大鼠运动皮层中的激光诱发脑损伤

Summary

此处介绍的协议显示了创建脑损伤啮齿动物模型的技术。此处描述的方法使用激光照射和目标运动皮层。

Abstract

在实验啮齿动物模型中诱导中风的一种常见技术涉及使用导管的中脑动脉（MCA）的瞬态（通常表示为 MCAO-t）或永久（指定为 MCAO-p）闭塞。然而，这种普遍接受的技术有一些局限性，从而限制了其广泛使用。该方法的中风诱导通常表现为缺血区定位和大小变化大、出血周期性发生、死亡率高等。此外，成功完成任何临时或永久程序都需要专业知识，通常持续约 30 分钟。在该协议中，提出了一种激光辐照技术，可以作为诱导和研究啮齿动物模型中脑损伤的替代方法。

与对照组和MCAO组大鼠相比，激光诱导的脑损伤在体温、梗塞量、脑水肿、颅内出血和死亡率方面变化减小。此外，使用激光引起的损伤只对运动皮层的脑组织造成损害，这与在 MCAO 实验中不同，在 MCAO 实验中观察到运动皮层和石体组织的破坏。

这项调查的结果表明，激光照射可以作为诱导运动皮层脑损伤的替代和有效的技术。该方法还缩短了完成该过程的时间，不需要专家处理程序。

Introduction

从全球程度上，中风是第二大死因，也是第三大残疾^原因。中风还会导致严重的残疾，往往需要医务人员和亲属的额外护理。因此，需要了解与疾病相关的并发症，并提高取得更积极结果的潜力。

使用动物模型是了解疾病的第一步。为了确保最佳的研究成果，典型的模型将包括简单的技术、可负担性、高可重复性和最小的可变性。缺血性中风模型中的决定因素包括脑水肿体积、梗塞大小、血脑屏障（BBB）分解程度以及通常通过神经严重性评分²评估的功能损伤。

啮齿动物模型中应用最广泛的中风诱导技术暂时或永久地遮挡了中脑动脉（MCA）。³这种技术产生一个类似于人类的中风模型：它有一个五角体围绕中风区域，是高度可重复的，并调节缺血持续时间和再灌^注4。然而，MCAO方法有一些并发症。该技术容易颅内出血和损伤的ipilater视网膜与视觉皮层功能障碍和常见的体温过高，往往导致额外的结果^{5，6，7。,6,7}其他限制包括诱发性中风的高变异性（由于缺血可能扩展至意外区域（如外部胡萝卜动脉区域）、MCA 的闭塞不足以及过早再灌注。此外，不同菌株和大小的大鼠表现出不同的梗塞卷^8。除了上述所有缺点外，MCAO模型不能诱发脑深区域的小孤立中风，因为它在技术上限制了其对导管最小体积的要求。这使得对替代模型的需要变得更加关键。另一种方法，光膜形成，提供了一个可能的替代MCAO程序，但没有提高效率^9。此技术以光描边为目标，并针对以前的模型提供了一些改进。然而，光膜形成需要与继发性复合9相关的侵入性颅骨^切除术。

鉴于概述的缺点，这里介绍的协议提供了一种能够替代激光技术，诱导啮齿动物的脑损伤。激光技术的作用机制基于激光对活组织产生光热效应，导致人体组织吸收光束并转化为热量。使用激光技术的优点是它的安全性和操作方便性。激光产生热量以阻止出血的能力使它在医学上非常重要，而它在给定的满足点上放大不同光束的能力确保激光避免破坏影响目标点^10的健康组织。该协议中使用的激光束可以通过低液体介质（如骨骼），而不会释放其能量和/或造成任何破坏。一旦它达到高液体介质，如脑组织，它消耗其能量来摧毁目标组织。因此，这项技术只能在大脑的适当区域诱发脑损伤。

这里介绍的技术显示了巨大的能力来调节其辐照水平，产生从一开始所选择的脑损伤变异。与影响皮层和线状体的原始 MCAO 不同，激光技术能够调节脑损伤的影响，仅对预期的运动皮层造成伤害。本文提供了激光诱发脑损伤方案，并总结了对大鼠大脑皮层的手术具有代表性的结果。

Protocol

下列程序是按照欧洲共同体实验动物使用准则进行的。这些实验还得到了内盖夫本-古里安大学动物护理委员会的批准。

1. 动物选择和准备

1. 选择65只重达300至350克的雄性Sprague-Dawley大鼠，此程序没有男性病理学。较小的尺寸对 MCAO 程序造成技术困难。
2. 每个笼子分配3只老鼠，让它们适应至少3天。

2. MCAO 程序

1. 选择25只大鼠为MCAO，允许10-20%的死亡率与程序^11。
2. 使用标准技术执行 MCAO，如前面详细描述^{的 12}。

3. 激光引脑损伤实验程序

1. 将20只大鼠分配给一个标记为激光组的组，将20只大鼠分配给另一组对照组（Sham-操作）。
2. 激光组大鼠以下列方式在 50J X 10 点进行激光照射：
   1. 麻醉大鼠与2%异氟的氧气混合物，允许自发通风。通过用钳子捏住尾巴，检查是否有足够的麻醉深度，以查看没有退气反射。
   2. 在整个实验过程中，使用直肠温度调节加热垫，将大鼠的核心体温保持 37°C。
   3. 用剃须刀去除局部头发，用 70% 酒精和 0.5% 氯西丁葡萄糖酸盐进行消毒。再重复两次消毒步骤。
      注：手术切口的大小应约为3厘米。在切口区域周围去除至少 2 厘米的头发。
   4. 将大鼠放在立体式头架上，放在易发位置，并做一个 3 厘米的切口，横向反射头皮，并露出布雷格玛和兰姆达之间的区域。
   5. 通过鼻锥保持麻醉。
   6. 使用Neodymium-YAG（Nd-YAG）激光（峰值波长1064nm）对右半球上方头骨的暴露区域施用50个J X 10点，脉冲持续时间为1秒。
   7. 确保仪器的激光生成部分与暴露区域的距离为 2 mm，以产生激光束。在仔细评估了不同的能量/表面组合后，选择了 50 J X 10 点。这种组合是有效的，不会造成骨质破坏后，给给不到一秒^10。
      注：2 mm 是激光束的端子（从它通过的光缆）和头骨之间的距离。在使用对焦镜头的情况下，应计算距离时应考虑到镜头倾斜的角度，以将光束对焦在所需的损坏区域。使用激光设备时，包括适当的训练和眼睛保护，确保适当的安全。
   8. 将大鼠从设备中取出，用3-0丝质手术缝合线关闭头皮。
   9. 停止麻醉，将大鼠返回到笼子进行恢复。局部管理0.1 mL 0.25%的百吉瓦卡因，在手术后立即减少术后疼痛。
      注：如果执行正确，整个过程应持续少于 5 分钟。
3. 观察大鼠在麻醉后恢复期间是否有危难迹象。在麻醉出现之前，给0.01mg/kg肌肉内丁丙诺啡进行术后镇痛，并持续重复剂量每12小时至少48小时。
4. 使控制大鼠在相同的条件下，而不受激光照射。

4. 神经严重性评分 （NSS）

1. 用43分¹³评估激光诱发脑损伤后24小时的神经严重性评分。测试动物的神经缺陷，行为障碍，光束平衡任务和反射，分配更高的分数，更严重的残疾，如前面^{详述的13。}

5. 受伤后操作

1. 在NSS评估后，通过让大鼠暴露在20%的氧气和80%的二氧化碳（通过灵感）中，对大鼠进行安乐死，并转心用肝素磷酸盐缓冲盐水（PBS，0.9%NaCl）使大鼠心动。
   注：确保 CO₂ 按照机构动物护理和使用委员会准则以预定速度交付。此步骤也可以在 5% 异氟兰麻醉下执行。
2. 收获大脑，并准备进一步检查，如前面的协议^11所述。
3. 评估亚脑出血（SAH）通过视觉检查整个大脑后，从头骨分离。如有必要，可以使用显微镜或放大镜用于此目的。

6. 脑损伤评估

1. 通过TTC染色确定脑梗塞体积和脑水肿
   注：2，3，5-三氯乙烯（TTC）染色是脑梗塞检测的一个方便的程序^11。
   1. 将收获的大脑切成6个日冕片，每个2毫米厚。
   2. 在 0.05% TTC 的 37 °C 下，从每个大脑孵育出一组切片 30 分钟。
   3. 染色后，用分辨率为 1600 X 1600 dpi的光学扫描仪扫描切片。
   4. 固定大脑切片的未污染区域被定义为梗塞^12。
   5. 使用图像处理软件（例如，自由软件 图像J）测量6个日冕切片中每个未污染的梗塞区、ipsi和反向半球。
   6. 计算梗塞体积占大脑总数的百分比：
      
   7. 使用卡普兰方法计算脑水肿：
      
2. 确定血脑屏障 （BBB） 破损的程度
   注：在激光引起的脑损伤后评估 BBB 破损 24 小时，如下所示：
   1. 管理2%埃文斯蓝与4 mL/kg盐水溶液静脉注射到大鼠通过可管的尾静脉，并允许溶液循环1小时。
   2. 安乐死大鼠暴露给20%的氧气和80%的_CO2（ 通过灵感）24小时后，最后NSS，如前面^描述的13。
   3. 收获血管内局部染料，如下所示：
      1. 用手术针和手术剪刀打开老鼠的胸膛。
      2. 使用 110 mmHg 通过左心室用冷却 0.9% 盐水对动物进行接触，直到从右中庭获得无色灌注液。
   4. 收获大脑，把它们切成2毫米的切片。
   5. 将左脑切片与右部分开，分别评估受伤和非受伤的半球。
   6. 称重，用砂浆和害虫均质，然后用50%三氯乙酸孵育脑组织24小时。
   7. 将均质的脑片以10，000μg 离心 20分钟。
   8. 将离心大脑中1 mL的上流液与1：3时1.5 mL的96%乙醇混合，并使用荧光探测器在620nm激发波长（10 nm带宽）和680nm发射波长（10 nm带宽）时评估血脑屏障断裂。
      注：两组大鼠都经过相同的协议来确定BBB分解。

Representative Results

对照组或实验组无死亡或SAH登记（表1）。MCAO组的死亡率和SAH死亡率均达到20%。

尽管两组大鼠的变异性不同（表1），但两组大鼠的相对体温变化也相似。

与假操作对照组（1 ± 0.3）相比，激光（16 ±1.1）和MCAO（20±1.5）型号的NSS明显恶化。 表 1;p<0.01）。

与假操作对照组（2.4% = 0.3% 对 0.5% = 0.1） 相比，激光引起的脑损伤也导致目标半球的梗塞体积显著增加; 表 2 和 图 1A;p<0.01），根据曼-惠特尼U测试。然而，与 MCAO 技术相比，激光模型的法化体积较小（2.4% = 0.3 与 9.9% = 2.9）。

脑水肿确定24小时脑损伤后，如图 1B 和 表2所示。激光诱发脑损伤模型与假操作对照组（3.4% = 0.6 对 0.7% = 1.2）在脑水肿方面没有差异。激光模型和 MCAO 技术（3.4 ± 0.6 vs 7 = 2.6°）在脑水肿方面存在显著差异。数据以均值 = SEM 表示。

与假操作对照组相比，激光引起的脑损伤和MCAO技术在非损伤半球（563纳克/克=66和1176纳克=168，对141纳克/克=14）的BBB破损显著增加;图2A和表2;p<0.01） 和目标半球 （2204 ng/g = 280 和 2764 ng/g = 256，分别与 134 ng/g = 11;图2B和表2;p<0.01）。

图3显示了对大鼠大脑的 组织学检查。

	Nss		温度，°C		SAH， %	死亡率， 百分比
组	均值 = Sem	变异性，百分比	均值 = Sem	变异性，百分比
沙姆操作控制	1 ± 0.3	97	37.2 × 0.1	59	0	0
激光 50J x10	16 × 1.1*	30	37.4 × 0.1	84	0	0
p - mcao	20 × 1.5*	37	38.3 = 0.1*	129	20*	20*

表1：NSS、体温、亚拉奇诺类出血和死亡率的评估。

	Bbb		已法处理卷		脑水肿
组	均值 = Sem	变异性，百分比	均值 = Sem	变异性，百分比	均值 = Sem	变异性，百分比
沙姆操作控制	134 × 11	25	0.5 × 0.1	77	0.7 × 1.2	573
激光 50J x10	2204 × 280*	40	2.4 × 0.3*	34	3.4 × 0.6	58
p - mcao	2764 × 256*	29	9.9 × 2.9*	92	7 × 2.6*	115

表2：BBB分解、梗塞区和脑水肿的评估。 \ p < 0.01

图1：与MCAO模型和假操作控制相比，激光模型24小时脑损伤的评估。 （A） 评估梗塞量。与假操作控制（*p<0.01）相比，激光模型中的梗塞体积增加了。但是，与 MCAO 模型 （*p<0.01） 相比，激光模型中的法能体积较小。（B） 脑总水肿评估。与激光模型或假操作控制相比，MCAO 模型中脑水肿增加。激光模型和假操作控制在脑水肿方面没有区别。数据以百分比为单位对反面半球进行测量，并 表示为均值 = SEM。请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：与虚假控件相比，BBB 分解的程度。（A） 反面（非伤害）半球。与假操作对照组（*p<0.01）相比，激光和 MCAO 模型在非伤害半球的 BBB 破损显著增加。（B） 伊普西拉特拉尔（受伤）半球.与假操作控制（*p<0.01）相比，激光和MCAO模型中的异位BBB分解有区别。请单击此处查看此图的较大版本。

图3：从假、激光和MCAO组对大鼠大脑进行组织学检查。请单击此处查看此图的较大版本。

Discussion

鉴于激光组没有死亡或SAH，可以公平地假设激光技术是微创的。死亡和SAH的主要死因是血管损伤，导致颅内压力升高（ICP），如最初的MCAO技术^10所示。激光组没有死亡和SAH可能是由于激光的特定影响：它们对血管没有直接影响，在泄漏时可诱发凝固。低梗塞体积和脑水肿也有助于尽量减少死亡风险。鉴于最初的用于触发中风（瞬态和永久性）的 MCAO 技术已证明可导致死亡和 SAH^6，因此使用激光应被视为诱导脑损伤的合适技术。

激光组的低体温结果表明，激光技术不会遮挡调节体温的下丘脑动脉，因为原来的MCAO通常^为7，这支持了激光技术更具针对性的理论。所调查的参数可变性低表明，使用激光诱发脑损伤的一致性，但这种精细的结果在很大程度上取决于功率的选择。充足的功率提供所需的结果，而很少或多余的校准可能会导致性能不足或过余，这在这两种情况下都是有害的。然而，瞄准目标的能力仍然使技术风险降低。因此，正确的处理使得使用激光技术能够更容易地获得精确的结果，并调节所需的效果方法。

激光技术的精度和功效明显地表现在它能够只打击运动皮层而不对线状体造成损害，这表明激光技术可以产生局部损伤，而MCAO^{10几乎不可能达到这种损伤}。激光技术的这种可实现的结果是由于能够调节激光束及其功率，使激光方法成为诱导更小、外周和深度和定义脑损伤的模型技术，而MCAO无法获得这种技术。操作激光机的简单性使它非常可取。与需要艰苦培训和专家的 MCAO 技术不同，使用激光更简单，无需专家或昂贵的培训。激光技术的使用可以促进研究，有助于发现更好的结果比MCAO方法单独。

就激光技术的局限性而言，使用激光束不会产生与急性血管闭塞性中风完全相似的脑损伤。具体来说，激光在目标站点产生直接的组织疤痕，可与数天前的血管闭塞性中风相媲美。因此，该技术可能不适合评估旨在预防中风扩散的药物，但应是评估长期运动、认知和行为损伤的孤立运动皮层中风的理想之选。使用少量大鼠进行这项研究也是一个限制，每组用于大脑采集和检查中风大小、脑水肿程度、BBB破损和SAH存在的大鼠数量（n = 10）只有一半。

我们的技术和其他激光方法之间缺乏比较也可能被视为一种限制。我们仔细考虑了执行比较方法，但决定不这样做，因为评估这些其他激光方法造成的损害是困难的。例如，光膜形成技术⁶ 造成弱损伤，因此很难评估脑肿胀和其他可能发生的情况。此外，在激光技术中使用颅骨切除术治疗缺血是有问题的，因为颅骨切除术是非常侵入性的，可以增加BBB的渗透性，导致额外的脑损伤，与中风不相关。评估这种损害，以便与我们的方法进行比较几乎是不可能的。激光模型诱导中风与辐射通过头骨没有颅骨切除术。

和许多模型一样，激光模型也有其优点和局限性，最明显的缺点是无法像其他模型那样精确地模仿人体的笔触。然而，大多数参数的主要结果变化性低，精度高，可负担性强，诱发小脑损伤的能力，以及直接的应用，使它成为啮齿动物脑损伤的合适替代技术。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	SIGMA - ALDRICH	298-96-4
50% trichloroacetic acid	SIGMA - ALDRICH	76-03-9
Brain & Tissue Matrices	SIGMA - ALDRICH	15013
Cannula Venflon 22 G	KD-FIX	1.83604E+11
Centrifuge Sigma 2-16P	SIGMA - ALDRICH	Sigma 2-16P
Compact Analytical Balances	SIGMA - ALDRICH	HR-AZ/HR-A
Digital Weighing Scale	SIGMA - ALDRICH	Rs 4,000
Dissecting scissors	SIGMA - ALDRICH	Z265969
Eppendorf pipette	SIGMA - ALDRICH	Z683884
Eppendorf Tube	SIGMA - ALDRICH	EP0030119460
Ethanol 96 %	ROMICAL		Flammable Liquid
Evans Blue 2%	SIGMA - ALDRICH	314-13-6
Fluorescence detector	Tecan, Männedorf Switzerland	model Infinite 200 PRO multimode reader
Heater with thermometer	Heatingpad-1	Model: HEATINGPAD-1/2
Infusion Cuff	ABN	IC-500
Isofluran, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017
Multiset	TEVA MEDICAL	998702
Olympus BX 40 microscope	Olympus
Optical scanner	Canon	Cano Scan 4200F
Petri dishes	SIGMA - ALDRICH	P5606
Scalpel blades 11	SIGMA - ALDRICH	S2771
Sharplan 3000 Nd:YAG (neodymium-doped yttrium aluminum garnet) laser machine	Laser Industries Ltd
Stereotaxic head holder	KOPF	900LS
Sterile Syringe 2 ml	Braun	4606027V
Syringe-needle 27 G	Braun	305620