Summary
I dette eksperimentet injiseres en mus i halevenen med Rhodamine B isothiocyanate-dextran som kan flekke blodkar. Etter at leveren er utsatt og fast, kan en bestemt del av leveren velges for å observere det dype vevet i den levende kroppen ved hjelp av multifotonmikroskopi.
Abstract
Ved å observere den intravaskulære dynamikken i muselevervev, kan vi gjennomføre ytterligere grundige observasjoner og studier på vevsrelaterte sykdommer i muselever. En mus injiseres med et fargestoff som kan flekke blodårene. For å observere muslever in vivo, blir den utsatt og festet i en ramme. To og tredimensjonale bilder av blodkarene i levervevet oppnås ved hjelp av et multifotonmikroskop. Bilder av vevet på de valgte stedene er kontinuerlig anskaffet for å observere langsiktige endringer; De dynamiske endringene av blodkar i levervevet observeres også. Multifotonmikroskopi er en metode for å observere celle- og cellefunksjon i dype vevsseksjoner eller organer. Multifotonmikroskopi har følsomhet for vevmikrostruktur og muliggjør avbildning av biologisk vev ved høy romlig oppløsning in vivo, noe som gir evnen til å fange den biokjemiske informasjonen til organisasjonen. Multifotonmikroskopi brukes til å observere en del av leveren, men å fikse leveren for å gjøre bildet mer stabilt er problematisk. I dette eksperimentet brukes en spesiell vakuum sugekopp til å fikse leveren og få et mer stabilt bilde av leveren under mikroskopet. I tillegg kan denne metoden brukes til å observere dynamiske endringer av spesifikke stoffer i leveren ved å markere slike stoffer med fargestoffer.
Introduction
Blodårer kan gi næringsstoffer til ulike organvev i menneskekroppen, og utveksle stoffer. Samtidig fungerer mange cytokiner, hormoner, narkotika og celler også gjennom vaskulær transport til bestemte steder. Å observere vaskulære endringer i levervev kan bidra til å forstå fordelingen av blodstrøm i levervev og transport av stoffer, og bistå i analysen av visse vaskulære relaterte sykdommer1,2.
Det er mange måter å observere blodkarene i leveren hos mus. Blant dem har optisk mikroskopi mange begrensninger i å observere ugjennomsiktig vaskulært vev3. Multifotonmikroskopi kan brukes til å avbilde blodkarene i levende lever med ikke-invasiv høy oppløsning4. Ikke bare kan tredimensjonale bilder av blodkar oppnås, men teknikken kan også brukes til å organisere vevet for å observere biologiske effekter der; Videre kan hele vevet avbildes i stedet for bare mikrovesselene som i beregnet tomografi og magnetisk resonansavbildning5.
Multifotonmikroskopi kan brukes til effektivt å oppdage spredte fluorescerende signaler i dypt levende vev, med mindre fototoksisitet6. Derfor kan aktiviteten til levende vev sikres, og mengden skade kan reduseres. Multifotonmikroskopi har bedre gjennomtrengende kraft enn konfektmikroskopi, slik at dypere lag kan observeres7, noe som gir unik 3D-avbildning. Multifotonmikroskopi brukes nå ofte i avbildning av kranialnerver8 og har blitt utvidet til studiet av nevrondynamikk hos levende mus9,10,11.
I dette eksperimentet, etter fluorescerende merking av museblodkar, er leveren festet i en ramme, og dynamikken i blodkar i levende levervev kan ses ved hjelp av multifotonmikroskopi. Dette eksperimentet demonstrerer hvordan man markerer spesifikke stoffer, bruker multifotonmikroskopi for å observere et sted i vevet, observere cellulære hendelser i intercellulært vev, gjøre fotokjemiskemålinger 12,13,14, og observere materialdynamikken inne i det levende vevet15. For eksempel har tumor endotelmarkør 1 (TEM1) blitt identifisert som en ny overflatemarkør upregulert på blodkarene og stroma i mange faste svulster, markerer enkeltkjedet variabelt fragment (scFv) 78 mot TEM1, og deretter kan multifotonmikroskopi brukes til mus hemangioma plassering og evaluering avsvulster 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All dyrepleie og prosedyrer var i samsvar med Kinas Nanfang Sykehus retningslinjer for helse og velvære (søknad Nr: NFYY-2019-73).
1. Forberedelse av mus
- Bedøv musen.
- Forbered natrium pentobarbital (50 mg/kg) i en sprøyte.
- Ta tak i musen (8 uker gammel mannlig C57BL / 6) med venstre hånd slik at magen vender opp og hodet er lavere enn halen. Desinfiser bukhuden med 75% alkohol.
- Hold sprøyten i høyre hånd, pierce magen hvit linje med nålen litt til høyre side av huden med 3-5 mm. Pass på at sprøytenålen og huden er i en 45° vinkel, injiser pentobarbital sakte inn i bukhulen. Etter barbering desinfiserer rundt musens snittsted 3 ganger vekselvis med 75% alkohol og klorhexidinoppløsning.
- Sjekk om anestesi var vellykket av mangelen på en rett refleks.
- Injiser Rhodamine B isothiocyanate-dextran i kaudal vene.
- Forbered 100 μL 10 mg/ml Rhodamin B isothiocyanat-dextran i en sprøyte.
- Tørk av musens hale med 75% alkohol.
- Hold halen med venstre hånd, hold sprøyten i høyre hånd med nålen parallelt med venen, og injiser 100 μL fargestoffet.
- Stopp blødningen med en bomullspinne etter injeksjonen.
- Bløtlegg musens bukpels med gasbind fuktet med sterilt vann, og barber musens underliv ved hjelp av en barberhøvel, og gjør slag i retning av pelsen. Etter barbering desinfiserer rundt musens snittsted 3 ganger vekselvis med 75% alkohol og klorhexidinoppløsning.
- Etter å ha tørket en varmepute med 75% alkohol, åpne varmeputen, og legg musen på ryggen i varmeputen for å opprettholde kroppstemperaturen ved 37 °C.
2. Festing av muselever med kroppsorganets bilderamme
MERK: Den kommersielle organavbildningsrammen er ikke utgitt ennå.
- Sett en ren sugekopp i fast stilling.
- Installer en organavbildningsarmatur (Tilleggsfigur 1) og tørk av varmeputen og sugekoppen med 75 % alkohol.
- Koble sugekoppen (5 mm diameter) til vakuumpumpeslangen og slå på vakuumpumpen.
- På et sterilt bord sterilisert med 75% alkohol, desinfiserer rundt musens snittsted 3 ganger vekselvis med 75% alkohol og klorhexidinoppløsning, desinfiserer deretter rundt musens snittsted 3 ganger vekselvis med 75% alkohol og klorhexidinoppløsning, og bruk deretter kirurgisk saks for å kutte 2 cm hud av den nedre sternal grensen av musen og utsette leveren.
- Plasser musen sammen med varmeputen på holderbasen.
- Juster organavbildningsarmaturen slik at sugekoppen holder leveren. Bruk deretter et negativt trykk på 30-35 kPa for sug slik at leveren festes til sugekoppen (Supplerende figur 2).
3. Justere multifoton laserskanning mikroskop
- Slå på multifotonmikroskopet, og velg målsettingen 60x/1.00 W.
- Fest rammen og musen under objektivlinsen.
- Legg til en dråpe vanlig saltvann som kan dekke hele linsen, som er midten av sugekoppen, og juster objektivlinsen for å bare berøre den vanlige saltvannslinjen.
- Dobbeltklikk på datamaskinikonet for å slå på laserprogramvaren og slå på bryteren. Trykk deretter på og hold inne av/på-knappen og lukkeren i 3 s.
- Sett bølgelengden til 800 nm.
- Start mikroskopets driftsprogramvare ved hjelp av datamaskinen.
- Angi Laser 800for anskaffelsesinnstillingen.
4. Observasjon ved hjelp av multifoton laserskanning mikroskop
- Klikk fluorescerende bryter for Bildeanskaffelseskontroll.
- Kontroller at rom- og utstyrslysene er slått av. For å redusere støynivået, bruk mikroskopet i et mørkt miljø.
- Åpne lysbanelukkeren på mikroskopet.
- Roter fluorescensfilteret til det fjerde giret og trekk de to spakene på den optiske bryteren.
- Når du ser gjennom okularet, bruk de grove og fine fokuserende kvasispiralene til å justere brennvidden, og bruk X/Y-aksene til å justere synsfeltet for å finne målområdet.
5. Multifoton laser skanning mikrografi
- Slå av fluorescerende bryter på programvaren, bytt fluorescerende filter til det andre giret (andre gir er RXD1), og skyv de to spakene på den optiske bryteren.
- Klikk på Fokus ×2 for å forhåndsvise målområdet og justere anskaffelsesinnstillingen og bildeanskaffelseskontrollparameterne (bildeoppløsning: 1024).
- Trykk på Kontroll + C og juster høyspenningen, forsterkningen og forskyvningen (for å redusere støynivået).
- Klikk Stopp for å stoppe forhåndsvisningen, klikk XY-knappen for å skanne i to dimensjoner, og lagre etter fullføring (Figur 1).
- Velg en region, klikk Dybde, og forhåndsvis deretter for å velge sluttsett og startsett (se hele den nødvendige delen av blodkaret) i mikroskopinnstillingen. Skann 3D-bilder og lagre etter fullføring (Figur 2).
- Velg et område, klikk På tid, og juster andre parametere for anskaffelses- og bildeanskaffelseskontroll (Trinnstørrelse: 1 μm; Stykker: 10; Tidsskanning nummer: 40). Skann forskjellige stykker og lagre etter ferdigstillelse for å få bevegelige bilder (Video 1).
MERK: Få noen til å ta vare på musene under skanningen og legge til anestesi tilsvarende. - Ofre musen med nakke disseksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fordelingen av blodkar i leveren kan ses i figur 1, oppnådd ved hjelp av multifotonmikroskopi. Blodkaret er delt inn i et flertall av grener som kommer fra en koffert og fordelt til det omkringliggende rommet. Blodkarets ytre omkrets er rød, det indre hulrommet er mørkt, og det er mange ting inne. Jo klarere bildet er, jo nærmere observasjonsplanet er det. Det er også noen røde flekker rundt, sannsynligvis fordi fargestoffet trenger inn i det omkringliggende vevet for å flekke andre stoffer. I Video 1er det ikke-røde ting som kan være celler som beveger seg i de røde blodårene. På slutten av videoen er noen av disse tingene mørkere. Dette skyldes sannsynligvis at den faste leveren ikke har blitt løst godt over tid. Denne metoden tillater avbildning i 2 timer.
Figur 1: Blodårene i levervevet under multifotonmikroskopi. Blodårene er røde. Et todimensjonalt bilde av blodkaret med en oppløsning på 2048 og en HV på 512, kan tydelig avbilde de røde blodkarene etter farging. Det er også noen røde flekker rundt, og fargestoffet kan også trenge inn i det omkringliggende vevet for å farge andre stoffer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Tredimensjonalt bilde av levende levervev i samme posisjon. Tykkelsen er 9 μm, morfologien til blodkarene observeres fra forskjellige vinkler, og dynamiske bilder samles inn. Etter syntese ses cellene i blodkarene (mørke) som strømmer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Bilderamme for kroppsorganer. (a) Varmepute: Den opprettholder musens kroppstemperatur. (b) Brakett: Den kan gi en base for å plassere musen og den justerbare sugekoppposisjonen med knotter. (c) Sugekopp: Den festes av braketten. Det negative trykket fra den negative trykkpumpen får leveren til å adsorbere til den gjennomsiktige linsen i midten av sugekoppen. (d) Fleksibelt rør: Den kobler sugekoppen til trykkpumpen. Trykkpumpen gir negativt trykk til sugekoppen. (e) Sentrifugerør: Sentrifugerøret midt i det fleksible røret kan holde væsken, for å forhindre at disse væskene suges inn i vakuumpumpen. (f) Trykkpumpe: Den kobles til sugekoppen med det fleksible røret. Den negative trykkpumpen kan gi negativt trykk til sugekoppen for å få leveren til å klamre seg til linsen. Klikk her for å laste ned denne figuren.
Supplerende figur 2: Et nærbilde av leveren festet til gjennomsiktig linse. Den gjennomsiktige linsen er i midten av sugekoppen. Pumpen gir negativt trykk til sugekoppen for å få den til å suge leveren og leveren er festet til den gjennomsiktige linsen. Fordi suge-faced leveren er litt borte fra musen, effekten av å puste og hjerterytmen på gjenstander er redusert. Den gjennomsiktige linsen kan gi en stabil visning for multifotonmikroskopet. Klikk her for å laste ned denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Å observere et bestemt levende vev er et effektivt middel for å forstå endringene, lokaliseringen og biologiske effektene av materialet inne i vevet17. I dette eksperimentet er de viktige trinnene å fikse leveren med en organavbildningsarmatur, som kan løse problemet med bevegelsesartefakter på grunn av pust og hjerteslag, og bruk av et multifotonmikroskop for observasjon. Ved hjelp av denne metoden observeres leverens indre vev in vivo gjennom et multifotonmikroskop, og blodkarene er fluorescerende merket for å tydelig observere deres posisjon og tredimensjonale struktur. Denne metoden kan brukes til å observere spesifikke effekter ved å fluorescerende merke et stoff og dynamisk følge stoffet i det levende vevet for å gi ytterligere visualiseringer.
Multifotonmikroskopi har utviklet seg fra å være en ny teknikk til å bli et uunnværlig verktøy for å samle informasjon fra cellulære hendelser i et organisert vevsmiljø. Imidlertid må orgelet festes på plass for å produsere et stabilt bilde slik at metoden kan være effektiv i å observere visse vev og organer. Bevegelsesartefakter fra å puste og hjerterytmen kan forhindre at leveren blir direkte avbildet, så en kroppsorganarmatur brukes, som bruker prinsippet om vakuum adsorpsjon for å sikre orgelet og forhindre bildeshake. Vakuumchucken kan også fikse en rekke kroppsorganer. Det er imidlertid fare for vevsbrudd hvis riktig negativt trykk ikke brukes eller bildetiden strekker seg utover 2 timer.
Selv om oppløsningen av multifotonmikroskopi er litt mindre enn for konfektmikroskopi, økes penetrasjonsdybden til 9-10 μm, noe som muliggjør levering av bilder for dypere vevsobservasjon, cellulære hendelser og materialeffekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (81772133, 81902444), Guangdong Natural Science Fund (2020A1515010269, 2020A1515011367), Guangzhou Citizen Health Science and Technology Research Project (201803010034, 201903010072) og Military Medical Innovation Project (17CXZ008).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe x 2 | Hunan Pinan Medical Devices Technology | YA0551 | |
| 5 W heating pad | BiolinkOptics Technology | BL336 | |
| 75% absolute ethanol | Guangdong Guanghua Sci-Tech | 1.17113.023 | |
| Absorbent cotton ball | Healthy Sanitation Kingdom | ||
| Mouse surgical instrument | RWD Life Science | SP0001-G | Including scissors and tweezers |
| Multiphoton microscopy | Olympus | FV1200MPE | |
| Organ imaging fixture | BiolinkOptics Technology | BL336 | Including suction cup, hose, negative pressure pump and bracket |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | Sigma | R9379 | |
| Shaving machine | Lei Wa | RE-3201 | |
| Sodium pentobarbital | Sigma | P3761-25G |
References
- Wu, Z., et al. Multi-photon microscopy in cardiovascular research. Methods. 130, 79-89 (2017).
- Zhou, M., Ling, W., Luo, Y. Intrahepatic mass-forming cholangiocarcinoma growing in a giant hepatic hemangioma: A case report. Medicine (Baltimore). 98 (27), 16410 (2019).
- Werkmeister, E., et al. Multiphoton microscopy for blood vessel imaging: new non-invasive tools (Spectral SHG, FLIM). Clinical Hemorheology and Microcirculation. 37 (1-2), 77 (2007).
- Wang, H., et al. Does optical microangiography provide accurate imaging of capillary vessels?: validation using multiphoton microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (10), 1-5 (2014).
- Upputuri, P. K., Sivasubramanian, K., Mark, C. S., Pramanik, M. Recent developments in vascular imaging techniques in tissue engineering and regenerative medicine. Biomed Research International. 2015, 783983 (2015).
- Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. Journal of Microscopy. 243 (3), 221-226 (2011).
- Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys Journal. 75 (4), 2015-2024 (1998).
- Vogt, N. Chromatic multiphoton imaging of the whole brain. Nature Methods. 16 (6), 459 (2019).
- Bacskai, B. J., et al. Imaging of amyloid-β deposits in brains of living mice permits direct observation of clearance of plaques with immunotherapy. Nature Medicine. 7 (3), 369-372 (2001).
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385 (6612), 161-165 (1997).
- Liu, H., et al. In vivo Deep-Brain Structural and Hemodynamic Multiphoton Microscopy Enabled by Quantum Dots. Nano Letters. , (2019).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology. Methods. 128, 20-32 (2017).
- Shear, J. B. Peer Reviewed: Multiphoton-Excited Fluorescence in Bioanalytical Chemistry. Analytical Chemistry. 71 (17), 598-605 (1999).
- Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Yuan, X., et al. Characterization of the first fully human anti-TEM1 scFv in models of solid tumor imaging and immunotoxin-based therapy. Cancer Immunology & Immunotherapy. 66 (3), 367-378 (2017).
- Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Multiphoton microscopy in biological research. Current Opinion in Chemical Biology. 5 (5), 603-608 (2001).
