Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

İnsan iPSC Tabanlı Kan-Beyin Bariyer Chip Üretimi

Published: March 2, 2020 doi: 10.3791/60925
Automatic Translation
1,2,3, 4, 5,6, 4, 1,2,3
1The Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, 2The Regenerative Medicine and Stem Cell (RMSC) Research Center, Ben-Gurion University of the Negev, 3The Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, 4The Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 5Division of Micro and Nanosystems, KTH Royal Institute of Technology, 6AIMES, Department of Neuroscience, Karolinska Institutet

Summary

Kan-beyin bariyeri (BBB) sıkı beyin homeostazı düzenleyen bir çok hücreli nörovasküler birimdir. İnsan iPSC'leri ve çip üzerine organ teknolojilerini birleştirerek, hastalık modellemesi ve CNS ilaç penetrite tahminleri için uygun kişiselleştirilmiş bir BBB çipi ürettik. BBB çipinin üretimi ve işletimi için ayrıntılı bir protokol açıklanmıştır.

Abstract

Kan beyin bariyeri (BBB) nörovasküler birimler tarafından oluşur (NUS) bu kalkan merkezi sinir sistemi (CNS) hassas beyin fonksiyonlarını bozabilir kanda bulunan bir dizi faktörden. Bu nedenle, BBB CNS terapötik teslim için önemli bir engeldir. Kanıt birikmesi BBB başlangıç ve nörolojik hastalıkların ilerlemesinde önemli bir rol oynadığını göstermektedir. Bu nedenle, CNS hedefli ilaçların penetrasyon tahmin yanı sıra sağlık ve hastalık BBB rolünü açıklığa kavuşturabilir bir BBB modeli için büyük bir ihtiyaç vardır.

Yakın zamanda, insanlar için tamamen kişiselleştirilmiş bir BBB çipi üretmek için çip üzerine organ ve indüklenen pluripotent kök hücre (iPSC) teknolojilerini birleştirdik. Bu yeni platform insan BBB genelinde ilaç ve molekül taşıma tahmin için uygun hücresel, moleküler ve fizyolojik özellikleri görüntüler. Ayrıca, hastaya özel BBB çipleri kullanarak, nörolojik hastalık modelleri oluşturduk ve kişiselleştirilmiş prediktif tıp uygulamaları için potansiyel gösterdi. Burada iPSC kaynaklı BBB yongalarının nasıl üretiliş gösterilmiş olduğunu gösteren ayrıntılı bir protokol, iPSC kaynaklı beyin mikrovasküler endotel hücrelerinin (iBT'ler) farklılaşmasıyla başlayan ve nöral atalar içeren karışık sinir kültürleriyle sonuçlanan, farklılaştırılmış nöronlar ve astrositler. Ayrıca, hücreleri organ çipine tohumlama ve BBB yongalarının kontrollü laminar akışı altında birliğe dönüştürme prosedürü de açıklanmıştır. Son olarak, ilaç ve molekül geçirgenliğinin değerlendirilmesi için parasellüler geçirgenlik tahlilleri ve çip içindeki hücre tiplerinin bileşimini belirlemek için immünositokimyasal yöntemler de dahil olmak üzere BBB çip analizlerinin ayrıntılı açıklamaları sağlanmaktadır.

Introduction

BBB, CNS'yi dolaşan kandan ayıran son derece seçici bir bariyerdir. Aynı zamanda beyin homeostaz1 korumak için gerekli besin ve diğer metabolitlerin akını sağlarken potansiyel olarak yıkıcı maddeler, faktörler ve kksobiyotikler kritik beyin fonksiyonları korur1. BBB, perisitlerin, astrosit endfeet'in ve nöronal süreçlerin beyin mikrovasküler endotel hücrelerine (BMEC) doğrudan temas ettiği çok hücreli bir NVU'dur. Bu etkileşimler BMECs sıkı ve bağlı kavşaklar2,3tarafından desteklenen özel bariyer özellikleri oluşturmak için izin verir. Bu bariyerin oluşumu moleküllerin parasellüler geçişini sınırlar, ancak molekülleri cns'ye veya kageri taşımak için polarize taşıyıcılar içerir1. Bu benzersiz bariyer özellikleri nedeniyle, BBB beyne biyofarmasötik lerin teslimi için önemli bir engel oluşturmaktadır, ve fda onaylı küçük moleküllerin az% 5 CNS ulaşabilirsiniz tahmin edilmektedir4.

Hayvan modelleri yaygın BBB penetrance ve BBBgelişiminde yer moleküler mekanizmalar 5 çalışma için kullanılmıştır. Hayvan modelleri sadakatle in vivo ortamda karmaşık çok hücreli temsil ederken, ifade ve BBB taşıyıcıların aktivitesi farklılıkları yanı sıra türler arasında substrat özgüllüğü genellikle insanlar için hayvan verilerinin doğru ekstrapolasyon engel6. Bu nedenle, insan tabanlı modeller insan BBB çalışma ve CNS hedef tasarlanmış ilaçların geliştirilmesinde kullanılmak üzere önemlidir. Bu ihtiyaç, ilaç geliştirme alanında biyolojik, insana özgü ilaçların artan hakimiyeti ile daha da belirgin hale gelir. Kanıt birikmesi, tehlikeye bbb ciddi CNS bozuklukları bir dizi ile ilişkili olduğunu göstermektedir, beyin tümörleri ve nörolojik hastalıklar da dahil olmak üzere7,8,9. Bu hastalıkları sadakatle yansıtan insan modelleri hem 1) ilaç gelişimi için hedeflenebilir yeni yollar belirlemek ve 2) CNS penetrans tahmin, böylece klinik öncesi çalışmalarda zaman ve kaynakları azaltmak ve muhtemelen klinik çalışmalarda başarısızlık oranını azaltarak potansiyeline sahip.

In vitro modelleri yaygın BMECs ve NVU diğer hücreler arasındaki etkileşimleri incelemek ve prospektif BBB geçirgen ilaçlar için ekranları yürütmek için uygulanmıştır10. İnsan BBB'nin temel yönlerini yeniden oluşturmak için, in vitro modeller fizyolojik olarak ilgili özellikleri (örn. düşük parasellüler geçirgenlik ve fizyolojik olarak ilgili transendotelelektrik direnci [TEER] endotel monotabakası boyunca göstermelidir. Buna ek olarak, bir in vitro sistemin moleküler profili temsili fonksiyonel taşıma sistemlerinin ifadesini içermelidir. Tipik olarak, in vitro modeller bbb özelliklerini geliştirmek için diğer NVU hücrelerinin kombinasyonları ile yarı geçirimli bir membran üzerinde birlikte kültürlenen endotel hücrelerinden oluşur11. Bu yaklaşım bariyer işlevselliği ve molekül geçirgenliğinin basit ve nispeten hızlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Bu tür hücre bazlı BBB modelleri, cerrahi eksizyonlardan veya ölümsüzleştirilmiş BMEC hatlarından izole edilmiş hücreler de dahil olmak üzere hayvan veya insan hücre kaynakları ile kurulabilir.

Son zamanlarda, protokoller BMECs içine insan pluripotent hücreleri ayırt etmek için in vitro insan BBB modelleri için cazip bir kaynak olarak tanıtıldı12,13. İndüklenen pluripotent kök hücre (iPSC)kaynaklı BMECs (iBMECs) yüksek ölçeklenebilir, insan BBB önemli morfolojik ve fonksiyonel özellikleri göstermek, ve hastanın genetik taşır. Kültürde, iBMEC'ler sıkı bağlantı işaretlerini ifade eden ve vivo benzeri sıkı bağlantı komplekslerini görüntüleyen bir monolayer oluşturur. Bu hücreler ayrıca BBB glikoz taşıyıcısı, glikoz taşıyıcısı 1 (GLUT1) dahil olmak üzere BBB belirteçlerini ifade eder. Daha da önemlisi, ve insan BMECs için diğer alternatif hücre kaynaklarının aksine, iBMECs bu vivo ölçülen kadar yüksek değerlere sahip bariyer özellikleri elde14, bazolateral eksen boyunca polarize, ve fonksiyonel efflux pompalar ifade. Ayrıca, çeşitli konulardan gelen iPSC'lerin kullanımı 1) BBB'nin yönlerini kişiselleştirilmiş bir tıp tarzında test etme fırsatını memnuniyetle karşılar ve 2) NVU'nun ek hücre tipleri oluşturmak için esnek bir kaynak sağlar. Kişiselleştirilmiş BBB yongaları oluşturmak için izojenik bir hücre kaynağından bu hücreleri üreten de ilaç yanıtları, klinik çalışmalarda gözlenen tedaviye direnç veya uzlaşmalı yanıt için önemli bir neden dir bireysel farklılıkların anlaşılmasına yardımcı olacaktır.

iBMEC'lerin bir çanakta veya yarı geçirimli transwell eklentisinde monolayers olarak kullanılması BBB modellemeiçin güçlü bir yaklaşımı temsil eder. Bu sistemler sağlam, tekrarlanabilir ve uygun maliyetli olma eğilimindedir. Buna ek olarak, TEER ve geçirgenlik gibi fonksiyonel analizlerin gerçekleşmesi nispeten kolaydır. Ancak, iki boyutlu (2D) sistemler in vivo dokunun 3Boyutlu doğasını özetleyemedi ve kan ve kan hücrelerinin dolaşımı tarafından sağlanan fizyolojik kesme stres kuvvetlerinden yoksundur. Bu, bu modellerde vasküler endotel yeteneğini geliştirmek ve içsel BBB özellikleri ve fonksiyonları korumak için sınırlar.

Canlı hücreler tarafından sıralanmış mikro mühendislik sistemleri, organ-on-chips adı verilen bir kavram içinde çeşitli organ işlevlerini modellemek için uygulanmıştır. İnvivo benzeri çok hücreli mimari, doku-doku arayüzleri, fizikokimyasal mikroortamlar ve vasküler perfüzyonu yeniden oluşturarak, bu mikromühendislik platformları doku ve organ işlevselliği mümkün olmayan düzeylerde geleneksel 2D kültür sistemleri. Ayrıca in vivo doku ve organ bağlamında canlı hücrelere benzer biyokimyasal, genetik ve metabolik profillerin yüksek çözünürlüklü, gerçek zamanlı görüntüleme ve analizini sağlarlar. Ancak, organ-on-chip belirli bir sorun, tasarım, imalat ve bu mikromühendislik yongaları uygulama genellikle biyolojik odaklı akademik laboratuvarlarda eksik özel mühendislik uzmanlık gerektirir.

Biz son zamanlarda kişiselleştirilmiş bir BBB çip modeli oluşturmak için iPSC ve organ-on-chip teknolojileri kombine ettik15,16. Açıklanan teknolojik zorlukların üstesinden gelmek için, ticari olarak kullanılabilen Chip-S1, çiplerin bakımını basit ve sağlam bir şekilde otomatikleştirmek için tasarlanmış bir araç olan kültür modülüyle birlikte kullanılmaktadır (Öykünme A.Ş.). BBB çipi nöral ve endotel hücreleri arasındaki etkileşimleri yeniden oluşturur ve entegre altın elektrotlar17ile özel yapım organ yongaları ile ölçülen fizyolojik olarak ilgili TEER değerleri elde eder. Ayrıca, BBB çip düşük parasellüler geçirgenlik görüntüler, organ düzeyinde inflamatuar ipuçları yanıt, aktif efflux pompalar ifade, ve çözünür biyobelirteçleri ve biyofarmasötiklerin öngörülü taşıma sergiler. Özellikle, BBB yongaları birkaç kişiden oluşturulan sağlıklı bireyler ve nörolojik hastalıkları olan hastalar arasında beklenen fonksiyonel farklılıklar yakalar15.

Aşağıda açıklanan protokol, dinamik akış koşullarında insan iPSC tabanlı BBB yongalarının üretimi için güvenilir, verimli ve tekrarlanabilir bir yöntemi açıklamaktadır. Doğrudan BBB çipinde veya numune alma atıklarından yapilebilen tahlil ve uç nokta analizlerinin türünde rehberlik sağlanır. Böylece protokol, biyolojik ve fonksiyonel özelliklerin ve tepkilerin insanla ilgili bir modelde değerlendirilmesi için uygulanabilecek teknik lerin spektrumlarını göstermektedir.

burada iPSC tabanlı BBB çipin kısa bir açıklaması verilmiştir. İnsan iPSCs başlangıçta farklılaşmış ve nöral progenitors serbest yüzen agregalar olarak doku kültürü şişeleri yayılır, EZ-küreler denir. Chip-S116üst kanal,18,19, hücrelerin nöral ata hücreleri (iNPCs), iAstrocytes ve iNeurons karışık bir kültür içine 7 gün içinde ayırt olarak, çipin "beyin tarafı" oluşturan ayrıştırılmış EZ-küreler ile tohumlu olduğunu. İnsan iPSC'leri de doku kültürü plakalarında iBMEC'lere ayrılır. Çipin alt kanalı iBM'lerle tohumlanır ve endotel tüpü oluşturmak için gelişirken "kan tarafını" oluştururlar (Şekil 1). Üst ve alt kanalları ayıran gözenekli hücre dışı matriks (ECM) kaplı membran, kanallar ve 2 arasındaki hücre-hücre etkileşimlerinin oluşmasına izin verir) kullanıcının geleneksel Bir ışık mikroskobu kullanarak her iki kanalda da geçirgenlik tahlilleri ve görüntü hücrelerini çalıştırmasına olanak tanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. IPSC kaynaklı nöral progenitor hücrelerinin (iNPCs) üretimi

  1. Aşağıda açıklandığı gibi ve daha önce yayınlanan20,21,22iPSC kolonilerinden EZ-küreler üretin.
    1. Kültür iPSC kolonileri mTESR1 veya diğer ticari ortamda (bkz. Malzeme Tablosu)bodrum membran matris kaplı 6 kuyu plakaları (0.5 mg /plaka) üzerinde biraraya gelmek için).
    2. iPSC ortamını çıkarın ve 2 mL EZ-küre orta ile değiştirin [ESM; DMEM:F12 7:3 ile desteklenmiş 100 ng/mL temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF), 100 ng/mL epidermal büyüme faktörü, 5 g/mL heparin, ve %2 B27 takviyesi].
    3. Steril 1000 μL pipet ucu veya hücre kazıyıcının arka sıyla her bir konflufluentin altını iyice kazıyın.
    4. Serbest yüzen kürelerin kendiliğinden oluşmasını sağlamak için tüm hücreleri toplayın ve ultra düşük eki T25 şişesine yerleştirin. Bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
    5. Ortam sarıya döndüğünde küreleri her 2-3 günde bir taze ESM ile değiştirerek besleyin. Bu küreler için son derece büyüme ve bakım için önemlidir koşullu ortamda kalmasını sağlar.
      1. Şişeyi bir tüp rafına yaslayın ve kürelerin şişenin köşesine 1-2 dk kadar yer çekimiyle yerleşmesine izin verin.
      2. Yerleştikten sonra, 5 mL veya 10 mL serolojik pipet ile supernatant ın yarısını aspire edin ve taze, önceden ısıtılmış ESM ile değiştirin.
    6. Daha önce açıklandığı gibi200μm çapları küreler doğrama tarafından Passage EZ-küreler haftalık 23,20,21. EZ küreleri 25 ayete kadar korunabilir ve 8-25 pasajları arasında kullanıldığında idealdir.
  2. iNPM'lerin tek hücreli süspansiyonunun hazırlanması:
    1. Nöral farklılaşmayı tetiklemek için EZ küresini tek hücrelere ayırın.
    2. Bir T75 şişesinden doğramadan 3-4 gün sonra küreleri toplayın ve 15 mL konik bir alana aktarın, sonra 2 dakika boyunca veya tüm küreler dibe yerleşene kadar bekletin.
    3. Yerleşmiş küreleri bozmadan 5 mL'lik pipetle ESM'yi yavaşça çıkarın. 1 mL ayrışma çözeltisi ekleyin (Bkz. Malzemeler Tablosu)ve 37 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.
    4. Herhangi bir yerleşmiş küreler tedavi edilmesini sağlamak için kuluçka 5 dakika sonra dissociation çözüm ve küreler girdap.
    5. Ayrışma çözeltisini yavaşça çıkarın. 1 mL nöral farklılaşma ortamı ekleyin [NDM; DMEM: F12 ile 2% B27 eksi A vitamini, 1% N2 takviyesi, ve insan beyin kaynaklı nörotrofik faktör (hBDNF, 20 ng / mL)].
    6. 1 mL pipet ve ardından 200 μL pipet kullanarak tüm küreler ayrışıncaya kadar küreleri tek bir hücreye ayırın. Triturasyon işlemi sırasında kabarcık oluşumundan kaçının.
    7. Hemositometre kullanarak ayrışmış hücreleri sayve hücreleri 1 x 106 hücre/mL'lik son yoğunluğa kadar seyreltin. Uygulamaya bağlı olarak yoğunluğu değiştirmek mümkündür.
      NOT: 3 güne kadar kısa süreli kültürler için daha yüksek yoğunluklar (6 x 106 hücre/mL) önerilir ve 3 haftaya kadar uzun süreli uygulamalar için daha düşük yoğunluklar önerilir.
      NOT: Hücreler artık çipin üst kanalına tohum atarak "beyin tarafını" oluşturmaya hazırdır.

2. iPSC'lerin iBMEC'lere Farklılaşması

  1. 1:6 oranında 6 kuyulu bir plakanın tek bir confluent kuyusundan 6 kuyulu bir membran matris kaplı plakaya geçiş iPSC'leri. Hücrelerin 24 saat boyunca yapışmasını sağlar.
  2. Hücreleri her gün hemositometre kullanarak say.
  3. Hücreler 1.5-3.0 x 105 hücre/kuyu yoğunluğuna ulaştığında, iPSC ortamını bFGF olmadan 3 mL koşulsuz ortam [DMEM:F12 1:1, %10 nakavt serum replasmanı (KOSR), %1 esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), %0,5 glutamin takviyesi(Malzeme Tablosu)ve 100 μM β mercaptoeol] ile değiştirin. Orta orta günlük 6 gün24değiştirin.
  4. 6. günde orta ortamı endotel hücresi (EC) orta [insan endotel serumu serbest orta (hESFM) %1 trombosit-zayıf plazma türevi büyükbaş hayvan serumu, 20 ng/mL bFGF ve 10 μM all-trans retinoik asit (RA)] ile değiştirin. Orta yı 2 gün bekletin.
  5. EC ortamını çıkarın ve kuyu başına 1 mL dissociation çözeltisi ekleyin. 37 °C'de 35 dk kuluçkaya yatırın.
    NOT: Burada kullanılan dissosiasyon çözeltisinde uzun bir kuluçka süresi olarak kabul edilirken, iBMEC'ler hücre canlılığı %90'Dan daha yüksek olan bu tedaviye katlanabilirler.
  6. Hücre süspansiyonuna yavaşça pipetyaparak ve tüm hücreleri 15 mL konik bir tüpe toplayarak hücreleri kuyudan ayırın.
    NOT: Sert pipetleme kaçının. Hücreler kolayca ayrışmazsa, ek 5 dakika kuluçkaya yatırın.
  7. Accutase'i etkinleştirmek için 15 mL konik konik ortama 1 hacim li ortam ekleyin, 5 dk için 200 x g'da santrifüj, ortayı çıkarın ve 1 mL EC ortamı (bFGF ve RA olmadan) değiştirin.
  8. Hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve hücre yoğunluğunu 14-20 x 106 hücre/mL olarak ayarlayın.
    NOT: Hücreler artık "kan tarafını" oluşturmak için çipin alt kanalına tohumlenmeye hazırdır.

3. Organ çipinin mikro imalatı

  1. BBB çip modeli ve üretimi için daha önce16,18,19yapılan bir organ çipi kullanın. Uzun kanal lı organ yongası (Bkz. Malzeme Tablosu)esnek gözenekli membran ile ayrılmış iki adet üst üste bindirilmiş ve paralel mikro ölçekli kanal içeren son derece esnek polidimetilsiloksane (PDMS) elastomerden imal edilmiştir. Üst ve alt mikrokanal boyutları sırasıyla 1 mm x 1 mm ve 1,0 mm x 0,2 mm'dir. İki kanal, 40 μm aralıklı 7 μm çapında gözenek içeren 50 m kalınlığında PDMS yapımı esnek gözenekli membran ile ayrılır. Kanalları ayıran gözenekli membranın yüzey alanı 0,171cm 2'dir.

4. Fiş hazırlama

  1. Organ yongaları, talaş taşıyıcısı içinde önceden paketlenmiş olarak temin edilir ve işleme sırasında talaş hizasını bozma veya bozma ihtiyacını ortadan kaldırır. Buna ek olarak, çip taşıyıcı güvenli bir şekilde taşınabilir bir modüle ("Pod") bağlanır ve bu da kültür modülü ile çip arasında bir arayüz görevi görür.
    1. Cipslerin ambalajını %70 etanolle püskürtün ve biyogüvenlik kabinine (BSC) getirin.
    2. Ambalajı açın ve steril bir Petri kabına organ çipini yerleştirin. Çiple doğrudan temastan kaçınmak için çip taşıyıcısını yalnızca yanlardan tutarak.
    3. Taşıyıcının sekmesinin sağa dönük olduğundan emin olun(Şekil 2), ve birden çok fiş kullanırken, hepsini aynı yönde hizalayın.
    4. Taşıyıcı sekmesindeki her fişi etiketle (tam fiş hazırlama ve iş akışı Şekil 3'tegösterilmiştir).

5. Yüzey aktivasyonu ve ECM kaplama

  1. Yüzey aktivasyon çözeltisinin hazırlanması
    1. 5 mg içeren bir şişede sağlanan öykünme reaktifi 1 (ER-1) ışığa duyarlıdır. Kullanmadan hemen önce taze ER-1 çözeltisi hazırlayın. ER-1 bütünlüğü fişlerin başarılı hazırlanmasında çok önemlidir.
    2. ER-1'i kullanırken BSC'deki ışığı kapatın.
      NOT: ER-1 bir göz tahriş edici ve uygun eldiven ve göz koruması ile BSC ele alınmalıdır.
    3. ER-1 ve ER-2 reaktiflerin kullanmadan önce oda sıcaklığını (RT) dengelemesine izin verin.
    4. Boş bir steril 15 mL konik tüpü folyo ile sararak çözeltiyi ışıktan koruyun.
    5. BSC'de, tozu alttaki yemi yerleştirmek için kısa bir süre ER-1 şişesine dokunun.
    6. Şişeye 1 mL ER-2 tamponu ekleyin ve içeriğini hemen 15 mL'lik konik tüpün altına aktarın. Karıştırmak için pipet etmeyin. Konik tüpe aktarılan çözeltinin rengi kırmızı olacaktır.
    7. Adımı 5.1.6 3x tekrarlayın. Son turda, ER-1 şişe kapağı ve kapak tan kalan toz toplamak için ters, sonra konik tüp için çözelti aktarın; bu da toplam hacmi 4 mL ER-1 çözeltisine getirecektir.
    8. 15 mL konik tüpteki 4 mL ER-1 çözeltisine 0,5 mg/mL'lik son konsantrasyona 6 mL ER-2 çözeltisi ekleyin. ER-1, ER-2 çözeltisi içinde tamamen çözülmelidir.
  2. Yüzey aktivasyonu
    1. P200 pipet ve steril 200 μL filtreli pipet ucu kullanarak 200 μL ER-1 karışımı alın.
    2. Pipeti alt girişe yerleştirin ve karışım alt kanal çıkışından akmaya başlayana kadar 20 μL ER-1 karışımını alt kanaldan geçirin.
    3. Yaklaşık 50 μL ER-1 karışımı ekleyin ve üst kanal girişine yerleştirin. Karışımı üst kanal çıkışından dışarı akmaya başlayana kadar üst kanaldan geçirin.
    4. Talaş yüzeyinden tüm fazla ER-1 karışımını nazik aspirasyon ile çıkarın. ER-1 karışımının kanallardan değil, sadece talaş yüzeyinden çıkarıldığından emin olun.
    5. Ultraviyole (UV) aktivasyonundan önce kanalların hava kabarcıklarından arındığını doğrulayın. Hava kabarcıkları tespit edilirse, ER-1 karışımı ile kanal yıkayarak kabarcıklar kaldırın.
    6. Cipsiçeren açık kabı UV ışık kutusuna yerleştirin (Emulate Inc. tarafından sağlanmaktadır).
    7. UV ışık kutusunun arka daki anahtarı "Tutarlı" ayarına ayarlayın. Gücü açın ve UV aktivasyonunu başlatın. 20 dakika UV ışığı altında cips bırakın.
      NOT: Personelin UV ışığına maruz kalmasından kaçının.
    8. ER-1 karışımını her iki kanaldan da çıkarın.
    9. Her kanalı 200 μL ER-2 çözeltisi ile yıkayın.
    10. ER-2'yi her iki kanaldan da çıkarın.
    11. Her kanalı 200 μL steril soğuk Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (DPBS) ile yıkayın.
    12. Bir sonraki adıma devam edene kadar soğuk DPBS'yi kanalların içinde bırakın.
  3. Hücre dışı matriks (ECM) hazırlama ve kaplama
    1. Tek tek ECM bileşenlerini soğuk DPBS, su veya diğer çözücülerle son çalışma konsantrasyonlarıyla birleştirerek ECM çözeltisini hazırlayın. ECM çözeltisi her kullanıldığında taze olarak hazırlanmalıdır.
    2. ECM ile çipin hem üst hem de alt kanallarını kaplayın, seri yapılacak hücre tipine göre kompozisyonu belirlenir. ECM karışımı kullanıma kadar buz üzerinde muhafaza edilmelidir.
    3. "Beyin tarafını" kaplamak için laminin (50 g/mL) ve kollajen IV ve fibronektin 4:1 oranında (320:80 μg/mL) karıştırılıp bölüm 5.6'da açıklandığı gibi "kan tarafını" kaplamak için kullanın.
  4. ECM aliquots hazırlanması
    1. Soğuk DPBS'de 1 mg/mL laminin isini 50 g/mL'lik son konsantrasyona seyreltin. Aliquot ve kullanıma kadar -20 °C'de saklayın.
    2. Kollajen IV'ü %0.1 asetik asit ile 1 mg/mL konsantrasyonuna çözün. Çözeltiyi bir gecede 2-8 °C'de veya RT'de 1-3 saat veya tamamen eriyene kadar kuluçkaya yatırın.
    3. Kollajen IV:fibronektin 1 mL karışımı hazırlayın (320 l kollajen IV, 80 μL fibronektin, 600 μL steril çift distile H2O). Karışım -20 °C'de saklanabilir.
  5. Talaşların ECM ile kaplandırın
    1. Her iki kanaldan da soğuk DPBS'yi tamamen aspire edin. 100 μL kollajen IV:fibronektin çözeltisi alacak bir P200 pipet ayarlayın.
    2. Çıkışta küçük bir damlacık oluşana kadar alt kanal girişi ile çözümü tanıtın. Pipet ucunu çıkardıktan sonra girişe küçük bir damlacık bırakın.
    3. Çıkışta küçük bir damlacık oluşana kadar laminin çözeltisini üst kanal girişinden tanıtın. Pipet ucunu çıkardıktan sonra girişe küçük bir damlacık bırakın.
    4. Kabarcıkların bulunmadığından emin olmak için kanallara yakından bakın. Kabarcıklar varsa, tüm kabarcıklar kaldırılana kadar kanalı uygun ECM çözeltisi ile yıkayın.
    5. Her çip için 5.5.1-5.5.4 adımlarını tekrarlayın.
    6. 15 mL konik tüpün kapağına 1,5 mL DPBS ekleyin. Ekstra nem sağlamak ve çanak parafilm ile mühürlemek için cips ile 150 mm kültür çanak DPBS kap yerleştirin. En iyi sonuçları elde etmek için, fişleri bir gecede 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
      NOT: İstenirse, hücre çip aktivasyonu ve ECM kaplama ile aynı gün tohumlanabilir, ancak gece kuluçka tercih edilir. Cipsler, ECM'yi ekledikten ve 37 °C'de kuluçkaya yattıktan sonra 4 saat tohumlama için hazır olabilir.

6. "Beyin tarafı" kanal Tohumlama ve karışık nöral kültürlere EZ küreler ayırt

  1. Hazırlanan cipsiçeren yemeği BSC'ye getirin. Her iki kanalı da 200 μL NDM ile hafifçe yıkayın.
  2. Bağlantı noktalarıyla temastan kaçınarak, talaş yüzeyinden fazla ortam damlacıklarını dikkatlice aspire edin. Homojen bir hücre süspansiyonu sağlamak için her çipi tohumlamadan önce hücre süspansiyonuna hafifçe çalkalayın
  3. "Beyin tarafı" oluşturmak için iNC'leri üst kanala tohumlama
    1. Hücreleri (1 x 106 hücre/mL) çipin üst kanalına tohumlatın. Üst kanal girişine 30-100 μL hücre süspansiyonu içeren bir P200 ucu ekleyin ve ucu pipetten yavaşça bırakın. Boş bir P200 pipet alın, pistonu bastırın, üst kanal prizine yerleştirin ve tek hücre süspansiyonunu çipten dikkatlice çekin.
    2. Çanak kapağı ve üst kanal içinde hücrelerin tohumlama yoğunluğu ve homojen dağılımını kontrol etmek için mikroskop aktarın. Pipet ucunu yonga giriş ve çıkış bağlantı noktalarından yavaşça çıkarın.
    3. Tohumlama yoğunluğu %20 kapsama alanı olarak görünmelidir. Tohumlama yoğunluğu beklenenden daha yüksek veya daha düşükveya düzensizse, talaşları BSC'ye geri verin, kanal 2x'i 200 μL taze ortamla yıkayın ve 6.3.1 adımını tekrarlayın.
    4. Doğru hücre yoğunluğunu doğruladıktan sonra, her bir cips içip her bir fişi tohumladıktan sonra talaşları hemen 37 °C'de 2 saat kuluçka makinesine yerleştirin. Taze NDM ile bağlanmayan hücreleri yıkayın.
    5. Hücreleri 37 °C'de statik koşullarda tutun ve akışı başlatmadan önce günlük NDM değişimi en az 48 saat tutun. iBM'ler bağlandıktan sonra veya iNPC tohumlamayı takip eden bir sonraki gün iPC'ler tohumlanabilir.

7. "kan tarafı" oluşturmak için alt kanaliçine iBMECs tohumlama

  1. Hazırlanan cipsiçeren yemeği BSC'ye getirin. Alt kanalı 200 μL EC orta ile hafifçe yıkayın.
  2. Bağlantı noktalarıyla temastan kaçınarak, çipin yüzeyinden aşırı EC ortamına ait damlacıkları dikkatlice aspire ederek her iki kanalda da orta nokta yığmayı sağlar. Homojen bir hücre süspansiyonu sağlamak için her çipi tohumlamadan önce hücre süspansiyonuna hafifçe doğru layın.
  3. P200 pipetkullanarak, iBMEC hücre süspansiyonunun 30-100 μL'sini (14-20 x 106 hücre/mL) çizin ve ucu alt kanal girişine yerleştirin. Ucunu pipetten yavaşça keserek hücre içeren ucu giriş portunda bırakın.
  4. Boş bir uçla P200 pipetindeki pistonu bastırın, alt kanal prizine takın ve pipet pistonunu yavaşça serbest bırakarak tek hücreli süspansiyonu alt kanaldan dikkatlice çekin.
  5. Çipin yüzeyinden aşırı hücre süspansiyonu aspire. Kanallardan hücre süspansiyonu çıkmadığından emin olmak için giriş ve çıkış bağlantı noktalarıyla doğrudan temastan kaçının.
  6. Fişi kapatın ve tohumlama yoğunluğunu gözlemlemek için mikroskoba aktarın. Mikroskop altında 4x veya 10x'te gözlendiğinde alt kanal hücreler arasında gözlemlenebilir boşluklar bulunmamalıdır(Şekil 4).
  7. Tohumlama yoğunluğu %90 kapsama alanının altındaysa veya eşit olmayan bir şekilde dağıtılıyorsa, kanal içinde doğru yoğunluk elde edilene kadar hücre yoğunluğunu buna göre ayarlayın ve 7.2-7.6 adımlarını tekrarlayın. Doğru hücre yoğunluğunu doğruladıktan sonra(Şekil 4),kalan talaştaki tohum hücreleri. Alt kanalın üst kısmında bulunan gözenekli membran üzerine hücreleri eklemek için, her çip ters ve bir yonga beşiği dinlenin.
  8. Hücrelere nem sağlamak için 150 mm'lik tablanın içine küçük bir rezervuar (steril DPBS içeren 15 mL konik tüp kapağı) yerleştirin. 37 °C'de yaklaşık 3 saat veya alt kanaldaki hücreler bağlanınceye kadar kuluçkaya yatırın. IBMEC'ler bağlandıktan sonra (~3 saat tohumlama sonrası), alt kanalın alt kısmına hücre ekine izin vermek için talaşları dik konuma geri çevirin.

8. Akışın başlatılması

  1. Akış genellikle iBMECs 48 saat sonra tohumlama başlatılır. Bu süre iBMECs için sıkıca çip eklemek için gereklidir.
  2. Talaş üzerinden laminar akışını korumak için, gaz gidermek ve ortamın sıcaklığını dengelemek önemlidir. Orta 37 °C'lik bir su banyosunda 1 saat önceden ısıtılmalıdır.
  3. 50 mL'ye kadar ısıtılmış ortam, 15 dakika boyunca vakumlu filtrasyon sistemi altında kuluçka ile gazdan çıkarılabilir.
  4. Taşınabilir modüllerin astarlanması
    1. Taşınabilir modül ambalajının ve tepsilerin dış kısmını %70 etanol, silme ve BSC'ye aktarın. Paketi açın ve modülleri tepsiye yerleştirin. Rezervuarlarla tepsinin arkasına doğru yönlendirin.
    2. Pipet 3 mL önceden dengeli, her giriş rezervuarı için sıcak ortam. Alt kanalın giriş haznesine EC kültür ortamı ve üst kanalın üst kanal giriş haznesi ndm ekleyin(Şekil 5).
    3. Pipet 300 μL önceden dengelenmiştir, her çıkış rezervuarına sıcak ortam, doğrudan her çıkış noktası üzerinde(Şekil 5).
    4. Her tepsiye en fazla altı taşınabilir modül yerleştirin. Tepsileri kuvöze getirin ve tepsi sapı dışa bakacak şekilde kültür modülüne tamamen kaydırın.
    5. Kültür modülündeki "Prime" döngüsünü seçin ve çalıştırın. Kuluçka makinesi nin kapağını kapatın ve kültür modülünün taşınabilir modülleri astarlamasını bekleyin (~1 dk sürer). Durum çubuğunda "Hazır" yazan astar döngüsü tamamlanır. Tepsiyi kültür modülünden çıkarın ve BSC'ye getirin.
    6. Taşınabilir modüllerin BSC'deki her taşınabilir modülün alt tarafını inceleyerek başarıyla astarlandığını doğrulayın. Dört bağlantı noktasında da küçük damlacıkların varlığını arayın.
      1. Herhangi bir taşınabilir modül damlacıkları göstermiyorsa, bu modüller üzerindeki asal döngüyü yeniden çalıştırın. Tepsiye damlayan herhangi bir ortam varsa (bu daha sık çıkış bağlantı noktalarında oluşabilir), tepsiyi %70 etanol ile temizleyin.
  5. Yongaların taşınabilir modüllere bağlanması, düzenleme ve akış başlatma
    1. Kanaldaki olası kabarcıkları gidermek ve her giriş ve çıkış portunun üstüne küçük ortam damlacıkları (kanaldaki ortama göre) yerleştirmek için her çipin her iki kanalını da sıcak, eşit liyete sahip hücreye özgü kültür ortamıyla nazikçe yıkayın.
    2. Taşıyıcılarla birlikte yongaları taşınabilir modüllere yerleştirin ve her tepsiye altı ya kadar yerleştirin. Tepsileri kültür modülüne takın. Kültür modülünde uygun organ çipi kültür koşullarını (akış hızı ve streç) programla.
    3. Programlanmış koşullar "Düzenleme" döngüsü tamamlanır tamamlanmaz başlayacaktır.
      NOT: Her kanalın akış hızları bağımsız olarak kontrol edilebilir ve 0-1.000 μL/sa arasında değişen hızlara göre ayarlanabilir. BBB çipi genellikle 30 μL/h olarak kültürlenir. 30 μL/h ve 1000 μL/h'de EC media veya ESM gibi akan ortamlarda kesme kuvvetleri sırasıyla 0,01 dyn/cm2 ve 0,33 dyn/cm2'dir.
    4. Yaklaşık 2 saat süren "Düzenleme" döngüsünü çalıştırın, bundan sonra kültür modülü önceden ayarlanmış organ çipi kültür koşullarında akmaya başlayacaktır.

9. Kan-to-beyitparaselliability değerlendirme

  1. 10 μg/mL dextran-FITC (4 kDa) ile takviye edilmiş NDM hazırlayın. Bu çözüm "kan tarafı" kanalının girdisi olarak kullanılacaktır.
  2. Taşınabilir modüllerin alt kanal rezervuarlarını dextran-FITC ile desteklenen NDM ile doldurun. En üst kanal rezervuarlarını ndm ile izleme olmadan doldurun.
  3. Bir plaka okuyucusunda (genellikle 100 μL) floresan değerlendirmesi için yeterli ortam birikinceye kadar her iki sinde de üst ve alt kanalları en az 4 saat akış hızında geçirin.
  4. Üst ve alt kanalların giriş ve çıkış haznelerinden medya örnekleri toplayın. Örnekleri ışıktan koruyun.
  5. 10-12 noktalı kalibrasyon eğrisi oluşturmak için ndm'yi izleme denilmeden ndm kullanarak 10 μg/mL dextran-FITC 1:1 ile takviye edilen NDM'yi seri olarak seyreltin.
  6. Kalibrasyon eğrisi de dahil olmak üzere her numuneden 100 μL'yi siyah 96 kuyu plakasına alın ve bir plaka okuyucusu (485 nm uyarma, 530 nm emisyon) kullanarak floresan okuyun.
  7. Puygulama değerlerini hesaplamak için ölçülen değerleri aşağıdaki gibi kullanın:

Equation 1

  1. Bariyer özelliklerini değerlendirmek ve BBB çipinin hala işlevsel olduğunu doğrulamak için günlük ölçümleri alın.

10. İmmünositokimya

  1. Kimyasal duman başlığına cips getirin. P200 pipetkullanarak, dpbs'de %4 paraformaldehit (PFA) 200 μL ile her iki kanalı da perfüzyon yaparak hücreleri sabitler ve RT'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.
  2. Fiksasyonu takiben, her kanala 200 μL DPBS ve 5 dk. Tekrar DPBS yıkama 2x için inkübat.
  3. Birincil bloklama solüsyonu (PBS, %5 normal eşek serumu ve %0.1 Triton X-100) ile desteklenerek çipteki hücreleri bloke edin ve permeabilize edin). RT'de 1 saat kuluçka.
  4. Primer blokaj çözeltisinde birincil antikorları seyreltin ve gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın. BMECs belirteçleri GLUT-1 (1:100 seyreltme), ZO-1 (1:300), PECAM-1 (1:250; CD31) ve VE-kadherin (1:200). Nöral belirteçler βIII-tubulin (1:1000; Tuj1α), S100β (1:500), nestin (1:1000) ve GFAP (1:1000).
  5. Cipsleri 3x soğuk DPBS ile yıkayın.
  6. Sekonder blokaj çözeltisinde seyreltin sekonder antikorlar (Triton-X olmadan %5 normal eşek serumu ile DPBS).
  7. İkincil antikor solüsyonu her iki kanaldan da geçirin. Tipik olarak, floresan ikincil antikorlar 1:1000 seyreltilir. RT'de 1 saat boyunca ışıktan korunan kuluçka.
  8. Yongaları DPBS ile 3 kat yıkayın.
  9. 100 μL DAPI çözeltisi ile talaşı nı geçirerek hücre çekirdeklerini lekele. 5 dakika RT'de kuluçka.
  10. Yongaları DPBS ile 3 kat yıkayın.
  11. Çip, dik veya ters floresan mikroskop kullanarak görüntüleme için hazırdır. PDMS saydamlığı bozulmamış organ çipinde görüntülemeye izin verir. 10x üzerindeki büyütmeler, organ çipinin kalınlığı nedeniyle uzun çalışma mesafesi hedefleri gerektirebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 6A,B,C "beyin tarafı" üst kanal üzerinde EZ-küreler ve "kan tarafı"" alt kanal üzerinde iBMECs ile tohumlu bir BBB çip temsil eder. iBMECs ilk tohumlu ve bir gecede eklemek için izin verildi, sonra EZ-küreler tohumlu edildi. Cips daha sonra yedi gün boyunca günlük medya değişimi ile statik koşullar altında kültürlü edildi. BBB çipi daha sonra RT'de %4 PFA kullanılarak 10 dakika boyunca sabitlendi ve 3x DPBS ile yıkandı. İmmünositokimya BBB çipinde 1) nöral progenitör hücreler için bir belirteç olarak nestin, astrositler için belirteç olarak S100β veya GFAP ve nöronlar için bir belirteç olarak 3) βIII-tubulin kullanılarak yapıldı. GLUT-1 ve Pecam-1 BMECs için bir marker olarak kullanılmıştır. Görüntüleme 20x'te konfokal mikroskop kullanılarak gerçekleştirildi ve görüntüler ImageJ yazılımı için Fiji kullanılarak işlendi.

Şekil 6D, iBMEC'ler ve EZ küreleri, yalnız iBM'ler (EZ küreleri olmadan) veya EZ küreleri (iBMEC'ler olmadan) ile doldurulan organ yongaları üzerinde yapılan bir parasellüler geçirgenlik tetkikini temsil eder. "Düzenleme" döngüsünün ardından, "kan tarafının" haznesine 10 μg/mL'lik son konsantrasyona 4 kDa Dextran-FITC izleyicisi eklendi ve talaşlar bir gecede 30 μL/h'de delindi. Daha sonra, medya hem üst hem de alt kanalların giriş ve çıkış rezervuarlarından toplandı. Her numuneden 100 μL toplandı ve bir plaka okuyucu kullanılarak floresan için incelendi.

Daha da önemlisi, floresan değerlerini Dextran FITC'nin konsantrasyon değerlerine dönüştürmek için 1:1 kalibrasyon eğrisi kullanılmıştır. Değerler daha sonra geçirgenliği hesaplamak için kullanılmıştır (Puygulaması). Bu sonuçlar, iBMEC'lerin EZ-kürelerle birlikte kültürlendiğinde daha da sıkılaştırılan işlevsel bariyer özellikleri oluşturduğunu göstermektedir. Cips sadece EZ-küreler ile kültürlü, bir engel oluşturmak için başarısız. Benzer bir yaklaşım, mevcut bir ölçüm yöntemine (örn. floresan, ELISA veya kütle spektrofotometrisi) bağlı olarak, herhangi bir molekülün BBB çipi boyunca taşınmasını incelemek için kullanılabilir.

Figure 1
Şekil 1: iPSC tabanlı BBB yongasının şeması. Çipüzerinde tohumlama dan önce, iPSC'ler kültür plakalarında (i) EZ kürelerine (nöral progenitor hücreleri, iNPC'ler) ve (ii) beyin mikrovasküler endotel hücrelerine (iBT'ler) ayrılır. EZ-küreler tek hücrelere ayrılır, organ çipinin üst kanalında tohumlanır, burada daha da karışık sinir kültürleri içine "beyin tarafı" oluşturmak için ayırt. iBMECs "kan tarafında" bir kan damarı gibi bir yapı oluşturmak için organ çipinin alt kanalında tohumlu vardır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Etiketli bağlantı noktalarına sahip çip taşıyıcısındaki çipin üst görünümünün şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: iPSC tabanlı BBB yonga hazırlama ve iş akışının akış şeması. İş akışının başlamasından önce hem nöral hem de endotel hücrelerinin iPSC'lerden önceden farklılaşması gereklidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Alt kanaldaki iBMEC'lerin tohumlanması. Alt kanalda(A)tohumlamadan hemen sonra veya (B) 24 saat tohumlama sonrası, hücreler bağlandıktan sonra tohumlanmış iBMEC'lerin brightfield görüntüleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Etiketli giriş ve çıkış ortam rezervuarları ile bağlı yonga ve taşınabilir modülün şematik. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Temsili sonuçlar. IPSC tabanlı BBB çipinde immünositokimya 7 gün sonra tohumlama. EZ-küreler üst "beyin tarafı" kanalında karışık bir nöral hücre popülasyonu olarak farklılaşmıştır, dahil olmak üzere (A) S100β + (yeşil) astrositler, Nestin+ (kırmızı) nöral progenitor hücreleri yanı sıra (B) GFAP+ (kırmızı) astrositler ve βIII-tubulin+ (kırmızı) nöronlar. Ölçek çubukları = 200 μm. (C) alt "kan tarafı" kanalında tohumlanmış iBMECs GLUT-1 ve (yeşil) PECAM-1 (CD31, kırmızı) ifade. Ölçek çubuğu = 200 μm. (D) BBB talaş geçirgenliğinin değerlendirilmesi alt kanalın haznesine dekstran-FITC (4 kDa) eklenerek yapıldı. Sonuçlar, iBMEC'ler ve EZ küreleri ile tohumlanmış organ yongalarının tek başına iBMEC'lerle tohumlanmış organ yongalarına göre sıkı bir bariyer gösterdiğini göstermektedir (*p < 0.05). Sadece EZ küreleri ile tohumlanmış organ yongaları herhangi bir bariyer özelliği göstermez (***p < 0.001; Tukey'nin çoklu karşılaştırma testi ile tek yönlü ANOVA). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

NVU'daki organ-on-chip teknolojisi ve iPSC kaynaklı hücrelerin birleşimi, insan BBB'nin doğru bir şekilde modellemesi için umut vaat ediyor. Burada, son zamanlarda yayınlanan iPSC tabanlı BBB çip16basit ve sağlam uygulama için ayrıntılı bir protokol sağlar. Tohumlama paradigmasının genel bakışı ve zamanlaması Şekil 3'tegösterilmiştir. BBB modellemesi için uygun bariyer fonksiyonlarını elde etmek ve sürdürmek, homojen bir iBMEC monolayer oluşturmak ve bütünlüğünü korumak çok önemlidir. Fonksiyonel bir monolayer üretimine yönelik ilk adım, ECM proteinlerinin bağlanmasını sağlayan polar olmayan PDMS yüzeyinin kimyasal aktivasyonudur. Yüzey aktivasyon reaktifleri yeniden yapılanma üzerine hızla bozulur, bu da hücrelerin optimal olmayan bağlanmasına neden olabilir. Bu nedenle reaktifleri taze tutmak ve süreç boyunca ışıktan korumak önemlidir.

UV aktivasyonu sırasında (bölüm 5.2), tutarlı ECM kaplama ve homojen hücre eki elde etmek için reaktifler her kanal içinde eşit olarak dağıtılmalıdır. Bu protokolde sağlanan ECM kompozisyonları ve konsantrasyonları belirli hücre türlerine (yani iBMEC'ler ve EZ-küre kaynaklı nöral progenitor hücreler) optimize edilmiştir. Hücre bileşimini değiştirmek mümkündür, ancak optimizasyon gerektiren diferansiyel ECM koşulları gerektirebilir. ECM kaplamayı takiben, iBT'lerin düzgün bir şekilde tohumlamaları için çok önemlidir. Yüksek hücre tohumlama yoğunluğu (>14 x 106 hücre/mL) tam bir monolayer elde etmek için gereklidir. Tam hücre birleşimi elde etmek için başarısız olursa, daha fazla 20 x 106 hücre / mL tohumlama sırasında hücre süspansiyon yoğunluğunu artırmak için tavsiye edilir.

Laminar akışı daha önce iBMEC olgunlaşma geliştirmek için önerildi15 ve mikroakışkan platformu tarafından sağlanan avantajları sağlamak için vazgeçilmezdir. Ancak, çipin kanallarından akan mikrokabarcıklar fiziksel olarak stres yapabilir ve yerleşik hücreleri ayırabilir, bu da BBB çip bütünlüğünün bozulmasına yol açabilir. Laminar akış sırasında mikrokabarcık oluşumunu önlemek için perfüzyon başlamadan önce ortamın dengelemesi çok önemlidir. Equilibration kullanmadan önce orta ön ısıtma ve gaz giderme gerektirir.

Kişiselleştirilmiş yongaların üretimi hem insan iPSC kaynaklı iBM'ler hem de iNPC'ler kullanılarak mümkün kılınmıştır. iBMECs farklılaşması kısa ve oldukça basit iken24,22, nöral hücrelere iPSCs farklılaşması21,25 daha zordur. Ancak, çipin "beyin tarafında" bulunan nöral hücreler herhangi bir nöral hücre tipi ile değiştirilebilir, birincil nöral hücreler veya iPSC türetilmiş motor nöronlar gibi16. Benzer şekilde "iyi niyetli" endotel hücreleri, iBMECs farklı nöral co-kültürlere yanıt olarak gen ekspresyonunda plastisite görüntüler. Bu nedenle, bu esneklik çip üzerinde çeşitli NUS'ların gelecekte gelişmesine neden olabilir. Hücre tohumlama zamanlaması ve düzeni ayarlayarak sistemin ek esneklik elde edilebilir. iBM'ler nöral hücrelerden önce veya sonra tohumlanabilir, bu da iBTE'lerin nöral hücrelerin tohumlanmasından hemen sonra veya EZ-kürelerinin çip ortamında daha olgun sinir kültürleri olarak farklılaşmasından sonra tohumlamayı mümkün kılar. Bu özellikle önemlidir, iPSC kaynaklı nöral hücrelerin olgunlaşmamış doğası göz önüne alındığında. EZ-küreler erken nöral atalar olduğu göz önüne alındığında, uzun farklılaşma süreleri de astrositler ve nöronların artan bir yüzdesi neden olabilir.

Protokolde eksik olan bir bileşen, fizyolojik NVU'da önemli bir bileşen sağlayan perivasküler perisitlerdir. Perisit benzeri hücrelere iPSCs farklılaşma son gelişmeler26,27 bu ek hücre türünün giriş izin verecek, böylece kişiselleştirilmiş doğasını korurken BBB geliştirilmiş bir kopyasını sağlayan.

IBMECs daha önce hücresel belirteçleri ifade dahil Olmak üzere BBB modeli için kritik olan çeşitli özellikleri göstermek için gösterilmiştir, TEER kurulması ve efflux pompaların fonksiyonel etkinliği28,24,5. Ancak, moleküler analizler bu hücrelerin de çeşitli epitel belirteçleri ifade ortaya koymuştur15. Gelişmiş fonksiyon ve endotel belirteç ekspresyonu gösteren iBMEC kuşağındaki gelişmeler son zamanlarda29,30. Burada sunulan paradigmayı takiben, bu potansiyel olarak geliştirilmiş hücreler gelecekteki uygulamalar için BBB çip modeline kolayca dahil edilebilir. Burada açıklanan esnek ama sağlam platform hem hastalık modellemesini hem de yeni CNS ilaçlarının geliştirilmesini ve değerlendirilmesini kolaylaştırabilir.

Bu protokol belirli bir ticari ürüne dayansa da, ek ticari şirketler alternatif avantajlar sunabilecek çeşitli mikrofizyolojik platformlar sunmaktadır31. Buna ek olarak, mikroakışkan Organ yongaları "evde" üretim için protokoller de mevcuttur32 ve TEER elektrotlar entegrasyonu da dahil olmak üzere daha modülerlik sunabilir17, burada kullanılan platformdan eksik.

Organ-on-cips mevcut hücre kültürlerinin fizyolojik bağlamını geliştirmek için alternatif bir yaklaşım olarak tanıtıldı33. Ancak, bu teknolojinin uygulanması genellikle biyolojik odaklı laboratuvarlarda eksik olan özel mühendislik becerileri gerektirir. Burada kullanılan gibi ticari olarak kullanılabilen bir yonga platformu, daha az modülerlik ve daha geniş bir kullanıcı dizisi tarafından uygulanabilen daha az sağlamlık ve tekrarlanabilirlik sağlar. Ayrıca, bir mikroakışkan çip üzerinde laminar akış uygulaması şırınga veya peristaltik pompalar, karmaşıklık başka bir düzeyde tanıttı uygulanmasına dayanır. Bu engelin üstesinden gelmek artık birden fazla çipin eşzamanlı perfüzyonu sağlayan kültür modülünün uygulanmasıyla daha kolay.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Cedars-Sinai Emulate, çalışmanın mikroakışkan Organ yongaları üreten şirket bir azınlık hisse senedi hisse sahibi. Cedars-Sinai'nin bir subayı da Emulate'in Yönetim Kurulu'nda görev yapmaktadır. Taklit bu araştırma için hiçbir mali destek sağladı. Cedars-Sinai ve Emulate bu çalışma ile ilgili patent leri var.

Acknowledgments

Dr. Soshana Svendsen'e eleştirel kurgu için teşekkür ederiz. Bu çalışma İsrail Bilim Vakfı hibe 1621/18, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (MOST), İsrail 3-15647, Kaliforniya Rejeneratif Tıp hibe ID DISC1-08800, Sherman Aile Vakfı, NIH-NINDS hibe 1UG3NS105703 ve ALS Derneği hibe 18-SI-389 tarafından desteklenmiştir. AH, Wallenberg Vakfı tarafından finanse edilmiştir (hibe numarası 2015.0178).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accutase EMD Millipore SCR005 Dissociation solution
B27 Gibco 12587010
Bfgf Peprotech 100-18B
Chip-S1 Emulate Inc Chip-S1 Organ-Chip
Collagen IV Sigma C5533
DAPI Invitrogen D3571
Dextran-FITC Sigma 46944
DMEM: F12 Thermo Fisher Scientific 31330038
Donkey serum Sigma D9663
Emulate Reagent 1 (ER-1) Emulate Inc ER-1
Emulate Reagent 2 (ER-2) Emulate Inc ER-2
Fibronectin Sigma F1141
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Dako Z0334
GLUT-1 Invitrogen MA5-11315
Glutamax Life Technologies 35050038 Glutamine supplement
hBDNF Peprotech 450-02
KOSR Thermo Fisher Scientific 10828028
Laminin Sigma L2020
Matrigel Corning 354234 Basement membrane matrix
mTeSR1 StemCell Technologies, Inc. 85851
NEAA Biological industries 01-340-1B
Nestin Millipore MAB353
NutriStem Biological industries 05-100-1A Alternate media
PECAM-1 Thermo Fisher Scientific 10333
Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP) Biomedical Technologies J64483AB
Retinoic acid (RA) Sigma R2625
S100β Abcam ab6602
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit Millipore SCGP00525
Triton X-100 Sigma X100
ZO-1 Monoclonal Antibody Invitrogen 33-9100
βIII-tubulin (Tuj1α) Sigma T8660
β-mercaptoethanol Life Technologies 31350010

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier endogenous transporters as therapeutic targets: a new model for small molecule CNS drug discovery. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 19 (8), 1059-1072 (2015).
  2. Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Modeling the blood-brain barrier: beyond the endothelial cells. Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).
  3. Jamieson, J. J., Linville, R. M., Ding, Y. Y., Gerecht, S., Searson, P. C. Role of iPSC-derived pericytes on barrier function of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells in 2D and 3D. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 15 (2019).
  4. El-Habashy, S. E., et al. Novel treatment strategies for brain tumors and metastases. Pharmaceutical Patent Analyst. 3 (3), 279-296 (2014).
  5. Lim, R. G., et al. Huntington's disease iPSC-derived brain microvascular endothelial cells reveal WNT-mediated angiogenic and blood-brain barrier deficits. Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).
  6. Dumitrescu, A. M., Liao, X. H., Weiss, R. E., Millen, K., Refetoff, S. Tissue-specific thyroid hormone deprivation and excess in monocarboxylate transporter (mct) 8-deficient mice. Endocrinology. 147 (9), 4036-4043 (2006).
  7. Spencer, J. I., Bell, J. S., DeLuca, G. C. Vascular pathology in multiple sclerosis: reframing pathogenesis around the blood-brain barrier. Journal of Neurology and Neurosurgical Psychiatry. 89 (1), 42-52 (2018).
  8. Yamazaki, Y., Kanekiyo, T. Blood-brain barrier dysfunction and the pathogenesis of Alzheimer's disease. International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1965 (2017).
  9. Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507 (2014).
  10. Heng, M. Y., Detloff, P. J., Albin, R. L. Rodent genetic models of Huntington disease. Neurobiology of Disease. 32 (1), 1-9 (2008).
  11. Ho, R., et al. ALS disrupts spinal motor neuron maturation and aging pathways within gene co-expression networks. Nature Neuroscience. 19 (9), 1256 (2016).
  12. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  13. Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic tumor networks for screening drug delivery systems. Journal of controlled release. 201, 49-55 (2015).
  14. Delsing, L., et al. Barrier properties and transcriptome expression in human iPSC-derived models of the blood-brain barrier. Stem Cells. 36 (12), 1816-1827 (2018).
  15. Park, T. E., et al. Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies. Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).
  16. Vatine, G. D., et al. Human iPSC-Derived Blood-Brain Barrier Chips Enable Disease Modeling and Personalized Medicine Applications. Cell Stem Cell. 24 (6), 995-1005 (2019).
  17. Henry, O. Y. F., Villenave, R., Cronce, M. J., Leineweber, W. D., Benz, M. A., Ingber, D. E. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
  18. Sances, S., et al. Human iPSC-derived endothelial cells and microengineered organ chip enhance neuronal development. Stem Cell Reports. 10 (4), 1222-1236 (2018).
  19. Workman, M. J., et al. Enhanced utilization of induced pluripotent stem cell–derived human intestinal organoids using microengineered chips. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 669-677 (2018).
  20. Ebert, A. D., et al. EZ spheres: a stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs. Stem Cell Research. 10 (3), 417-427 (2013).
  21. Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. A cGMP-applicable expansion method for aggregates of human neural stem and progenitor cells derived from pluripotent stem cells or fetal brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (88), e51219 (2014).
  22. Vatine, G. D., et al. Modeling psychomotor retardation using iPSCs from MCT8-deficient patients indicates a prominent role for the blood-brain barrier. Cell Stem Cell. 20 (6), 831-843 (2017).
  23. Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. Journal of Neuroscience Methods. 85 (2), 141-152 (1998).
  24. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2014).
  25. Canfield, S. G., et al. An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).
  26. Jamieson, J. J., Gerecht, S. Chipping Away at Blood-Brain-Barrier Modeling. Cell stem cell. 24 (6), 831-832 (2019).
  27. Faal, T., et al. Induction of Mesoderm and Neural Crest-Derived Pericytes from Human Pluripotent Stem Cells to Study Blood-Brain Barrier Interactions. Stem Cell Reports. 12 (3), 451-460 (2019).
  28. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783 (2012).
  29. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), 1701679 (2017).
  30. Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).
  31. Wevers, N. R., et al. A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport. Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 23 (2018).
  32. Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. 8 (11), 2135 (2013).
  33. Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y., Ingber, D. E. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).

Tags

Gelişimbiyolojisi Sayı 157 kan beyin bariyeri BBB mikroakışkan org-on-chip OoC nörovasküler birim NVU iPSC iPS hücreleri astrositler kişiselleştirilmiş tıp hassas tıp
İnsan iPSC Tabanlı Kan-Beyin Bariyer Chip Üretimi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jagadeesan, S., Workman, M. J.,… More

Jagadeesan, S., Workman, M. J., Herland, A., Svendsen, C. N., Vatine, G. D. Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip. J. Vis. Exp. (157), e60925, doi:10.3791/60925 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter