Summary
בניסוי זה, עכבר מוזרק בווריד הזנב שלו עם רודמין B isothiocyanate-dextran שיכול להכתים כלי דם. לאחר שהכבד נחשף ומתוקן, ניתן לבחור חלק מסוים של הכבד כדי להתבונן ברקמה העמוקה בגוף החי באמצעות מיקרוסקופיה מולטי פוטון.
Abstract
התבוננות בדינמיקה התוך-וסקולרית של רקמת הכבד של העכבר מאפשרת לנו לבצע תצפיות מעמיקות נוספות ומחקרים על מחלות הקשורות לרקמות של כבד העכבר. עכבר מוזרק עם צבע שיכול להכתים כלי דם. כדי להתבונן בכבד העכבר ב vivo, הוא חשוף ומתוקן במסגרת. תמונות דו מימדיות ותלת מימדיות של כלי הדם ברקמת הכבד מתקבלות באמצעות מיקרוסקופ מולטי פוטון. תמונות של הרקמות באתרים שנבחרו נרכשות ברציפות כדי לבחון שינויים ארוכי טווח; השינויים הדינמיים של כלי הדם ברקמות הכבד נצפו גם. מיקרוסקופיה מולטי פוטון היא שיטה להתבוננות בתפקוד התא והתא בחלקי רקמות עמוקים או באיברים. מיקרוסקופיה מולטי פוטון יש רגישות מיקרו מבנה רקמות ומאפשר הדמיה של רקמות ביולוגיות ברזולוציה מרחבית גבוהה vivo, מתן היכולת ללכוד את המידע הביוכימי של הארגון. מיקרוסקופיה מולטי פוטון משמש כדי לבחון חלק מהכבד אבל תיקון הכבד כדי להפוך את התמונה יציבה יותר הוא בעייתי. בניסוי זה, יניקה ואקום מיוחד משמש כדי לתקן את הכבד ולקבל תמונה יציבה יותר של הכבד מתחת למיקרוסקופ. בנוסף, שיטה זו יכולה לשמש כדי לבחון שינויים דינמיים של חומרים ספציפיים בכבד על ידי סימון חומרים כאלה עם צבעים.
Introduction
כלי דם יכולים לספק חומרים מזינים עבור רקמות איברים שונות של גוף האדם, ולהחליף חומרים. במקביל, ציטוקינים רבים, הורמונים, תרופות ותאים מתפקדים גם באמצעות הובלת כלי דם למקומות ספציפיים. התבוננות בשינויים בכלי הדם ברקמת הכבד יכולה לסייע בהבנת התפלגות זרימת הדם ברקמת הכבד והובלת חומרים, ולסייע בניתוח של מחלות מסוימות הקשורות לכלי הדם1,2.
ישנן דרכים רבות להתבונן בכלי הדם של הכבד בעכברים. ביניהם, מיקרוסקופיה אופטית יש מגבלות רבות בהתבוננות רקמת כלי דם אטומים3. מיקרוסקופיה מולטי פוטון יכול לשמש כדי לדמיין את כלי הדם של כבדים חיים עם רזולוציה גבוהה פולשנית4. לא רק תמונות תלת מימדיות של כלי דם ניתן להשיג, אבל הטכניקה יכולה לשמש גם כדי לעזור לארגן את הרקמה כדי לבחון את ההשפעות הביולוגיות בו; יתר על כן, הרקמה כולה ניתן לדמיין ולא רק את microvessels כמו טומוגרפיה ממוחשבת הדמיה תהודה מגנטית5.
מיקרוסקופיה מולטי פוטון ניתן להשתמש כדי לזהות ביעילות אותות פלואורסצנטיים מפוזרים ברקמה חיה עמוקה, עם פוטוטוקסיות פחות6. לכן, ניתן להבטיח את הפעילות של רקמה חיה, ואת כמות הנזק ניתן להפחית. מיקרוסקופיה מולטי פוטון יש כוח חודר טוב יותר מאשר מיקרוסקופיה confocal, המאפשר שכבות עמוקות יותר להיות שנצפו7, מתן הדמיה 3D ייחודי. מיקרוסקופיה מולטי פוטון משמשת כיום לעתים קרובות בהדמיית עצביגולגולת 8 והורחבה לחקר הדינמיקה העצבית בעכבריםחיים 9,10,11.
בניסוי זה, לאחר תיוג פלואורסצנטי של כלי דם של העכבר, הכבד קבוע במסגרת, ואת הדינמיקה של כלי הדם ברקמת הכבד החי ניתן לראות באמצעות מיקרוסקופיה מולטי פוטון. ניסוי זה מדגים כיצד לסמן חומרים ספציפיים, להשתמש במיקרוסקופיה מולטי פוטוטון כדי לעזור להתבונן במיקום בתוך הרקמה, להתבונן באירועים תאיים ברקמה הבין תאית, לבצע מדידות פוטוכימיות12,13,14, ולבחון את הדינמיקה החומרית בתוך הרקמה החיה15. לדוגמה, סמן אנדותל הגידול 1 (TEM1) זוהה כסמן משטח חדשני upregulated על כלי הדם סטרומה בגידולים מוצקים רבים, סימון שבר משתנה שרשרת אחת (scFv) 78 נגד TEM1, ולאחר מכן מיקרוסקופיה multiphoton יכול לשמש עבור מיקום המנגיומה העכבר והערכה של גידולים16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הטיפול והנהלים בבעלי חיים היו בהתאם למדיניות בית החולים סין Nanfang עבור הית ורווחה (יישום לא: NFYY-2019-73).
1. הכנת עכבר
- תהרם את העכבר.
- מכינים נתרן פנטוברביטל (50 מ"ג/ק"ג) במזרק.
- תפוס את העכבר (זכר בן 8 שבועות C57BL/6) עם יד שמאל, כך הבטן שלה פונה כלפי מעלה וראשו נמוך יותר הזנב שלה. לחטא את עור הבטן עם 75% אלכוהול.
- מחזיק את המזרק ביד ימין, לנקב את הקו הלבן בבטן עם המחט מעט בצד ימין של העור על ידי 3-5 מ"מ. ודא כי מחט המזרק ואת העור נמצאים בזווית של 45 °, להזריק את pentobarbital לאט לתוך חלל הבטן. לאחר הגילוח, מחטא סביב אתר החתך של העכבר 3 פעמים לסירוגין עם 75% אלכוהול ופתרון Chlorhexidine.
- בדוק אם ההרדמה הצליחה על ידי היעדר רפלקס תיקון.
- הזרק רודמין B isothiocyanate-דקסטרן לתוך הווריד caudal.
- הכן 100 μL של 10 מ"ג / מ"ל רודמין B isothiocyanate-dextran במזרק.
- נגב את זנב העכבר עם 75% אלכוהול.
- להחזיק את הזנב עם היד השמאלית, להחזיק את המזרק ביד ימין עם המחט במקביל לווריד, ולהזריק את צבע 100 μL.
- לעצור את הדימום עם ספוגית כותנה לאחר הזריקה.
- משרים את פרוות הבטן של העכבר עם גזה רטובה במים סטריליים, ומגלחים את הבטן של העכבר באמצעות סכין גילוח, מה שהופך משיכות לכיוון הפרווה. לאחר הגילוח, מחטא סביב אתר החתך של העכבר 3 פעמים לסירוגין עם 75% אלכוהול ופתרון Chlorhexidine.
- לאחר ניגוב כרית חימום עם 75% אלכוהול, לפתוח את כרית החימום, ומניחים את העכבר על גבו כרית החימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף שלה ב 37 °C (69 °F).
2. תיקון כבד העכבר עם מסגרת הדמיית איבר הגוף
הערה: מסגרת הדמיית האיברים המסחרית עדיין לא שוחררה.
- מניחים יניקה נקייה בתנוחה קבועה.
- התקינו מתקן הדמיית איברים(איור 1 משלים)ונגבו את כרית החימום ואת היניקה ב-75% אלכוהול.
- חבר את היניקה (בקוטר 5 ממ) לצינור משאבת הוואקום והפעל את משאבת הוואקום.
- על שולחן סטרילי מעוקר עם 75% אלכוהול, מחטא סביב אתר החתך של העכבר 3 פעמים לסירוגין עם 75% אלכוהול ופתרון Chlorhexidine, ולאחר מכן מחטא סביב אתר החתך של העכבר 3 פעמים לסירוגין עם 75% אלכוהול פתרון Chlorhexidine, ולאחר מכן להשתמש במספריים כירורגיים לחתוך 2 ס"מ של העור את הגבול התחתון של העכבר ולחשוף את
- מניחים את העכבר יחד עם כרית החימום על בסיס המחזיק.
- התאימו את מתקן הדמיית האיברים כך שגביע היניקה יחזיק את הכבד. לאחר מכן השתמשו בלחץ שלילי של 30-35 קילוואט-אפ ליניקה, כך שהכבד נצמד לגביע היניקה(איור משלים 2).
3. התאמת מיקרוסקופ סריקת לייזר מולטי פוטון
- הפעל את המיקרוסקופ מרובה פוטון ובחר את המטרה 60x/1.00 W.
- תקן את המסגרת והעכבר מתחת לעדשה האובייקטיבית.
- מוסיפים טיפה של מלוחים רגילים שיכולים לכסות את כל העדשה, שהיא מרכז היניקה, ולהתאים את העדשה האובייקטיבית רק כדי לגעת במלח הרגיל.
- לחץ פעמיים על סמל המחשב כדי להפעיל את תוכנת הלייזר ולהדליק את המתג. לאחר מכן לחץ לחיצה ארוכה על לחצן ההפעלה והתריס למשך 3 שניות.
- הגדר את אורך הגל ל-800 ננומטר.
- הפעל את תוכנת ההפעלה של המיקרוסקופ באמצעות המחשב.
- עבור הגדרת הרכישה, הגדר לייזר 800.
4. תצפית באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר מולטי פוטון
- עבור בקרת רכישת תמונה, לחץ על הבורר פלואורסצנטי.
- ודא שאורות החדר והציוד כבויים. כדי להפחית את רמות הרעש, השתמש במיקרוסקופ בסביבה חשוכה.
- פתח את תריס נתיב האור במיקרוסקופ.
- סובב את מסנן הפלואורסצנטי להילוך הרביעי ומשוך את שני המנופים של המתג האופטי.
- במבט דרך העינית, להשתמש quasispirals התמקדות גסה ועדינה כדי להתאים את אורך המוקד, ולהשתמש צירי X/Y כדי להתאים את שדה הראייה כדי למצוא את אזור היעד.
5. מיקרוגרפיה של סריקת לייזר מולטיפוטון
- כבה את מתג הפלורסנט בתוכנה, העבר את מסנן הפלורסנט להילוך השני (ההילוך השני הוא RXD1) ולחץ על שני המנופים של המתג האופטי.
- לחץ על פוקוס ×2 כדי להציג בתצוגה מקדימה את אזור היעד ולהתאים את הגדרת הרכישה ואת הפרמטרים של בקרת רכישת התמונה (רזולוציית תמונה: 1024).
- לחץ על Control + C והתאם את המתח הגבוה, הרווח וההיסט (כדי להפחית את רמות הרעש).
- לחצו על 'עצור' כדי לעצור את התצוגה המקדימה, לחצו על הלחצן XY לסריקה בשני ממדים ושמרו לאחר השלמתו (איור 1).
- בחר אזור, לחץ על עומקולאחר מכן תצוגה מקדימה כדי לבחור את ערכת הסיום ולהתחיל להגדיר (ראה את החלק הנדרש המלא של כלי הדם) בהגדרה מיקרוסקופ. סרוק תמונות תלת-ממד ושמור לאחר השלמתן (איור 2).
- בחר אזור, לחץ על זמן, והתאם הגדרת רכישה אחרת ופרמטרים של בקרת רכישת תמונה (גודל שלב: 1 מיקרומטר; פרוסות: 10; מספר סריקת זמן: 40). לסרוק פרוסות שונות ולשמור לאחר השלמת כדי להשיג תמונות נעות (וידאו 1).
הערה: יש מישהו לטפל בעכברים במהלך הסריקה ולהוסיף הרדמה בהתאם. - להקריב את העכבר על ידי ניתוח בצוואר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
את התפלגות כלי הדם בכבד ניתן לראות באיור 1, המתקבל באמצעות מיקרוסקופיה מולטי פוטון. כלי הדם מחולק לריבוי ענפים הנובעים מתא מטען ומופצים לחלל שמסביב. ההיקף החיצוני של כלי הדם הוא אדום, החלל הפנימי חשוך, ויש הרבה דברים בפנים. ככל שהתמונה ברורה יותר, כך היא קרובה יותר למישור התצפית. יש גם כמה כתמים אדומים מסביב, כנראה בגלל הצבע חודר את הרקמה שמסביב כדי להכתים חומרים אחרים. בסרטון 1, ישנם דברים לא אדומים שיכולים להיות תאים נעים בכלי הדם האדומים. בסוף הסרטון, חלק מהדברים האלה חשוכים. זה כנראה בגלל הכבד הקבוע לא תוקן היטב לאורך זמן. שיטה זו תאפשר הדמיה למשך שעתיים.
איור 1: כלי הדם ברקמת הכבד תחת מיקרוסקופיה מולטי פוטון. כלי הדם אדומים. תמונה דו מימדית של כלי הדם ברזולוציה של 2048 ו HV של 512, יכול בבירור לדמיין את כלי הדם האדומים לאחר הכתמת. יש גם כמה כתמים אדומים מסביב, ואת הצבע עשוי גם לחדור את הרקמה שמסביב לצבוע חומרים אחרים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תמונה תלת מימדית של רקמת כבד חיה באותה תנוחה. עובי הוא 9 מיקרומטר, המורפולוגיה של כלי הדם נצפית מזוויות שונות, ותמונות דינמיות נאספות. לאחר הסינתזה, התאים בכלי הדם (כהים) נראים זורמים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 1: מסגרת הדמיית איברי גוף. (א)כרית חימום: זה שומר על טמפרטורת הגוף של העכבר. (ב) סוגר: זה יכול לספק בסיס למקם את העכבר ואת מיקום יניקה מתכווננת עם ידיות. (ג)יניקה: הוא קבוע על ידי הסוגר. הלחץ השלילי שמספקת משאבת הלחץ השלילית גורם לכבד להסתחפג לעדשה השקופה במרכז היניקה. (ד)צינור גמיש: זה מחבר את היניקה עם משאבת הלחץ. משאבת הלחץ מספקת לחץ שלילי לגביע היניקה. (ה)צינור צנטריפוגה: צינור צנטריפוגה באמצע הצינור הגמיש יכול להחזיק את הנוזל, כדי למנוע נוזלים אלה נשאבים לתוך משאבת ואקום. (ו)משאבת לחץ שלילית: היא מחוברת לגביע היניקה על ידי הצינור הגמיש. משאבת הלחץ השלילי יכולה לספק לחץ שלילי לגביע היניקה כדי לגרום לכבד להיאחז בעדשה. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.
איור משלים 2: תמונת תקריב של הכבד המחובר לעדשה שקופה. העדשה השקופה נמצאת במרכז היניקה. המשאבה מספקת לחץ שלילי לגביע היניקה כדי לגרום לו למצוץ את הכבד והכבד מחובר לעדשה השקופה. מכיוון שהכבד בעל פני היניקה קצת רחוק מהעכבר, השפעת הנשימה ופעימות הלב על החפצים מצטמצמות. העדשה השקופה יכולה לספק תצוגה יציבה למיקרוסקופ מולטי פוטון. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
התבוננות ברקמה חיה ספציפית היא אמצעי יעיל להבנת השינויים, לוקליזציה, ואת ההשפעות הביולוגיות של החומר בתוך הרקמה17. בניסוי זה, הצעדים החשובים הם תיקון הכבד עם גוף הדמיית איברים, אשר יכול לפתור את הבעיה של חפצי תנועה עקב נשימה ופעימות לב, ושימוש במיקרוסקופ מולטי פוטון לתצפית. בשיטה זו, הרקמות הפנימיות של הכבד in vivo נצפו באמצעות מיקרוסקופ מולטי פוטון, וכלי הדם מסומנים בפלורסנט כדי לבחון בבירור את מיקומם ואת המבנה התלת מימדי. שיטה זו יכולה לשמש כדי לבחון אפקטים ספציפיים על ידי תיוג פלואורסצנטי חומר באופן דינמי בעקבות החומר ברקמה החיה כדי לספק הדמיות נוספות.
מיקרוסקופיה מולטי פוטון התפתחה מלהיות טכניקה חדשנית להיות כלי הכרחי לאיסוף מידע מאירועים סלולריים בסביבת רקמות מאורגנת. עם זאת, האיבר חייב להיות קבוע במקום כדי לייצר תמונה יציבה, כך השיטה יכולה להיות יעילה בהתבוננות רקמות ואיברים מסוימים. ממצאי תנועה מנשימה ואת פעימות הלב יכול למנוע את הכבד מלהיות תמונה ישירה, ולכן אביזר איבר הגוף משמש, אשר משתמש בעיקרון של ספיחה ואקום כדי לאבטח את האיבר ולמנוע טלטול תמונה. צ'אק ואקום יכול גם לתקן מגוון של איברי גוף. עם זאת, קיים סיכון לקרע ברקמות אם לא נעשה שימוש בלחץ השלילי המתאים או שזמן ההדמיה משתרע מעבר ל -2 שעות.
למרות הרזולוציה של מיקרוסקופיה multiphoton הוא קצת פחות מזה של מיקרוסקופיה confocal, עומק החדירה הוא גדל ל 9-10 מיקרומטר, המאפשר מתן תמונות עבור תצפית רקמות עמוקה יותר, אירועים הסלולר, ואפקטים חומריים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81772133, 81902444), הקרן למדעי הטבע גואנגדונג (2020A1515010269, 2020A1515011367), פרויקט מדעי הבריאות והטכנולוגיה של אזרח גואנגג'ואו (201803010034, 201903010072) ופרויקט החדשנות הרפואית הצבאית (17CXZ008).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe x 2 | Hunan Pinan Medical Devices Technology | YA0551 | |
| 5 W heating pad | BiolinkOptics Technology | BL336 | |
| 75% absolute ethanol | Guangdong Guanghua Sci-Tech | 1.17113.023 | |
| Absorbent cotton ball | Healthy Sanitation Kingdom | ||
| Mouse surgical instrument | RWD Life Science | SP0001-G | Including scissors and tweezers |
| Multiphoton microscopy | Olympus | FV1200MPE | |
| Organ imaging fixture | BiolinkOptics Technology | BL336 | Including suction cup, hose, negative pressure pump and bracket |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | Sigma | R9379 | |
| Shaving machine | Lei Wa | RE-3201 | |
| Sodium pentobarbital | Sigma | P3761-25G |
References
- Wu, Z., et al. Multi-photon microscopy in cardiovascular research. Methods. 130, 79-89 (2017).
- Zhou, M., Ling, W., Luo, Y. Intrahepatic mass-forming cholangiocarcinoma growing in a giant hepatic hemangioma: A case report. Medicine (Baltimore). 98 (27), 16410 (2019).
- Werkmeister, E., et al. Multiphoton microscopy for blood vessel imaging: new non-invasive tools (Spectral SHG, FLIM). Clinical Hemorheology and Microcirculation. 37 (1-2), 77 (2007).
- Wang, H., et al. Does optical microangiography provide accurate imaging of capillary vessels?: validation using multiphoton microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (10), 1-5 (2014).
- Upputuri, P. K., Sivasubramanian, K., Mark, C. S., Pramanik, M. Recent developments in vascular imaging techniques in tissue engineering and regenerative medicine. Biomed Research International. 2015, 783983 (2015).
- Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. Journal of Microscopy. 243 (3), 221-226 (2011).
- Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys Journal. 75 (4), 2015-2024 (1998).
- Vogt, N. Chromatic multiphoton imaging of the whole brain. Nature Methods. 16 (6), 459 (2019).
- Bacskai, B. J., et al. Imaging of amyloid-β deposits in brains of living mice permits direct observation of clearance of plaques with immunotherapy. Nature Medicine. 7 (3), 369-372 (2001).
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385 (6612), 161-165 (1997).
- Liu, H., et al. In vivo Deep-Brain Structural and Hemodynamic Multiphoton Microscopy Enabled by Quantum Dots. Nano Letters. , (2019).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology. Methods. 128, 20-32 (2017).
- Shear, J. B. Peer Reviewed: Multiphoton-Excited Fluorescence in Bioanalytical Chemistry. Analytical Chemistry. 71 (17), 598-605 (1999).
- Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Yuan, X., et al. Characterization of the first fully human anti-TEM1 scFv in models of solid tumor imaging and immunotoxin-based therapy. Cancer Immunology & Immunotherapy. 66 (3), 367-378 (2017).
- Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Multiphoton microscopy in biological research. Current Opinion in Chemical Biology. 5 (5), 603-608 (2001).
