Summary
في هذه التجربة، يتم حقن الماوس في الوريد الذيل مع رودامين B isothiocyanate-dextran التي يمكن أن وصمة عار الأوعية الدموية. بعد تعرض الكبد وإصلاحه ، يمكن اختيار جزء محدد من الكبد لمراقبة الأنسجة العميقة في الجسم الحي باستخدام المجهر متعدد الفوتون.
Abstract
مراقبة ديناميات داخل الأوعية الدموية من أنسجة الكبد الماوس يسمح لنا لإجراء مزيد من الملاحظات المتعمقة والدراسات على الأمراض المرتبطة بالأنسجة من كبد الفأر. يتم حقن الماوس بصبغة يمكن أن تلطخ الأوعية الدموية. لمراقبة كبد الماوس في الجسم الحي ، يتم كشفه وإصلاحه في إطار. يتم الحصول على صور ثنائية وثلاثية الأبعاد للأوعية الدموية في أنسجة الكبد باستخدام مجهر متعدد الفوتون. يتم الحصول على صور الأنسجة في المواقع المختارة باستمرار لمراقبة التغيرات على المدى الطويل؛ ويلاحظ أيضا التغيرات الديناميكية للأوعية الدموية في أنسجة الكبد. المجهر متعدد الفوتون هو وسيلة لمراقبة وظيفة الخلية والخلية في أقسام الأنسجة العميقة أو الأعضاء. يتميز المجهر متعدد الفوتون بحساسية تجاه البنية المجهرية للأنسجة ويمكن من تصوير الأنسجة البيولوجية بدقة مكانية عالية في الجسم الحي ، مما يوفر القدرة على التقاط المعلومات الكيميائية الحيوية للمنظمة. يستخدم المجهر متعدد الفوتون لمراقبة جزء من الكبد ولكن تحديد الكبد لجعل الصورة أكثر استقرارا هو إشكالية. في هذه التجربة ، يتم استخدام كوب شفط فراغ خاص لإصلاح الكبد والحصول على صورة أكثر استقرارا للكبد تحت المجهر. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذه الطريقة لمراقبة التغيرات الديناميكية لمواد محددة في الكبد عن طريق وضع علامات على هذه المواد بالأصباغ.
Introduction
يمكن للأوعية الدموية توفير المواد الغذائية لمختلف أنسجة الأعضاء في جسم الإنسان، وتبادل المواد. وفي الوقت نفسه، تعمل العديد من السيتوكينات والهرمونات والأدوية والخلايا أيضا من خلال نقل الأوعية الدموية إلى مواقع محددة. يمكن أن تساعد مراقبة التغيرات الوعائية في أنسجة الكبد في فهم توزيع تدفق الدم في أنسجة الكبد ونقل المواد ، والمساعدة في تحليل بعض الأمراض المرتبطة بالأوعية الدموية1،2.
هناك العديد من الطرق لمراقبة الأوعية الدموية للكبد في الفئران. من بينها ، المجهر البصري له العديد من القيود في مراقبة الأنسجة الوعائية المبهمة3. يمكن استخدام المجهر متعدد الفوتون لتصوير الأوعية الدموية للكبد الحية بدقة عالية غير باضعة4. لا يمكن فقط الحصول على صور ثلاثية الأبعاد للأوعية الدموية ، ولكن يمكن أيضا استخدام هذه التقنية للمساعدة في تنظيم الأنسجة لمراقبة الآثار البيولوجية فيها ؛ وعلاوة على ذلك، يمكن تصوير الأنسجة بأكملها بدلا من الميكروفسيل فقط كما هو الحال في التصوير المقطعي المحوسب والتصوير بالرنين المغناطيسي5.
يمكن استخدام المجهر متعدد الفوتونات للكشف الفعال عن إشارات الفلورسنت المتناثرة في الأنسجة الحية العميقة ، مع أقل سميةضوئية 6. لذلك ، يمكن ضمان نشاط الأنسجة الحية ، ويمكن تقليل كمية الضرر. Microscopy multiphoton لديه قوة اختراق أفضل من المجهر confocal ، مما يسمح لطبقات أعمق أن يلاحظ7، وتوفير التصوير 3D فريدة من نوعها. يستخدم الآن المجهر متعدد الفوتون في تصوير الأعصاب القحفية8 وتم توسيعه ليشمل دراسة ديناميات الخلايا العصبية في الفئران الحية9و10و11.
في هذه التجربة ، بعد وضع علامات فلورية للأوعية الدموية الماوس ، يتم إصلاح الكبد في إطار ، ويمكن رؤية ديناميات الأوعية الدموية في أنسجة الكبد الحية باستخدام المجهر متعدد الفوتون. توضح هذه التجربة كيفية وضع علامة على مواد محددة ، واستخدام المجهر متعدد الفوتون للمساعدة في مراقبة موقع داخل الأنسجة ، ومراقبة الأحداث الخلوية في الأنسجة بين الخلايا ، وإجراءقياسات ضوئية 12،13،14، ومراقبة الديناميكيات المادية داخل الأنسجة الحية15. على سبيل المثال، تم تحديد علامة بطانة الورم 1 (TEM1) كعلامة سطح جديدة أعلى تنظيما على الأوعية الدموية والستروما في العديد من الأورام الصلبة، ووضع علامة على جزء متغير من سلسلة واحدة (scFv) 78 ضد TEM1، ومن ثم يمكن استخدام المجهر متعدد الفوتون لموقع ورم وعائي الماوس وتقييم الأورام16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع العناية بالحيوانات والإجراءات كانت وفقا لسياسات مستشفى نانفانغ الصيني للرعاية الصحية والرفاهية (التطبيق رقم: NFYY-2019-73).
1. إعداد الماوس
- تخدير الفأرة.
- إعداد بنتوباربيتال الصوديوم (50 ملغم/كغ) في حقنة.
- الاستيلاء على الماوس (8 أسابيع من العمر C57BL الذكور / 6) مع اليد اليسرى بحيث بطنها تواجه ورأسها هو أقل من ذيله. تطهير الجلد البطن مع الكحول 75٪.
- عقد الحقنة في اليد اليمنى، واخترق خط البطن الأبيض مع الإبرة قليلا إلى الجانب الأيمن من الجلد من قبل 3-5 ملم. تأكد من أن إبرة الحقن والجلد بزاوية 45 درجة، وحقن البنتوباربيتال ببطء في تجويف البطن. بعد الحلاقة، يطهر حول موقع شق الماوس 3 مرات بالتناوب مع 75٪ الكحول والحل الكلورهيكسيدين.
- تحقق مما إذا كان التخدير ناجحا بسبب عدم وجود رد فعل تصحيحي.
- حقن رودامين B ايزوثيوسيانات-ديكتران في الوريد الكودالي.
- إعداد 100 ميكرولتر من 10 ملغم/مل رودامين B ايزوثيوسيانات-ديكتران في حقنة.
- امسح ذيل الفأر ب 75٪ كحول.
- أمسك الذيل باليد اليسرى، واحمل الحقنة في اليد اليمنى مع الإبرة الموازية للوريد، وحقن صبغة 100 ميكرولتر.
- وقف النزيف مع مسحة القطن بعد الحقن.
- نقع فرو البطن الماوس مع شاش مبللة بالماء العقيم، وحلق بطن الماوس باستخدام شفرة حلاقة، مما يجعل السكتات الدماغية في اتجاه الفراء. بعد الحلاقة، يطهر حول موقع شق الماوس 3 مرات بالتناوب مع 75٪ الكحول والحل الكلورهيكسيدين.
- بعد مسح وسادة التدفئة مع الكحول 75٪، وفتح وسادة التدفئة، ووضع الماوس على ظهره في لوحة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم في 37 درجة مئوية.
2. تحديد الكبد الماوس مع إطار تصوير الجهاز الجسم
ملاحظة: لم يتم إصدار إطار تصوير الأعضاء التجارية بعد.
- ضع كوب شفط نظيف في وضع ثابت.
- تثبيت لاعبا اساسيا التصوير الجهاز (الشكل التكميلي 1) ومسح وسادة التدفئة وكأس الشفط مع الكحول 75٪.
- قم بتوصيل كوب الشفط (قطر 5 مم) بخرطوم مضخة الفراغ ثم قم بتشغيل مضخة الفراغ.
- على طاولة معقمة معقمة مع الكحول 75٪، ويطهر حول موقع شق الماوس 3 مرات بالتناوب مع 75٪ الكحول ومحلول الكلورهيكسيدين، ثم يطهر حول موقع شق الماوس 3 مرات بالتناوب مع 75٪ الكحول ومحلول الكلورهيكسيدين، ثم استخدام مقص الجراحية لقطع 2 سم من الجلد قبالة الحدود السفلية القصية للفأر وفضح الكبد.
- ضع الماوس مع لوحة التدفئة على قاعدة الحامل.
- ضبط لاعبا اساسيا التصوير الجهاز بحيث كوب شفط يحمل الكبد. ثم استخدم الضغط السلبي من 30-35 كيلو باسكال للشفط بحيث يعلق الكبد على كوب الشفط(الشكل التكميلي 2).
3. ضبط المجهر متعدد الضوئي الليزر المسح الضوئي
- قم بتشغيل المجهر متعدد الفوتون وحدد الهدف 60x/1.00 W.
- إصلاح الإطار والفأرة تحت العدسة الهدف.
- إضافة قطرة من المالحة العادية التي يمكن أن تغطي العدسة بأكملها، والتي هي مركز كوب الشفط، وضبط العدسة الهدف لمجرد لمس المالحة العادية.
- انقر نقرا مزدوجا فوق رمز الكمبيوتر لتشغيل برنامج الليزر وتشغيل المفتاح. ثم اضغط مع الاستمرار على زر الطاقة ومصراع الكاميرا لمدة 3 ق.
- تعيين الطول الموجي إلى 800 نانومتر.
- بدء تشغيل برنامج تشغيل المجهر باستخدام الكمبيوتر.
- لإعداد الاستحواذ، قم بتعيين ليزر 800.
4. المراقبة باستخدام مجهر المسح بالليزر متعدد الفوتون
- للتحكم في الحصول على الصورة، انقر فوق مفتاح الفلورسنت.
- تأكد من أن أضواء الغرفة والمعدات مطفأة. لتقليل مستويات الضوضاء، استخدم المجهر في بيئة مظلمة.
- افتح مصراع مسار الضوء على المجهر.
- تدوير مرشح مضان إلى العتاد الرابع وسحب اثنين من العتلات من التبديل البصري.
- يبحث من خلال العدسة، واستخدام شبه القرصنة الخشنة وغرامة التركيز لضبط البعد البؤري، واستخدام محاور X/Y لضبط مجال الرؤية للعثور على المنطقة المستهدفة.
5. التصوير المجهري متعدد الفوتون بالليزر
- إيقاف تشغيل مفتاح الفلورسنت على البرنامج، والتبديل مرشح الفلورسنت إلى العتاد الثاني (والعتاد الثاني هو RXD1)، ودفع اثنين من العتلات من التبديل البصري.
- انقر على التركيز ×2 لمعاينة المنطقة المستهدفة وضبط الإعداد الاستحواذ والمعلمات التحكم في اقتناء الصور (دقة الصورة: 1024).
- اضغط على Control + C وضبط الجهد العالي والكسب والإزاحة (لتقليل مستويات الضوضاء).
- انقر فوق إيقاف لإيقاف المعاينة، وانقر فوق الزر XY لمسح بعدين، وحفظ بعد الانتهاء (الشكل 1).
- حدد منطقة، وانقر على العمق،ثم معاينة لتحديد مجموعة النهاية وبدء مجموعة (انظر الجزء المطلوب الكامل من الأوعية الدموية) في إعداد المجهر. مسح الصور ثلاثية الأبعاد وحفظها بعد الانتهاء (الشكل 2).
- حدد منطقة، وانقر على الوقت،وضبط إعدادات الاستحواذ الأخرى والمعلمات التحكم في اقتناء الصور (حجم الخطوة: 1 ميكرومتر؛ 1 ميكرومتر؛ شرائح: 10; رقم المسح الضوئي للوقت: 40). مسح شرائح مختلفة وحفظ بعد الانتهاء من الحصول على الصور المتحركة (فيديو 1).
ملاحظة: يجب أن يهتم شخص ما بالفئران أثناء الفحص وإضافة التخدير وفقا لذلك. - التضحية الماوس عن طريق تشريح الرقبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويمكن رؤية توزيع الأوعية الدموية في الكبد في الشكل 1, الحصول عليها باستخدام المجهر متعددةفوتون. وينقسم الأوعية الدموية إلى عدد وافر من الفروع المنبثقة من جذع وتوزيعها على المساحة المحيطة بها. المحيط الخارجي للأوعية الدموية أحمر ، والتجويف الداخلي مظلم ، وهناك العديد من الأشياء في الداخل. كلما كانت الصورة أكثر وضوحا ، كلما كانت أقرب إلى مستوى الملاحظة. وهناك أيضا بعض البقع الحمراء حولها، وربما لأن الصبغة تخترق الأنسجة المحيطة بها لتلطيخ مواد أخرى. في الفيديو 1، هناك أشياء غير حمراء يمكن أن تكون خلايا تتحرك في الأوعية الدموية الحمراء. في نهاية الفيديو ، يتم تظلم بعض هذه الأشياء. ربما يرجع ذلك إلى أن الكبد الثابت لم يتم إصلاحه بشكل جيد مع مرور الوقت. هذه الطريقة سوف تسمح التصوير لمدة 2 ساعة.
الشكل 1: الأوعية الدموية في أنسجة الكبد تحت المجهر متعدد الفوتون. الأوعية الدموية حمراء. صورة ثنائية الأبعاد للأوعية الدموية بدقة 2048 وHV من 512 ، يمكن أن تصور بوضوح الأوعية الدموية الحمراء بعد التلطيخ. وهناك أيضا بعض البقع الحمراء حولها، وصبغ قد تخترق أيضا الأنسجة المحيطة بها لصبغ مواد أخرى. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صورة ثلاثية الأبعاد لأنسجة الكبد الحية في نفس الوضع. سمك هو 9 ميكرومتر، ويلاحظ مورفولوجيا الأوعية الدموية من زوايا مختلفة، ويتم جمع الصور الديناميكية. بعد التوليف ، وينظر إلى الخلايا في الأوعية الدموية (الظلام) تتدفق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: إطار تصوير أعضاء الجسم. (أ) وسادة التدفئة: يحافظ على درجة حرارة جسم الماوس. (ب) قوس: يمكن أن توفر قاعدة لوضع الماوس وموقف كوب شفط قابل للتعديل مع المقابض. (ج) كوب الشفط: يتم إصلاحه بواسطة القوس. الضغط السلبي الذي توفره مضخة الضغط السلبي يسبب الكبد لامتزاز العدسة الشفافة في وسط كوب الشفط. (د) الأنابيب المرنة: يربط كوب الشفط مع مضخة الضغط. توفر مضخة الضغط ضغطا سلبيا على كوب الشفط. أنبوبالطرد المركزي: يمكن أن يحمل أنبوب الطرد المركزي في منتصف الأنبوب المرن السائل ، لمنع امتصاص هذه السوائل في مضخة الفراغ. (و) مضخة الضغط السلبي: يتم توصيله إلى كوب الشفط بواسطة أنبوب مرن. مضخة الضغط السلبي يمكن أن توفر الضغط السلبي على كوب الشفط لجعل الكبد التشبث العدسة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.
الشكل التكميلي 2: صورة عن قرب للكبد متصلة بعدسة شفافة. العدسة الشفافة في مركز كوب الشفط. المضخة توفر الضغط السلبي على كوب الشفط لجعله تمتص الكبد والكبد هو تعلق على عدسة شفافة. لأن الكبد الشفط الوجه هو قليلا بعيدا عن الماوس، يتم تقليل تأثير التنفس وضربات القلب على القطع الأثرية. يمكن للعدسة الشفافة توفير رؤية مستقرة للمجهر متعدد الفوتون. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مراقبة نسيج حي معين هو وسيلة فعالة لفهم التغيرات والتوطين والآثار البيولوجية للمواد داخل الأنسجة17. في هذه التجربة ، والخطوات الهامة هي تحديد الكبد مع لاعبا اساسيا تصوير الجهاز ، والتي يمكن أن تحل مشكلة القطع الأثرية الحركة بسبب التنفس وضربات القلب ، واستخدام المجهر متعددةفوتون للمراقبة. باستخدام هذه الطريقة ، لوحظت الأنسجة الداخلية للكبد في الجسم الحي من خلال مجهر متعدد الفوتون ، ويتم تسمية الأوعية الدموية بشكل فلوري لمراقبة موقعها بوضوح وبنيتها ثلاثية الأبعاد. يمكن استخدام هذه الطريقة لمراقبة تأثيرات محددة عن طريق وضع علامة فلورية على مادة واتباع المادة في الأنسجة الحية بشكل ديناميكي لتوفير المزيد من المرئيات.
وقد تطور المجهر متعدد الفوتون من كونه تقنية جديدة لتصبح أداة لا غنى عنها لجمع المعلومات من الأحداث الخلوية في بيئة الأنسجة المنظمة. ومع ذلك ، يجب إصلاح الجهاز في مكانه لإنتاج صورة مستقرة بحيث يمكن أن تكون الطريقة فعالة في مراقبة بعض الأنسجة والأعضاء. يمكن أن تمنع القطع الأثرية للحركة من التنفس وضربات القلب الكبد من التصوير المباشر ، لذلك يتم استخدام جهاز الجسم ، والذي يستخدم مبدأ الامتزاز الفراغي لتأمين العضو ومنع اهتزاز الصورة. تشاك فراغ يمكن أيضا إصلاح مجموعة متنوعة من أجهزة الجسم. ومع ذلك، هناك خطر تمزق الأنسجة إذا لم يتم استخدام الضغط السلبي المناسب أو يمتد وقت التصوير إلى ما بعد 2 ساعة.
على الرغم من أن دقة المجهر متعدد الفوتون أقل قليلا من دقة المجهر الكونفوجكال ، إلا أن عمق الاختراق يزداد إلى 9-10 ميكرومتر ، مما يتيح توفير الصور لمراقبة الأنسجة الأعمق والأحداث الخلوية والآثار المادية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81772133، 81902444)، وصندوق غوانغدونغ للعلوم الطبيعية (2020A1515010269، 2020A1515011367)، ومشروع بحوث العلوم والتكنولوجيا الصحية للمواطنين في قوانغتشو (201803010034، 201903010072)، ومشروع الابتكار الطبي العسكري (17CXZ008).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe x 2 | Hunan Pinan Medical Devices Technology | YA0551 | |
| 5 W heating pad | BiolinkOptics Technology | BL336 | |
| 75% absolute ethanol | Guangdong Guanghua Sci-Tech | 1.17113.023 | |
| Absorbent cotton ball | Healthy Sanitation Kingdom | ||
| Mouse surgical instrument | RWD Life Science | SP0001-G | Including scissors and tweezers |
| Multiphoton microscopy | Olympus | FV1200MPE | |
| Organ imaging fixture | BiolinkOptics Technology | BL336 | Including suction cup, hose, negative pressure pump and bracket |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | Sigma | R9379 | |
| Shaving machine | Lei Wa | RE-3201 | |
| Sodium pentobarbital | Sigma | P3761-25G |
References
- Wu, Z., et al. Multi-photon microscopy in cardiovascular research. Methods. 130, 79-89 (2017).
- Zhou, M., Ling, W., Luo, Y. Intrahepatic mass-forming cholangiocarcinoma growing in a giant hepatic hemangioma: A case report. Medicine (Baltimore). 98 (27), 16410 (2019).
- Werkmeister, E., et al. Multiphoton microscopy for blood vessel imaging: new non-invasive tools (Spectral SHG, FLIM). Clinical Hemorheology and Microcirculation. 37 (1-2), 77 (2007).
- Wang, H., et al. Does optical microangiography provide accurate imaging of capillary vessels?: validation using multiphoton microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (10), 1-5 (2014).
- Upputuri, P. K., Sivasubramanian, K., Mark, C. S., Pramanik, M. Recent developments in vascular imaging techniques in tissue engineering and regenerative medicine. Biomed Research International. 2015, 783983 (2015).
- Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. Journal of Microscopy. 243 (3), 221-226 (2011).
- Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys Journal. 75 (4), 2015-2024 (1998).
- Vogt, N. Chromatic multiphoton imaging of the whole brain. Nature Methods. 16 (6), 459 (2019).
- Bacskai, B. J., et al. Imaging of amyloid-β deposits in brains of living mice permits direct observation of clearance of plaques with immunotherapy. Nature Medicine. 7 (3), 369-372 (2001).
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385 (6612), 161-165 (1997).
- Liu, H., et al. In vivo Deep-Brain Structural and Hemodynamic Multiphoton Microscopy Enabled by Quantum Dots. Nano Letters. , (2019).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology. Methods. 128, 20-32 (2017).
- Shear, J. B. Peer Reviewed: Multiphoton-Excited Fluorescence in Bioanalytical Chemistry. Analytical Chemistry. 71 (17), 598-605 (1999).
- Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Yuan, X., et al. Characterization of the first fully human anti-TEM1 scFv in models of solid tumor imaging and immunotoxin-based therapy. Cancer Immunology & Immunotherapy. 66 (3), 367-378 (2017).
- Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Multiphoton microscopy in biological research. Current Opinion in Chemical Biology. 5 (5), 603-608 (2001).
