفلكية، و 3) αIII-tubulin كعلامة للخلايا العصبية. تم استخدام GLUT-1 و Pecam-1 كعلامة لBMECs. تم إجراء التصوير في 20x باستخدام المجهر البؤري وتمت معالجة الصور باستخدام فيجي لبرنامج ImageJ.

يمثل الشكل 6D مُقايسة نفاذية شبه خلوية تم إجراؤها على رقائق الأعضاء المأهولة بـ iBMECs وEZ-spheres، أو iBMECs وحدها (بدون مجالات EZ)، أو مجالات EZ وحدها (بدون iBMECs). بعد دورة "تنظيم"، تمت إضافة متتبع 4 KDa Dextran-FITC إلى خزان "جانب الدم" إلى تركيز نهائي قدره 10 ميكروغرام/مل، وتم غرس الرقائق عند 30 ميكرولتر/ساعة بين عشية وضحاها. بعد ذلك، تم جمع وسائل الإعلام من المكامن المهول ومنافذ من كل من القنوات العلوية والسفلية. تم جمع 100 ميكرولتر من كل عينة وفحصها بحثًا عن الفلورسينس باستخدام قارئ لوحة.

الأهم من ذلك، تم استخدام منحنى معايرة 1:1 لتحويل قيم الفلورسينس إلى قيم تركيز Dextran FITC. ثم تم استخدام القيم لحساب نفاذية (Pالتطبيق). وتبين هذه النتائج أن الـ iBMECs تشكل خصائص حاجز وظيفي، يتم تشديدها بشكل أكبر عندما يتم استزراع iBMECs بشكل مشترك مع مجالات EZ. رقائق مثقف مع EZ-المجالات فقط، تفشل في تشكيل حاجز. ويمكن استخدام نهج مماثل لفحص نقل أي جزيء عبر رقاقة BBB، اعتماداً على طريقة قياس متاحة (على سبيل المثال، الفلورسينس، ELISA، أو قياس الطيف الكتلي).

Figure 1
الشكل 1: التخطيطي لرقاقة BBB المستندة إلى iPSC. قبل البذر على الشريحة ، يتم تمييز iPSCs في لوحات الثقافة إلى (i) مجالات EZ (خلايا السلف العصبية ، iNPCs) ، والتي تزرع في التعليق كمجالات ، وإلى (2) خلايا البوائية الدقيقة الوعائية (iBMECs). يتم فصل المجالات EZ إلى خلايا واحدة، بذر على القناة العليا من رقاقة الجهاز، حيث أنها تفرق كذلك في الثقافات العصبية المختلطة لتشكيل "الجانب الدماغ". يتم بذر iBMECs في القناة السفلية من رقاقة الجهاز لتشكيل بنية تشبه الأوعية الدموية على "جانب الدم". يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التخطيطي للعرض العلوي للشريحة في حامل الشريحة، مع منافذ تحمل علامة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: مخطط انسيابي لإعداد رقاقة BBB وسير العمل المستندة إلى iPSC. مطلوب ما قبل التمايز من كل من الخلايا العصبية والطرفية من iPSCs قبل بدء سير العمل. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: بذر iBMECs في القناة السفلية. صور Brightfield من iBMECs المصنفة في القناة السفلية(A)مباشرة بعد البذر أو (B) 24 ح بعد البذر ، بعد أن تعلق الخلايا. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: التخطيطي للرقاقة المتصلة والوحدة المحمولة مع منافذ ومنافذ الخزانات الإعلامية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: النتائج التمثيلية. الكيمياء المناعية على رقاقة BBB المستندة إلى iPSC 7 أيام بعد البذر. EZ-المجالات متمايزة في مجموعة الخلايا العصبية المختلطة في أعلى "جانب الدماغ" قناة, بما في ذلك (A) S100α + (الأخضر) astrocytes, نستين + (أحمر) خلايا السلف العصبية وكذلك (B) GFAP + (الأحمر) الخلايا الفلكية وαIII-tubulin + (الأحمر) الخلايا العصبية. أشرطة المقياس = 200 ميكرومتر(C)iBMECs المصنفة في قناة "جانب الدم" السفلية التي أعرب عنها GLUT-1 و (أخضر) PECAM-1 (CD31، أحمر). مقياس شريط = 200 ميكرومتر . (D) تم إجراء تقييم نفاذية رقاقة BBB عن طريق إضافة dextran-FITC (4 كيلو دا) إلى خزان القناة السفلية. تظهر النتائج أن رقائق الأعضاء المبذرة مع iBMECs وEZ-spheres تعرض حاجزًا ضيقًا مقارنة برقائق الأعضاء المصنفة بـ iBMECs وحدها (*p < 0.05). رقائق الجهاز المزروعة مع مجالات EZ وحدها لا تعرض أي خصائص الحاجز (***p < 0.001; ANOVA في اتجاه واحد مع اختبار المقارنات متعددة Tukey). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

مزيج من تكنولوجيا الجهاز على رقاقة والخلايا المستمدة من iPSC في NVU يحمل وعدا لنمذجة دقيقة من BBB الإنسان. هنا ، نقدم بروتوكولًا مفصلًا للتطبيق البسيط والقوي لرقاقة BBB16التي تم نشرها مؤخرًا في iPSC. يتم عرض نظرة عامة وتوقيت نموذج البذر في الشكل 3. للحصول على وظائف الحاجز والحفاظ عليها التي هي مناسبة لنمذجة BBB ، وتوليد أحادية متجانسة iBMEC والحفاظ على سلامتها أمر بالغ الأهمية. الخطوة الأولى نحو توليد طبقة أحادية وظيفية تشمل التنشيط الكيميائي لسطح PDMS غير القطبي الذي يسمح بإرفاق بروتينات ECM. الكواشف تنشيط السطح تتحلل بسرعة عند إعادة تشكيل، والتي قد تؤدي في نهاية المطاف إلى التعلق دون الأمثل من الخلايا. لذلك من المهم الحفاظ على الكواشف الطازجة والمحمية من الضوء طوال العملية.

أثناء تنشيط الأشعة فوق البنفسجية (القسم 5.2)، يجب توزيع الكواشف بالتساوي داخل كل قناة من أجل تحقيق طلاء ECM ثابت ومرفق الخلية المتجانسة. تم تحسين تراكيب وتركيزات ECM المنصوص عليها في هذا البروتوكول إلى أنواع محددة من الخلايا(أي iBMECs وخلايا السلف العصبي المشتقة من المنطقة EZ). تغيير تكوين الخلية ممكن ولكن قد تتطلب ظروف ECM التفاضلية، والتي سوف تتطلب التحسين. بعد طلاء ECM، فمن الأهمية بمكان لiBMECs البذور بشكل صحيح. كثافة البذر عالية الخلية (> 14 × 106 خلايا / مل) أمر ضروري للحصول على طبقة أحادية كاملة. إذا فشل في تحقيق التقاء الخلية الكاملة، وينصح لزيادة كثافة تعليق الخلية تصل إلى 20 × 106 خلايا / مل أثناء البذر.

وكان قد اقترح سابقا تدفق Laminar لتعزيز نضوج iBMEC15 ولا غنى عنه لتحقيق المزايا التي توفرها منصة microfluidic. ومع ذلك ، يمكن للفقاعات الدقيقة المتدفقة عبر قنوات الشريحة الإجهاد البدني وفصل الخلايا المقيمة ، مما قد يؤدي إلى تدمير سلامة رقاقة BBB. لتجنب تشكيل الفقاعات الصغيرة أثناء تدفق اللاصف ، من الأهمية بمكان أن توازن الوسط قبل بدء التروية. ويتطلب المعادلة ما قبل الاحترار وإزالة الغاز عن الوسيلة قبل استخدامها.

وقد أمكن توليد رقائق شخصية باستخدام كل من iBMECs البشرية المشتقة من iPSC وiNPCs. في حين أن التمايز من iBMECs قصيرة وبسيطة إلى حد ما24،22، تمايز iPSCs في الخلايا العصبية21،25 هو أكثر تحديا. ومع ذلك ، يمكن استبدال الخلايا العصبية الموجودة في "الجانب الدماغي" للرقاقة بأي نوع من الخلايا العصبية ، مثل الخلايا العصبية الأولية أو الخلايا العصبية الحركية المشتقة من iPSC16. وعلى غرار الخلايا المنبوبية "الحسنة النية"، تعرض الخلايا الثيوبية اللدونة في التعبير الجيني استجابة لمختلف الثقافات العصبية المشتركة. وبالتالي، قد تؤدي هذه المرونة إلى تطوير NVUs مختلفة على الشريحة في المستقبل. ويمكن الحصول على مرونة إضافية للنظام عن طريق ضبط توقيت البذر الخلية والنظام. يمكن أن تكون بذر iBMECs قبل أو بعد الخلايا العصبية، مما يجعل من الممكن لiBMECs البذور مباشرة بعد البذر والتعلق من الخلايا العصبية، أو بعد EZ-المجالات قد تمايز في الثقافات العصبية أكثر نضجا في بيئة رقاقة. وهذا أمر ذو أهمية خاصة، بالنظر إلى الطبيعة غير الناضجة للخلايا العصبية المشتقة من iPSC. وبالنظر إلى أن المجالات EZ هي السلف العصبية في وقت مبكر، فترات التمايز أطول قد يؤدي أيضا إلى زيادة نسبة مئوية من الخلايا الفلكية والخلايا العصبية.

أحد المكونات المفقودة من البروتوكول هو pericytes المحيطية الوعائية ، والتي توفر مكونًا حاسمًا في NVU الفسيولوجي. التطورات الأخيرة في التمايز iPSCs إلى الخلايا مثل pericyte26،27 سوف تسمح بإدخال هذا النوع من الخلايا الإضافية ، وبالتالي توفير نسخة طبق الأصل محسنة من BBB مع الحفاظ على طبيعته الشخصية.

وقد سبق أن ثبت IBMECs لإثبات الخصائص المختلفة التي تعتبر حاسمة لنمذجة BBB بما في ذلك التعبير عن علامات الخلوية، وإنشاء TEER والنشاط الوظيفي للمضخات efflux28،24،5. ومع ذلك ، فقد كشفت التحليلات الجزيئية أن هذه الخلايا تعبر أيضًا عن العديد من العلامات الظهارية15. وقد وصفت مؤخرا التطورات في جيل iBMEC تظهر وظيفة محسنة والتعبير علامة البووإظهار البدالة29،30. باتباع النموذج المعروض هنا ، يمكن دمج هذه الخلايا التي يحتمل أن تكون محسنة بسهولة في نموذج رقاقة BBB للتطبيقات المستقبلية. قد تسهل المنصة المرنة والقوية الموصوفة هنا نمذجة الأمراض وتطوير وتقييم أدوية الجهاز العصبي المركزي الجديدة.

في حين أن هذا البروتوكول يعتمد على منتج محدد متاح تجاريًا ، فإن شركات تجارية إضافية تقدم منصات فسيولوجية جزئية متنوعة ، والتي قد توفر مزايا بديلة31. وبالإضافة إلى ذلك، بروتوكولات لتصنيع "في المنزل" من رقائق الجهاز microfluidic وتتوفر أيضا32 ويمكن أن تقدم المزيد من وحدات بما في ذلك التكامل من أقطاب TEER17، وهو مفقود من منصة تستخدم هنا.

تم إدخال الجهاز على رقائق كنهج بديل لتحسين السياق الفسيولوجي لثقافات الخلايا الحالية33. ومع ذلك، فإن تطبيق هذه التكنولوجيا يتطلب مهارات هندسية متخصصة، والتي غالبا ما تفتقر إلى مختبرات ذات توجه بيولوجي. توفر منصة الشرائح المتاحة تجاريًا ، مثل تلك المستخدمة هنا ، وحدات أقل وزيادة المتانة والاستنساخ ، والتي يمكن تطبيقها من قبل مجموعة أوسع من المستخدمين. علاوة على ذلك ، يعتمد تطبيق تدفق اللاصف على شريحة microfluidic على تطبيق الحقنة أو المضخات التمعّلية ، والتي تقدم مستوى آخر من التعقيد. هذه العقبة الآن أسهل للتغلب عليها مع تطبيق وحدة الثقافة ، مما يسهل الترويس المتزامن للرقائق متعددة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

تمتلك شركة سيدارس سيناي حصة من أسهم الأقلية في شركة "بوية"، وهي الشركة التي تنتج رقائق الأعضاء الميكروسائلية للدراسة. كما يعمل ضابط في سيدارس سيناي في مجلس إدارة شركة "ديديه". لم تقدم محاكاة أي دعم مالي لهذا البحث. سيدارس سيناء ومحاكاة لديها براءات الاختراع المقدمة المتعلقة بهذا العمل.

Acknowledgments

ونود أن نشكر الدكتورة سوشانا سفيندسن على التحرير النقدي. تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الإسرائيلية منحة 1621/18، ووزارة العلوم والتكنولوجيا (MOST)، إسرائيل 3-15647، ومعهد كاليفورنيا للطب التجديدي منحة ID DISC1-08800، ومؤسسة عائلة شيرمان، ومنحة NIH-NINDS 1UG3NS105703، ومنحة جمعية ALS 18-SI-389. تم تمويل AH من قبل مؤسسة والنبرغ (رقم المنحة 2015.0178).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accutase EMD Millipore SCR005 Dissociation solution
B27 Gibco 12587010
Bfgf Peprotech 100-18B
Chip-S1 Emulate Inc Chip-S1 Organ-Chip
Collagen IV Sigma C5533
DAPI Invitrogen D3571
Dextran-FITC Sigma 46944
DMEM: F12 Thermo Fisher Scientific 31330038
Donkey serum Sigma D9663
Emulate Reagent 1 (ER-1) Emulate Inc ER-1
Emulate Reagent 2 (ER-2) Emulate Inc ER-2
Fibronectin Sigma F1141
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Dako Z0334
GLUT-1 Invitrogen MA5-11315
Glutamax Life Technologies 35050038 Glutamine supplement
hBDNF Peprotech 450-02
KOSR Thermo Fisher Scientific 10828028
Laminin Sigma L2020
Matrigel Corning 354234 Basement membrane matrix
mTeSR1 StemCell Technologies, Inc. 85851
NEAA Biological industries 01-340-1B
Nestin Millipore MAB353
NutriStem Biological industries 05-100-1A Alternate media
PECAM-1 Thermo Fisher Scientific 10333
Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP) Biomedical Technologies J64483AB
Retinoic acid (RA) Sigma R2625
S100β Abcam ab6602
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit Millipore SCGP00525
Triton X-100 Sigma X100
ZO-1 Monoclonal Antibody Invitrogen 33-9100
βIII-tubulin (Tuj1α) Sigma T8660
β-mercaptoethanol Life Technologies 31350010

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier endogenous transporters as therapeutic targets: a new model for small molecule CNS drug discovery. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 19 (8), 1059-1072 (2015).
  2. Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Modeling the blood-brain barrier: beyond the endothelial cells. Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).
  3. Jamieson, J. J., Linville, R. M., Ding, Y. Y., Gerecht, S., Searson, P. C. Role of iPSC-derived pericytes on barrier function of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells in 2D and 3D. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 15 (2019).
  4. El-Habashy, S. E., et al. Novel treatment strategies for brain tumors and metastases. Pharmaceutical Patent Analyst. 3 (3), 279-296 (2014).
  5. Lim, R. G., et al. Huntington's disease iPSC-derived brain microvascular endothelial cells reveal WNT-mediated angiogenic and blood-brain barrier deficits. Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).
  6. Dumitrescu, A. M., Liao, X. H., Weiss, R. E., Millen, K., Refetoff, S. Tissue-specific thyroid hormone deprivation and excess in monocarboxylate transporter (mct) 8-deficient mice. Endocrinology. 147 (9), 4036-4043 (2006).
  7. Spencer, J. I., Bell, J. S., DeLuca, G. C. Vascular pathology in multiple sclerosis: reframing pathogenesis around the blood-brain barrier. Journal of Neurology and Neurosurgical Psychiatry. 89 (1), 42-52 (2018).
  8. Yamazaki, Y., Kanekiyo, T. Blood-brain barrier dysfunction and the pathogenesis of Alzheimer's disease. International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1965 (2017).
  9. Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507 (2014).
  10. Heng, M. Y., Detloff, P. J., Albin, R. L. Rodent genetic models of Huntington disease. Neurobiology of Disease. 32 (1), 1-9 (2008).
  11. Ho, R., et al. ALS disrupts spinal motor neuron maturation and aging pathways within gene co-expression networks. Nature Neuroscience. 19 (9), 1256 (2016).
  12. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  13. Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic tumor networks for screening drug delivery systems. Journal of controlled release. 201, 49-55 (2015).
  14. Delsing, L., et al. Barrier properties and transcriptome expression in human iPSC-derived models of the blood-brain barrier. Stem Cells. 36 (12), 1816-1827 (2018).
  15. Park, T. E., et al. Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies. Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).
  16. Vatine, G. D., et al. Human iPSC-Derived Blood-Brain Barrier Chips Enable Disease Modeling and Personalized Medicine Applications. Cell Stem Cell. 24 (6), 995-1005 (2019).
  17. Henry, O. Y. F., Villenave, R., Cronce, M. J., Leineweber, W. D., Benz, M. A., Ingber, D. E. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
  18. Sances, S., et al. Human iPSC-derived endothelial cells and microengineered organ chip enhance neuronal development. Stem Cell Reports. 10 (4), 1222-1236 (2018).
  19. Workman, M. J., et al. Enhanced utilization of induced pluripotent stem cell–derived human intestinal organoids using microengineered chips. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 669-677 (2018).
  20. Ebert, A. D., et al. EZ spheres: a stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs. Stem Cell Research. 10 (3), 417-427 (2013).
  21. Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. A cGMP-applicable expansion method for aggregates of human neural stem and progenitor cells derived from pluripotent stem cells or fetal brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (88), e51219 (2014).
  22. Vatine, G. D., et al. Modeling psychomotor retardation using iPSCs from MCT8-deficient patients indicates a prominent role for the blood-brain barrier. Cell Stem Cell. 20 (6), 831-843 (2017).
  23. Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. Journal of Neuroscience Methods. 85 (2), 141-152 (1998).
  24. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2014).
  25. Canfield, S. G., et al. An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).
  26. Jamieson, J. J., Gerecht, S. Chipping Away at Blood-Brain-Barrier Modeling. Cell stem cell. 24 (6), 831-832 (2019).
  27. Faal, T., et al. Induction of Mesoderm and Neural Crest-Derived Pericytes from Human Pluripotent Stem Cells to Study Blood-Brain Barrier Interactions. Stem Cell Reports. 12 (3), 451-460 (2019).
  28. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783 (2012).
  29. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), 1701679 (2017).
  30. Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).
  31. Wevers, N. R., et al. A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport. Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 23 (2018).
  32. Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. 8 (11), 2135 (2013).
  33. Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y., Ingber, D. E. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 157، حاجز الدم في الدماغ، BBB، microfluidic، الجهاز على رقاقة، OoC، وحدة الأوعية الدموية العصبية، NVU، iPSC، خلايا iPS، الخلايا الفلكية، الطب الشخصي، الطب الدقيق
جيل من iPSC الإنسان القائم على الدم في الدماغ حاجز رقاقة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jagadeesan, S., Workman, M. J.,… More

Jagadeesan, S., Workman, M. J., Herland, A., Svendsen, C. N., Vatine, G. D. Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip. J. Vis. Exp. (157), e60925, doi:10.3791/60925 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter