Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

إصابة الدماغ الناجمة عن الليزر في القشرة الحركية للفئران

doi: 10.3791/60928 Published: September 26, 2020
* These authors contributed equally

Summary

البروتوكول المعروض هنا يظهر تقنية لخلق نموذج القوارض من إصابات الدماغ. الطريقة الموصوفة هنا تستخدم تشعيع الليزر وتستهدف القشرة الحركية.

Abstract

تتضمن تقنية شائعة لحث السكتة الدماغية في نماذج القوارض التجريبية انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCA) العابر (غالباً ما يشار إليه باسم MCAO-t) أو دائم (يُعيّن باسم MCAO-p). غير أن هذه التقنية المقبولة عموماً لها بعض القيود، مما يحد من استخدامها على نطاق واسع. وغالبا ما يتميز تحريض السكتة الدماغية من خلال هذه الطريقة من قبل ارتفاع التباين في توطين وحجم منطقة الإقفاري، والحوادث الدورية من النزيف، وارتفاع معدلات الوفيات. كما أن النجاح في إنجاز أي من الإجراءات العابرة أو الدائمة يتطلب خبرة وغالباً ما يستمر لمدة 30 دقيقة تقريباً. في هذا البروتوكول، يتم تقديم تقنية تشعيع الليزر التي يمكن أن تكون بمثابة وسيلة بديلة لاستحثاء ودراسة إصابات الدماغ في نماذج القوارض.

بالمقارنة مع الفئران في مجموعات التحكم وMCAO ، أظهرت إصابة الدماغ عن طريق تحريض الليزر انخفاض التباين في درجة حرارة الجسم ، وحجم المزارع ، وذمة الدماغ ، والنزيف داخل الجمجمة ، والوفيات. وعلاوة على ذلك، تسبب استخدام إصابة ناجمة عن الليزر في تلف أنسجة المخ فقط في القشرة الحركية على عكس تجارب MCAO حيث لوحظ تدمير كل من القشرة الحركية والأنسجة النسترية.

تشير النتائج التي توصل إليها هذا التحقيق إلى أن التشعيع بالليزر يمكن أن يكون بمثابة تقنية بديلة وفعالة للحث على إصابة الدماغ في القشرة الحركية. الأسلوب أيضاً تقصير الوقت لإكمال الإجراء ولا يتطلب معالجات الخبراء.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

على الصعيد العالمي، السكتة الدماغية هي السبب الرئيسي الثاني للوفاة والسبب الرئيسي الثالث للإعاقة1. كما تؤدي السكتة الدماغية إلى إعاقة شديدة، وغالباً ما تتطلب رعاية إضافية من الطاقم الطبي والأقارب. لذلك، هناك حاجة لفهم المضاعفات المرتبطة بالاضطراب وتحسين إمكانية تحقيق نتائج أكثر إيجابية.

استخدام النماذج الحيوانية هو الخطوة الأولى لفهم الأمراض. ولضمان أفضل نتائج البحوث، فإن النموذج النموذجي سوف يشمل تقنية بسيطة، والقدرة على تحمل التكاليف، وإمكانية التكاثر العالية، والحد الأدنى من التغير. وتشمل المحددات في نماذج السكتة الدماغية الإقفارية حجم وذمة الدماغ، وحجم الحفارة، ومدى انهيار حاجز الدم في الدماغ (BBB)، وضعف وظيفية تقييمها عموما عن طريق درجة شدة العصبية2.

تقنية تحريض السكتة الدماغية الأكثر استخداما في نماذج القوارض يُحل الشريان الدماغي الأوسط (MCA) بشكل عابر أو دائم3. تنتج هذه التقنية نموذج السكتة الدماغية مماثلة لتلك الموجودة في البشر: فقد penumbra المحيطة منطقة السكتة الدماغية، هو استنساخ عالية، وينظم مدة الإقفاريات وإعادة ضخ4. ومع ذلك، فإن طريقة MCAO لديها بعض التعقيدات. هذه التقنية عرضة للنزف داخل الجمجمة وإصابة شبكية العين ipsilateral مع خلل في القشرة البصرية وفرط الحرارة المشتركة التي غالبا ما تؤدي إلى نتائج إضافية5,6,7. وتشمل القيود الأخرى الاختلافات العالية في السكتة المستحثة (الناشئة عن التمديد المحتمل لاقفارية الإقفاريات إلى مناطق غير مقصودة، مثل منطقة الشريان السباتي الخارجية)، وعدم كفاية انسداد MCA، وإعادة التسريب السابق لأوانه. أيضا، الفئران من سلالات مختلفة وأحجام عرض مختلف وحدات التخزين في المزارع8. بالإضافة إلى جميع العيوب المذكورة، لا يمكن لنموذج MCAO أن يحفز السكتات الدماغية المعزولة الصغيرة في مناطق الدماغ العميقة، لأنها محدودة من الناحية الفنية من حيث متطلباتها من الحد الأدنى لحجم السفينة للقسطرة. وهذا يجعل الحاجة إلى نموذج بديل أكثر أهمية. طريقة أخرى، فوتوثرمومبوسيس، ويوفر بديلا محتملا لإجراءات MCAO ولكن لا يحسن على كفاءة9. هذه التقنية تستهدف السكتة الدماغية مع الضوء ويقدم بعض التحسينات على النماذج السابقة. ومع ذلك، يتطلب استئصال القحف الغازية التي ترتبط مع الكومبيات الثانوية9.

في ضوء أوجه القصور المبينة، يوفر البروتوكول المعروض هنا تقنية ليزر بديلة قادرة لحث إصابات الدماغ في القوارض. وتستند آلية عمل تقنية الليزر على آثار الليزر الحرارية الضوئية المنقولة على الأنسجة الحية ، مما يؤدي إلى امتصاص أشعة الضوء بواسطة أنسجة الجسم وتحويلها إلى حرارة. مزايا استخدام تقنية الليزر هي سلامته وسهولة التلاعب. قدرة الليزر على إنتاج الحرارة لوقف النزيف يجعلها مهمة جدا في الطب، في حين أن قدرته على تضخيم أشعة مختلفة في نقطة لقاء معين يضمن أن أشعة الليزر تجنب تدمير الأنسجة السليمة التي تقف في طريق الهدفنقطة 10. شعاع الليزر المستخدمة في هذا البروتوكول يمكن أن تمر من خلال وسيلة منخفضة السائل، مثل العظام، دون انبعاث الطاقة و / أو التسبب في أي تدمير. بمجرد أن تصل إلى وسيلة سائلة عالية ، مثل أنسجة الدماغ ، فإنها تستخدم طاقتها لتدمير الأنسجة المستهدفة. ولذلك، فإن هذه التقنية يمكن أن تحفز إصابات الدماغ فقط في المنطقة المناسبة من الدماغ.

وأظهرت التقنية المعروضة هنا قدرا هائلا من القدرة على تنظيم مستوياتها من الإشعاع، مما أدى إلى الاختلافات المختارة من إصابات الدماغ المقصود من البداية. على عكس MCAO الأصلي الذي يؤثر على كل من القشرة والمخطط ، كانت تقنية الليزر قادرة على تنظيم تأثير إصابة الدماغ ، مما أدى إلى الإصابة فقط على قشرة المحرك المقصودة. هنا، يتم توفير بروتوكول إصابات الدماغ الناجم عن الليزر وملخص للنتائج التمثيلية للإجراءات التي يتم إجراؤها على قشرة الدماغ للفئران.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وقد تم إجراء الإجراء التالي وفقاً للمبادئ التوجيهية لاستخدام الحيوانات التجريبية للجماعة الأوروبية. كما وافقت لجنة رعاية الحيوان في جامعة بن غوريون في النقب على هذه التجارب.

1. اختيار الحيوانات وإعدادها

  1. حدد 65 ذكور فئران Sprague-Dawley وزنها 300 إلى 350 غرام مع عدم وجود أمراض اُنفسية لهذا الإجراء. الحجم الأصغر يطرح صعوبات تقنية لإجراء MCAO.
  2. تعيين 3 فئران في قفص والسماح لهم التكيف لمدة 3 أيام على الأقل.

2. MCAO الإجراء

  1. اختر 25 الفئران لMCAO السماح ل 10-20٪ الوفيات المرتبطة الإجراء11.
  2. تنفيذ MCAO باستخدام تقنية قياسية، كما هو موضح سابقا بالتفصيل12.

3. إجراء تجريبي لإصابة الدماغ الناجم عن الليزر

  1. تعيين 20 الفئران إلى مجموعة وضعت علامة كمجموعة ليزر و 20 الفئران إلى مجموعة أخرى من السيطرة (صورية تعمل).
  2. اخضاع فئران مجموعة الليزر للإشعاع بالليزر عند 50J X 10 نقطة على النحو التالي:
    1. تخدير الفئران مع خليط من 2٪ isoflurane في الأكسجين مما يسمح للتهوية العفوية. تحقق من عمق مخدر كافية عن طريق معسر الذيل مع ملقط لمعرفة عدم وجود رد فعل الانسحاب.
    2. الحفاظ على درجة حرارة الجسم الأساسية للجرذ عند 37 درجة مئوية في جميع مراحل العملية التجريبية باستخدام منصة التدفئة الخاضعة للتنظيم في درجة حرارة المستقيم.
    3. إزالة الشعر المحلي مع ماكينة حلاقة وتطهير مع 70٪ الكحول و 0.5٪ chlorhexidine غلوكونات. كرر خطوة التطهير مرتين أكثر.
      ملاحظة: يجب أن يكون حجم الشق الجراحي حوالي 3 سم. إزالة الشعر على الأقل 2 سم حول منطقة شق.
    4. ضع الجرذ على حامل رأس مجسم في وضعية عرضة لعمل شق 3 سم ليعكس فروة الرأس بشكلٍ ثَمٍّ وفضح المنطقة بين بريغما و لامبدا.
    5. الحفاظ على التخدير من خلال مخروط الأنف.
    6. استخدام Neodymium-YAG (Nd-YAG) الليزر (الطول الموجي الذروة 1064 نانومتر) لإدارة 50J X 10 نقطة، مع 1 s مدة النبض ، إلى المنطقة المكشوفة من الجمجمة فوق نصف الكرة الأيمن.
    7. تأكد من أن جزء توليد الليزر من الجهاز على مسافة 2 مم من المنطقة المعرضة لإنتاج شعاع ليزر. تم اختيار 50J X 10 نقاط بعد تقييم دقيق لمختلف تركيبات الطاقة / السطح. هذا المزيج هو فعال ولا يسبب تدمير العظام من الجمجمة بعد الإدارة لأقل منثانية 10.
      ملاحظة: 2 مم هي المسافة بين محطة شعاع الليزر (من الكابل البصري الذي يتم تمريره من خلاله) وعظم الجمجمة. في حالة استخدام عدسة التركيز ، ينبغي حساب المسافة مع الأخذ في الاعتبار زاوية الميل للعدسة لتركيز الحزمة في المنطقة المطلوبة من الضرر. ضمان السلامة المناسبة عند استخدام جهاز ليزر بما في ذلك التدريب المناسب وحماية العين.
    8. إزالة الفئران من الجهاز وإغلاق فروة الرأس مع 3-0 خياطة جراحية الحرير.
    9. وقف التخدير والعودة إلى قفص الفئران للانتعاش. إدارة 0.1 مل من 0.25٪ بوبوفاكايين محليا للحد من الألم بعد الجراحة مباشرة بعد الجراحة.
      ملاحظة: يجب أن يستمر الإجراء بأكمله أقل من 5 دقائق إذا تم تنفيذه بشكل صحيح.
  3. مراقبة الفئران لأي علامات على الضيق أثناء الانتعاش بعد التخدير. قبل ظهور من التخدير، وإعطاء 0.01mg/kg بوبرينورفين العضلي للتخدير بعد الجراحة والاستمرار مع جرعات متكررة كل 12 ح لمدة 48 ساعة على الأقل.
  4. تخضع الفئران السيطرة لنفس الشروط دون إخضاعها بالليزر.

4. درجة شدة العصبية (NSS)

  1. تقييم درجة الشدة العصبية 24 ساعة بعد إصابة الدماغ الناجمة عن الليزر باستخدام نقاط 43 نقطة13. اختبار الحيوانات لعجز العصبية، والاضطرابات السلوكية، مهمة موازنة شعاع، وردود الفعل، وتعيين درجات أعلى لإعاقات أكثر شدة، كما سبقتفصيلها 13.

5- التلاعب بعد الإصابة

  1. بعد تقييم NSS ، قتل الفئران عن طريق تعريضها إلى 20 ٪ من الأوكسجين و 80 ٪ CO2 (عن طريق الإلهام) وtranscardialfuse الفئران مع heparinized الفوسفات المخزنة المالحة (PBS ، 0.9 ٪ 1.
    ملاحظة: تأكد من أن ثاني أكسيد الكربون2 يتم تسليمه بمعدل محدد مسبقًا وفقًا للمبادئ التوجيهية للجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للحيوانات. ويمكن أيضا أن يتم تنفيذ هذه الخطوة تحت 5٪ ايزوفلوران التخدير.
  2. احصد الأدمغة واستعد لمزيد من الفحص كما هو موضح في بروتوكول سابق11.
  3. تقييم ل دون العنكبوتية البواسير (SAH) من خلال الفحص البصري للدماغ كله بعد عزلته عن الجمجمة. إذا لزم الأمر، يمكن استخدام المجهر أو النظارات المكبرة لهذا الغرض.

6. تقييم إصابات الدماغ

  1. تحديد حجم المخ وذمة الدماغ عن طريق تلطيخ TTC
    ملاحظة: 2،3،5-Triphenyltetrazolium كلوريد (TTC) تلطيخ هو إجراء مناسب للكشف عن11في الدماغ.
    1. قسم الأدمغة المحصودة إلى 6 شرائح الإكللة، كل سمك 2 مم.
    2. احتضان مجموعة من شرائح من كل دماغ لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية في 0.05٪ TTC.
    3. بعد تلطيخ، مسح الشرائح مع الماسح الضوئي مع قرار من 1600 × 1600 نقطة في البوصة.
    4. يتم تعريف المناطق غير المطّع من شرائح الدماغ الثابتة كما12مُحتَل.
    5. باستخدام برنامج معالجة الصور (على سبيل المثال، صورة مجانية J)قياس منطقة غير محتورة، ipsi- ونصف الكرة الأرضية contralateral لكل من شرائح الإكليل 6.
    6. حساب حجم المزارع كنسبة مئوية من مجموع الدماغ:
      Equation 1
    7. حساب وذمة الدماغ باستخدام أسلوب كابلان:
      Equation 2
  2. تحديد مدى كسر حاجز الدم في الدماغ (BBB)
    ملاحظة: تقييم BBB الكسر 24 ساعة بعد إصابة الدماغ الناجمة عن الليزر على النحو التالي:
    1. إدارة 2٪ ايفانز الأزرق مختلطة مع 4 مل / كغ محلول ملحي عن طريق الوريد للفئران عن طريق الوريد الذيل معبّع والسماح للمحلول لتعميم لمدة 1 ساعة.
    2. القتل الرحيم الفئران عن طريق تعريضها ل 20٪ الأوكسجين و 80٪ CO2 (عن طريق الإلهام) 24 ساعة بعد NSS الماضي، كما وصفت سابقا13.
    3. حصاد صبغة موضعية داخل الأوعية على النحو التالي:
      1. افتح صدور الفئران مع الدبابيس الجراحية والمقص الجراحي.
      2. اثقب الحيوانات بـ 0.9% من الملح المُبرّد عبر البطين الأيسر باستخدام 110 مم زئبق حتى الحصول على سائل رطوبة عديم اللون من الأذين الأيمن.
    4. حصاد العقول وشريحة لهم rostrocaudally إلى شرائح 2 ملم.
    5. فصل شرائح الدماغ الأيسر من الأجزاء اليمنى لتقييم نصفي الكرة الأرضية المصابين وغير المصابين بشكل منفصل.
    6. تزن، التجانس باستخدام قذائف الهاون والأوبئة، ومن ثم احتضان أنسجة المخ في 50٪ حمض ثلاثي الكلوراسكيت لمدة 24 ساعة.
    7. الطرد المركزي شرائح الدماغ المتجانسة في 10،000 × ز لمدة 20 دقيقة.
    8. اخلط 1 مل من المناط من الدماغ المُهتزَز مع 1.5 مل من الإيثانول بنسبة 96% في 1:3 وقيِّم كسر حاجز الدم في الدماغ باستخدام كاشف الفلورسينس في الطول الموجي 620 نانومتر (عرض النطاق الترددي 10 نانومتر) و680 نانومتر الطول الموجي للانبعاثات (10 نانومتر).
      ملاحظة: تخضع كلتا المجموعتين من الفئران لنفس البروتوكول لتحديد انهيار BBB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

لم تسجل أي وفيات أو SAH في مجموعات التحكم أو المجموعات التجريبية(الجدول 1). وكان لدى مجموعة MCAO معدل 20٪ من الوفيات و SAH.

كما كانت التغيرات النسبية في درجة حرارة الجسم في فئران كلتا المجموعتين متشابهة، على الرغم من وجود اختلاف في التباين بين المجموعتين(الجدول 1).

كان هناك أسوأ بكثير NSS في كل من الليزر (16 ± 1.1) و MCAO (20 ± 1.5) نماذج، مقارنة مع مجموعة التحكم التي تعمل الصورية (1 ± 0.3; الجدول 1؛ p<0.01).

كما تسببت إصابة الدماغ الناجمة عن الليزر في زيادة كبيرة في حجم المزارع في نصف الكرة الأرضية المستهدف، مقارنة بمجموعة التحكم التي تعمل بالضَمَّم (2.4% ± 0.3 في مقابل 0.5% ± 0.1؛ 2.4% ± 0.3 في المائة± 0.1؛ 2.4 في المائة ± 0.3 في المائة ± 0.1؛ 2.4 في المائة ± 0.3 في المائة ± 0.1؛ 2.4 في المائة مقابل 0.5 في المائة± 0.1 في المائة؛ 2.4 في المائة مقابل 0.5 في المائة في المائة و 0.1 في المائة؛ و 0.5 في المائة الجدول 2 والشكل 1 ألف؛ p<0.01)، في اختبار مان ويتني يو. ومع ذلك، كان حجم الفاركت من طراز الليزر أصغر بالمقارنة مع تقنية MCAO (2.4٪ ± 0.3 مقابل 9.9٪ ± 2.9).

تم تحديد ذمة الدماغ 24 ساعة بعد إصابة الدماغ تظهر في الشكل 1B والجدول 2. لم يكن هناك فرق في وذمة الدماغ بين نموذج إصابة الدماغ الناجم عن الليزر ومجموعة التحكم التي تعمل بالضيم (3.4٪ ± 0.6 مقابل 0.7٪ ± 1.2). كان هناك فرق كبير في وذمة الدماغ بين نموذج الليزر وتقنية MCAO (3.4 ± 0.6 مقابل 7 ± 2.6 †). وتقدم البيانات على أنها متوسط ± SEM.

وبالمقارنة مع مجموعة التحكم التي تعمل بالقطع، تسببت إصابة الدماغ الناجمة عن الليزر وتقنية MCAO في زيادة كبيرة في كسر BBB في نصف الكرة الأرضية غير المصاب (563 نانوغرام/غرام ± 66 و1176 نانوغرام/غرام ± 168، على التوالي، مقابل 141 نانوغرام/غرام ± 14؛ الشكل 2A والجدول 2؛ p<0.01) ونصف الكرة المستهدفة (2204 نانوغرام/غرام ± 280 و2764 نانوغرام/غرام ± 256، على التوالي، مقابل 134 نانوغرام/غرام ± 11؛ الشكل 2B والجدول 2؛ p<0.01).

يتم عرض الفحص النسيجي لأدمغة الفئران في الشكل 3.

Nss درجة الحرارة, °C SAH، % معدل الوفيات، النسبة المئوية
مجموعات يعني ± SEM التقلبي، % يعني ± SEM التقلبي، %
السيطرة التي تديرها الشام 1 ± 0.3 97 37.2 ± 0.1 59 0 0
ليزر 50J x10 16 ± 1.1* 30 37.4 ± 0.1 84 0 0
P-MCAO 20 ± 1.5* 37 38.3 ± 0.1* 129 20* 20*

الجدول 1: تقييم NSS، درجة حرارة الجسم، البواسير تحت العنكبوتية، والوفيات.

Bbb حجم التخزين غير المُستفر وذمة الدماغ
مجموعات يعني ± SEM التقلبي، % يعني ± SEM التقلبي، % يعني ± SEM التقلبي، %
السيطرة التي تديرها الشام 134 ± 11 25 0.5 ± 0.1 77 0.7 ± 1.2 573
ليزر 50J x10 2204 ± 280* 40 2.4 ± 0.3* 34 3.4 ± 0.6 58
P-MCAO 2764 ± 256* 29 9.9 ± 2.9* 92 7 ± 2.6* 115

الجدول 2: تقييم انهيار BBB، والمنطقة الزراعية، وذمة الدماغ. * = ف < 0.01

Figure 1
الشكل 1: تقييم إصابات الدماغ في نموذج الليزر 24 ساعة بعد الإصابة مقارنة مع نموذج MCAO والتحكم في الصور. (أ)تقييم حجم الفار. كانت هناك زيادة في حجم الفاركت في طراز الليزر مقارنة بالتحكم الزائف (*p<0.01). ومع ذلك، كان حجم الفاركت في طراز الليزر أصغر مقارنة مع طراز MCAO (*p<0.01). (B) تقييم الوذمة الكلية للدماغ. كانت هناك زيادة في وذمة الدماغ في نموذج MCAO مقارنة إما نموذج الليزر أو التحكم في الصور. لم يكن هناك فرق في وذمة الدماغ بين نموذج الليزر والسيطرة التي تعمل بالشامية. يتم قياس البيانات كنسبة مئوية إلى نصف الكرة الأرضية المقابلة ويعبر عنها على أنها متوسط ± SEM. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: مدى انهيار BBB مقارنة بالضوابط الزائفة. (أ) كونترالثال (غير مصاب) نصف الكرة الأرضية. أدى كل من الليزر وMCAO نماذج، إلى زيادة كبيرة في الكسر BBB في نصف الكرة الأرضية غير المصاب مقارنة مع مجموعة التحكم التي تعمل بالجروح (*p<0.01). (ب) Ipsilateral (المصابين) نصف الكرة الأرضية. كان هناك فرق في انهيار IPSilateral BBB في نماذج الليزر وMCAO مقارنة بالتحكم الزائف (*p<0.01). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الفحص النسيجي لأدمغة الفئران من مجموعات الصور والليزر وMCAO. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ومن الإنصاف أن نفترض أن تقنية الليزر هي الحد الأدنى من الغازية، نظرا لأنه لم تحدث وفيات أو SAH في مجموعة الليزر. السبب الرئيسي للوفاة و SAH هو الضرر الذي لحق بالأوعية الدموية التي تؤدي إلى ارتفاع الضغط داخل الجمجمة (ICP) ، كما هو مبين في تقنيات MCAO الأصلية10. من المرجح أن يرجع غياب الموت و SAH في مجموعة الليزر إلى الآثار المحددة لأشعة الليزر: فهي لا تؤثر بشكل مباشر على الأوعية الدموية ويمكن أن تحفز على التخثر في حالة التسرب. انخفاض حجم الاحفار وذمة الدماغ تساعد أيضا في تقليل خطر الوفاة. وينبغي اعتبار استخدام الليزر كتقنية مناسبة لإثارة إصابات الدماغ مع الحد الأدنى من النتائج السلبية، نظرا لأن تقنيات MCAO الأصلي لتحريك السكتة الدماغية (سواء عابرة ودائمة) قد ثبت لإنتاج الوفيات و SAH6.

تظهر نتائج درجة حرارة الجسم المنخفضة في مجموعة الليزر أن تقنية الليزر لا تُكد الشريان hypothalamic الذي ينظم درجة حرارة الجسم ، كما يفعل MCAO الأصلي عادة7، مما يدعم النظرية القائلة بأن تقنية الليزر أكثر استهدافًا. انخفاض التباين عبر مجلس المعلمات التحقيق أشار إلى الاتساق في استخدام الليزر للحث على إصابة الدماغ، ولكن هذه النتائج الدقيقة تعتمد كثيرا على اختيار السلطة. توفر الطاقة الكافية النتائج المرجوة، في حين أن المعايرات قليلة أو فائضة يمكن أن تسبب الأداء الناقص أو الزائد، وهو في كلتا الحالتين ضار. ومع ذلك، فإن القدرة على استهداف الهدف لا تزال تجعل هذه التقنية أقل خطورة. وبالتالي، فإن المعالجة الصحيحة تجعل من الأسهل الحصول على النتائج بدقة باستخدام تقنية الليزر، وكذلك لتنظيم طريقة التأثيرات المرغوبة.

كانت دقة وفعالية تقنية الليزر واضحة في قدرتها على ضرب القشرة الحركية فقط دون التسبب في تلف المخطط ، مما يشير إلى أن تقنية الليزر يمكن أن تنتج إصابة مترجمة يكاد يكون من المستحيل تحقيقها مع MCAO10. هذه النتيجة التي يمكن تحقيقها مع تقنية الليزر يرجع إلى القدرة على تنظيم شعاع الليزر وقوته ويجعل طريقة الليزر تقنية نموذج لحفز إصابات الدماغ أصغر حجماً وطرفية وعميقة ومحددة لا يمكن الحصول عليها مع MCAO. بساطة التلاعب آلة ليزر يجعل من المرغوب فيه جدا. على عكس تقنيات MCAO التي تتطلب تدريبًا شاقًا وخبراء ، فإن استخدام الليزر أكثر بساطة ، ولا يتطلب أي خبراء أو تدريب مكلف. استخدام تقنية الليزر يمكن أن تعزز البحوث وتساعد على الكشف عن نتائج أفضل بسرعة أكبر من طريقة MCAO وحدها.

من حيث القيود المفروضة على تقنية الليزر ، فإن استخدام أشعة الليزر لا ينتج إصابات الدماغ التي تشبه تمامًا السكتات الحادة في انسداد الأوعية الدموية. على وجه التحديد، تنتج أشعة الليزر ندوب الأنسجة الفورية في الموقع المستهدف التي تضاهي السكتة الدماغية انسداد الأوعية الدموية التي هي عدة أيام من العمر. لذلك، قد لا تكون هذه التقنية مناسبة لتقييم الأدوية التي تهدف إلى منع انتشار السكتة الدماغية ولكن يجب أن تكون مثالية في تقييم السكتة الدماغية القشرة الحركية المعزولة على الإعاقات الحركية والمعرفية والسلوكية المطولة. وكان استخدام عدد صغير من الفئران لهذا البحث أيضا قيدا، مع نصف عدد الجرذان فقط (ن = 10) في كل مجموعة تستخدم لحصاد الدماغ وفحص حجم السكتة الدماغية، ومدى وذمة الدماغ، وكسر BBB، ووجود SAH.

كما يمكن اعتبار عدم وجود مقارنات بين أسلوبنا وطرق الليزر الأخرى قيدًا. لقد تداولنا حول أداء أساليب مقارنة ولكن قررنا عدم القيام بذلك لأن تقييم الضرر الناجم عن أساليب الليزر الأخرى هذه أمر صعب. على سبيل المثال، تسبب تقنية الفوتوثرمومبوسيس6 تلفًا ضعيفًا يجعل تقييم تورم الدماغ والحالات الأخرى التي قد تحدث أمرًا صعبًا. أيضا، استخدام استئصال القحف في تقنية الليزر لاقفوية إشكالية لأن استئصال القحف هو الغازية جدا ويمكن أن تزيد نفاذية BBB، مما تسبب في إصابات إضافية في الدماغ التي لا ترتبط بالسكتة الدماغية. إن تقييم مثل هذا الضرر للمقارنة مع طريقتنا يكاد يكون مستحيلاً. نموذج الليزر يحفز السكتة الدماغية مع الإشعاع من خلال الجمجمة دون استئصال القحف.

مثل العديد من النماذج، ونموذج الليزر له فوائده والقيود، مع العيب الأكثر وضوحا هو عدم قدرته على تقليد السكتة الدماغية الإنسان تماما كما بالضبط مثل النماذج الأخرى. ومع ذلك، فإن انخفاض التباين في النتائج الأولية لمعظم المعلمات، دقته، قدرته على تحمل التكاليف، القدرة على الحث على إصابات أصغر في الدماغ، وتطبيقه المباشر يجعله تقنية بديلة مناسبة لإصابة الدماغ في القوارض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

ونود أن نشكر قسم التخدير في المركز الطبي لجامعة سوروكا وموظفي المختبر في جامعة بن غوريون في النقب على مساعدتهم في أداء هذه التجربة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride SIGMA - ALDRICH 298-96-4
50% trichloroacetic acid SIGMA - ALDRICH 76-03-9
Brain & Tissue Matrices SIGMA - ALDRICH 15013
Cannula Venflon 22 G KD-FIX 1.83604E+11
Centrifuge Sigma 2-16P SIGMA - ALDRICH Sigma 2-16P
Compact Analytical Balances SIGMA - ALDRICH HR-AZ/HR-A
Digital Weighing Scale SIGMA - ALDRICH Rs 4,000
Dissecting scissors SIGMA - ALDRICH Z265969
Eppendorf pipette SIGMA - ALDRICH Z683884
Eppendorf Tube SIGMA - ALDRICH EP0030119460
Ethanol 96 % ROMICAL Flammable Liquid
Evans Blue 2% SIGMA - ALDRICH 314-13-6
Fluorescence detector Tecan, Männedorf Switzerland model Infinite 200 PRO multimode reader
Heater with thermometer Heatingpad-1 Model: HEATINGPAD-1/2
Infusion Cuff ABN IC-500
Isofluran, USP 100% Piramamal Critical Care, Inc NDC 66794-017
Multiset TEVA MEDICAL 998702
Olympus BX 40 microscope Olympus
Optical scanner Canon Cano Scan 4200F
Petri dishes SIGMA - ALDRICH P5606
Scalpel blades 11 SIGMA - ALDRICH S2771
Sharplan 3000 Nd:YAG (neodymium-doped yttrium aluminum garnet) laser machine Laser Industries Ltd
Stereotaxic head holder KOPF 900LS
Sterile Syringe 2 ml Braun 4606027V
Syringe-needle 27 G Braun 305620

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. Global health estimates: deaths by cause, age, sex and country, 2000-2012. World Health Organization. 9, Geneva. (2014).
  2. Meadows, K. L. Experimental models of focal and multifocal cerebral ischemia: a review. Reviews in the Neurosciences. 29, 661-674 (2018).
  3. Durukan, A., Strbian, D., Tatlisumak, T. Rodent models of ischemic stroke: a useful tool for stroke drug development. Current Pharmaceutical Designs. 14, 359-370 (2008).
  4. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).
  5. Li, F., Omae, T., Fisher, M. Spontaneous hyperthermia and its mechanism in the intraluminal suture middle cerebral artery occlusion model of rats. Stroke. 30, 2464-2470 (1999).
  6. Boyko, M., et al. An experimental model of focal ischemia using an internal carotid artery approach. Journal of Neuroscience Methods. 193, 246-253 (2010).
  7. Zhao, Q., Memezawa, H., Smith, M. L., Siesjo, B. K. Hyperthermia complicates middle cerebral artery occlusion induced by an intraluminal filament. Brain Research. 649, 253-259 (1994).
  8. Braeuninger, S., Kleinschnitz, C. Rodent models of focal cerebral ischemia: procedural pitfalls and translational problems. Experimental and Translational Stroke Medicine. 1, 8 (2009).
  9. Choi, B. I., et al. Neurobehavioural deficits correlate with the cerebral infarction volume of stroke animals: a comparative study on ischaemia-reperfusion and photothrombosis models. Environmental Toxicology and Pharmacology. 33, 60-69 (2012).
  10. Boyko, M., et al. An Alternative Model of Laser-Induced Stroke in the Motor Cortex of Rats. Biological Procedure Online. 21, 9 (2019).
  11. Bleilevens, C., et al. Effect of anesthesia and cerebral blood flow on neuronal injury in a rat middle cerebral artery occlusion (MCAO) model. Experimental Brain Research. 224, 155-164 (2013).
  12. Kuts, R., et al. A Middle Cerebral Artery Occlusion Technique for Inducing Post-stroke Depression in Rats. Journal of Visualized Experiments. (147), e58875 (2019).
  13. Boyko, M., et al. Morphological and neuro-behavioral parallels in the rat model of stroke. Behavioural Brain Research. 223, 17-23 (2011).
إصابة الدماغ الناجمة عن الليزر في القشرة الحركية للفئران
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuts, R., Melamed, I., Shiyntum, H. N., Gruenbaum, B. F., Frank, D., Knyazer, B., Natanel, D., Severynovska, O., Vinokur, M., Boyko, M. Laser-Induced Brain Injury in the Motor Cortex of Rats. J. Vis. Exp. (163), e60928, doi:10.3791/60928 (2020).More

Kuts, R., Melamed, I., Shiyntum, H. N., Gruenbaum, B. F., Frank, D., Knyazer, B., Natanel, D., Severynovska, O., Vinokur, M., Boyko, M. Laser-Induced Brain Injury in the Motor Cortex of Rats. J. Vis. Exp. (163), e60928, doi:10.3791/60928 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter