Medicine

兔子静脉介词模型模仿再血管化手术使用静脉移植评估动脉血压下的影响增生

Published: May 15, 2020 doi: 10.3791/60931

Hiroomi Nishio^1,3, Kenji Minatoya¹, Hidetoshi Masumoto^1,2

¹Department of Cardiovascular Surgery, Graduate School of Medicine, Kyoto University, ²Clinical Translational Research Program, RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, ³Department of Cardiovascular Surgery, Takamatsu Red Cross Hospital

Summary

本议定书旨在通过将静脉置于动脉血压下，在使用静脉移植进行静脉移植手术后衰减静脉内血性增生的策略，从而在实验中产生静脉内质增生。

Abstract

虽然静脉移植在缺血性疾病的再血管化手术中通常用作自体移植物，但由于动脉血压暴露，导致静脉增生加速，长期的体量仍然很差。本协议旨在通过将兔形静脉与ipsi侧胡萝卜动脉相交，建立实验性静脉增生。该协议不需要在身体躯干深处进行外科手术，切口的程度有限，对动物的侵入性较小，允许在植入后进行长期观察。这个简单的程序使研究人员能够研究减轻植入静脉移植的暗示增生进展的策略。使用这种协议，我们报告了微RNA-145（miR-145）的影响转导，已知微RNA-145能够控制血管平滑肌肉细胞（VSMC）从增殖到收缩状态的表型，进入收获的静脉移植物。我们通过VSMC的表型变化，在植入手术前通过转导miR-145，证实了静脉移植的体内增生衰减。在这里，我们报告一个侵入性较低的实验平台，以研究可用于减轻静脉移植在再血管手术中的风险增生的策略。

Introduction

全世界因动脉粥样硬化而患缺血性疾病的患者数量正在增加^1。尽管目前心血管疾病的医学和外科治疗取得了进步，但缺血性心脏病，如心肌梗死，仍然是导致发病率和死亡率的主要原因^2。此外，以四肢血流量减少为特征的外周动脉疾病诱发严重的肢体缺血，其中约40%的患者在诊断后6个月内失去双腿，死亡率高达^20%3。

再血管化手术，如冠状动脉旁路移植（CABG）和周围动脉旁路手术，是缺血性疾病的主要治疗选择。这些手术的目的是提供一个新的血液途径，提供足够的血液流向动脉的硬骨或阻塞病变的远端部位。虽然原位动脉移植，如CABG的内部胸动脉，是首选作为旁路移植，因为预期的更长的光度，静脉移植，如自体性沙芬静脉，是常用的，因为更高的可及性和可用性^4。静脉移植的薄弱环节是动脉移植率比动脉移植率低^，在动脉压力下加速增生，导致静脉移植病^6。

静脉移植疾病通过以下三个步骤发展：1）血栓;2）暗示性增生;和3）动脉粥样硬化^7。为了解决静脉移植病，已经进行了大量的^{基础研究。}到目前为止，除了抗血小板和降脂疗法外，没有建议^,在近期指南^{9、10、11、12}¹⁰中进行冠状动脉或外周⁹再血管化手术后进行二次预防。¹¹^,¹²因此，为了克服静脉移植疾病，特别是静脉增生，需要建立相关的实验平台，供进一步研究。

肌增多是一种适应现象，发生在对周围环境变化的反应中，血管平滑肌肉细胞（VSMC）在肌阵中增殖、积累和生成细胞外基质。因此，它为移植异质⁷提供了基础。在超塑性内皮中，VSMC承担增殖，生产而不是收缩，称为"象形变化^"8。控制静脉移植的VSMC表型，预防静脉移植疾病，是一项关键的研究目标，并为此课题⁸进行了许多基础研究。然而，一项旨在实现VSMC表型药理控制的随机对照临床研究^{显示，结果}有限。此外，没有标准化的疗法来防止内量增生。更多的基础研究，包括动物模型研究，是必要的。

为了促进这一领域的研究，建立一个动物模型，在动脉血压下重述静脉移植，允许长期的术后观察是至关重要的。Carrel等人建立了将外管静脉植入胡萝卜动脉¹⁴的一种狗模型。之后，各种静脉移植物被用于调查动脉血压变化的生理和病理影响，包括下部静脉卡巴移植到胸腔或腹部主动脉，或移植到股动脉^15、16、17¹⁶^,¹⁷的沙赫诺静脉。¹⁵这些模型建在较大的动物，如猪或狗，适合模仿静脉移植疾病在临床的情况下。然而，建立一个动物模型，可以准备没有特殊的手术技术，以较低的成本将是研究人员试图开发新的治疗策略，通过VSMC表型控制在体内衰减体内的增生。最初，在神经外科^18、19^,¹⁹领域，将血管插入兔子的胡萝卜动脉。此后，它应用于^20、21^,²¹年恶性增生研究。初始模型仅由静脉互置组成，从而节省时间。此外，随后的研究表明，静脉移植的制备也影响了静脉增生^22。Davies等人评估了气球导管损伤对兔子静脉介词模型^23、24^,²⁴中刺激性增生的影响。虽然气球导管损伤，除了静脉介词更相关的临床设置，一个更可重现的模型也要求。因此，江等人考察了差流量环境对突增增生的影响，建立了远端分支结扎程序，作为可重现的模型^25。然而，他们在静脉移植介位时采用了袖口技术，在临床环境中似乎不同于手工缝合的麻醉。在本协议中，我们报告一个可重复的，临床相关，和广泛的程序，准备兔子静脉介词模型，以评估动脉血压下的内量增生。

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Protocol

注：所有对动物进行的外科手术均应按照《实验室动物护理和使用指南》（www.nap.edu/catalog/5140.html）或其他适当的道德准则进行。议定书应在继续之前得到有关机构动物福利委员会的批准。

1. 动物的准备

购买体重2.7~3.0公斤的雄性日本白兔（或体型相当的兔子）。
在12小时的光暗周期中使兔子适应1周，并在手术前定期喂兔子周食。

2. 麻醉和动物环境

注：所有后续过程必须在无菌条件下执行。手术领域和设备应在使用前用10%的povidone碘溶液、70%酒精或四元铵化合物进行消毒。

通过阴囊静脉注射五巴比妥钠（25毫克/千克）给兔子麻醉。
确保兔子失去力量后，将其转移到操作台，并将其置于上位位置。用麻醉面罩盖住鼻子和嘴巴。开始使用吸入 0.7-1.0% 的 isoflurane-氧混合物来管理一般麻醉。
注：如果兔子开始移动，高达2%的叶氏暂时性浪涌将有效。
使用电动发夹修剪颈部和肩部的毛皮。喷洒70%乙醇或其他防腐剂对表面进行消毒后，用剃须刀剃须刀剃下宫颈区域的其余头发。用10%的povidone-碘消毒手术场，并施用盐酸脂（3毫克/千克）作为局部麻醉。
注：检查气管的重复运动。观察颈静脉和颈动脉的脉动。当呼吸和脉动率降低时，考虑暂时减少麻醉。监测皮内氧饱和度和脉搏速率也很有帮助。
注：协议可以在这里暂停。

3. 血管的收获

注：在进行皮肤切口之前，应使用局部麻醉剂（如利多卡因）。

皮肤切口前，施用预防性鼻糖素（5毫克/千克）下皮。对于肛门，每天给0.05毫克/千克的丁丙诺啡下皮服用，为期3天。
注意：为了避免体温下降，可以使用切口部位的手术磨砂，而不是用70%的乙醇喷洒动物的身体。
通过手术手术刀纵向切开50~60毫米的颈椎区域。直接解剖皮下组织和筋膜，露出20~30毫米的血管部分。用4-0丝缝合线将裸露的静脉的所有分支都拉闸。
在下一步切开颈静脉后，在内部和外部管静脉周围放置一个2-0丝形缝合线，以立即执行连接。
切开静脉远端的贴面墙（约 1 毫米）。从切口插入一个 2 法式气球导管，朝静脉的近端。在壶静脉的远端部位，将2-0丝缝合线。
用0.2 mL的空气充气气球。使用导管的三个通道进行内皮去角质，使静脉的内部化。
注：此过程被认为相当于人类再血管手术中沙赫诺静脉移植的散开，导致内皮去角质。
利盖特的静脉近端。切断静脉收获。
注：仔细区分收获的静脉的远端和近端，因为动脉的麻醉应以倒置的方式进行（即，静脉的远端应附着在动脉的近端）。例如，从某一侧插入静脉导管可以作为标记。
对于收获的血管的治疗操作，使用为每个研究问题设计的方法（例如，电穿孔²⁶或直接浸入溶液²⁷以将微RNA转化为静脉）来治疗收获的静脉。
注：对于此协议，静脉移植物浸泡在磷酸盐缓冲盐水中，控制微RNA和微RNA-145。协议可以在这里暂停。

4. 通过收获的颈静脉将胡萝卜动脉交成

暴露 20-30 mm 的 ipsi侧胡萝卜动脉段。小心地将动脉与附近的静脉和神经分开。用4-0丝缝合线使裸露静脉的所有分支都利盖特。
静脉注射肝素钠（200 IU/kg）。等待 3⁄4 分钟。
用手术夹夹住动脉的近端和远端。在夹子之间切开动脉。将正常盐水注入切口胡萝卜动脉，使动脉变小。
注：兔子颈动脉趋于收缩。选择一个良好失散的网站作为一个阿如托莫西网站。
以反向端到端的方式将收获的静脉向动脉进行治疗。
1. 将 20 G 静脉导管插入收获的静脉中，从远端到近端方向，以保持静脉流明在远端麻醉期间打开。
2. 使用 8-0 将静脉的近端到动脉的远端进行解剖聚丙烯中断缝合。在站点和相反位置放置两个锚杆。在锚性支子之间添加稳定线上侧。
3. 翻转动脉和静脉移植倒置。在阿生托莫森线的剩余部分添加阶梯。
4. 从静脉中取出静脉导管。近地夹紧静脉移植，使静脉动脉变臭。确定静脉移植正在逐步扩大。
5. 使用 8-0 将静脉的远端连接到动脉的近端聚丙烯中断缝合。去给动脉下钳子，检查从阿神莫化部位的出血。如果需要，为Hemostsis添加缝合线。
  注：用纱布温和压缩出血部位并等待可能足以止血。检查近端脱压后静脉移植的立即膨胀和强脉动。如果未观察到这一点，请考虑重复步骤 4.4.2_4.4.3
用4-0丝缝合线对内胡萝卜动脉进行修带，以模拟不良的径流条件，并促进肌化增生。
用盐水清洁伤口。使用 3-0 聚glactin 910逐层关闭伤口。

5. 术后程序

检查动物的自发呼吸后，停止麻醉并取出麻醉面罩。经常检查动物的状况，直到它从麻醉中恢复过来。
保持动物与其他动物分离，直到呼吸功能完全恢复。如有必要，手动支持呼吸。在完全恢复之前，不要将动物返回到更大的组。
从麻醉中恢复后检查食物和水摄入量，并提供适当的营养支持。施用镇痛药（例如，丁丙诺啡0.05~0.2毫克/千克，皮下2倍，为期3天），并检查是否有不适或疼痛的迹象。

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Representative Results

图 1A显示了静脉间位手术（上面板）后 2 周内成功进行插值增生的代表性图像。下面板显示微RNA-145负载聚（乳酸-共甘油酸）纳米粒子的治疗效果，这些纳米粒子衰减了内量增生（下面板）。图1B显示了使用磷酸盐缓冲盐水控制（PBS）、控制微RNA（Cont-miR）和微RNA-145（miR-145）组对照组之间的内量增生的比较。微RNA含有聚（乳酸-共甘油酸）纳米粒子。微RNA-145治疗显著减弱了刺激性增生。图2显示了基-67的免疫染色，一个细胞增殖标记。在miR-145组中观察到的Ki-67阳性细胞较少，这表明VSMC从未成熟的增殖状态到成熟的收缩状态的表型变化。

图1：静脉的刺激性增生成功。（A）代表 Elastica Van Gieson 染色的样品处理与 PBS （上面板）和微RNA-145 加载聚（乳酸-共糖酸）纳米颗粒（下面板）.刻度棒 = 500 μm. （B）对照PBS组中，控制微RNA组（Cont-miR）和微RNA-145（miR-145）组中的内量面积。微RNA含有聚（乳酸-共甘油酸）纳米粒子。统计分析是使用方差的单向分析进行的。请点击此处查看此图形的较大版本。

图2：细胞增殖。Ki-67 染色（棕色）。比例尺 = 100 μm。请点击这里查看此图形的较大版本。

图 3：过程架构。脱氧核糖核酸;PLGA = 聚（乳酸-共甘油酸）;RNA = 核糖核酸。请点击此处查看此图形的较大版本。

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Discussion

本协议旨在提供一个实验平台，用于测试 VSMC 的各种分子或基因干预，以控制表型从增殖状态到收缩状态，进而衰减体内静脉内刺激增生的进展。利用这个模型，我们在手术后2周成功地制备了内皮增生（图1A），并指明了微RNA-145控制VSMC表型^26、27^,²⁷的治疗潜力，验证了本发明作为模型，以进一步研究静脉增生的衰减。

我们的兔子增生模型包括以下三个主要步骤：1）导管损伤;2）血管间位;和3）远端分支连接（图3）。用气球导管通道受伤的静脉移植物被证明是去皮的，并且被证明是超塑性^23，28。²³^,在此协议中，我们将导管受伤的静脉移植物视为皂状静脉移植物，这些移植通常通过人工加压和扩张，用于冠状动脉或外周动脉旁路移植等程序。此外，由于流量降低，远端分支结扎促进了内量增生^25。在报告的低流量模型中，内胡萝卜动脉和除最劣质分支外的所有外部胡萝卜动脉都结扎，与没有远端分支结扎的高流量模型中相比，新肌素增强更多。相反，本协议中的远端分支结扎不包括外部胡萝卜动脉结扎，以简化和最小化程序，本协议中额外的外部胡萝卜动脉连接可能导致更大的新肿瘤进展。

现有的兔子增生模型已经开发，以追求可重复性或临床有效性。初始模型仅包括管状静脉介位^21。之后做了一些修改，包括导管损伤或远端分支结扎，以扩大内量增生的程度^23，25。²³^,相反，我们的目标是建立一个类似临床病例的可重现模型，即糖尿病或周围动脉疾病患者在冠状动脉或下肢循环中往往存在不良的远流。此外，沙芬静脉移植通常通过静水压力手动分离，导致内皮去角质^29。考虑到这些多重因素诱发静脉增生，我们采用了混合静脉介导模型与两个额外的程序相结合，模仿血管化手术。

此程序要求在相对肤浅的身体层上进行手术切除，手术切口仅限于宫颈区域，使其对动物的侵入性降低，从而产生更高的存活率，并促进长期观察。手术麻醉剂在身体的表层进行。这使得不同的研究人员，而不仅仅是外科医生，进行手术。唯一关键的步骤是步骤 4.4 中提到的麻醉过程。不准确的刺激可能导致阿曲解部位的狭窄或遮挡。当 8-0聚丙烯缝合线被创建，建议使用放大倍率至少为2.5倍的手术望远镜。正如另一份报告所述，涉及兔子的刺激性增生模型26，10-0缝合与10倍功率显微镜的帮助也将是有帮助的。²⁶完善模型后，术后2周植入静脉移植的存活率为90.9%。与大型动物实验相比，我们的模型的另一个优点是程序成本相对较低。这使得调查人员能够增加实验量，以执行更多的干预措施。

这种静脉间插模型具有临床相关性、易于处理且成本低。它可以应用于较大的动物模型，并用于临床研究。虽然猪和苍能CABG模型已经开发出30，31，32，他们技术要求很高。³⁰^,³¹^,³²一个猪颈静脉介孔模型，仅由颈静脉介位一项，就建立了^33个。因此，导管损伤和远端分支结扎这两个程序可能另外执行，因为更有效。

另一种可能性是将我们的模型应用于鼠标静脉介词模型。据报道，一个小鼠静脉介词模型采用了技术要求苛刻的袖口技术，以规避直接麻醉^34。在静脉移植病害领域，小鼠实验模型以及大型动物模型已普遍使用³⁵种。其中包括暗示性增生模型和静脉移植性香气模型^36。小鼠体内增生模型的准备技术包括胡萝卜动脉结扎^37、线伤^38、静脉介位和衣领损伤^39。在静脉移植性香气模型中，转基因小鼠通常用于小鼠实验模型，与较大的动物模型不同。在转基因小鼠中，一种混合静脉间交模型与胡萝卜动脉连接将更具临床相关性。

本程序的一个局限性是，在穿插静脉部位的流动模式与人类手术中的静脉移植的流动模式不同。特别是，CABG上静脉移植的血流在舒张阶段提供，其中流动模式与收缩相不同。另一个限制是，建立动物模型，重述由动脉粥样硬化在人类中介导的缺血的病因，是具有挑战性的。使用有脂质代谢受损的转基因动物或高脂肪饮食可能有助于克服这种限制在未来。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了日本教育、文化、体育、科学和技术部的研究资助（25462136）的支持。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Povidone-iodine solution	Nakakita	872612	Surgical expendables
2-0 VICRYL Plus	Johnson and Johnson	VCP316H	Surgical expendables
4-0 Silk suture	Alfresa pharma	GA04SB	Surgical expendables
8-0 polypropylene suture	Ethicon	8741H	Surgical expendables
Cefazorin sodium	Nichi-Iko Pharmaceutical	6132401D3196	Antibiotics
Fogarty Catheter (2Fr)	Edwards Lifesciences LLC	E-060-2F	Surgical expendables
Heparin	Nipro	873334	Anticoagulant
Intravenous catheter (20G)	Terumo	SR-OT2051C	Surgical expendables
Isoflurane	Fujifilm	095-06573	Anesthesia
Lidocaine hydrochloride	MP Biomedicals	193917	Anesthesia
Pentobarbital sodium	Tokyo Chemical Industry	P0776	Anesthesia