Summary
O presente protocolo visa criar experimentalmente hiperplasia intimal venosa submetendo veias à pressão arterial arterial para o desenvolvimento de estratégias para atenuar a hiperplasia intimal venosa após cirurgia de revascularização usando enxertos venosos.
Abstract
Embora enxertos venosos tenham sido comumente usados como enxertos autólogos em cirurgias de revascularização para doenças isquêmicas, a patência a longo prazo permanece pobre devido à aceleração da hiperplasia intimal devido à exposição à pressão arterial. O presente protocolo é projetado para o estabelecimento de hiperplasia intimal venosa experimental interpondo veias jugulares de coelho às artérias carótidas ipsilaterais. O protocolo não requer procedimentos cirúrgicos profundos no tronco do corpo e a extensão da incisão é limitada, o que é menos invasivo para os animais, permitindo a observação a longo prazo após a implantação. Este procedimento simples permite aos pesquisadores investigar estratégias para atenuar a progressão da hiperplasia intimal dos enxertos venosos implantados. Utilizando este protocolo, reportamos os efeitos da transdução de microRNA-145 (miR-145), que é conhecida por controlar o fenótipo das células musculares lisas vasculares (VSMCs) do estado proliferativo ao estado contrátil, em enxertos venosos colhidos. Confirmamos a atenuação da hiperplasia intimal dos enxertos venosos através da transdução de miR-145 antes da cirurgia de implantação através da mudança do fenótipo dos VSMCs. Aqui relatamos uma plataforma experimental menos invasiva para investigar as estratégias que podem ser usadas para atenuar a hiperplasia intimal de enxertos venosos em cirurgias de revascularização.
Introduction
O número de pacientes que sofrem de doenças isquêmicas devido à aterosclerose está aumentando em todo o mundo1. Apesar dos atuais avanços em terapias médicas e cirúrgicas para doenças cardiovasculares, as doenças isquêmicas do coração, como o infarto do miocárdio, continuam sendo uma das principais causas de morbidade e mortalidade2. Além disso, as doenças arteriais periféricas caracterizadas pela redução do fluxo sanguíneo para os membros induzem isquemia crítica aos membros, onde aproximadamente 40% dos pacientes perdem as pernas dentro de 6 meses após o diagnóstico, e a taxa de mortalidade é de até 20%3.
Cirurgias de revascularização, como enxerto de bypass da artéria coronária (CABG) e cirurgia de bypass para artérias periféricas, são as principais opções terapêuticas para doenças isquêmicas. O objetivo dessas cirurgias é fornecer uma nova via sanguínea para fornecer fluxo sanguíneo suficiente em direção ao local distal das lesões estenóticas ou ocluídas das artérias ateroscleróticas. Embora enxertos arteriais in situ, como artérias torácicas internas para CABG, sejam preferidos como enxertos de bypass devido à paciência mais longa esperada, enxertos venosos, como veias saphenous autólogas, são comumente utilizados devido à maior acessibilidade e disponibilidade4. O ponto fraco dos enxertos venosos é a baixa taxa de patency em comparação com a dos enxertos de artéria5 devido à hiperplasia intimal acelerada quando submetida à pressão arterial, o que leva à doença do enxerto venoso6.
A doença do enxerto venoso desenvolve-se através dos seguintes três passos: 1) trombose; 2) hiperplasia intimal; e 3) aterosclerose7. Para enfrentar a doença do enxerto venoso, muitas pesquisas básicas têm sido realizadas8. Até agora, nenhuma estratégia farmacológica além de terapias antiplaquetárias e de redução de lipídios são recomendadas para prevenção secundária após cirurgias de revascularização coronariana ou periférica nas diretrizes recentes9,,10,11,12. Assim, para superar a doença do enxerto venoso, especialmente a hiperplasia intimal, é necessário o estabelecimento de uma plataforma experimental relevante para novos estudos.
A hiperplasia intimal é um fenômeno adaptativo que ocorre em resposta à mudança no ambiente, onde as células musculares lisas vasculares (VSMCs) proliferam, se acumulam e geram matriz extracelular no intima. Consequentemente, apresenta uma base para o ateroroma de enxerto7. No hiperplástico intima, os VSMCs suportam a proliferação, e a produção em vez de contração, denominada "mudança phenotípica"8. É um dos principais alvos de pesquisa para controlar o fenótipo dos VSMCs dos enxertos venosos para prevenir a doença do enxerto venoso, e inúmeros estudos básicos têm sido realizados sobre este tema8. No entanto, um estudo clínico controlado randomizado que teve como objetivo alcançar o controle farmacológico do fenótipo VSMC mostrou resultados limitados13. Além disso, não há terapias padronizadas para prevenir hiperplasia intimal. Mais pesquisas básicas, incluindo estudos de modeloanimal, são necessárias.
Para promover pesquisas nesse campo, é fundamental estabelecer um modelo animal que recapitula enxertos venosos sob pressão arterial, permitindo uma observação pós-operatória de longo prazo. Carrel et al. estabeleceram um modelo canino de implantação da veia jugular externa na artéria carótida14. Tem sido utilizada uma variedade de enxertos venosos para investigar os efeitos fisiológicos e patológicos das alterações na pressão arterial, incluindo a veia cava inferior enxertada na aorta torácica ou abdominal, ou a veia safena enenxertada na artéria femoral15,16,17. Esses modelos foram construídos em animais maiores, como porcos ou cães, que são adequados para imitar uma doença do enxerto venoso em um caso clínico. No entanto, o estabelecimento de um modelo animal que possa ser preparado sem técnicas cirúrgicas especiais e a um custo menor seria ideal para pesquisadores que tentam desenvolver uma nova estratégia terapêutica para atenuar a hiperplasia intimal através do controle do fenótipo VSMC in vivo. Inicialmente, foi introduzida a interposição da veia jugular na artéria carótida em um coelho no campo da neurocirurgia18,19. Posteriormente, foi aplicada a pesquisas sobre hiperplasia intimal20,21. O modelo inicial consiste apenas na interposição venosa, economizando tempo. Além disso, um estudo subsequente demonstrou que a preparação de um enxerto venoso também afetou a hiperplasia intimal22. Davies et al. avaliaram o efeito da lesão do cateter de balão na hiperplasia intimal em uma interposição venosa de coelho modelo23,24. Embora a lesão do cateter de balão, além da interposição venosa, tenha sido mais relevante para um ambiente clínico, também foi desejado um modelo mais reprodutível. Assim, Jiang et al. examinaram o impacto dos ambientes de fluxo diferencial na hiperplasia intimal e estabeleceram um procedimento de ligadura de ramo distal como um modelo reprodutível25. No entanto, eles utilizaram uma técnica de punho no momento da interposição do enxerto venoso que parece diferente da anastomose costurada à mão no ambiente clínico. No presente protocolo, relatamos um procedimento reprodutível, clinicamente relevante e amplamente disponível para a preparação de um modelo de interposição venosa de coelho para avaliar a hiperplasia intimal sob pressão arterial.
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Protocol
NOTA: Todos os procedimentos cirúrgicos realizados em animais devem ser realizados de acordo com o Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (www.nap.edu/catalog/5140.html) ou outras diretrizes éticas adequadas. Os protocolos devem ser aprovados pela comissão de bem-estar animal na instituição apropriada antes de prosseguir.
1. Preparação de animais
- Compre coelhos brancos japoneses machos (ou coelhos com tamanho equivalente do corpo) pesando 2,7-3,0 kg.
- Aclimate os coelhos por 1 semana em um ciclo claro-escuro de 12 horas e alimente uma dieta regular de comida de coelho antes do procedimento.
2. Anestesia e configuração animal
NOTA: Todos os procedimentos subsequentes devem ser realizados sob condições assépticas. O campo cirúrgico e os dispositivos devem ser desinfetados com 10% de solução de povidone-iodo, 70% de álcool ou um composto quaternário de amônio antes do uso.
- Anestesiar um coelho com administração intravenosa de sódio pentobarbital (25 mg/kg) através da veia auricular.
- Depois de garantir que o coelho perdeu sua força, transfira-o para uma mesa de operação e coloque-o na posição supina. Cubra o nariz e a boca com uma máscara anestéstica. Iniciar a administração da anestesia geral com a inalação de 0,7-1,0% mistura isoflurano-oxigênio.
NOTA: Se o coelho começar a se mover, um surto temporal de isoflurano de até 2% será eficaz. - Corte a pele no pescoço e no ombro usando um cortador de cabelo elétrico. Depois de desinfetar a superfície pulverizando 70% de etanol ou outra solução antisséptica, raspe o resto do cabelo na região cervical com uma navalha. Desinfete o campo cirúrgico com 10% de povidone-iodo e administre cloridrato de lidocaína (3 mg/kg) subcutâneamente como anestesia local.
NOTA: Examine o movimento repetitivo da traqueia. Observe a pulsação da veia jugular e da artéria carótida. Quando as taxas respiratórias e pulsátilas diminuem, considere uma redução temporária na administração da anestesia. Monitorar a saturação percutânea de oxigênio e a freqüência de pulso também é útil.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
3. Colheita da veia jugular
NOTA: Os anestésicos locais (como a lidocaína) devem ser usados antes de fazer a incisão cutânea.
- Antes da incisão da pele, administre enrofloxacina profilática (5 mg/kg) subcutâneamente. Para analgesia, administre 0,05 mg/kg de buprenorfina subcutânea duas vezes por dia durante 3 dias.
NOTA: Para evitar uma queda na temperatura corporal, pode ser utilizado um esfoliante cirúrgico do local da incisão em vez de pulverizar o corpo do animal com 70% de etanol. - Incise 50-60 mm da região cervical com bisturi cirúrgico longitudinalmente. Dissecar sem rodeios os tecidos subcutâneos e a fáscia para expor um segmento de 20 a 30 mm da veia jugular. Liga todos os ramos da veia exposta com suturas de seda 4-0.
- Coloque uma sutura de seda 2-0 em torno das veias jugular internas e externas para realizar a ligadura imediatamente após a incisa da veia jugular no próximo passo.
- Incida a parede venosa (aproximadamente 1 mm) do lado distal da veia. Insira um cateter de balão 2-French do corte em direção ao lado proximal da veia. Liga a sutura de seda 2-0 nos locais distais das veias jugularas.
- Infle o balão com 0,2 mL de ar. Desnuda a intimação da veia usando três passagens do cateter para esfoliação endotelial.
NOTA: Este procedimento é considerado equivalente à distensão de enxerto de veia safena em cirurgias de revascularização humana, o que causa esfoliação endotelial. - Liga a extremidade proximal da veia. Corte a veia para colher.
NOTA: Distingue cuidadosamente a extremidade distal e proximal da veia colhida, pois a anastomose na artéria deve ser realizada de forma invertida (ou seja, a extremidade distal da veia deve ser anastomosa da extremidade proximal da artéria). Por exemplo, a inserção de um cateter intravenoso de um determinado lado funcionaria como um marcador. - Para manipulações terapêuticas para a veia jugular colhida, trate a veia colhida com métodos projetados para cada questão de pesquisa (por exemplo, eletroporação26 ou imersão direta com soluções27 para transdutação de microRNAs nas veias).
NOTA: Para este protocolo, os enxertos venosos foram embebidos em solução salina tamponada por fosfato, microRNA de controle e microRNA-145. O protocolo pode ser pausado aqui.
4. Interpor a artéria carótida pela veia jugular colhida
- Exponha um segmento de 20 a 30 mm da artéria carótida ipsilateral. Separe a artéria cuidadosamente da veia e nervo próximo. Liga todos os ramos da veia exposta com sutura de seda 4-0.
- Administrar o sódio de heparina por via intravenosa (200 UI/kg). Espere de 3 a 4 min.
- Fixar as extremidades proximal e distal da artéria com grampos cirúrgicos. Corte a artéria no meio, entre os grampos. Injete salina normal na artéria carótida incisiva proximamente e distalmente para distendir a artéria.
NOTA: Uma artéria carótida de coelho tende a encolher. Escolha um site bem distendido como um site de anastomose. - Anastomose a veia colhida para a artéria de uma forma invertida de ponta a ponta.
- Insira um cateter intravenoso de 20 G na veia colhida desde o distal até a direção proximal para manter o lúmen venoso aberto durante a anastomose distal.
- Anastomose a extremidade proximal da veia para a extremidade distal da artéria usando 8-0 suturas interrompidas de polipropileno. Coloque dois estiques de âncora no local e no local oposto. Adicione o lado superior da linha de anastomose entre as estrias de âncora.
- Vire a artéria e o enxerto de veia de cabeça para baixo. Adicione stiches na parte restante da linha de anastomose.
- Retire o cateter intravenoso da veia. Aperte o enxerto venoso proximamente e decline a artéria carótida distalmente. Verifique se o enxerto venoso está se expandindo gradualmente.
- Anastomose a extremidade distal da veia para a extremidade proximal da artéria usando 8-0 suturas interrompidas de polipropileno. Declâmp a artéria para verificar o sangramento dos locais de anastomose. Adicione suturas para hemostasia, se necessário.
NOTA: Uma compressão suave do local sangrando com gaze e espera pode ser suficiente para hemostasia. Verifique a expansão imediata e a forte pulsação do enxerto venoso após a depressão proximal. Se isso não for observado, considere repetir as etapas 4.4.2-4.4.3
- Liga a artéria carótida interna com uma sutura de seda 4-0 para simular uma condição de escoamento ruim e para facilitar a hiperplasia intimal.
- Limpe a ferida com salina. Feche a ferida usando 3-0 poliglactina 910, camada por camada.
5. Procedimentos pós-operatórios
- Acabe com a anestesia e remova a máscara de anestesia depois de verificar a respiração espontânea do animal. Verifique as condições do animal com freqüência até que ele se recupere da anestesia.
- Mantenha o animal separado de outros animais até que a função respiratória seja totalmente restaurada. Apoie a respiração manualmente, se necessário. Não devolva o animal para um grupo maior até a recuperação completa.
- Verifique a ingestão de alimentos e água após a recuperação da anestesia e forneça suporte nutricional adequado. Administrar analgésicos (por exemplo, buprenorfina 0,05-0,2 mg/kg subcutâneamente 2x por dia durante 3 dias) e verificar se há sinais de desconforto ou dor.
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Representative Results
A Figura 1A mostra uma imagem representativa de hiperplasia intimal bem sucedida em 2 semanas após a cirurgia de interposição venosa (painel superior). O painel inferior mostra os efeitos terapêuticos de nanopartículas poli(ácido cogólico- lacótico-co-glicólico) microRNA-145 que atenuaram a hiperplasia intimal (painel inferior). A Figura 1B mostra a comparação da hiperplasia intimal entre o grupo controle utilizando os grupos de controle de solução salina tamponada fosfato (PBS), microRNA de controle (Cont-miR) e microRNA-145 (miR-145). As MicroRNAs foram carregadas com nanopartículas polióticas-coglicólicos. Tratamento com microRNA-145 hiperplasia intimal atenuada significativamente. A Figura 2 mostra imunocoloração para Ki-67, um marcador de proliferação celular. Menos células Ki-67 positivas são observadas no grupo miR-145, indicando uma mudança de fenótipo nos VSMCs do estado proliferativo imaturo para o estado de contração maduro.
Figura 1: Hiperplasia intimal bem sucedida das veias. (A) A Coloração representativa Elastica Van Gieson para amostras tratadas com PBS (painel superior) e com nanopartículas poli(ácido lacótico-cogólico) (painel inferior). Barras de escala = 500 μm. (B) Área intima l no grupo PBS controle, grupo de microRNA de controle (Cont-miR) e microRNA-145 (miR-145). MicroRNAs são carregadas com nanopartículas polióticas-co-glicólicos. As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se análise unidirecional de variância. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Proliferação celular. Coloração Ki-67 (marrom). Barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Esquema processual. DNA = ácido desoxiribonucleico; PLGA = poli (ácido láctico-cogólico); RNA = ácido ribonucleico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O presente protocolo foi projetado para fornecer uma plataforma experimental para testar várias intervenções moleculares ou genéticas para VSMCs para controlar o fenótipo do estado proliferativo para o estado contrátil e, posteriormente, atenuar a progressão da hiperplasia intimal venosa in vivo. Utilizando este modelo, preparamos com sucesso a hiperplasia intimal 2 semanas após a cirurgia (Figura 1A) e indicamos o potencial terapêutico do microRNA-145 para controlar o fenótipo VSMC26,27, validando o presente protocolo como modelo para investigar ainda mais a atenuação da hiperplasia venosa intima.
Nosso modelo de hiperplasia intimal de coelho consiste nos seguintes três passos principais: 1) lesão do cateter; 2) interposição de veias jugularas; e 3) ligadura de ramo distal(Figura 3). Enxertos venosos feridos com passagem de cateter de balão mostraram-se deendotelializados, e o intima foi provado ser hiperplástico23,28. Neste protocolo, consideramos os enxertos venosos feridos por cateter como enxertos de veia saphenous que muitas vezes são pressurizados manualmente e dilatados em ambientes clínicos para procedimentos como enxertos de bypass coronárias ou periféricas. Além disso, a ligadura de ramo distal promoveu hiperplasia intimal devido à redução da vazão25. No modelo relatado de baixo fluxo, onde a artéria carótida interna e todas as artérias carótidas externas, exceto o ramo mais inferior, foram ligadas, a neointima foi mais aprimorada em relação à do modelo de alto fluxo sem ligadura de ramo distal. Em contrapartida, a ligadura de ramo distal neste protocolo não incluiu ligadura de artéria carótida externa para simplificar e minimizar os procedimentos, e a ligadura adicional da artéria carótida externa no presente protocolo pode resultar em maior progressão neoíntimal.
Modelos de hiperplasia intimal de coelho existentes foram desenvolvidos para buscar a reprodutibilidade ou a validade clínica. O modelo inicial compreendeu apenas a interposição da veia jugular21. Posteriormente foram feitas algumas modificações, incluindo lesão por cateter ou ligadura de ramo distal, para aumentar a extensão da hiperplasia intimal23,25. Em contrapartida, buscou-se estabelecer um modelo reprodutível semelhante a um caso clínico, onde pacientes com diabetes mellitus ou doença arterial periférica frequentemente apresentam má perfusão distal na circulação coronariana ou inferior da extremidade. Além disso, enxertos de veia saphenous são frequentemente distendidos manualmente através da pressão hidrostática que causa esfoliação endotelial29. Considerando esses múltiplos fatores indutores da hiperplasia intimal, adotamos o modelo de interposição venosa mista combinado com os dois procedimentos adicionais, imitando uma cirurgia de revascularização.
Este procedimento requer dissecções cirúrgicas em camadas relativamente superficiais do corpo, e a incisão cirúrgica é limitada à região cervical, tornando-a menos invasiva para os animais, resultando em uma maior taxa de sobrevivência e facilitando a observação a longo prazo. As anastomoses cirúrgicas são realizadas no nível superficial do corpo. Isso permite que diferentes pesquisadores, não apenas cirurgiões, realizem o procedimento. O único passo crítico seria o procedimento de anastomose mencionado na etapa 4.4. Estereos imprecisos podem resultar em estenose ou oclusão no local da anastomose. Quando 8-0 Suturas de polipropileno são criadas, recomenda-se o uso de telescópios cirúrgicos com uma ampliação de pelo menos 2,5x. Como descrito em outro relatório que abordou a hiperplasia intimal de coelho modelo26, 10-0 suturas com o auxílio de microscópios de energia 10x também seria útil. Após aperfeiçoar nosso modelo, nossa taxa de patency do enxerto de veia implantado em 2 semanas no pós-operatório foi de 90,9%. Outra vantagem do nosso modelo é o custo de procedimento relativamente menor em comparação com o de grandes experimentos em animais. Isso permite que os investigadores aumentem o volume experimental para realizar um número maior de intervenções.
Este modelo de interposição venosa é mais relevante clinicamente, fácil de manusear e de baixo custo. Pode ser aplicado a modelos animais maiores e usado para estudos clínicos. Embora os modelos CABG suínos e caninos tenham sido desenvolvidos30,31,32, eles são tecnicamente exigentes. Um modelo interposto de veia jugular porcina que consiste apenas na interposição de veias jugulares foi estabelecido33. Assim, é possível que os dois procedimentos de lesão por cateter e ligadura de ramificação distal sejam realizados adicionalmente como sendo mais válidos.
Outra possibilidade é aplicar nosso modelo a um modelo de interposição venosa do mouse. Um modelo de interposição venosa relatado do rato adotou uma técnica de punho tecnicamente exigente para contornar a anastomose direta34. No campo da doença do enxerto venoso, modelos experimentais de camundongos, bem como modelos animais maiores têm sido comumente utilizados35. Estes incluem modelos de hiperplasia intimal e modelos de atheroma de enxerto venoso36. As técnicas envolvidas na preparação de modelos de hiperplasia intimal em camundongos incluem ligadura da artéria carótida37,lesão de arame38,interposição venosa e lesão na coleira39. Nos modelos de atera de enxerto de veia, camundongos geneticamente modificados são tipicamente usados em modelos experimentais de camundongos, em contraste com modelos animais maiores. Um modelo de interposição venosa mista com a ligadura da artéria carótida em camundongos geneticamente modificados seria mais relevante clinicamente.
Uma limitação do presente procedimento é que o padrão de fluxo no local da veia interposta não é o mesmo dos enxertos venosos em cirurgias humanas. Em particular, o fluxo sanguíneo dos enxertos venosos no CABG é fornecido na fase diastólica, onde o padrão de fluxo é diferente do da fase sistólica. Outra limitação é que o estabelecimento de modelos animais recapitulando a etiologia da isquemia mediada pela aterosclerose em humanos é desafiador. O uso de animais geneticamente modificados com metabolismo lipídico prejudicado ou em uma dieta rica em gordura pode ajudar a superar essa limitação no futuro.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por bolsas de pesquisa do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia do Japão (25462136).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Povidone-iodine solution | Nakakita | 872612 | Surgical expendables |
| 2-0 VICRYL Plus | Johnson and Johnson | VCP316H | Surgical expendables |
| 4-0 Silk suture | Alfresa pharma | GA04SB | Surgical expendables |
| 8-0 polypropylene suture | Ethicon | 8741H | Surgical expendables |
| Cefazorin sodium | Nichi-Iko Pharmaceutical | 6132401D3196 | Antibiotics |
| Fogarty Catheter (2Fr) | Edwards Lifesciences LLC | E-060-2F | Surgical expendables |
| Heparin | Nipro | 873334 | Anticoagulant |
| Intravenous catheter (20G) | Terumo | SR-OT2051C | Surgical expendables |
| Isoflurane | Fujifilm | 095-06573 | Anesthesia |
| Lidocaine hydrochloride | MP Biomedicals | 193917 | Anesthesia |
| Pentobarbital sodium | Tokyo Chemical Industry | P0776 | Anesthesia |
References
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