Lésion cérébrale induite au laser dans le cortex moteur des rats

Summary

Le protocole présenté ici montre une technique pour créer un modèle de rongeur de lésions cérébrales. La méthode décrite ici utilise l’irradiation laser et cible le cortex moteur.

Abstract

Une technique courante pour induire l’AVC dans les modèles expérimentaux de rongeurs implique l’occlusion transitoire (souvent désignée comme MCAO-t) ou permanente (désignée comme MCAO-p) de l’artère cérébrale moyenne (MCA) à l’aide d’un cathéter. Cette technique généralement acceptée, cependant, a quelques limites, limitant ainsi son utilisation extensive. L’induction de l’AVC par cette méthode est souvent caractérisée par une grande variabilité dans la localisation et la taille de la zone ischémique, des occurrences périodiques d’hémorragie, et des taux de mortalité élevés. En outre, l’achèvement réussi de l’une des procédures transitoires ou permanentes nécessite une expertise et dure souvent environ 30 minutes. Dans ce protocole, une technique d’irradiation laser est présentée qui peut servir de méthode alternative pour induire et étudier les lésions cérébrales dans les modèles de rongeurs.

Comparé aux rats dans les groupes de commande et de MCAO, les dommages de cerveau par induction de laser ont montré la variabilité réduite dans la température de corps, le volume infarctus, l’oedème de cerveau, l’hémorragie intracrânienne, et la mortalité. En outre, l’utilisation d’une lésion induite par le laser a causé des dommages aux tissus cérébraux seulement dans le cortex moteur contrairement aux expériences MCAO où la destruction du cortex moteur et des tissus striataux est observée.

Les résultats de cette recherche suggèrent que l’irradiation laser pourrait servir comme une technique alternative et efficace pour induire des lésions cérébrales dans le cortex moteur. La méthode raccourcit également le temps d’achèvement de la procédure et ne nécessite pas de gestionnaires experts.

Introduction

À l’échelle mondiale, l’AVC est la deuxième cause de décès et la troisième cause d’invalidité¹. L’AVC entraîne également un handicap grave, nécessitant souvent des soins supplémentaires de la part du personnel médical et de leurs proches. Il est donc nécessaire de comprendre les complications associées au trouble et d’améliorer le potentiel de résultats plus positifs.

L’utilisation de modèles animaux est la première étape pour comprendre les maladies. Pour assurer les meilleurs résultats de recherche, un modèle typique comprendrait une technique simple, une abordabilité, une reproductibilité élevée et une variabilité minimale. Les déterminants dans les modèles d’AVC ischémiques incluent le volume d’œdème cérébral, la taille infarctus, l’étendue de la rupture de la barrière hémato-encéphalique (BBB) et l’affaiblissement fonctionnel généralement évalué par le score de gravité neurologique².

La technique d’induction de course la plus largement utilisée dans les modèles de rongeurs occluse l’artère cérébrale moyenne (MCA) transitoirement ou de façon permanente³. Cette technique produit un modèle de trait semblable à ceux chez l’homme : elle a une penumbra entourant la zone caressée, est très reproductible, et régule la durée de l’ischémie et la reperfusion⁴. Néanmoins, la méthode MCAO a quelques complications. La technique est sujette à l’hémorragie intracrânienne et des blessures à la rétine ipsilateral avec un dysfonctionnement du cortex visuel et l’hyperthermie commune qui conduisent souvent à des résultats supplémentaires^5,6,7. D’autres limitations incluent des variations élevées dans l’avc induit (résultant de l’extension probable de l’ischémie aux régions involontaires, comme la région externe de l’artère carotide), l’occlusion insuffisante du MCA, et la reperfusion prématurée. En outre, les rats de différentes souches et tailles présentent divers volumes infarctus⁸. En plus de tous les inconvénients mentionnés, le modèle MCAO ne peut pas induire de petits accidents vasculaires cérébraux isolés dans les zones profondes du cerveau, parce qu’il est limité techniquement en termes d’exigence de la taille minimale du navire pour la cathétérisme. Cela rend le besoin d’un modèle alternatif d’autant plus critique. Une autre méthode, la photothrombose, offre une alternative possible aux procédures MCAO, mais n’améliore pas l’efficacité⁹. Cette technique cible les traits avec la lumière et offre quelques améliorations sur les modèles précédents. Cependant, la photothrombose nécessite une craniotomie invasive qui est associée à des compications secondaires⁹.

À la lumière des lacunes décrites, le protocole présenté ici fournit une technique laser alternative capable pour induire des lésions cérébrales chez les rongeurs. Le mécanisme d’action de la technique laser est basé sur les effets photothermaux du laser transmis sur les tissus vivants, ce qui conduit à l’absorption des faisceaux lumineux par les tissus du corps et leur conversion en chaleur. Les avantages de l’utilisation d’une technique laser sont sa sécurité et sa facilité de manipulation. La capacité d’un laser à produire de la chaleur pour arrêter le saignement le rend très important en médecine, tandis que sa capacité à amplifier différents faisceaux à un point de rencontre donné assure que les lasers évitent de détruire les tissus sains qui se dresse sur le chemin du point cible¹⁰. Le faisceau laser utilisé dans ce protocole peut passer à travers un milieu liquide faible, comme l’os, sans émettre son énergie et / ou causer une destruction. Une fois qu’il atteint un milieu liquide élevé, comme les tissus du cerveau, il utilise son énergie pour détruire les tissus cibles. La technique, par conséquent, ne peut induire des lésions cérébrales que dans la zone appropriée du cerveau.

La technique présentée ici a montré une énorme quantité de capacité à réguler ses niveaux d’irradiation, produisant les variations choisies de lésions cérébrales prévues dès le début. Contrairement au MCAO original qui affecte à la fois le cortex et le striatum, la technique laser a été en mesure de réguler l’impact des lésions cérébrales, induisant des blessures uniquement sur le cortex moteur prévu. Ici, le protocole de lésion cérébrale induite par le laser et un résumé des résultats représentatifs de la procédure effectuée sur le cortex cérébral des rats sont fournis.

Protocol

La procédure suivante a été menée conformément aux lignes directrices sur l’utilisation des animaux expérimentaux de la Communauté européenne. Les expériences ont également été approuvées par le Comité des soins aux animaux de l’Université Ben Gourion du Néguev.

1. Sélection et préparation des animaux

1. Sélectionnez 65 rats mâles Sprague-Dawley pesant de 300 à 350 g sans pathologie manifeste pour cette procédure. La plus petite taille pose des difficultés techniques pour la procédure MCAO.
2. Assignez 3 rats par cage et laissez-les s’adapter pendant au moins 3 jours.

2. Procédure MCAO

1. Sélectionnez 25 rats pour MCAO permettant une mortalité de 10 à 20 % associée à la procédure¹¹.
2. Effectuer MCAO en utilisant une technique standard, comme décrit précédemment en détail¹².

3. Procédure expérimentale de lésion cérébrale induite par le laser

1. Assignez 20 rats à un groupe marqué comme groupe laser et 20 rats à un autre groupe témoin (opéré par imposture).
2. Soumettre les rats du groupe laser à l’irradiation laser à 50J X 10 points de la manière suivante:
   1. Anesthétiser le rat avec un mélange de 2% d’isoflurane dans l’oxygène permettant la ventilation spontanée. Vérifiez suffisamment de profondeur anesthésique en pinçant la queue avec des forceps pour voir l’absence du réflexe de retrait.
   2. Maintenir la température corporelle du rat à 37 °C tout au long de la procédure expérimentale à l’aide d’un coussin chauffant régulé à la température rectale.
   3. Retirer les cheveux locaux à l’aide d’un rasoir et les désinfecter avec 70 % d’alcool et 0,5 % de gluconate de chlorhexidine. Répétez l’étape de désinfection deux fois de plus.
      REMARQUE : La taille de l’incision chirurgicale doit être d’environ 3 cm. Retirer les cheveux d’au moins 2 cm autour de la zone d’incision.
   4. Placez le rat sur un support de tête stéréotaxique dans une position sujette et faire une incision de 3 cm pour refléter le cuir chevelu de façon postérieure et pour exposer la zone entre Bregma et Lambda.
   5. Maintenir l’anesthésie par le cône de nez.
   6. Utilisez le laser Neodymium-YAG (Nd-YAG) (longueur d’onde maximale 1064 nm) pour administrer 50 pointsJ X 10, avec une durée d’impulsion de 1 s, à la zone exposée du crâne au-dessus de l’hémisphère droit.
   7. Assurez-vous que la partie génératrice laser de l’appareil se trouve à une distance de 2 mm de la zone exposée pour produire un faisceau laser. 50J X 10 points ont été sélectionnés après une évaluation minutieuse des différentes combinaisons énergie/surface. Cette combinaison est efficace et ne provoque pas la destruction osseuse du crâne après l’administration pour moins d’un deuxième¹⁰.
      REMARQUE : 2 mm est la distance entre le terminal du faisceau laser (du câble optique qu’il traverse) et l’os du crâne. Dans le cas où une lentille de mise au point est utilisée, la distance doit être calculée en tenant compte de l’angle d’inclinaison de la lentille pour concentrer le faisceau dans la zone de dommages souhaitée. Assurer une sécurité adéquate lors de l’utilisation d’un appareil laser, y compris une formation appropriée et une protection oculaire.
   8. Retirer le rat de l’appareil et fermer le cuir chevelu avec 3-0 sutures chirurgicales en soie.
   9. Interrompre l’anesthésie et retourner le rat dans sa cage pour la récupération. Administrer 0,1 mL de 0,25% bupivacaine localement pour réduire la douleur postopératoire immédiatement après la chirurgie.
      REMARQUE : L’ensemble de la procédure doit durer moins de 5 min si elle est effectuée correctement.
3. Observez le rat pour tout signe de détresse pendant la récupération post-anesthésie. Avant l’émergence de l’anesthésie, donner 0.01mg/kg buprénorphine intramusculaire pour l’analgésie postopératoire et continuer avec des doses répétées tous les 12 h pour au moins 48 h.
4. Soumettre les rats de contrôle aux mêmes conditions sans les soumettre au laser.

4. Score de gravité neurologique (NSS)

1. Évaluez le score de gravité neurologique 24 h après la lésion cérébrale induite par le laser à l’aide d’un score de 43 points¹³. Testez les animaux pour les déficits neurologiques, les perturbations de comportement, la tâche d’équilibrage de faisceau, et les réflexes, attribuant des scores plus élevés pour des incapacités plus graves, comme précédemment détaillé¹³.

5. Manipulations post-blessures

1. Après l’évaluation du NSS, euthanasier les rats en les exposant à 20 % d’oxygène et à 80 % de CO2 (par inspiration) et en perfuse transcardiellement le rat avec de la solution saline tamponnée au phosphate héparinisé (PBS, 0,9 % de NaCl).
   REMARQUE : Veiller à ce que le CO₂ soit administré à un taux prédéterminé conformément aux lignes directrices du Comité des soins et de l’utilisation des animaux en établissement. Cette étape peut également être effectuée sous l’anesthésie isoflurane de 5%.
2. Récoltez les cerveaux et préparez-vous à un examen plus approfondi tel que décrit dans un protocole^{antérieur 11}.
3. Évaluer l’hémorragie sous-arachnoïde (SAH) par l’examen visuel du cerveau entier après son isolement du crâne. Si nécessaire, un microscope ou des loupes peuvent être utilisés à cette fin.

6. Évaluation des lésions cérébrales

1. Détermination du volume infarctus du cerveau et de l’œdème cérébral par coloration TTC
   NOTE : La coloration de chlorure de chlorure de 2,3,5-Triphenyltetrazium (TTC) est une procédure pratique pour la détection des infarctus du cerveau¹¹.
   1. Section des cerveaux récoltés en 6 tranches coronales, chacune d’épaisseur de 2 mm.
   2. Incuber l’ensemble de tranches de chaque cerveau pendant 30 min à 37 °C dans 0,05% TTC.
   3. Après coloration, numérisez les tranches à l’aide d’un scanner optique avec une résolution de 1600 X 1600 dpi.
   4. Les zones non tachées des tranches de cerveau fixes sont définies comme infroctées¹².
   5. À l’aide d’un logiciel de traitement d’images (p. ex., freeware Image J),mesurez les hémisphères infarctus, ipsi- et contralatéral non tachés pour chacune des 6 tranches coronales.
   6. Calculer le volume infléqué en pourcentage du cerveau total :
      
   7. Calculer l’oedème cérébral à l’aide de la méthode Kaplan :
      
2. Détermination de l’étendue de la rupture de la barrière hémato-encéphalique (BBB)
   REMARQUE : Évaluez la rupture de BBB 24 h après la lésion cérébrale induite par le laser comme suit :
   1. Administrer 2% Evans Blue mélangé avec 4 mL/kg solution saline par voie intraveineuse aux rats via la veine de la queue cannulée et permettre à la solution de circuler pendant 1 h.
   2. Euthanasier les rats en les exposant à 20% d’oxygène et 80% de CO₂ (via l’inspiration) 24 h après le dernier NSS, comme décrit précédemment¹³.
   3. Récoltez le colorant intravascular localisé comme suit :
      1. Ouvrez les coffres des rats avec des pincettes chirurgicales et des ciseaux chirurgicaux.
      2. Perfusez les animaux avec refroidi 0,9% saline via le ventricule gauche en utilisant 110 mmHg jusqu’à obtenir un liquide de perfusion incolore de l’atrium droit.
   4. Récoltez les cerveaux et coupez-les rostrocaudally en tranches de 2 mm.
   5. Séparez les tranches du cerveau gauche des parties droites pour évaluer séparément les hémisphères blessés et non blessés.
   6. Peser, homogénéiser à l’aide de mortier et de pilon, puis incuber les tissus cérébraux dans 50% d’acide trichloroacétique pendant 24 h.
   7. Centrifuge les tranches de cerveau homogénéisées à 10.000 × g pendant 20 min.
   8. Mélanger 1 mL du supernatant du cerveau centrifuge avec 1,5 mL d’éthanol à 96% à 1:3 et évaluer la rupture de la barrière hémato-encéphalique à l’aide d’un détecteur de fluorescence à 620 nm de longueur d’onde d’excitation (bande passante de 10 nm) et 680 nm de longueur d’onde d’émission (10 nm de bande passante).
      REMARQUE : Les deux groupes de rats subissent le même protocole pour déterminer la dégradation de BBB.

Representative Results

Aucun décès ou SAH n’a été enregistré dans les groupes témoins ou expérimentaux (Tableau 1). Le groupe MCAO avait un taux de mortalité de 20 % et de SAH.

Les changements relatifs de température corporelle chez les rats des deux groupes étaient également similaires, malgré une différence dans la variabilité des deux groupes (tableau 1).

Il y avait un NSS significativement pire dans les modèles laser (16 ± 1.1) et MCAO (20 ± 1,5), comparativement au groupe témoin à commande à commande simulée (1 ± 0,3; Tableau 1; p<0,01).

Les lésions cérébrales induites par le laser ont également causé une augmentation significative du volume d’infarctus dans l’hémisphère cible, comparativement au groupe témoin opéré par imposture (2,4 % ± 0,3 contre 0,5 % ± 0,1; Tableau 2 et figure 1A; p<0.01), selon le test Mann-Whitney U. Toutefois, le volume infarctus du modèle laser était plus faible que la technique MCAO (2,4 % ± 0,3 contre 9,9 % ± 2,9).

Œdème cérébral déterminé 24 h après une lésion cérébrale sont indiqués dans la figure 1B et le tableau 2. Il n’y avait aucune différence dans l’œdème cérébral entre le modèle de lésion cérébrale induite par le laser et le groupe témoin opéré par imposture (3,4 % ± 0,6 contre 0,7 % ± 1,2). Il y avait une différence significative dans l’œdème cérébral entre le modèle laser et la technique MCAO (3,4 ± 0,6 vs 7 ± 2,6†). Les données sont présentées comme moyennes ± SEM.

Comparativement au groupe témoin opéré par une imposture, les lésions cérébrales induites par le laser et la technique MCAO ont toutes deux causé une augmentation significative de la rupture de BBB dans l’hémisphère non blessé (563 ng/g ± 66 et 1176 ng/g ± 168, respectivement, vs 141 ng/g ± 14; Figure 2A et tableau 2; p<0,01) et hémisphère cible (2204 ng/g ± 280 et 2764 ng/g ± 256, respectivement, vs 134 ng/g ± 11; Figure 2B et tableau 2; p<0,01).

L’examen histologique du cerveau des rats est indiqué à la figure 3.

	Nss		Température, °C		SAH, %	Mortalité, %
Groupes	moyenne ± SEM	variabilité, %	moyenne ± SEM	variabilité, %
Contrôle opéré par sham	1 ± 0,3	97	37,2 ± 0,1	59	0	0
Laser 50J x10	16 ± 1,1*	30	37,4 ± 0,1	84	0	0
p-MCAO	20 ± 1,5*	37	38,3 ± 0,1*	129	20*	20*

Tableau 1: Évaluation du SNRS, de la température corporelle, de l’hémorragie sous-arachnoïde et de la mortalité.

	Bbb		Volume infarctus		Œdème cérébral
Groupes	moyenne ± SEM	variabilité, %	moyenne ± SEM	variabilité, %	moyenne ± SEM	variabilité, %
Contrôle opéré par sham	134 ± 11	25	0,5 ± 0,1	77	0,7 ± 1,2	573
Laser 50J x10	2204 ± 280*	40	2,4 ± 0,3*	34	3,4 ± 0,6	58
p-MCAO	2764 ± 256*	29	9,9 ± 2,9*	92	7 ± 2,6*	115

Tableau 2 : Évaluation de la dégradation de BBB, de la zone infarctus et de l’œdème cérébral. * = p < 0,01

Figure 1 : Évaluation des lésions cérébrales dans le modèle laser 24 h après la blessure par rapport au modèle MCAO et au contrôle opéré par imposture. (A) Évaluation du volume infarctus. Il y a eu une augmentation du volume d’infarctus dans le modèle laser par rapport au contrôle opéré par imposture (*p<0.01). Toutefois, le volume infarctus du modèle laser était plus faible que le modèle MCAO (*p<0.01). (B) Évaluation de l’œdème cérébral total. Il y avait une augmentation de l’œdème cérébral dans le modèle MCAO par rapport soit au modèle laser ou le contrôle opéré par imposture. Il n’y avait aucune différence dans l’œdème cérébral entre le modèle laser et le contrôle simulé. Les données sont mesurées en % à l’hémisphère contralatéral et exprimées en moyenne ± SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : L’étendue de la ventilation BBB par rapport aux contrôles fictifs. (A) Hémisphère contralatéral (non blessé). Les modèles laser et MCAO ont entraîné une augmentation significative de la rupture de BBB dans l’hémisphère non blessé par rapport au groupe témoin à commande simulée (*p<0.01). (B) Hémisphère Ipsilateral (blessé). Il y avait une différence dans la dégradation ipsilateral BBB dans les modèles laser et MCAO par rapport à la commande sous l’effet simulé (*p<0.01). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Examen histologique du cerveau des rats à partir de groupes fictifs, laser et MCAO. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Il est juste de supposer que la technique laser est mini-invasive, étant donné qu’aucun décès ou SAH s’est produit dans le groupe laser. La principale cause de décès et de SAH est les dommages aux vaisseaux sanguins qui conduit à une élévation de la pression intracrânienne (ICP), comme le montrent les techniques originales mcao¹⁰. L’absence de décès et de SAH dans le groupe laser est probablement due aux effets spécifiques des lasers : ils n’ont pas d’impact direct sur les vaisseaux sanguins et peuvent induire la coagulation en cas de fuite. Le faible volume infarctus et l’œdème cérébral aident également à minimiser le risque de décès. L’utilisation de lasers devrait être considérée comme une technique appropriée pour induire des lésions cérébrales avec des résultats négatifs minimes, étant donné que les techniques originales mcao pour déclencher un AVC (à la fois transitoire et permanente) ont été montrés pour produire des décès et SAH⁶.

Les résultats de basse température corporelle dans le groupe de laser montrent que la technique de laser n’occluse pas l’artère hypothalamique qui régule la température du corps, comme le MCAO original fait typiquement⁷, soutenant la théorie que la technique de laser est plus ciblée. Une faible variabilité dans l’ensemble des paramètres étudiés a indiqué la cohérence dans l’utilisation des lasers pour induire des lésions cérébrales, mais ces résultats fins dépendent beaucoup du choix de la puissance. Une puissance suffisante donne les résultats souhaités, tandis que peu ou les étalonnages excédentaires peuvent causer une sous-performance ou une sure performance, ce qui, dans les deux cas, est préjudiciable. Néanmoins, la capacité de viser la cible rend encore la technique moins risquée. Par conséquent, une manipulation correcte facilite l’obtention de résultats avec précision en utilisant la technique laser, ainsi que de réguler la méthode pour les effets souhaitables.

La précision et l’efficacité de la technique laser étaient évidentes dans sa capacité à frapper uniquement le cortex moteur sans endommager le striatum, ce qui suggère que la technique laser peut produire des blessures localisées qui est presque impossible à réaliser avec MCAO¹⁰. Ce résultat réalisable avec la technique laser est dû à la capacité de réguler le faisceau laser et sa puissance et fait de la méthode laser une technique de modèle pour induire des lésions cérébrales plus petites, périphériques et profondes et définies qui ne peuvent pas être obtenues avec MCAO. La simplicité de la manipulation d’une machine laser le rend très souhaitable. Contrairement aux techniques MCAO qui exigent une formation ardue et des experts, l’utilisation de lasers est plus simple, ne nécessitant pas d’experts ou de formation coûteuse. L’utilisation de la technique laser pourrait stimuler la recherche et aider à découvrir de meilleurs résultats plus rapidement que la méthode MCAO seule.

En termes de limitations de la technique laser, l’utilisation de faisceaux laser ne produit pas de lésions cérébrales qui sont parfaitement similaires aux accidents vasculaires aigus occlusifs. Plus précisément, les lasers produisent des cicatrices de tissu immédiates au site cible qui sont comparables à un accident vasculaire cérébral occlusif qui est de plusieurs jours. La technique pourrait, par conséquent, ne pas être approprié pour évaluer les médicaments qui visent à prévenir la propagation de l’AVC, mais devrait être idéal dans l’évaluation des accidents vasculaires cérébraux isolés cortex moteur sur les troubles moteurs, cognitifs et comportementaux prolongés. L’utilisation d’un petit nombre de rats pour cette recherche était également une limitation, avec seulement la moitié du nombre de rats (n = 10) dans chaque groupe utilisé pour la récolte du cerveau et l’examen de la taille de l’AVC, l’étendue de l’œdème cérébral, la rupture BBB, et la présence sah.

L’absence de comparaisons entre notre technique et d’autres méthodes laser peut également être considérée comme une limitation. Nous avons délibéré sur l’exécution de méthodes comparatives, mais nous avons décidé de ne pas le faire parce que l’évaluation des dommages causés par ces autres méthodes laser est difficile. Par exemple, la technique de photothrombose⁶ cause des dommages faibles qui font qu’il est difficile d’évaluer l’enflure du cerveau et d’autres conditions qui peuvent se produire. En outre, l’utilisation de la craniotomie dans la technique laser pour l’ischémie est problématique parce que la craniotomie est très invasive et peut augmenter la perméabilité de BBB, causant des lésions cérébrales supplémentaires qui ne sont pas associées à un ACCIDENT VASCULAIRE CÉRÉBRAL. Il est presque impossible d’évaluer ces dommages par rapport à notre méthode. Le modèle laser induit un coup avec le rayonnement à travers le crâne sans craniotomy.

Comme beaucoup de modèles, le modèle laser a ses avantages et ses limites, avec l’inconvénient le plus flagrant est son incapacité à imiter le trait parfaitement humain aussi précisément que d’autres modèles. Néanmoins, la faible variabilité des résultats primaires de la plupart des paramètres, sa précision, son abordabilité, sa capacité à induire de plus petites lésions cérébrales et son application simple en font une technique alternative appropriée pour les lésions cérébrales chez les rongeurs.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	SIGMA - ALDRICH	298-96-4
50% trichloroacetic acid	SIGMA - ALDRICH	76-03-9
Brain & Tissue Matrices	SIGMA - ALDRICH	15013
Cannula Venflon 22 G	KD-FIX	1.83604E+11
Centrifuge Sigma 2-16P	SIGMA - ALDRICH	Sigma 2-16P
Compact Analytical Balances	SIGMA - ALDRICH	HR-AZ/HR-A
Digital Weighing Scale	SIGMA - ALDRICH	Rs 4,000
Dissecting scissors	SIGMA - ALDRICH	Z265969
Eppendorf pipette	SIGMA - ALDRICH	Z683884
Eppendorf Tube	SIGMA - ALDRICH	EP0030119460
Ethanol 96 %	ROMICAL		Flammable Liquid
Evans Blue 2%	SIGMA - ALDRICH	314-13-6
Fluorescence detector	Tecan, Männedorf Switzerland	model Infinite 200 PRO multimode reader
Heater with thermometer	Heatingpad-1	Model: HEATINGPAD-1/2
Infusion Cuff	ABN	IC-500
Isofluran, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017
Multiset	TEVA MEDICAL	998702
Olympus BX 40 microscope	Olympus
Optical scanner	Canon	Cano Scan 4200F
Petri dishes	SIGMA - ALDRICH	P5606
Scalpel blades 11	SIGMA - ALDRICH	S2771
Sharplan 3000 Nd:YAG (neodymium-doped yttrium aluminum garnet) laser machine	Laser Industries Ltd
Stereotaxic head holder	KOPF	900LS
Sterile Syringe 2 ml	Braun	4606027V
Syringe-needle 27 G	Braun	305620