Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Laser-Geïnduceerde hersenletsel in de motorische cortex van ratten

Published: September 26, 2020 doi: 10.3791/60928
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4, 1, 5, 1, 3, 1, 1
1Division of Anesthesiology and Critical Care, Soroka University Medical Center and the Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, 2Department of Neurosurgery, Soroka University Medical Center and the Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, 3Department of Biochemistry and Physiology, Faculty of Biology, Ecology, and Medicine, Oles Honchar Dnipro National University, 4Department of Anesthesiology, Yale University School of Medicine, 5Department of Ophthalmology, Soroka University Medical Center and the Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Het hier gepresenteerde protocol toont een techniek om een knaagdiermodel van hersenletsel te creëren. De hier beschreven methode maakt gebruik van laserbestraling en richt zich op de motorische cortex.

Abstract

Een veel voorkomende techniek voor het induceren van een beroerte in experimentele knaagdier modellen omvat de voorbijgaande (vaak aangeduid als MCAO-t) of permanente (aangeduid als MCAO-p) occlusie van de middelste hersenslagader (MCA) met behulp van een katheter. Deze algemeen aanvaarde techniek heeft echter een aantal beperkingen, waardoor het uitgebreide gebruik ervan wordt beperkt. Slaginductie door deze methode wordt vaak gekenmerkt door hoge variabiliteit in de lokalisatie en grootte van het ischemische gebied, periodieke gebeurtenissen van bloeding, en hoge sterftecijfers. Ook de succesvolle voltooiing van een van de voorbijgaande of permanente procedures vereist expertise en duurt vaak ongeveer 30 minuten. In dit protocol wordt een laserbestralingstechniek gepresenteerd die kan dienen als een alternatieve methode voor het opwekken en bestuderen van hersenletsel in knaagdiermodellen.

In vergelijking met ratten in de controle- en MCAO-groepen vertoonde het hersenletsel door laserinductie verminderde variabiliteit in lichaamstemperatuur, infarctvolume, hersenoedeem, intracraniale bloeding en sterfte. Bovendien veroorzaakte het gebruik van een laser-geïnduceerde verwonding schade aan de hersenweefsels alleen in de motorische cortex in tegenstelling tot in de MCAO-experimenten waar vernietiging van zowel de motorische cortex als striatale weefsels wordt waargenomen.

Bevindingen uit dit onderzoek suggereren dat laser bestraling kan dienen als een alternatieve en effectieve techniek voor het induceren van hersenletsel in de motorische cortex. De methode verkort ook de tijd voor het voltooien van de procedure en vereist geen deskundige handlers.

Introduction

Wereldwijd, beroerte is de tweede belangrijkste doodsoorzaak en de derde belangrijkste oorzaak van invaliditeit1. Beroerte leidt ook tot ernstige invaliditeit, vaak die extra zorg van medisch personeel en familieleden. Er is daarom een noodzaak om de complicaties in verband met de aandoening te begrijpen en het verbeteren van het potentieel voor meer positieve resultaten.

Het gebruik van diermodellen is de eerste stap naar het begrijpen van ziekten. Om de beste onderzoeksresultaten te garanderen, zou een typisch model een eenvoudige techniek, betaalbaarheid, hoge reproduceerbaarheid en minimale variabiliteit bevatten. De determinanten in ischemische beroerte modellen omvatten hersenoedeem volume, infarct grootte, de omvang van de bloed-hersenbarrière (BBB) afbraak, en functionele stoornis over het algemeen geëvalueerd via neurologische ernst score2.

De meest gebruikte slag inductie techniek in knaagdier modellen occludes de middelste cerebrale slagader (MCA) tijdelijk of permanent3. Deze techniek produceert een lijn model vergelijkbaar met die bij de mens: het heeft een penumbra rond het gestoste gebied, is zeer reproduceerbaar, en reguleert ischemie duur en reperfusie4. Toch heeft de MCAO-methode enkele complicaties. De techniek is gevoelig voor intracraniale bloeding en letsel aan het ipsilaterale netvlies met een disfunctie van de visuele cortex en gemeenschappelijke hyperthermie die vaak leiden tot extra uitkomsten5,6,7. Andere beperkingen zijn hoge variaties in geïnduceerde beroerte (als gevolg van de waarschijnlijke uitbreiding van de ischemie tot onbedoelde gebieden, zoals de externe halsslagader regio), onvoldoende occlusie van de MCA, en vroegtijdige reperfusie. Ook ratten van verschillende stammen en maten vertonen verschillende infarct volumes8. Naast alle genoemde nadelen kan het MCAO-model geen kleine geïsoleerde beroertes veroorzaken in diepe hersengebieden, omdat het technisch beperkt is in termen van de vereiste van minimale vatgrootte voor katheterisatie. Dit maakt de behoefte aan een alternatief model des te kritischer. Een andere methode, fototrombose, biedt een mogelijk alternatief voor MCAO-procedures, maar verbetert de efficiëntie niet9. Deze techniek richt zich op slag met licht en biedt een aantal verbeteringen ten opzichte van de vorige modellen. Fototrombose vereist echter een invasieve craniotomie die wordt geassocieerd met secundaire compicaties9.

In het licht van geschetste tekortkomingen, het protocol hier gepresenteerd biedt een capabele alternatieve laser techniek voor het induceren van hersenletsel bij knaagdieren. Het werkingsmechanisme van de lasertechniek is gebaseerd op de fotothermale effecten van de laser die worden bijgebracht op levende weefsels, wat leidt tot de absorptie van lichtstralen door lichaamsweefsels en hun omzetting in warmte. De voordelen van het gebruik van een lasertechniek zijn de veiligheid en het gemak van manipulatie. Het vermogen van een laser om warmte te produceren om te stoppen met bloeden maakt het erg belangrijk in de geneeskunde, terwijl het vermogen om verschillende stralen op een bepaald meetpunt te versterken ervoor zorgt dat lasers voorkomen dat ze gezonde weefsels vernietigen die het doelpunt10in de weg staan. De laserstraal die in dit protocol wordt gebruikt, kan door een laag vloeibaar medium, zoals bot, gaan zonder zijn energie uit te stoten en/of vernietiging te veroorzaken. Zodra het een hoog vloeibaar medium bereikt, zoals hersenweefsels, gebruikt het zijn energie om de doelweefsels te vernietigen. De techniek kan daarom alleen hersenletsel veroorzaken in het juiste gebied van de hersenen.

De hier gepresenteerde techniek toonde een enorme hoeveelheid vermogen om de niveaus van bestraling te reguleren, waardoor de gekozen variaties van hersenletsel bedoeld vanaf het begin. In tegenstelling tot de oorspronkelijke MCAO die zowel de cortex als het striatum beïnvloedt, was de lasertechniek in staat om de impact van hersenletsel te reguleren, waardoor letsel alleen op de beoogde motorische cortex werd veroorzaakt. Hierin, de laser-geïnduceerde hersenletsel protocol en een samenvatting van de representatieve resultaten voor de procedure uitgevoerd op de hersenschors van ratten zijn voorzien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De volgende procedure werd uitgevoerd volgens de richtsnoeren voor het gebruik van proefdieren van de Europese Gemeenschap. De experimenten werden ook goedgekeurd door het Comité voor dierenverzorging van de Ben-Gurion Universiteit van de Negev.

1. Selectie en bereiding van dieren

  1. Selecteer 65 mannelijke Sprague-Dawley ratten met een gewicht van 300 tot 350 g zonder openlijke pathologie voor deze procedure. De kleinere omvang brengt technische problemen met zich mee voor de MCAO-procedure.
  2. Wijs 3 ratten per kooi toe en laat ze zich minstens 3 dagen aanpassen.

2. MCAO-procedure

  1. Selecteer 25 ratten voor MCAO, waardoor 10-20% sterfte in verband met de procedure11.
  2. Voer MCAO uit met behulp van een standaardtechniek, zoals eerder beschreven in detail12.

3. Laser-geïnduceerde hersenletsel experimentele procedure

  1. Wijs 20 ratten toe aan een groep die als lasergroep is gemarkeerd en 20 ratten aan een andere controlegroep (schijn-bediend).
  2. Onderwier de ratten van de lasergroep op de volgende wijze op laserstraling op 50J X 10-punten: points
    1. Verdoof de rat met een mengsel van 2% isoflurane in zuurstof waardoor de spontane ventilatie mogelijk is. Controleer op voldoende verdovingsdiepte door de staart met tangen te knijpen om de afwezigheid van de terugtrekkingsreflex te zien.
    2. Houd de kernlichaamstemperatuur van de rat gedurende de gehele experimentele procedure op 37 °C met behulp van een rectale temperatuur geregeld verwarmingskussen.
    3. Verwijder lokaal haar met een scheerapparaat en ontsmet met 70% alcohol en 0,5% chloorhexidine gluconaat. Herhaal de desinfectiestap nog twee keer.
      LET OP: De grootte van de chirurgische incisie moet ongeveer 3 cm zijn. Verwijder het haar ten minste 2 cm rond het incisiegebied.
    4. Plaats de rat op een stereotaxic hoofdhouder in een gevoelige positie en maak een incisie van 3 cm om de hoofdhuid zijdelings te reflecteren en om het gebied tussen Bregma en Lambda bloot te stellen.
    5. Houd anesthesie door de neuskegel.
    6. Gebruik neodymium-YAG (Nd-YAG) laser (piekgolflengte 1064 nm) om 50J X 10 punten, met 1 s puls duur, toe te dienen aan het blootgestelde gebied van de schedel boven de rechterhersenhelft.
    7. Zorg ervoor dat het lasergenererende deel van het apparaat zich op 2 mm afstand van het blootgestelde gebied bevindt om een laserstraal te produceren. 50J X 10 punten werd geselecteerd na zorgvuldige evaluatie van verschillende energie/oppervlaktecombinaties. Deze combinatie is efficiënt en veroorzaakt geen botvernietiging van de schedel na toediening voor minder dan een seconde10.
      LET OP: 2 mm is de afstand tussen de terminal van de laserstraal (van de optische kabel die het wordt doorgegeven) en het schedelbot. In het geval dat een scherpstellens wordt gebruikt, moet de afstand worden berekend rekening houdend met de hellingshoek van de lens om de bundel in het gewenste beschadigingsgebied te richten. Zorg voor een goede veiligheid bij het gebruik van een laserapparaat, inclusief de juiste training en oogbescherming.
    8. Verwijder de rat van het apparaat en sluit de hoofdhuid met 3-0 zijde chirurgische hechtingen.
    9. Stop anesthesie en breng de rat terug naar zijn kooi voor herstel. Toedien 0,1 mL van 0,25% bupivacaine lokaal om de postoperatieve pijn onmiddellijk na de operatie te verminderen.
      LET OP: De hele procedure moet minder dan 5 min duren als deze correct wordt uitgevoerd.
  3. Observeer de rat op tekenen van nood tijdens het herstel van de anesthesie na de anesthesie. Vóór het ontstaan van anesthesie, geef 0,01mg/kg intramusculaire buprenorfine voor postoperatieve analgesie en ga verder met herhaalde doses om de 12 uur gedurende ten minste 48 uur.
  4. Subject control ratten aan dezelfde voorwaarden zonder ze te onderwerpen aan de laser.

4. Neurologische ernstscore (NSS)

  1. Evalueer de neurologische ernst score 24 uur na de laser-geïnduceerde hersenletsel met behulp van een 43-puntscore13. Test de dieren op neurologische tekorten, gedragsstoornissen, beam-balancing taak, en reflexen, het toewijzen van hogere scores voor meer ernstige handicaps, zoals eerder gedetailleerde13.

5. Manipulaties na de schade

  1. Na de evaluatie van NSS, euthanaseren de ratten door ze bloot te stellen aan 20% zuurstof en 80% CO2 (via inspiratie) en transcardially perfuse de rat met heparinized fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS, 0,9% NaCl).
    LET OP: Zorg ervoor dat CO2 tegen een vooraf bepaald tarief wordt geleverd in overeenstemming met de richtlijnen van het Institutional Animal Care and Use Committee. Deze stap kan ook worden uitgevoerd onder 5% isoflurane anesthesie.
  2. Oogst hersenen en bereid je voor op verder onderzoek zoals beschreven in een eerder protocol11.
  3. Evalueer voor subarachnoïdale bloeding (SAH) door visueel onderzoek van de hele hersenen na de isolatie van de schedel. Indien nodig kan hiervoor een microscoop of vergrootglas worden gebruikt.

6. Evaluatie van het hersenletsel

  1. Het bepalen van het volume van het herseninfarct en hersenoedeem door TTC-kleuring
    OPMERKING: 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) vlekken is een handige procedure voor herseninfarct detectie11.
    1. Doorsnede de geoogste hersenen in 6 coronale plakjes, elk 2 mm dikte.
    2. Incubeer de set van plakjes van elke hersenen gedurende 30 min bij 37 °C in 0,05% TTC.
    3. Na kleuring, scan de plakjes met een optische scanner met een resolutie van 1600 X 1600 dpi.
    4. De onbevlekte gebieden van de vaste hersenen plakjes worden gedefinieerd als infarct12.
    5. Met behulp van een software voor beeldverwerking (bijvoorbeeld freeware Image J)meet u het onbevlekte infarctgebied, ipsi- en contralaterale halfrondsen voor elk van de 6 coronale plakjes.
    6. Bereken het infarct volume als een percentage van de totale hersenen:
      Equation 1
    7. Bereken hersenoedeem met behulp van Kaplan methode:
      Equation 2
  2. Het bepalen van de omvang van de bloed-hersenbarrière (BBB) breuk
    OPMERKING: Beoordeel BBB-breuk 24 uur na het door laser geïnduceerde hersenletsel als volgt:
    1. Beheer 2% Evans Blue gemengd met 4 mL/kg zoutoplossing intraveneus aan ratten via de gebottuleerde staartader en laat de oplossing 1 uur circuleren.
    2. Euthanaseer ratten door ze bloot te stellen aan 20% zuurstof en 80% CO2 (via inspiratie) 24 uur na de laatste NSS, zoals eerder beschreven13.
    3. Oogst de intravasculair gelokaliseerde kleurstof als volgt:
      1. Open de kisten van de ratten met chirurgische pincettes en chirurgische schaar.
      2. Doorsfuus de dieren met gekoelde 0,9% zoutoplossing via de linker ventrikel met 110 mmHg tot het verkrijgen van een kleurloze perfusievloeistof uit het rechteratrium.
    4. Oogst de hersenen en snijd ze rostrocaudally in plakjes van 2 mm.
    5. Scheid de linker hersenen plakjes van de rechter porties om gewonde en niet-gewonde hemisferen afzonderlijk te evalueren.
    6. Weeg, homogenize met behulp van mortel en stamper, en vervolgens inculuberen de hersenweefsels in 50% trichloorazijnzuur voor 24 uur.
    7. Centrifugeer de gehomogeniseerde hersenen plakjes op 10.000 × g gedurende 20 min.
    8. Meng 1 mL van de supernatant uit de gecentrifugeerde hersenen met 1,5 mL van 96% ethanol op 1:3 en beoordeel de bloed-hersenbarrière breuk met behulp van een fluorescentie detector op 620 nm excitatie golflengte (10 nm bandbreedte) en 680 nm emissiegolflengte (10 nm bandbreedte).
      OPMERKING: Beide groepen ratten ondergaan hetzelfde protocol voor het bepalen van BBB-afbraak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Er werden geen sterfgevallen of SAH geregistreerd in de controle- of experimentele groepen(tabel 1). De MCAO-groep had een 20% percentage van zowel sterfte als SAH.

De relatieve veranderingen in de lichaamstemperatuur bij de ratten van beide groepen waren ook vergelijkbaar, ondanks een verschil in variabiliteit van beide groepen (tabel 1).

Er was een aanzienlijk slechtere NSS in zowel de laser (16 ± 1.1) en MCAO (20 ± 1.5) modellen, in vergelijking met de sham-operated control group (1 ± 0,3; Tabel 1; p<0,01).

Het door laser geïnduceerde hersenletsel veroorzaakte ook een aanzienlijke toename van het infarctvolume op het doelhalshalfrond, vergeleken met de schijnbediende controlegroep (2,4% ± 0,3 vs 0,5% ± 0,1; tabel 2 en figuur 1A; p<0.01), volgens de Mann-Whitney U-test. Het infarctvolume van het lasermodel was echter kleiner in vergelijking met de MCAO-techniek (2,4% ± 0,3 vs 9,9% ± 2,9).

Hersenoedeem 24 uur na hersenletsel worden weergegeven in figuur 1B en tabel 2. Er was geen verschil in hersenoedeem tussen het laser-geïnduceerde hersenletselmodel en de sham-operated control group (3,4% ± 0,6 vs 0,7% ± 1,2). Er was een significant verschil in hersenoedeem tussen het lasermodel en de MCAO-techniek (3,4 ± 0,6 vs 7 ± 2,6†). Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM.

In vergelijking met de schijnbare controlegroep veroorzaakten de laser-geïnduceerde hersenletsel en MCAO-techniek beide een aanzienlijke toename van BBB-breuken op het niet-gewonde halfrond (respectievelijk 563 ng/g ± 66 en 1176 ng/g ± 168, vs 141 ng/g ± 14; Figuur 2A en tabel 2; p<0,01) en doelhalf (respectievelijk 2204 ng/g ± 280 en 2764 ng/g ± 256 vs 134 ng/g ± 11; Figuur 2B en tabel 2; p<0,01).

Histologisch onderzoek van de hersenen van ratten is te zien in figuur 3.

Nss Temperatuur, °C SAH, % Sterfte, %
Groepen gemiddelde ± SEM variabiliteit, % gemiddelde ± SEM variabiliteit, %
Sham-operated control 1 ± 0,3 97 37,2 ± 0,1 59 0 0
Laser 50J x10 16 ± 1,1* 30 37,4 ± 0,1 84 0 0
p-MCAO 20 ± 1,5* 37 38,3 ± 0,1* 129 20* 20*

Tabel 1: Beoordeling van NSS, lichaamstemperatuur, subarachnoïdale bloeding en sterfte. * = p < 0,01

Bbb Infarct volume Hersenen Oedeem
Groepen gemiddelde ± SEM variabiliteit, % gemiddelde ± SEM variabiliteit, % gemiddelde ± SEM variabiliteit, %
Sham-operated control 134 ± 11 25 0,5 ± 0,1 77 0,7 ± 1,2 573
Laser 50J x10 2204 ± 280* 40 2,4 ± 0,3* 34 3,4 ± 0,6 58
p-MCAO 2764 ± 256* 29 9,9 ± 2,9* 92 7 ± 2,6* 115

Tabel 2: Beoordeling van BBB-afbraak, infarctzone en hersenoedeem. * = p < 0,01

Figure 1
Figuur 1: Beoordeling van hersenletsel in het lasermodel 24 uur na de verwonding in vergelijking met het MCAO-model en sham-operated control. (A) Beoordeling van het infarctvolume. Er was een toename van het infarct volume in het lasermodel in vergelijking met de sham-operated control (* p<0,01). Het infarctvolume in het lasermodel was echter kleiner in vergelijking met het MCAO-model (*p<0,01). (B) Beoordeling van het totale hersenoedeem. Er was een toename van hersenoedeem in het MCAO-model in vergelijking met het lasermodel of sham-operated control. Er was geen verschil in hersenoedeem tussen het lasermodel en sham-operated control. De gegevens worden gemeten als % van het contralaterale halfrond en uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: De omvang van de BBB-uitsplitsing in vergelijking met schijncontroles. (A) Contralateraal (niet-gewond) halfrond. Zowel de laser- als de MCAO-modellen hebben geleid tot een aanzienlijke toename van bbb-breuken op het niet-gewonde halfrond in vergelijking met de sham-operated control group (*p<0.01). (B) Ipsilaterale (gewonde) hemisfeer. Er was een verschil in ipsilaterale BBB-afbraak in de laser- en MCAO-modellen ten opzichte van de sham-operated control (*p<0.01). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Histologisch onderzoek van de hersenen van ratten van sham-, laser- en MCAO-groepen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het is eerlijk om aan te nemen dat de lasertechniek minimaal invasief is, gezien het feit dat er geen sterfgevallen of SAH in de lasergroep zijn opgetreden. De belangrijkste doodsoorzaak en SAH is de schade aan bloedvaten die leidt tot een verhoging van de intracraniale druk (ICP), zoals blijkt uit de oorspronkelijke MCAO-technieken10. De afwezigheid van overlijden en SAH in de lasergroep is waarschijnlijk te wijten aan de specifieke effecten van lasers: ze hebben geen directe invloed op de bloedvaten en kunnen stolling veroorzaken in geval van lekkage. Laag infarct volume en hersenoedeem ook helpen minimaliseren van het risico op overlijden. Het gebruik van lasers moet worden beschouwd als een geschikte techniek voor het induceren van hersenletsel met minimale nadelige resultaten, gezien het feit dat de oorspronkelijke MCAO-technieken voor het activeren van een beroerte (zowel voorbijgaande als permanente) zijn aangetoond dat sterfgevallen en SAH6produceren .

Lage lichaamstemperatuur bevindingen in de lasergroep tonen aan dat de lasertechniek niet de hypothalamic slagader occlude die lichaamstemperatuur regelt, zoals de oorspronkelijke MCAO doet meestal7, ter ondersteuning van de theorie dat de laser techniek is meer gericht. Lage variabiliteit over de hele linie van onderzochte parameters aangegeven consistentie in het gebruik van lasers om hersenletsel te induceren, maar dergelijke fijne resultaten zijn sterk afhankelijk van de keuze van de macht. Voldoende vermogen zorgt voor de gewenste resultaten, terwijl weinig of overtollige kalibraties onder- of overprestaties kunnen veroorzaken, wat in beide gevallen schadelijk is. Toch maakt de mogelijkheid om te streven naar het doel nog steeds de techniek minder riskant. Vandaar, de juiste behandeling maakt het gemakkelijker om resultaten te verkrijgen met behulp van de laser techniek, evenals de methode voor wenselijke effecten te reguleren.

De precisie en werkzaamheid van de lasertechniek waren duidelijk in zijn vermogen om alleen de motorische cortex te raken zonder schade aan het striatum te veroorzaken, wat suggereert dat de lasertechniek gelokaliseerde schade kan produceren die bijna onmogelijk is te bereiken met MCAO10. Dit haalbare resultaat met de laser techniek is te wijten aan de mogelijkheid om de laserstraal en de kracht ervan te reguleren en maakt de lasermethode een modeltechniek voor het induceren van kleinere, perifere en diepe en gedefinieerde hersenletsel die niet kan worden verkregen met MCAO. De eenvoud van het manipuleren van een lasermachine maakt het zeer wenselijk. In tegenstelling tot MCAO technieken die zware training en deskundigen vereisen, is het gebruik van lasers eenvoudiger, waarvoor geen experts of dure training nodig zijn. Het gebruik van de lasertechniek kan het onderzoek stimuleren en helpen om betere resultaten sneller te ontdekken dan alleen de MCAO-methode.

In termen van beperkingen van de lasertechniek produceert het gebruik van laserstralen geen hersenletsel dat perfect lijkt op acute vasculaire occlusieve beroertes. Specifiek, lasers produceren onmiddellijke weefsel littekens op de doellocatie die vergelijkbaar zijn met een vasculaire occlusive beroerte die is enkele dagen oud. De techniek kan daarom niet geschikt zijn voor de evaluatie van geneesmiddelen die gericht zijn op de verspreiding van een beroerte te voorkomen, maar moet ideaal zijn bij het beoordelen van geïsoleerde motorische cortex beroerte op langdurige motorische, cognitieve en gedragsstoornissen. Het gebruik van een klein aantal ratten voor dit onderzoek was ook een beperking, met slechts de helft van het aantal ratten (n = 10) in elke groep die wordt gebruikt voor het oogsten van de hersenen en onderzoek van de grootte van de beroerte, de omvang van hersenoedeem, BBB-breuk en SAH-aanwezigheid.

Het gebrek aan vergelijkingen tussen onze techniek en andere lasermethoden kan ook worden beschouwd als een beperking. We hebben overlegd over het uitvoeren van vergelijkende methoden, maar besloten dit niet te doen omdat het beoordelen van de schade veroorzaakt door deze andere lasermethoden moeilijk is. Bijvoorbeeld, de fototrombose techniek6 veroorzaakt zwakke schade die het een uitdaging maakt om zwelling van de hersenen en andere aandoeningen die kunnen optreden te evalueren. Ook het gebruik van craniotomie in de lasertechniek voor ischemie is problematisch omdat craniotomie zeer invasief is en de doorlaatbaarheid van BBB kan verhogen, waardoor extra hersenletsel ontstaat dat niet geassocieerd wordt met een beroerte. Het beoordelen van dergelijke schade voor vergelijking met onze methode is bijna onmogelijk. Het lasermodel induceert een beroerte met straling door de schedel zonder craniotomie.

Zoals vele modellen, de laser model heeft zijn voordelen en beperkingen, met de meest opvallende nadeel is het onvermogen om perfect menselijke beroerte zo precies als andere modellen na te bootsen. Niettemin, de lage variabiliteit in de primaire resultaten van de meeste parameters, de precisie, betaalbaarheid, het vermogen om kleinere hersenletsels te induceren, en de eenvoudige toepassing ervan maakt het een geschikte alternatieve techniek voor hersenletsel bij knaagdieren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We willen de afdeling Anesthesiologie van het Soroka Universitair Medisch Centrum en de laboratoriummedewerkers van de Ben-Gurion Universiteit van de Negev bedanken voor hun hulp bij de uitvoering van dit experiment.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride SIGMA - ALDRICH 298-96-4
50% trichloroacetic acid SIGMA - ALDRICH 76-03-9
Brain & Tissue Matrices SIGMA - ALDRICH 15013
Cannula Venflon 22 G KD-FIX 1.83604E+11
Centrifuge Sigma 2-16P SIGMA - ALDRICH Sigma 2-16P
Compact Analytical Balances SIGMA - ALDRICH HR-AZ/HR-A
Digital Weighing Scale SIGMA - ALDRICH Rs 4,000
Dissecting scissors SIGMA - ALDRICH Z265969
Eppendorf pipette SIGMA - ALDRICH Z683884
Eppendorf Tube SIGMA - ALDRICH EP0030119460
Ethanol 96 % ROMICAL Flammable Liquid
Evans Blue 2% SIGMA - ALDRICH 314-13-6
Fluorescence detector Tecan, Männedorf Switzerland model Infinite 200 PRO multimode reader
Heater with thermometer Heatingpad-1 Model: HEATINGPAD-1/2
Infusion Cuff ABN IC-500
Isofluran, USP 100% Piramamal Critical Care, Inc NDC 66794-017
Multiset TEVA MEDICAL 998702
Olympus BX 40 microscope Olympus
Optical scanner Canon Cano Scan 4200F
Petri dishes SIGMA - ALDRICH P5606
Scalpel blades 11 SIGMA - ALDRICH S2771
Sharplan 3000 Nd:YAG (neodymium-doped yttrium aluminum garnet) laser machine Laser Industries Ltd
Stereotaxic head holder KOPF 900LS
Sterile Syringe 2 ml Braun 4606027V
Syringe-needle 27 G Braun 305620

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. Global health estimates: deaths by cause, age, sex and country, 2000-2012. World Health Organization. 9, Geneva. (2014).
  2. Meadows, K. L. Experimental models of focal and multifocal cerebral ischemia: a review. Reviews in the Neurosciences. 29, 661-674 (2018).
  3. Durukan, A., Strbian, D., Tatlisumak, T. Rodent models of ischemic stroke: a useful tool for stroke drug development. Current Pharmaceutical Designs. 14, 359-370 (2008).
  4. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).
  5. Li, F., Omae, T., Fisher, M. Spontaneous hyperthermia and its mechanism in the intraluminal suture middle cerebral artery occlusion model of rats. Stroke. 30, 2464-2470 (1999).
  6. Boyko, M., et al. An experimental model of focal ischemia using an internal carotid artery approach. Journal of Neuroscience Methods. 193, 246-253 (2010).
  7. Zhao, Q., Memezawa, H., Smith, M. L., Siesjo, B. K. Hyperthermia complicates middle cerebral artery occlusion induced by an intraluminal filament. Brain Research. 649, 253-259 (1994).
  8. Braeuninger, S., Kleinschnitz, C. Rodent models of focal cerebral ischemia: procedural pitfalls and translational problems. Experimental and Translational Stroke Medicine. 1, 8 (2009).
  9. Choi, B. I., et al. Neurobehavioural deficits correlate with the cerebral infarction volume of stroke animals: a comparative study on ischaemia-reperfusion and photothrombosis models. Environmental Toxicology and Pharmacology. 33, 60-69 (2012).
  10. Boyko, M., et al. An Alternative Model of Laser-Induced Stroke in the Motor Cortex of Rats. Biological Procedure Online. 21, 9 (2019).
  11. Bleilevens, C., et al. Effect of anesthesia and cerebral blood flow on neuronal injury in a rat middle cerebral artery occlusion (MCAO) model. Experimental Brain Research. 224, 155-164 (2013).
  12. Kuts, R., et al. A Middle Cerebral Artery Occlusion Technique for Inducing Post-stroke Depression in Rats. Journal of Visualized Experiments. (147), e58875 (2019).
  13. Boyko, M., et al. Morphological and neuro-behavioral parallels in the rat model of stroke. Behavioural Brain Research. 223, 17-23 (2011).

Tags

Neurowetenschappen Probleem 163 Hersenletsel beroerte lasertechniek dierlijk model middelste cerebrale slagader occlusie MCAO motorische cortex

Erratum

Formal Correction: Erratum: Laser-Induced Brain Injury in the Motor Cortex of Rats
Posted by JoVE Editors on 02/07/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Laser-Induced Brain Injury in the Motor Cortex of Rats. The Authors section was updated.

One of the author names was updated from:

Dmitri Frank

to

Dmitry Frank

Laser-Geïnduceerde hersenletsel in de motorische cortex van ratten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuts, R., Melamed, I., Shiyntum, H.… More

Kuts, R., Melamed, I., Shiyntum, H. N., Gruenbaum, B. F., Frank, D., Knyazer, B., Natanel, D., Severynovska, O., Vinokur, M., Boyko, M. Laser-Induced Brain Injury in the Motor Cortex of Rats. J. Vis. Exp. (163), e60928, doi:10.3791/60928 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter