Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

הדור של המוח האנושי מבוסס על-ידי שבב דם-מחסום

Published: March 2, 2020 doi: 10.3791/60925
Automatic Translation
1,2,3, 4, 5,6, 4, 1,2,3
1The Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, 2The Regenerative Medicine and Stem Cell (RMSC) Research Center, Ben-Gurion University of the Negev, 3The Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, 4The Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 5Division of Micro and Nanosystems, KTH Royal Institute of Technology, 6AIMES, Department of Neuroscience, Karolinska Institutet

Summary

מחסום הדם-מוח (BBB) הוא יחידת נוירונימי-דם הדוקה באופן הדוק הומאוסטזיס מוחי. על ידי שילוב האדם iPSCs והעוגב-על-שבב טכנולוגיות, יצרנו שבב BBB אישי, מתאים למידול מחלות ותחזיות החדירה לתרופות של הפונקציה. פרוטוקול מפורט מתואר לדור ותפעול של שבב BBB.

Abstract

מחסום מוח הדם (BBB) נוצר על ידי יחידות נוירוכלי (הבוס) כי מגן על מערכת העצבים המרכזית (CN) מתוך מגוון של גורמים שנמצאו בדם שיכול לשבש את תפקוד המוח העדין. ככזה, BBB הוא מכשול גדול להעברת therapeutics לתוך ה-CN. צבירת ראיות עולה כי BBB משחק תפקיד מפתח בתחילתה והתקדמות של מחלות נוירולוגיות. לפיכך, יש צורך אדיר במודל BBB שיכול לחזות את החדירה של תרופות ממוקדות-CN, כמו גם להבהיר את תפקידה של BBB בבריאות ובמחלות.

יש לנו לאחרונה שילבו איבר על שבב והמושרה תא גזע pluriפוטנטי (iPSC) טכנולוגיות לייצר שבב BBB אישית מלאה לבני אדם. פלטפורמת הרומן מציגה תכונות סלולריות, מולקולריות ופיזיולוגיות המתאימות לחיזוי העברת הסמים והמולקולה ברחבי BBB האנושי. יתר על כן, באמצעות שבבי BBB ספציפי לחולה, יצרנו מודלים של מחלות נוירולוגיות והפגינו פוטנציאל עבור יישומים מותאמים אישית לרפואה חזוי. בתנאי כאן הוא פרוטוקול מפורט הממחיש כיצד לייצר שבבי BBB נגזר, החל בבידול של iPSC-נגזר מיקרוכלי המוח של תאים אנדותל (iBMECs) וכתוצאה מכך תרבויות עצביות מעורבת המכילה ושלתי עצביים, נוירונים הבדיל, ו astrocytes. כמו כן, מתוארת הליך לזריעת תאים לתוך שבב העוגב ולקבלת שבבי BBB תחת זרימה מבוקרת של שכבתית. לבסוף, תיאורים מפורטים של ניתוחי השבבים BBB מסופקים, כולל הפרפרביליות הפרסומליות להערכת תרופות וחדירות מולקולה, כמו גם שיטות אימונוציטוטוקוכימיקלים לקביעת ההרכב של סוגי תאים בתוך השבב.

Introduction

BBB הוא מחסום סלקטיבי מאוד המפריד בין ה-CN לדם ממחזור הדם. הוא מגן על פונקציות המוח קריטי מפני חומרים הפרעה פוטנציאלי, גורמים, ו xenobiotics בעוד מאפשר זרם של חומרים מזינים ומטבוליטים אחרים הדרושים כדי לשמור על הומאוסטזיס המוח1. ה-BBB הוא מדור שינה (NVU), בו הננו-כפות הרגליים והתהליכים העצביים מגעים ישירות עם תאי המוח מיקרוכלי-דם (BMECs). אינטראקציות אלה מאפשרות ל-bmecs ליצור מאפייני מכשול מיוחדים הנתמכים על-ידי צמתים הדוקים ומחסיד2,3. היווצרות של המכשול הזה מגביל את המעבר הפרתאי של מולקולות, אבל הוא מכיל מובילי מקוטב כדי להעביר באופן פעיל מולקולות לתוך ה-CN או בחזרה לדם1. בשל מאפייני המכשול הייחודיים הללו, BBB מהווה מכשול גדול להעברת הביופרמקולוגיה למוח, וההערכה היא שפחות מ -5% ממולקולות קטנות באישור ה-FDA יכולים להגיע ל-CN4.

דגמי בעלי חיים שימשו רבות לחקר החדירה BBB והמנגנונים המולקולריים המעורבים בפיתוח BBB5. בעוד מודלים בעלי חיים מייצגים בנאמנות את מורכבות משולבת בסביבה vivo, הבדלים ביטוי ופעילות של מובילי BBB כמו גם ספציפיות מצע על פני מינים לעתים קרובות למנוע התרוממות מדויקת של נתונים בעלי חיים לבני אדם6. לפיכך, מודלים מבוססי-אדם הם קריטיים כדי ללמוד את BBB האנושי ולשימוש בפיתוח תרופות המיועדות למקד את ה-CN. צורך זה הופך להיות אפילו יותר ברור עם שליטה גוברת של תרופות ביולוגיות, ספציפיות לאדם בתחום הפיתוח הפרמצבטי. צבירת ראיות מרמזת כי bbb פרוצים קשורה למספר הפרעות המוח החמורות, כולל גידולים בראש ומחלות נוירולוגיות7,8,9. המודלים האנושיים בנאמנות משקפים מחלות אלה יש פוטנציאל שני 1) לזהות מסלולים הרומן שיכול להיות ממוקד עבור פיתוח התרופה 2) לחזות החדירה של ה-CN, ובכך הפחתת זמן ומשאבים במחקרים פרה-קליניים ואולי ירידה בשיעור כישלון בניסויים קליניים.

במודלים של חוץ גופית יושמו באופן נרחב כדי ללמוד אינטראקציות בין BMECs לבין תאים אחרים של NVU ומסכי התנהלות עבור תרופות לחדירות BBB פוטנציאליים10. כדי ליצור מחדש היבטים מרכזיים של BBB האנושי, במודלים החוץ-גופית חייבים להציג מאפיינים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית (דהיינו, חדירות הקרנף נמוכות והתנגדות מבחינה פיזיולוגית הקשורה לטראנס-תל-שורש). בנוסף, הפרופיל המולקולרי של מערכת החוץ-גופית חייב לכלול ביטוי למערכות התחבורה הפונקציונלית הייצוגית. בדרך כלל, במודלים של חוץ גופית מורכבים בתאי האנדותל כי הם משותפים על קרום למחצה חדיר עם שילובים של תאים NVU אחרים כדי לשפר את מאפייני BBB11. גישה זו מאפשרת הערכה פשוטה ומהירה יחסית של פונקציונליות המכשול וחדירות המולקולה. מודלים אלה מבוססי תא BBB ניתן להקים עם בעל חיים או מקורות תא אדם, כולל תאים מבודדים excisions כירורגי או קווי BMEC מונצח.

לאחרונה, פרוטוקולים כדי להבדיל בין התאים האנושיים החזקים לתוך bmecs הוצגו כמקור אטרקטיבי עבור מודלים bbb האנושי מתורבת12,13. תא גזע מושרה pluripotent (iPSC)-נגזר מסכת הנגזרת (iBMECs) הם מדרגיים מאוד, להפגין מאפיינים מורפולוגיים ופונקציונליים חיוניים של BBB האדם, ולשאת את הגנטיקה של המטופל. בתרבות, iBMECs ליצור מונאולייר כי מבטא סמנים הצומת הדוקה מציג vivo-כמו מתחמי הצומת הדוקה. תאים אלה גם מבטאים סמנים BBB, כולל משגר הגלוקוז BBB, הגלוקוז המוביל 1 (GLUT1). חשוב מכך, ובניגוד מקורות אחרים תאים חלופיים עבור האדם BMECs, iBMECs לרכוש מאפייני המכשול עם ערכים גבוהים כמו אלה שנמדדו ב vivo14, מקטפולז לאורך הציר בזלת צלעות, ומשאבות לבטא פונקציונלי מהיר. יתר על כן, השימוש iPSCs מתוך נושאים שונים שני 1) מברך את ההזדמנות לבחון היבטים של BBB באופן מותאם אישית התרופה 2) מספק מקור גמיש ליצירת סוגים נוספים של תאים של NVU. יצירת תאים אלה ממקור תא איזוגניים כדי ליצור שבבי BBB אישית תסייע גם הבנה בין הבדלים בין בודדים בתגובות התרופה, שהיא מטרה מרכזית לתגובה התנגדות או פרוצים לטיפול נצפתה במחקרים קליניים.

שימוש ב-iBMECs כמו monolayers בתבשיל או על הוספת מעבר חדיר למחצה מייצגת גישה רבת עוצמה עבור מידול BBB. מערכות אלה נוטות להיות חזקות, מיועלות וחסכוניות. בנוסף, ניתוחים פונקציונליים כגון הפרטיר והחדירות הם פשוטים יחסית לביצוע. עם זאת, דו מימדי (2D) מערכות לא לחזור לסדר את הטבע 3D של רקמת vivo, ואין להם את הכוח הפיזיולוגי להדגיש כוחות שסופקו על ידי במחזור דם ותאי דם. הדבר מגביל את יכולת האנדותל של כלי הדם במודלים אלה כדי לפתח ולתחזק מאפיינים ופונקציות מהותיים של BBB.

מערכות מיקרו הנדסה מרופדת על ידי תאים חיים יושמו למודל האיברים השונים שונים במושג שנקרא עוגב-על-צ'יפס. על-ידי יצירה מיוצרת של אדריכלות מvivo כמו, ממשקי רקמה רקמה, מיקרוקוכימיה פיסיוכימיקלים, ו perfusion כלי דם, אלה פלטפורמות מיקרו מהונדסים ליצור רמות של רקמות ואיברים פונקציונליות לא אפשרי עם מערכות התרבות 2D קונבנציונאלי. הם גם מאפשרים ברזולוציה גבוהה, הדמיה בזמן אמת, ניתוח של פרופילים ביוכימיים, גנטיים, ומטבוליים דומים לתאי החיים בתוך רקמת vivo והקשר עוגב. עם זאת, אתגר מסוים של האיבר על שבב הוא העיצוב, ייצור, ויישום של שבבי מיקרו מהונדסים אלה דורש מומחיות הנדסה מיוחדת כי הוא בדרך כלל חסר במעבדות האקדמיות מונחה ביולוגית.

לאחרונה שילבו ipsc וטכנולוגיות עוגב-על-שבב כדי ליצור מודל מותאם אישית של שבב bbb15,16. על מנת להתגבר על האתגרים הטכנולוגיים שתוארו, השבב הזמין מסחרית משמש יחד עם מודול התרבות, מכשיר שנועד להפוך את התחזוקה של האסימונים בצורה פשוטה ואיתנה (הדמיית Inc.). שבב BBB משחזר את האינטראקציות בין תאים עצביים ואנדותל ומשיגה את ערכי העגלון הרלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, הנמדדת על ידי שבבי עוגב מותאמים אישית עם אלקטרודות זהב משולבות17. בנוסף, שבב BBB מציג חדירות הקרנף נמוך, מגיב לרמזים דלקתיים ברמת האיבר, מבטא משאבות מיצוי פעיל, ומציג הובלה חזוי של ביוארים מסיסים וביופרמצבטיקה. בעיקר, שבבי BBB שנוצרו ממספר אנשים לוכדת את ההבדלים הפונקציונליים צפוי בין אנשים בריאים וחולים עם מחלות נוירולוגיות15.

הפרוטוקול המפורט להלן מתאר שיטה אמינה, יעילה ובעלת שדרוג ליצירת שבבי BBB מבוססי-האדם בתנאי זרימה דינמיים. ההדרכה מסופקת על סוג של מנתח וניתוח נקודות הקצה שניתן לבצע ישירות בשבב BBB או מדגימת קולחים. לפיכך, הפרוטוקול ממחיש את הספקטרום של טכניקות שניתן ליישם להערכת תכונות ביולוגיות ופונקציונליות ותגובות במודל הרלבנטי לאדם.

המלון מספק תיאור קצר של שבב BBB המבוסס על iPSC. האדם iPSCs הם הבדיל בתחילה והופץ בתוך מבחנות התרבות רקמות כמו אגרגטים בחינם צף של ושלתי עצביים, כינה כדורי EZ. הערוץ העליון של השבב-S116,18,19 הוא נזרע עם הנתק EZ-כדורים שיוצרים את "הצד המוח" של השבב, כמו תאים להבדיל מעל 7 ימים לתוך תרבות מעורבת של תאים מחולל קדמון (inpcs), iastrocytes, ו ineurons. האדם iPSCs גם מובחנת לוחיות התרבות רקמות לתוך iBMECs. הערוץ התחתון של השבב הוא הנזרע עם iBMECs כדי ליצור את "הצד הדם" כפי שהם מפתחים כדי ליצור צינורית אנדותל (איור 1). מטריצה נקבובי מגולוון (ecm) מצופה קרום המפריד בין הערוצים העליונים והתחתונים 1) מתיר את היווצרות אינטראקציות תא אל התא בין ערוצים ו 2) מאפשר למשתמש להפעיל חדירות בחני התאים התמונה באחד הערוצים באמצעות מיקרוסקופ אור קונבנציונאלי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הדור של התאים הנגזרים מעשה ידי iPSC (iNPCs)

  1. לייצר EZ-ספירות ממושבות ipsc כמתואר להלן, כפי שפורסמו בעבר20,21,22.
    1. תרבות iPSC מושבות לשטף על מרתף קרום המרתף מצופה 6 היטב צלחות (0.5 mg/צלחת) ב mTESR1 או מדיה מסחרית אחרת (ראה לוח חומרים).
    2. הסר את המדיום iPSC והחלף עם 2 מ ל של מדיום EZ-sphere [ESM; Dמאמ: F12 7:3 שיושלם עם 100 ng/mL בסיסי פיברופיצוץ גורם גידול (bFGF), 100 ng/mL גידול באפידרמיס, 5 μg/mL הפארין, ו 2% B27 מוסף].
    3. מגרד את החלק התחתון של כל היטב עם החלק האחורי של טיפ מעוקר מ1000 μL או מגרד התא.
    4. לאסוף את כל התאים ומקום מצורף אולטרה נמוך T25 תרמוס כדי לאפשר את היווצרות ספונטנית של כדורים צף חופשי. המלון משלב בין לילה ב-37 ° c.
    5. להאכיל את הספירות כל 2 – 3 ימים כאשר המדיום הופך צהוב על ידי החלפת חצי בינוני עם ESM טרי. זה מאפשר לתחומים להישאר בינוני מותנה, אשר חשוב מאוד לצמיחה שלהם ותחזוקה.
      1. להישען את הבקבוקון על מדף צינורית ולאפשר את התחומים להתיישב על ידי כוח הכבידה עבור 1 – 2 דקות למטה לפינה של הבקבוקון.
      2. לאחר התיישבו, משייף מחצית הסופרנטנט עם מיכל של 5 מ ל או 10 מ ל ומחליפים בטריות, מחומם מראש.
    6. מעבר-כדורים שבועיים על ידי קיצוץ כדורים עד 200 יקרומטר קטרים כפי שתוארו בעבר23,20,21. כדורי EZ-כדורים יכולים להישמר עד 25 מעברים והם אידיאליים כאשר הם משמשים בין מעברים 8 – 25.
  2. הכן השעיית תא בודד של iNPCs:
    1. לגרום לבידול עצבי, לנתק. את הכדור לתאים בודדים
    2. לאסוף כדורים 3 – 4 ימים לאחר חיתוך מ T75 תרמוס ולהעביר לתוך 15 מ ל חרוט, ואז לתת לו לעמוד עבור 2 דקות או עד כל הספירות התיישבו בתחתית.
    3. הסר באיטיות את ESM עם פיפטה באורך 5 מ ל מבלי לשבש את התחומים התיישבו. הוסף 1 מ ל של פתרון הדיסוציאציה (ראה טבלת חומרים) ו הדגירה עבור 10 דקות ב 37 ° c.
    4. מערבולת את פתרון הדיסוציאציה ואת הספירות לאחר 5 דקות של דגירה כדי להבטיח כי כל התחומים התיישבו מטופלים.
    5. הסר את פתרון הדיסוציאציה באיטיות. הוסף 1 מ ל של בידול עצבי בינוני [NDM; DMEM: F12 עם 2% B27 מינוס ויטמין A, 1% N2 תוספת, ואת המוח האנושי נגזר neurotrophic פקטור (hBDNF, 20 ng/mL)].
    6. Triturate את הספירות לתוך תאים בודדים על ידי ליטוף באמצעות פיפטה 1 מ ל ואחריו 200 μL הצינורות, עד שכל התחומים הפכו להיות מנתק. למנוע היווצרות בועה במהלך ההליך הטריטוראציה.
    7. לספור תאים הנתק באמצעות הומוציטוטומטר ולדלל תאים לצפיפות הסופית של 1 x 106 תאים/mL. ניתן לשנות את הצפיפות בהתאם ליישום.
      הערה: צפיפויות גבוהות (עד 6 x 106 תאים/mL) מומלצות לתרבויות קצרות לטווח של עד 3 ימים, וצפיפויות נמוכות מומלצות ליישומים ארוכי טווח של עד 3 שבועות.
      הערה: תאים מוכנים כעת לזרע לתוך הערוץ העליון של השבב כדי ליצור את "הצד המוח".

2. הבידול של iPSCs לתוך iBMECs

  1. מעבר iPSCs מתוך הבאר יחיד confluent של 6 צלחת הבאר ביחס 1:6 לתוך 6 היטב קרום המרתף מטריצה מצופה צלחת. תנו לתאים לדבוק 24 שעות ביממה.
  2. ספירת תאים מדי יום באמצעות הומוציטומטר.
  3. כאשר התאים מגיעים לצפיפות של 1.5 – 3.0 x 105 תאים/ובכן, החלפת ipsc בינונית עם 3 מ ל של מדיום ללא bFGF [dmem: F12 1:1, עם 10% החלפת סרום (kosr), 1% חומצות אמינו לא חיוניות (neaa), 0.5% גלוטמין תוסף (טבלת חומרים), ו 100 μm β-mercaptoethanol]. החלף יומי בינוני עבור 6 ימים24.
  4. ביום 6, להחליף בינוני עם תא אנדותל (EC) בינוני [האדם סרום אנדותל מדיום חינם (האסל) שיושלם עם 1% טסיות דם העניים-נגזר סרום הפרה, 20 ng/mL bFGF, ו 10 μM כל טרנס retinoic חומצה (RA)]. . השאירו מדיום ליומיים
  5. הסר את המדיום EC והוסף 1 mL של פתרון הדיסוציאציה לכל טוב. מודטה ב 37 ° c עבור 35 דקות.
    הערה: בעוד זה נחשב זמן דגירה ארוכה בפתרון הדיסוציאציה המשמש כאן, iBMECs יכול לסבול את הטיפול הזה עם הכדאיות של תאים גבוה יותר מ 90%.
  6. לנתק את התאים מן הבאר על ידי ליטוף בעדינות את ההשעיה התא ואיסוף כל התאים לתוך הצינור 15 מ ל חרוט.
    הערה: הימנע מליטוף קשה. אם התאים אינם מתנתק בקלות, מודלאטה עבור 5 דקות נוספות.
  7. להוסיף נפח 1 של מדיום EC לתוך 15 mL חרוטי כדי להשבית את Accutase צנטריפוגה ב 200 x g עבור 5 דקות, להסיר בינוני, ולהחליף עם 1 מ ל של EC בינונית (ללא bFGF ו-RA).
  8. ספירת תאים באמצעות התקן הומוציטוטומטר והתאמת צפיפות התא ל -14 – 20 x 106 תאים/mL.
    הערה: תאים מוכנים כעת להיות נזרע לתוך הערוץ התחתון של השבב כדי ליצור את "צד הדם".

3. המיקרוייצור של שבב העוגב

  1. השתמש בשבב עוגב עבור מודל שבב bbb והייצור שלה כפי שנעשה בעבר16,18,19. העוגב הגבוה אורגן הערוץ (לראות את הטבלה של חומרים) הוא המציא מאוד גמיש polydiמתיל siloxane (pdms) elastomer המכיל שתי מקבילות מיקרו בקנה מידה ערוצים מופרדים על ידי קרום נקבובי גמיש. הגודל העליון והתחתון של המיקרוערוץ הם 1 מ"מ x 1 מ"מ ו 1.0 מ"מ x 0.2 mm, בהתאמה. שני הערוצים מופרדים על ידי 50 יקרומטר עבה מתוצרת pdms גמיש ממברנה נקבובי, המכיל 7 יקרומטר קוטר נקבוביות עם 40 יקרומטר מרווח. השטח של הקרום נקבובי המפריד בין הערוצים הוא 0.171 ס מ2.

4. הכנת שבב

  1. שבבי עוגב מסופקים ארוזים מראש בתוך מנשא השבב, ומבטלים את הצורך להפריע או לעוות את יישור השבב במהלך הטיפול. בנוסף, נושא השבב מתחבר באופן מאובטח למודול נייד ("Pod") הפועל כממשק בין מודול התרבות והשבב.
    1. רסס את אריזת האסימונים עם 70% אתנול והכניסו לארון הביוטיחות (תואר ראשון).
    2. פתח את האריזה ופרוס את שבב העוגב בצלחת פטרי סטרילית. התמודד עם מנשא השבבים רק על-ידי הצדדים כדי להימנע ממגע ישיר עם השבב.
    3. ודא שלשונית המנשא פונה ימינה (איור 2), ובשעת שימוש באסימונים מרובים, יישר את כולם באותו כיוון.
    4. סמן כל שבב בכרטיסיית המנשא (הכנה מלאה של שבבים וזרימת עבודה מוצגת באיור 3).

5. הפעלת פני השטח וציפוי ECM

  1. הכנת פתרון הפעלת פני שטח
    1. הדמיית מגיב 1 (ER-1), המסופקת בבקבוקון המכיל 5 מ ג, הוא רגיש לאור. הכינו פתרון ER-1 רענן מיד לפני השימוש. שלמות ER-1 היא חיונית בהכנה מוצלחת של האסימונים.
    2. כבה את האור בתואר ראשון. בטיפול במיון-1
      הערה: ER-1 הוא מטרד עיניים והוא חייב להיות מטופל בתואר ראשון עם כפפות והגנת עיניים נאות.
    3. הרשו ל-ER-1 ו-ER-2 ריאגנטים להיות מתכלה לטמפרטורת החדר (RT) לפני השימוש.
    4. להגן על הפתרון מפני אור על ידי גלישת ריק מעוקר 15 מ"ל שפופרת חרוט עם נייר כסף.
    5. בתואר ראשון, הקש לחיצה קצרה על הבקבוקון ER-1 כדי ליישב את האבקה בתחתית.
    6. הוסף 1 מ ל של מאגר ER-2 לבקבוקון, והעבר מיד את תוכנו לחלק התחתון של הצינור החרוט העטוף ב -15 מ"ל. . אל תעשה את זה. אל תעשה בלגן צבע התמיסה המועברת לצינור החרוט יהיה אדום.
    7. חזור על השלב 5.1.6 3x. בסיבוב האחרון, כיסוי בקבוקון ER-1 והיפוך לאסוף את כל האבקה שנותרה מן המכסה, ולאחר מכן להעביר את הפתרון לצינור חרוט; זה יביא את הנפח הכולל ל 4 מ ל של פתרון ER-1.
    8. הוסף 6 מ ל של פתרון ER-2 ל 4 מ ל של פתרון ER-1 ב 15 מ"ל צינור חרוט לריכוז הסופי של 0.5 mg/mL. ER-1 צריך להיות מומס לחלוטין בתוך הפתרון ER-2.
  2. הפעלת פני שטח
    1. ניצול של P200 tte ו200 סטרילי מסוננים מסנן Μi עצה, לקחת את 200 μL of ER-1 תערובת.
    2. מניחים את הפיפטה בתא התחתון ולדחוף 20 μL של התערובת ER-1 דרך הערוץ התחתון עד התערובת מתחילה לזרום משקע הערוץ התחתון.
    3. הוסף כ 50 μL של התערובת ER-1 ומניחים אותו בערוץ העליון. דחף את התערובת דרך הערוץ העליון עד שהוא מתחיל לזרום משקע הערוץ העליון.
    4. להסיר את כל תערובת ER-1 מהמשטח של השבב על ידי שאיפה עדינה. לוודא את התערובת ER-1 מוסר רק מפני השטח שבב ולא מן הערוצים.
    5. ודא כי הערוצים הם ללא בועות אוויר לפני אולטרה סגול (UV) הפעלה. אם מזוהים בועות אוויר, להסיר בועות על ידי שטיפת הערוץ עם התערובת ER-1.
    6. מניחים את המנה הפתוחה המכילה את האסימונים לתוך תיבת אור UV (המסופקים על ידי הדמיית Inc.).
    7. הגדר את המתג בחלק האחורי של תיבת אור UV להגדרה "עקבית". הפעל את החשמל ואתחל הפעלת UV. השאירו את האסימונים תחת אור UV למשך 20 דקות.
      הערה: הימנע מחשיפה של כוח אדם לאור UV.
    8. הסר את התערובת ER-1 משני הערוצים.
    9. שטוף כל ערוץ עם 200 μL של פתרון ER-2.
    10. הסרת ER-2 משני הערוצים.
    11. שטוף כל ערוץ עם 200 μL של תמיסת מלח מוזרמת פוספט באגירה קר של דולבקה (DPBS).
    12. השאירו DPBS קר בתוך הערוצים עד שתמשיך לשלב הבא.
  3. הכנה וציפוי מטריצות (ECM)
    1. הכינו את פתרון ECM על ידי שילוב רכיבי ECM בודדים עם DPBS קר, מים, או אחרים הממס לריכוזי עבודה הסופי. הפתרון ECM צריך להיות מוכן טרי בכל פעם שהוא משמש.
    2. לחלוק את הערוצים העליונים והתחתונים של השבב עם ECM, עם קומפוזיציה כפי שנקבע על ידי סוג התא כדי להיות נזרע. תערובת ECM חייבת להישמר בקרח עד לשימוש.
    3. השימוש למינציה (50 μg/mL) כדי לחלוק את "הצד המוח", ו קולגן IV ו fibronectin מעורבב ביחס 4:1 (320:80 μg/mL) כדי לחלוק את "הצד הדם" כפי שמתואר בסעיף 5.6.
  4. הכנת מבני משפחת ECM
    1. לדלל 1 מ"ג/mL לימיל ב-DPBS קר לריכוז הסופי של 50 μg/mL. מחלקים ומאחסנים ב-20 ° צ' עד השימוש.
    2. התמוססות קולגן IV ב 0.1% חומצה אצטית לריכוז של 1 מ"ג/mL. הפתרון ב-2 – 8 ° c לילה או ב RT עבור 1-3 h או עד התפרקה במלואה.
    3. להכין תערובת 1 mL של קולגן IV: fibronectin (320 μL של קולגן IV, 80 μL של fibronectin, 600 μL של סטרילי כפול מזוקקים H2O). ניתן לאחסן את התערובת ב-20 ° c.
  5. ציפוי האסימונים באמצעות ECM
    1. . מרוב הערוצים הגדר P200 פייטה כדי לקחת את 100 μL של קולגן IV: פתרון fibronectin.
    2. הציגו את הפתרון באמצעות כניסת הערוץ התחתון עד לטפסי droplet קטנים בשקע. השאירו droplet קטן על כניסת האוויר לאחר הסרת הפיפטה.
    3. הציגו את פתרון המילמינציה דרך הערוץ העליון עד לטפסי droplet קטנים בשקע. השאירו droplet קטן על כניסת האוויר לאחר הסרת הפיפטה.
    4. הסתכל מקרוב על הערוצים כדי להבטיח כי בועות לא נוכח. אם קיימים בועות, שטוף את הערוץ עם הפתרון ECM המתאים עד שכל הבועות יוסרו.
    5. חזור על שלבים 5.5.1 – 5.5.4 עבור כל שבב.
    6. הוסף 1.5 mL של DPBS לכובע של צינור 15 מ ל חרוט. מניחים את כובע DPBS בצלחת התרבות 150 מ"מ עם האסימונים כדי לספק לחות נוספת לאטום את המנה עם parafilm. לקבלת תוצאות מיטביות, מודפים את האסימונים ב -4 ° c בלילה.
      הערה: אם תרצה, תאים יכולים להיות הזרע באותו יום כמו הפעלת שבב ו ECM ציפוי, אם כי הדגירה הלילה הוא המועדף. צ'יפס יכול להיות מוכן לזריעה 4 h לאחר הוספת שבבי ECM ו הדגירה ב 37 ° c.

6. זריעת ערוץ "צד המוח" והבחנה בין כדורי EZ לתרבויות עצביות מעורבות

  1. הביאו את המנה המכילה את האסימונים המוכנים לתואר ראשון. שטוף בעדינות את שני הערוצים עם 200 μL של NDM.
  2. הימנעות ממגע עם הנמלים, בזהירות מאחד טיפות מדיה עודף מפני השטח של השבב. בעדינות מתפרעים הבולם התא לפני זריעת כל שבב כדי להבטיח מתלה התא הומוגנית
  3. זריעת iNPCs לתוך הערוץ העליון כדי ליצור את "הצד המוח"
    1. הזרע את התאים (1 x 106 תאים/mL) לתוך הערוץ העליון של השבב. הוסף תיאור P200 המכיל 30 – 100 μL של תאים ההשעיה לתוך הערוץ העליון בעדינות לשחרר את הקצה מן הפיפטה. קח P200 מרוקן, לדכא את הבוכנה, להכניס לשקע הערוץ העליון ולמשוך בזהירות את התאים היחידים ההשעיה דרך השבב.
    2. כסו את הצלחת והעבירו למיקרוסקופ כדי לבדוק את צפיפות הזריעה ואת ההתפלגות הומוגנית של תאים בתוך הערוץ העליון. הסר בעדינות את קצה הפיפטה מיציאות השבבים ומהיציאות העודפים.
    3. צפיפות הזריעה אמורה להופיע כ -20% כיסוי. אם הזריעת הצפיפות גבוהה או נמוכה מהצפוי או לא אחידה, החזר את האסימונים לתואר ראשון, שטוף את ערוץ 2x עם 200 μL של מדיום טרי וחזור על שלב 6.3.1.
    4. לאחר המאשרת את צפיפות התא הנכונה, מניחים מיד את האסימונים בחממה עבור 2 h ב 37 ° צ' לאחר זריעת כל קבוצה של אסימונים. שטוף את התאים שאינם מתחברים באמצעות NDM טרייה.
    5. שמור את התאים תחת תנאים סטטיים ב 37 ° c עם החלפת NDM יומית לפחות 48 h לפני התחלת הזרימה. iBMECs יכול להיות הנזרע אחרי iNPCs יש מצורף או ביום הבא בעקבות זריעה Inpcs.

7. זריעת iBMECs לתוך הערוץ התחתון כדי ליצור את "צד הדם"

  1. הביאו את המנה המכילה את האסימונים המוכנים לתואר ראשון. שטוף בעדינות את הערוץ התחתון עם 200 μL של EC בינוני.
  2. הימנעות ממגע עם הנמלים, מכריח בזהירות טיפות של EC מדיום עודף מפני השטח של השבב, וודא לעזוב את המדיום בשני הערוצים. בעדינות מתפרעים הבולם התא לפני זריעת כל שבב כדי להבטיח השעיית תא הומוגנית.
  3. באמצעות P200 הצינורות, לצייר את 30-100 μL של השעיית התא iBMEC (14 – 20 x 106 תאים/mL) ולמקם את הקצה לתוך הערוץ התחתון. נתק בעדינות את הקצה מהפיפטה ומשאיר את הקצה המכיל את התא ביציאת ה-מפרץ.
  4. לדכא את הבוכנה על הצינור P200 tte עם טיפ ריק, להכניס לשקע הערוץ התחתון, ובזהירות למשוך את התא היחיד ההשעיה דרך הערוץ התחתון על ידי שחרור לאט לשחרר את המזרק.
  5. . מפני השטח של השבב הימנע מגע ישיר עם יציאות מפרץ ולשקע כדי להבטיח כי השעיית תא לא מנושף מתוך הערוצים.
  6. כסו את השבב והעבירו אותו למיקרוסקופ כדי להתבונן בצפיפות הזריעה. הערוץ התחתון צריך להיות מלא ללא פערים נצפה בין התאים כאשר נצפה ב 4x או 10x תחת מיקרוסקופ (איור 4).
  7. אם הזריעה היא מתחת ל-90% כיסוי או שהיא מופצת באופן בלתי שווה, התאימו את צפיפות התא בהתאם וחזרו על שלבים 7.2 – 12.3 עד להשגת הדחיסות הנכונה בתוך הערוץ. לאחר אישור צפיפות התא הנכונה (איור 4), תאי זרע באסימונים הנותרים. כדי לצרף תאים על הקרום הנקבובי, הממוקם בחלק העליון של הערוץ התחתון, להפוך כל שבב ולנוח בעריסה שבב.
  8. מניחים מאגר קטן (15 מ"ל כובע שפופרת חרוטי המכיל DPBS סטרילי) בתוך הצלחת 150 מ"מ כדי לספק לחות לתאים. שבבי דגירה ב 37 ° c עבור כ 3 h, או עד תאים בערוץ התחתון מחוברים. לאחר iBMECs יש מצורף (~ 3 h לאחר זריעה), להפוך את האסימונים חזרה למצב זקוף כדי לאפשר תא מצורף לחלק התחתון של הערוץ התחתון.

8. ייזום זרימה

  1. הזרימה מתחילה בדרך כלל 48 h לאחר זריעה של iBMECs. הפעם נדרש כדי לאשר את ה-iBMECs לצרף בחוזקה את השבב.
  2. כדי לשמור על זרימה שכבתית דרך השבב, חשוב לדגה ולהאביק את הטמפרטורה של המדיום. המדיום חייב להיות מחומם מראש באמבט מים 37 ° c עבור 1 h.
  3. עד 50 mL של מדיום מחומם ניתן לניטרול על ידי דגירה תחת מערכת סינון ואקום מונחה עבור 15 דקות.
  4. הטרמה של מודולים ניידים
    1. החלק החיצוני של האריזה מודול נייד מגשים עם 70% אתנול, לנגב, ולהעביר לתואר ראשון. פתח את החבילה והשם את המודולים במגש. כוון אותם עם המאגרים לכיוון גב המגש.
    2. פיפטה 3 מ ל של מדיות מוכנות למים לכל מאגר כלים. הוסף מדיום תרבות EC למאגר המים של הערוץ התחתון ו NDM למאגר הימני של הערוץ העליון של הערוץ העליון (איור 5).
    3. הפיפטה 300 μL של שיטה מוקדמת, מדיה חמה לכל מאגר לשקע, ישירות מעל כל יציאת לשקע (איור 5).
    4. מקם עד שישה מודולים ניידים על כל מגש. הביאו מגשים לחממה והחליקו לגמרי לתוך מודול התרבות כשידית המגש פונה כלפי חוץ.
    5. בחר והפעל את מעגל "פריים" על מודול התרבות. סגרו את דלת החממה והניחו למודול התרבות לראש את המודולים הניידים (לוקח ~ 1 דקות). מחזור הטרמה מושלם כאשר שורת המצב קוראת "מוכן". הסר את המגש ממודול התרבות והבא אותו לתואר ראשון.
    6. ודא כי המודולים הניידים בוצע בהצלחה על-ידי בדיקת החלק התחתון של כל מודול נייד ב-תואר ראשון. חפשו את הנוכחות של טיפות קטנות בכל ארבע היציאות.
      1. אם כל מודול נייד אינו מראה טיפות, הפעל מראש את המחזור הראשוני במודולים אלה. אם כל מדיה מטפטפים על המגש (זה עלול להתרחש לעתים קרובות יותר על ידי יציאות השקע), מגש נקי עם 70% אתנול.
  5. חיבור אסימונים למודולים ניידים, רגולציה וייזום של זרימה
    1. לשטוף בעדינות את שני הערוצים של כל שבב עם חם, בינוני בינונית התרבות הספציפית התרבותית כדי להסיר את כל הבועות האפשריים בערוץ ולמקם טיפות קטנות של מדיה (על פי התקשורת בערוץ) על גבי כל יציאת מפרץ ולשקע.
    2. הכנס אסימונים עם ספקים לתוך המודולים הניידים ולמקם עד שישה בכל מגש. הוסף מגשים למודול התרבות. מתכנת את התנאים המתאימים לתרבות העוגב (קצב זרימה ומתיחה) במודול התרבות.
    3. תנאים מתוכנתים יתחילו ברגע שהמחזור "ויסות" יושלם.
      הערה: ניתן לשלוט בתעריפי הזרימה של כל ערוץ באופן עצמאי וניתן לקבוע אותם לתעריפים הנעים בין 0 ל-1000 μL/h. שבב BBB הוא בדרך כלל תרבותי ב 30 μL/h. כאשר מדיה זורמת כגון EC מדיה או ESM ב 30 μL/h ו 1000 μL/h, כוחות ההטיה הם 0.01 דינמיקה/cm2 ו 0.33 דינמיקה/cm2, בהתאמה.
    4. הפעל את מחזור "ויסות", אשר לוקח כ 2 שעות, לאחר מכן מודול התרבות יתחיל לזרום בתנאים הקבועים מראש התרבות שבב האיברים.

9. הערכת בדיקת חדירות של דם למוח

  1. הכן NDM בתוספת עם 10 μg/mL dextran-FITC (4 kDa). פתרון זה ישמש כקלט עבור ערוץ "צד הדם".
  2. למלא את מאגרי הערוץ התחתון של מודולים ניידים עם NDM שיושלם עם dextran-FITC. מלא את מאגרי הערוצים העליונים עם NDM ללא מעקב.
  3. בנוסף, הערוצים העליונים והתחתונים בקצב הזרימה של 30 μL/h עבור לפחות 4 שעות עד למספר מדיה מצטבר לצורך הערכה של זריחה בקורא צלחת (בדרך כלל 100 μL).
  4. איסוף דגימות מדיה ממאגר הקלט והפלט של הערוצים העליונים והתחתונים. . להגן על הדגימות מהאור
  5. סרילית לדלל את ה-NDM שיושלם עם 10 μg/mL dextran-FITC 1:1 באמצעות NDM ללא מעקב כדי ליצור עקומת כיול של 10 – 12 נקודות.
  6. קח 100 μL של כל דוגמה, כולל עקומת כיול, לתוך שחור 96 צלחת הבאר ולקרוא הזריחה באמצעות קורא צלחת (485 הריגוש nm, 530 פליטת nm).
  7. השתמש בערכים שנמדדו כדי לחשב את ערכי ה-Papp באופן הבא:

Equation 1

  1. קחו מדידות יומיות להערכת מאפייני המכשול וודאו ששבב BBB עדיין פעיל.

10. אימונוציטוכימיה

  1. . תביא צ'יפס למנוע כימי באמצעות P200 הצינורות, לתקן את התאים על ידי מימוש שני הערוצים עם 200 μL של 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית) ב DPBS ו דגירה עבור 10 דקות ב RT.
  2. בעקבות הקיבעון, מבשם כל ערוץ עם 200 μL של DPBS ו דגירה עבור 5 דקות. חזור על DPBS כביסה 2x.
  3. לחסום ולחלחל תאים על השבב על ידי מבשם פתרון חסימה ראשונית (PBS, בתוספת עם 5% סרום חמור נורמלי 0.1% טריטון X-100). . בסדר.
  4. לדלל את הנוגדנים העיקריים בפתרון חסימה ראשונית לבין הדגירה ב 4 ° c. מסכת הסמנים הם GLUT-1 (1:100 דילול), ZO-1 (1:300), פקאם -1 (1:250; בע) CD31) ו-VE-קדהרין (1:200). סמנים עצביים הם βIII-טובולין (1:1000; Tuj1α), S100β (1:500), nestin (1:1000) ו GFAP (1:1000).
  5. רוחצים את שבבי 3x עם DPBS קר.
  6. לדלל נוגדנים משניים בפתרון חסימה משנית (DPBS עם 5% סרום חמור רגיל ללא טריטון-X).
  7. מבשם הפתרון נוגדן משני דרך שני הערוצים. בדרך כלל, נוגדנים משניים פלורסנט מדולל 1:1000. . הגנה מפני האור
  8. שטוף את שבבי 3x עם DPBS.
  9. הכתם גרעיני תאים על ידי מבשם שבב עם 100 μL של פתרון DAPI. דגירה ב RT עבור 5 דקות.
  10. שטוף את שבבי 3x עם DPBS.
  11. השבב מוכן הדמיה באמצעות זקוף או מיקרוסקופ פלורסנט הפוכה. השקיפות של PDMS מאפשרת דימות בשבב האיברים השלם. מגניציות מעל 10x עשוי לדרוש מטרות ארוכות עבודה מרחוק עקב עובי של שבב העוגב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 6A, B, C מייצג שבב bbb הנזרע עם EZ-כדורים על "צד המוח" בערוץ העליון ו-ibmecs על "הצד הדם" "הערוץ התחתון. iBMECs הופרה הראשון ומותר לצרף לילה, לאחר שנוצרו EZ ספירות. צ'יפס היו מתורבתים בתנאים סטטיים עם החלפת מדיה יומית במשך שבעה ימים. שבב BBB תוקן לאחר מכן באמצעות 4% כלפי מע ב RT עבור 10 דקות ושטף 3x עם DPBS. אימונוציטוכימיה בוצעה על שבב BBB באמצעות 1) nestin כסמן עבור תאים מעשה עצבי, 2) S100β או GFAP כמו סמנים עבור astrocytes, ו 3) βIII-טובולין כסמן עבור נוירונים. גלוט -1 ופקאם -1 שימשו כסמן ל-BMECs. הדמיה בוצעה ב 20x באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד ותמונות עובדו באמצעות פיג'י עבור תוכנת imagej.

איור 6D מייצג מערך חדירות הפרתאי שבוצע על שבבי איברים מיושבים עם ibmecs ו-Ez ספירות, IBMECS לבד (ללא EZ-ספירות), או ez-כדורים לבד (ללא ibmecs). בעקבות מחזור "ויסות", 4 מעקב של kDa Dextran-FITC נוספה למאגר של "הצד הדם" לריכוז הסופי של 10 μg/mL, ו צ'יפס היו במים 30 μL/h לילה. לאחר מכן, המדיה נאספה מתוך מאגרי משקע ומאגרים של הערוצים העליונים והתחתונים. 100 μL של כל דוגמה נאסף ונבדק עבור הזריחה באמצעות קורא צלחת.

וחשוב מכך, עקומת כיול 1:1 שימש לשינוי ערכי הזריחה לערכי הריכוז של Dextran FITC. הערכים שימשו לחישוב חדירות (Papp). תוצאות אלה מדגימים כי iBMECs טופס מאפיינים פונקציונליים מכשול, אשר התהדקו עוד יותר כאשר iBMECs הם שיתוף תרבותי עם EZ-ספירות. צ'יפס בעלי כדורי EZ-כדורים בלבד, אינם יוצרים מחסום. גישה דומה יכולה לשמש כדי לבחון את התעבורה של כל מולקולה באמצעות שבב BBB, בהתאם לשיטת המדידה הזמינה (למשל, קרינה פלואורסצנטית, אליסה, או ספקטרופוטומטר המוניים).

Figure 1
איור 1: סכימטי של שבב BBB מבוסס iPSC. לפני זריעה על השבב, iPSCs הם הבדיל בלוחות התרבות לתוך (i) EZ-כדורים (בתאי מחולל קדמון, iNPCs), אשר גדלים בהשעיה כמו כדורים, ולתוך (ii) מיקרוכלי המוח תאים אנדותל (iBMECs). ה-EZ-ספירות מוחלשות לתאים בודדים, הנזרע בתעלה העליונה של שבב העוגב, שם הם מבדילים עוד יותר לתרבויות עצביות מעורבות כדי ליצור את "הצד המוח". iBMECs הם שנזרע בערוץ התחתון של שבב העוגב כדי ליצור מבנה כמו כלי דם על "צד הדם". אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: סכמטית של ההשקפה העליונה של השבב במנשא השבב, עם שכותרתו יציאות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תרשים זרימה של הכנת שבב BBB המבוסס על iPSC וזרימת עבודה. הבחנה מראש של תאים עצביים ואנדותל מiPSCs נדרשת לפני החניכה של זרימת העבודה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: זריעת iBMECs בערוץ התחתון. ברייטפילד תמונות של iBMECs הנזרע בערוץ התחתון (א) מיד לאחר זריעה או (ב) 24 h לאחר זריעה, לאחר התאים המחוברים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: סכמטית של השבב המחובר ומודול נייד עם מאגרי מים מסומנים ומאגרים לשקע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: תוצאות מייצגות. אימונוציטוכימיה על שבב BBB מבוסס iPSC 7 ימים שלאחר זריעה. EZ-ספירות הבדיל לתוך אוכלוסיה מעורבת בתאי העצב בחלק העליון של "צד המוח", כולל (א) S100β + (ירוק) אסטרוציטים, nestin + (אדום) בתאי מחולל קדמון, כמו גם (ב) gfap + (אדום) אסטרוציטים ו-βIII-טובולין + (אדום) נוירונים. סולם ברים = 200 μm. (ג) ibmecs שנזרע בתחתית "הצד הדם" ערוץ הביע glut-1 ו (ירוק) פקאם -1 (CD31, אדום). סרגל בקנה מידה = 200 μm. (ד) הערכה של חדירות השבבים bbb בוצעה על ידי הוספת dextran-fitc (4 kda) לתוך המאגר של הערוץ התחתון. תוצאות להפגין כי שבבי איברים הנזרע עם iBMECs ו-EZ ספירות להציג מכשול צר לעומת שבבי איברים הנזרע עם iBMECs לבד (* p < 0.05). שבבי איברים הנזרע עם EZ-כדורים לבד לא להציג כל מאפייני המכשול (* * * p < 0.001; בדרך אחת ANOVA עם השוואות מרובות של Tukey מבחן). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השילוב של הטכנולוגיה לעוגב-על-שבב ותאי iPSC-נגזר ב-NVU מחזיקה הבטחה למידול מדויק של BBB האנושי. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור יישום פשוט וחזק של שבב BBB מבוסס לאחרונה שפורסם iPSC16. סקירה ותזמון של פרדיגמת הזריעה מוצגת באיור 3. כדי להשיג ולשמור על פונקציות המכשול המתאימות למידול BBB, יצירת מונאולר הומוגנית ושמירה על שלמות הם קריטיים. הצעד הראשון לקראת הדור של מונאולייר פונקציונלי כולל הפעלה כימית של משטח שאינו קוטבי PDMS המאפשר חיבור של חלבונים ECM. ההפעלה פני השטח ריאגנטים במהירות על החוקה, אשר עשוי בסופו של דבר לגרום להחזקה משנית של תאים. לכן חשוב לשמור על הריאגנטים טרי ומוגן מפני אור לאורך כל התהליך.

במהלך הפעלת UV (סעיף 5.2), ריאגנטים חייב להיות מופץ באופן שווה בתוך כל ערוץ כדי להשיג ציפוי ECM עקבי ומצורף התא הומוגנית. קומפוזיציות ECM וריכוזים הניתנים בפרוטוקול זה היו ממוטבים לסוגים ספציפיים של תאים (כלומר, ibmecs ו-EZ-ספירה-נגזר מחולל התאים העצביים). ניתן לשנות את הרכב התאים אך עשוי לדרוש תנאי ECM משלימים, שידרשו מיטוב. לאחר ציפוי ECM, זה חיוני לזרעים iBMECs כראוי. צפיפות התא הגבוהה זריעה (> 14 x 106 תאים/mL) חיוני להשגת מונאולייר שלם. אם לא להשיג שליטה מלאה בתאים, מומלץ להגדיל עוד יותר את הצפיפות של השעיית התא עד 20 x 106 תאים/mL במהלך הזריעה.

זרם לינארי הוצע בעבר כדי לשפר את ההבשלה iBMEC15 והוא הכרחי לקיים את היתרונות המסופקים על ידי פלטפורמת microfluidic. עם זאת, מיקרו בועות זורם דרך ערוצי השבב יכול פיזית לחץ וניתוק תאים תושב, אשר יכול להוביל להרס של השלמות שבב BBB. כדי למנוע היווצרות בועות מיקרו במהלך זרם למינארי, זה קריטי כדי לחסוך את המדיום לפני התחלת הפרזיה. שאקליציה דורשת התחממות מראש והעצמה של המדיום לפני השימוש.

הדור של שבבי אישית מתאפשרת באמצעות שני iPSC הנגזר של האדם ו iNPCs. בעוד הבידול של ibmecs הוא קצר ופשוט למדי24,22, הבידול של iPSCs לתוך תאים עצביים21,25 הוא מאתגר יותר. עם זאת, התאים העצביים השוכנים "בצד המוח" של השבב ניתן להחליף על ידי כל סוג תא עצבי, כגון תאים עצביים הראשי או מנוע מנועי iPSC-נגזר16. בדומה לתאי האנדותל, iBMECs מציגים פלסטיות בביטוי הגנים בתגובה לתרבויות שונות עצביות. לפיכך, גמישות זו עלולה לגרום להתפתחות עתידית של הבוס השונים בשבב. ניתן להשיג גמישות נוספת של המערכת באמצעות התאמת התזמון והסדר של התאים. iBMECs ניתן לזרוע לפני או אחרי התאים העצביים, מה שמאפשר זרעים iBMECs מיד אחרי זריעה והחזקה של תאים עצביים, או אחרי EZ-ספירות הבדיל לתוך תרבויות עצביות בוגרת יותר בסביבת השבב. הדבר מהווה חשיבות מיוחדת, בהתחשב בטבעו הילדותי של תאי העצבים הנגזרים מסוג iPSC. בהינתן כי EZ-ספירות הם ושלתי העצבית המוקדמים, תקופות בידול ארוך יכול גם לגרום לאחוז מוגבר של האסטרוציטים ונוירונים.

רכיב אחד חסר בפרוטוקול הוא קרום הלב הפריולוציטים, אשר מספקים מרכיב מכריע ב-NVU הפיזיולוגי. ההתפתחויות האחרונות ב iPSCs הבידול לתוך תאיםבעליכדוריות הדם 26,27 יאפשר את המבוא של סוג זה של תא נוסף, ובכך לספק העתק משופר של bbb תוך שמירה על הטבע האישי שלה.

Ibmecs הוכחו בעבר להפגין מאפיינים שונים הקריטיים עבור מידול bbb כולל ביטוי של סמנים סלולריים, הקמת העגלון ופעילות פונקציונלית של משאבות אפלוקס28,24,5. עם זאת, ניתוחים מולקולריים גילו כי תאים אלה גם לבטא מספר סמנים אפיתל15. התקדמויות בדור ibmec מראה פונקציה משופרת ביטוי מסמן אנדותל לאחרונה תוארה29,30. בעקבות הפרדיגמה המוצגת כאן, תאים אלה עשויים להיות משופר בקלות ניתן לשלב במודל השבב BBB ליישומים עתידיים. הפלטפורמה הגמישה אך איתנה המתוארת כאן עשויה להקל על מידול המחלה והן על פיתוח והערכה של תרופות ה-CN החדשות.

בעוד פרוטוקול זה מסתמך על מוצר ספציפי זמין מסחרית, חברות מסחריות נוספות מציעות פלטפורמות מיקרופיזיולוגיות מגוונות, אשר עשויים להציע יתרונות חלופיים31. בנוסף, פרוטוקולים עבור "בבית" הייצור של שבבי איברים microfluidic זמינים גם32 והוא עשוי להציע מודולריות יותר כולל שילוב של אלקטרודות העגלון17, אשר חסר מפלטפורמה בשימוש כאן.

העוגב-on-צ'יפס הוכנסו כגישה חלופית כדי לשפר את ההקשר הפיזיולוגי של תרביות תאים הנוכחית33. עם זאת, היישום של טכנולוגיה זו דורש מיומנויות הנדסה מיוחדות, אשר לעתים קרובות חסרים במעבדות מונחה ביולוגית. פלטפורמת שבב זמינה מסחרית, כגון האחד המועסקים כאן, מספק פחות מודולריות וחוסן מוגבר ומוחלשות, אשר ניתן להחיל על ידי מגוון רחב יותר של משתמשים. יתר על כן, היישום של זרימה למינארי על שבב microflu, מסתמך על יישום של משאבה או משאבות פריסטלטיות, אשר מציג רמה אחרת של מורכבות. כעת קל יותר להתגבר על מכשול זה ביישום של מודול התרבות, המקל על הפרזיה הסימולטנית של אסימונים מרובים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לארזים-סיני יש התעניינות במניות מיעוט בחיקוי, החברה המייצרת את שבבי העוגב המיקרופלואידיג של המחקר. גם קצין ארזים-סיני משרת את הדירקטוריון. הדמיה לא סיפקה תמיכה כספית עבור מחקר זה. ארזים-סיני ו הדמיית יש פטנטים שהוגשו הקשורים לעבודה זו.

Acknowledgments

אנחנו רוצים להודות לד ר סושנה סזוסן לעריכה קריטית. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן המדע הישראלי מענק 1621/18, משרד המדע והטכנולוגיה (רוב), ישראל 3-15647, המכון הקליפורני לרפואה רגנרטיבית המענק DISC1-08800, קרן משפחת שרמן, NIH-NINDS מענק 1יום 3NS105703, ואת האגודה ALS מענק 18-SI-389. AH מומן על ידי קרן ולנברג (גרנט מספר 2015.0178).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accutase EMD Millipore SCR005 Dissociation solution
B27 Gibco 12587010
Bfgf Peprotech 100-18B
Chip-S1 Emulate Inc Chip-S1 Organ-Chip
Collagen IV Sigma C5533
DAPI Invitrogen D3571
Dextran-FITC Sigma 46944
DMEM: F12 Thermo Fisher Scientific 31330038
Donkey serum Sigma D9663
Emulate Reagent 1 (ER-1) Emulate Inc ER-1
Emulate Reagent 2 (ER-2) Emulate Inc ER-2
Fibronectin Sigma F1141
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Dako Z0334
GLUT-1 Invitrogen MA5-11315
Glutamax Life Technologies 35050038 Glutamine supplement
hBDNF Peprotech 450-02
KOSR Thermo Fisher Scientific 10828028
Laminin Sigma L2020
Matrigel Corning 354234 Basement membrane matrix
mTeSR1 StemCell Technologies, Inc. 85851
NEAA Biological industries 01-340-1B
Nestin Millipore MAB353
NutriStem Biological industries 05-100-1A Alternate media
PECAM-1 Thermo Fisher Scientific 10333
Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP) Biomedical Technologies J64483AB
Retinoic acid (RA) Sigma R2625
S100β Abcam ab6602
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit Millipore SCGP00525
Triton X-100 Sigma X100
ZO-1 Monoclonal Antibody Invitrogen 33-9100
βIII-tubulin (Tuj1α) Sigma T8660
β-mercaptoethanol Life Technologies 31350010

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier endogenous transporters as therapeutic targets: a new model for small molecule CNS drug discovery. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 19 (8), 1059-1072 (2015).
  2. Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Modeling the blood-brain barrier: beyond the endothelial cells. Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).
  3. Jamieson, J. J., Linville, R. M., Ding, Y. Y., Gerecht, S., Searson, P. C. Role of iPSC-derived pericytes on barrier function of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells in 2D and 3D. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 15 (2019).
  4. El-Habashy, S. E., et al. Novel treatment strategies for brain tumors and metastases. Pharmaceutical Patent Analyst. 3 (3), 279-296 (2014).
  5. Lim, R. G., et al. Huntington's disease iPSC-derived brain microvascular endothelial cells reveal WNT-mediated angiogenic and blood-brain barrier deficits. Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).
  6. Dumitrescu, A. M., Liao, X. H., Weiss, R. E., Millen, K., Refetoff, S. Tissue-specific thyroid hormone deprivation and excess in monocarboxylate transporter (mct) 8-deficient mice. Endocrinology. 147 (9), 4036-4043 (2006).
  7. Spencer, J. I., Bell, J. S., DeLuca, G. C. Vascular pathology in multiple sclerosis: reframing pathogenesis around the blood-brain barrier. Journal of Neurology and Neurosurgical Psychiatry. 89 (1), 42-52 (2018).
  8. Yamazaki, Y., Kanekiyo, T. Blood-brain barrier dysfunction and the pathogenesis of Alzheimer's disease. International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1965 (2017).
  9. Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507 (2014).
  10. Heng, M. Y., Detloff, P. J., Albin, R. L. Rodent genetic models of Huntington disease. Neurobiology of Disease. 32 (1), 1-9 (2008).
  11. Ho, R., et al. ALS disrupts spinal motor neuron maturation and aging pathways within gene co-expression networks. Nature Neuroscience. 19 (9), 1256 (2016).
  12. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  13. Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic tumor networks for screening drug delivery systems. Journal of controlled release. 201, 49-55 (2015).
  14. Delsing, L., et al. Barrier properties and transcriptome expression in human iPSC-derived models of the blood-brain barrier. Stem Cells. 36 (12), 1816-1827 (2018).
  15. Park, T. E., et al. Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies. Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).
  16. Vatine, G. D., et al. Human iPSC-Derived Blood-Brain Barrier Chips Enable Disease Modeling and Personalized Medicine Applications. Cell Stem Cell. 24 (6), 995-1005 (2019).
  17. Henry, O. Y. F., Villenave, R., Cronce, M. J., Leineweber, W. D., Benz, M. A., Ingber, D. E. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
  18. Sances, S., et al. Human iPSC-derived endothelial cells and microengineered organ chip enhance neuronal development. Stem Cell Reports. 10 (4), 1222-1236 (2018).
  19. Workman, M. J., et al. Enhanced utilization of induced pluripotent stem cell–derived human intestinal organoids using microengineered chips. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 669-677 (2018).
  20. Ebert, A. D., et al. EZ spheres: a stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs. Stem Cell Research. 10 (3), 417-427 (2013).
  21. Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. A cGMP-applicable expansion method for aggregates of human neural stem and progenitor cells derived from pluripotent stem cells or fetal brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (88), e51219 (2014).
  22. Vatine, G. D., et al. Modeling psychomotor retardation using iPSCs from MCT8-deficient patients indicates a prominent role for the blood-brain barrier. Cell Stem Cell. 20 (6), 831-843 (2017).
  23. Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. Journal of Neuroscience Methods. 85 (2), 141-152 (1998).
  24. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2014).
  25. Canfield, S. G., et al. An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).
  26. Jamieson, J. J., Gerecht, S. Chipping Away at Blood-Brain-Barrier Modeling. Cell stem cell. 24 (6), 831-832 (2019).
  27. Faal, T., et al. Induction of Mesoderm and Neural Crest-Derived Pericytes from Human Pluripotent Stem Cells to Study Blood-Brain Barrier Interactions. Stem Cell Reports. 12 (3), 451-460 (2019).
  28. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783 (2012).
  29. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), 1701679 (2017).
  30. Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).
  31. Wevers, N. R., et al. A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport. Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 23 (2018).
  32. Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. 8 (11), 2135 (2013).
  33. Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y., Ingber, D. E. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).

Tags

ביולוגיה התפתחותית סוגיה 157 מחסום מוח דם BBB microflu מיקרופלואידים עוגב-על-שבב OoC יחידת נוירונימי NVU iPSC בתאי iPS אסטרוציטים רפואה אישית דיוק רפואה
הדור של המוח האנושי מבוסס על-ידי שבב דם-מחסום
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jagadeesan, S., Workman, M. J.,… More

Jagadeesan, S., Workman, M. J., Herland, A., Svendsen, C. N., Vatine, G. D. Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip. J. Vis. Exp. (157), e60925, doi:10.3791/60925 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter