Summary
In diesem Experiment wird eine Maus in ihre Schwanzvene mit Rhodamine B Isothiocyanat-Dextran injiziert, die Blutgefäße färben können. Nachdem die Leber exponiert und fixiert wurde, kann ein bestimmter Teil der Leber ausgewählt werden, um das tiefe Gewebe im lebenden Körper mittels Multiphotonenmikroskopie zu beobachten.
Abstract
Die Beobachtung der intravaskulären Dynamik des Lebergewebes der Maus ermöglicht es uns, weitere eingehende Beobachtungen und Studien über gewebebedingte Erkrankungen der Mausleber durchzuführen. Eine Maus wird mit einem Farbstoff injiziert, der Blutgefäße färben kann. Um die Mausleber in vivo zu beobachten, wird sie freigelegt und in einem Rahmen fixiert. Mit einem Multiphotonenmikroskop werden zwei- und dreidimensionale Bilder der Blutgefäße im Lebergewebe gewonnen. Bilder der Gewebe an den ausgewählten Standorten werden kontinuierlich erfasst, um langfristige Veränderungen zu beobachten; die dynamischen Veränderungen der Blutgefäße in den Lebergeweben werden ebenfalls beobachtet. Die Multiphotonenmikroskopie ist eine Methode zur Beobachtung der Zell- und Zellfunktion in tiefen Gewebeabschnitten oder Organen. Die Multiphotonenmikroskopie hat eine Empfindlichkeit gegenüber Gewebemikrostrukturen und ermöglicht die Abbildung von biologischen Geweben mit hoher räumlicher Auflösung in vivo, wodurch die biochemischen Informationen der Organisation erfasst werden können. Multiphotonenmikroskopie wird verwendet, um einen Teil der Leber zu beobachten, aber die Leber zu fixieren, um das Bild stabiler zu machen, ist problematisch. In diesem Experiment wird ein spezieller Vakuumsauger verwendet, um die Leber zu fixieren und ein stabileres Bild der Leber unter dem Mikroskop zu erhalten. Darüber hinaus kann diese Methode verwendet werden, um dynamische Veränderungen bestimmter Substanzen in der Leber zu beobachten, indem solche Stoffe mit Farbstoffen markiert werden.
Introduction
Blutgefäße können Nährstoffe für verschiedene Organgewebe des menschlichen Körpers liefern, und Austausch Substanzen. Gleichzeitig funktionieren viele Zytokine, Hormone, Medikamente und Zellen auch durch Gefäßtransport zu bestimmten Orten. Die Beobachtung von Gefäßveränderungen im Lebergewebe kann helfen, die Verteilung des Blutflusses im Lebergewebe und den Transport von Substanzen zu verstehen, und bei der Analyse bestimmter vaskulärer Erkrankungen helfen1,2.
Es gibt viele Möglichkeiten, die Blutgefäße der Leber bei Mäusen zu beobachten. Unter ihnen hat die optische Mikroskopie viele Einschränkungen bei der Beobachtung von undurchsichtigem Gefäßgewebe3. Multiphotonenmikroskopie kann verwendet werden, um die Blutgefäße von lebenden Lebern mit nichtinvasiver hoher Auflösung4abzubilden. Es können nicht nur dreidimensionale Bilder von Blutgefäßen gewonnen werden, sondern die Technik kann auch verwendet werden, um das Gewebe zu organisieren, um biologische Effekte darin zu beobachten; darüber hinaus kann das gesamte Gewebe abgebildet werden und nicht nur die Mikrogefäße wie in der Computertomographie und Magnetresonanztomographie5.
Multiphotonenmikroskopie kann verwendet werden, um verstreute fluoreszierende Signale in tiefem lebendem Gewebe effektiv zu erkennen, mit weniger Phototoxizität6. Daher kann die Aktivität des lebenden Gewebes sichergestellt werden, und die Höhe der Schäden kann reduziert werden. Die Multiphotonenmikroskopie hat eine bessere Durchdringende Leistung als die konfokale Mikroskopie, so dass tiefere Schichten beobachtet werden können7, die einzigartige 3D-Bildgebung bietet. Multiphotonenmikroskopie wird heute oft in bildgebenden Hirnnerven8 verwendet und wurde auf die Untersuchung der neuronalen Dynamik bei lebenden Mäusen9,10,11erweitert.
In diesem Experiment wird die Leber nach der fluoreszierenden Kennzeichnung von Mausblutgefäßen in einem Rahmen fixiert, und die Dynamik der Blutgefäße im lebenden Lebergewebe kann mit der Multiphotonenmikroskopie beobachtet werden. Dieses Experiment zeigt, wie man bestimmte Substanzen markiert, Multiphotonenmikroskopie verwendet, um einen Ort im Gewebe zu beobachten, zelluläre Ereignisse im interzellulären Gewebe zu beobachten, photochemische Messungen12,13,14zu machen und die Materialdynamik im lebenden Gewebe zu beobachten15. Zum Beispiel wurde der Tumorendothelmarker 1 (TEM1) als neuartiger Oberflächenmarker identifiziert, der auf den Blutgefäßen und Stroma in vielen soliden Tumoren hochreguliert ist und einkettiges variables Fragment (scFv) 78 gegen TEM1 markiert und dann die Multiphotonenmikroskopie für die Position des Maushämangioms und die Bewertung von Tumoren16verwendet werden kann.
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Protocol
Alle Tierpflege und -verfahren entsprachen der Politik des China Nanfang Hospital für Heide und Wohlbefinden (Antrag Nr.: NFYY-2019-73).
1. Mausvorbereitung
- Anästhesisieren Sie die Maus.
- Natriumpentobarbital (50 mg/kg) in einer Spritze vorbereiten.
- Schnappen Sie sich die Maus (8 Wochen altes Männchen C57BL/6) mit der linken Hand, so dass ihr Bauch nach oben und ihr Kopf niedriger als sein Schwanz ist. Desinfizieren Sie die Bauchhaut mit 75% Alkohol.
- Halten Sie die Spritze in der rechten Hand, durchbohren Sie den Bauch weiße Linie mit der Nadel leicht auf der rechten Seite der Haut um 3-5 mm. Stellen Sie sicher, dass sich die Spritzennadel und die Haut in einem 45°-Winkel befinden, injizieren Sie das Pentobarbital langsam in die Bauchhöhle. Nach der Rasur, desinfiziert um die Einschnittstelle der Maus 3 mal abwechselnd mit 75% Alkohol und Chlorhexidin-Lösung.
- Prüfen Sie, ob die Anästhesie durch das Fehlen eines rechten Reflexes erfolgreich war.
- Injizieren Rhodamine B Isothiocyanat-Dextran in die kaudale Vene.
- Bereiten Sie 100 l von 10 mg/ml Rhodamine B Isothiocyanat-Dextran in einer Spritze vor.
- Wischen Sie den Schwanz der Maus mit 75% Alkohol ab.
- Halten Sie den Schwanz mit der linken Hand, halten Sie die Spritze in der rechten Hand mit der Nadel parallel zur Vene, und injizieren Sie den 100-L-Farbstoff.
- Stoppen Sie die Blutung mit einem Wattestäbchen nach der Injektion.
- Das Bauchfell der Maus mit mit sterilem Wasser benetzten Gaze einweichen und den Bauch der Maus mit einem Rasiermesser rasieren, was Schläge in Richtung des Fells macht. Nach der Rasur, desinfiziert um die Einschnittstelle der Maus 3 mal abwechselnd mit 75% Alkohol und Chlorhexidin-Lösung.
- Nachdem Sie ein Heizkissen mit 75 % Alkohol gewischt haben, öffnen Sie das Heizkissen und legen Sie die Maus auf den Rücken in das Heizkissen, um die Körpertemperatur bei 37 °C zu halten.
2. Fixierung der Mausleber mit dem Körperorgan Bildgebungsrahmen
HINWEIS: Der kommerzielle Organbildrahmen wurde noch nicht veröffentlicht.
- Legen Sie einen sauberen Saugnapf in eine feste Position.
- Installieren Sie eine Organbildgebungsvorrichtung(Zusatzabbildung 1) und wischen Sie das Heizkissen und den Saugnapf mit 75% Alkohol ab.
- Schließen Sie den Saugnapf (5 mm Durchmesser) an den Vakuumpumpenschlauch an und schalten Sie die Vakuumpumpe ein.
- Auf einem sterilen Tisch, der mit 75% Alkohol sterilisiert ist, um die Einschnittstelle der Maus dreimal abwechselnd mit 75% Alkohol und Chlorhexidinlösung desinfiziert, dann um die Einschnittstelle der Maus 3 mal abwechselnd mit 75% Alkohol und Chlorhexidinlösung desinfiziert, dann mit einer chirurgischen Schere 2 cm Haut vom unteren Brustrand der Maus schneidet und die Leber freisetzt.
- Platzieren Sie die Maus zusammen mit dem Heizkissen auf der Halterungsbasis.
- Passen Sie die Organbildleuchte so an, dass der Saugnapf die Leber hält. Dann verwenden Sie einen Unterdruck von 30-35 kPa zum Absaugen, so dass die Leber am Saugnapf befestigt wird (Zusatzabbildung 2).
3. Einstellen des Multiphotonen-Laser-Scanning-Mikroskops
- Schalten Sie das Multiphotonenmikroskop ein und wählen Sie das 60x/1,00 W Objektiv aus.
- Fixieren Sie den Rahmen und die Maus unter der Objektivlinse.
- Fügen Sie einen Tropfen normaler Saline hinzu, die die gesamte Linse, die die Mitte des Saugnapfes ist, abdecken kann, und passen Sie die Objektivlinse so an, dass sie nur die normale Saline berührt.
- Doppelklicken Sie auf das Computersymbol, um die Lasersoftware einzuschalten und den Schalter einzuschalten. Halten Sie dann den Ein-/Ausschalter gedrückt und schließen Sie 3 s.
- Stellen Sie die Wellenlänge auf 800 nm ein.
- Starten Sie die Mikroskop-Betriebssoftware mit dem Computer.
- Für die Erfassungseinstellungsetzen Sie Laser 800.
4. Beobachtung mit Multiphotonen-Laser-Scanning-Mikroskop
- Klicken Sie für Die Bildaufnahmesteuerungauf den Schalter Fluorescent.
- Stellen Sie sicher, dass die Raum- und Gerätebeleuchtung ausgeschaltet ist. Um den Geräuschpegel zu reduzieren, verwenden Sie das Mikroskop in einer abgedunkelten Umgebung.
- Öffnen Sie den Lichtpfadverschluss am Mikroskop.
- Drehen Sie den Fluoreszenzfilter auf den vierten Gang und ziehen Sie die beiden Hebel des optischen Schalters.
- Wenn Sie durch das Okular schauen, verwenden Sie die groben und feinen Fokussier-Quasispiralen, um die Brennweite einzustellen, und verwenden Sie die X/Y-Achsen, um das Sichtfeld anzupassen, um den Zielbereich zu finden.
5. Multiphotonen LaserScanning Mikrographie
- Schalten Sie den Leuchtstoffschalter der Software aus, schalten Sie den Leuchtstofffilter auf den zweiten Gang (zweiter Gang ist RXD1) und drücken Sie die beiden Hebel des optischen Schalters.
- Klicken Sie auf Fokus ×2, um eine Vorschau des Zielbereichs anzuzeigen und die Aufnahmeeinstellung und die Bildaufnahmesteuerungsparameter anzupassen (Bildauflösung: 1024).
- Drücken Sie Control + C und passen Sie die Hochspannung, Verstärkung und Versatz (um den Geräuschpegel zu reduzieren).
- Klicken Sie auf Beenden, um die Vorschau zu beenden, klicken Sie auf die Schaltfläche XY, um in zwei Dimensionen zu scannen, und speichern Sie sie nach Abschluss (Abbildung 1).
- Wählen Sie einen Bereich aus, klicken Sie auf Tiefe, und dann in der Vorschau, um den Endsatz und den Startsatz (siehe den gesamten erforderlichen Teil des Blutgefäßes) in der Einstellung Mikroskop auszuwählen. 3D-Bilder scannen und nach Abschluss speichern (Abbildung 2).
- Wählen Sie einen Bereich aus, klicken Sie auf Zeit, und passen Sie andere Parameter für die Erfassungseinstellung und Bildaufnahmesteuerung an (Schrittgröße: 1 m; Scheiben: 10; Zeitscanzahl: 40). Scannen Sie verschiedene Slices und speichern Sie sie nach Abschluss, um bewegte Bilder zu erhalten (Video 1).
HINWEIS: Lassen Sie jemanden für die Mäuse während des Scans kümmern und Fügen Sie Anästhesie entsprechend hinzu. - Opfern Sie die Maus durch Nackensesection.
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Representative Results
Die Verteilung der Blutgefäße in der Leber kann in Abbildung 1gesehen werden, die mit Multiphotonenmikroskopie erhalten wurde. Das Blutgefäß ist in eine Vielzahl von Zweigen unterteilt, die von einem Stamm austreten und auf den umgebenden Raum verteilt sind. Der äußere Umfang des Blutgefäßes ist rot, die innere Höhle ist dunkel, und es gibt viele Dinge im Inneren. Je klarer das Bild, desto näher an der Beobachtungsebene ist es. Es gibt auch einige rote Flecken um, wahrscheinlich, weil der Farbstoff in das umgebende Gewebe eindringt, um andere Substanzen zu färben. In Video 1gibt es nicht-rote Dinge, die Zellen sein könnten, die sich in den roten Blutgefäßen bewegen. Am Ende des Videos werden einige dieser Dinge abgedunkelt. Dies liegt wahrscheinlich daran, dass die feste Leber im Laufe der Zeit nicht gut fixiert wurde. Diese Methode ermöglicht die Bildgebung für 2 Stunden.
Abbildung 1: Die Blutgefäße im Lebergewebe unter Multiphotonenmikroskopie. Die Blutgefäße sind rot. Ein zweidimensionales Bild des Blutgefäßes mit einer Auflösung von 2048 und einem HV von 512 kann die roten Blutgefäße nach der Färbung deutlich abbilden. Es gibt auch einige rote Flecken um, und der Farbstoff kann auch das umgebende Gewebe eindringen, um andere Substanzen zu färben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Dreidimensionales Bild des lebenden Lebergewebes an der gleichen Position. Die Dicke beträgt 9 m, die Morphologie der Blutgefäße wird aus verschiedenen Blickwinkeln beobachtet und dynamische Bilder werden gesammelt. Nach der Synthese werden die Zellen in den Blutgefäßen (dunkel) fließend gesehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Körperorganbildgebungsrahmen. (a) Heizpad: Es hält die Maus Körpertemperatur. (b) Halterung: Es kann eine Basis bieten, um die Maus und die einstellbare Saugnapfposition mit Knöpfen zu platzieren. (c) Saugnapf: Es wird durch die Halterung fixiert. Der von der Unterdruckpumpe erzeugte Unterdruck bewirkt, dass die Leber in der Mitte des Saugnapfes an die transparente Linse adsorbiert. (d) Flexibles Rohr: Es verbindet den Saugnapf mit der Druckpumpe. Die Druckpumpe sorgt für einen Unterdruck auf den Saugnapf. (e) Zentrifugenrohr: Das Zentrifugenrohr in der Mitte des flexiblen Rohres kann die Flüssigkeit aufnehmen, um zu verhindern, dass diese Flüssigkeiten in die Vakuumpumpe gesaugt werden. (f) Unterdruckpumpe: Sie wird durch das flexible Rohr mit dem Saugnapf verbunden. Die Unterdruckpumpe kann den Saugnapf unterDruck setzen, um die Leber an der Linse festzuhalten. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Ein Nahaufnahmebild der Leber, die an einer transparenten Linse befestigt ist. Die transparente Linse befindet sich in der Mitte des Saugnapfes. Die Pumpe sorgt für unteren Druck auf den Saugnapf, damit er die Leber saugt und die Leber an der transparenten Linse befestigt ist. Da die Saugleber etwas von der Maus entfernt ist, wird die Wirkung der Atmung und der Herzschlag auf Artefakte reduziert. Die transparente Linse kann eine stabile Ansicht für das Multiphotonenmikroskop bieten. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
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Discussion
Die Beobachtung eines bestimmten lebenden Gewebes ist ein wirksames Mittel, um die Veränderungen, Lokalisierung und biologischen Wirkungen des Materials im Gewebe zu verstehen17. In diesem Experiment sind die wichtigen Schritte die Fixierung der Leber mit einer Organbildvorrichtung, die das Problem der Bewegungsartefakte durch Atmung und Herzschläge lösen kann, und der Einsatz eines Multiphotonenmikroskops zur Beobachtung. Mit dieser Methode werden die inneren Gewebe der Leber in vivo durch ein Multiphotonenmikroskop beobachtet, und die Blutgefäße sind fluoreszierend gekennzeichnet, um ihre Position und dreidimensionale Struktur deutlich zu beobachten. Diese Methode kann verwendet werden, um spezifische Effekte zu beobachten, indem eine Substanz fluoreszierend gekennzeichnet wird und der Substanz im lebenden Gewebe dynamisch folgt, um weitere Visualisierungen zu liefern.
Die Multiphotonenmikroskopie hat sich von einer neuartigen Technik zu einem unverzichtbaren Werkzeug für das Sammeln von Informationen aus zellulären Ereignissen in einer organisierten Gewebeumgebung entwickelt. Das Organ muss jedoch fixiert werden, um ein stabiles Bild zu erzeugen, damit die Methode bei der Beobachtung bestimmter Gewebe und Organe wirksam sein kann. Bewegungsartefakte aus der Atmung und der Herzschlag können verhindern, dass die Leber direkt abgebildet wird, so dass eine Körperorganhalterung verwendet wird, die das Prinzip der Vakuumadsorption verwendet, um das Organ zu sichern und Bildschütteln zu verhindern. Das Vakuumfutter kann auch eine Vielzahl von Körperorganen fixieren. Es besteht jedoch die Gefahr eines Gewebebruchs, wenn der entsprechende Unterdruck nicht verwendet wird oder die Bildgebungszeit über 2 h hinausgeht.
Obwohl die Auflösung der Multiphotonenmikroskopie etwas geringer ist als die der konfokalen Mikroskopie, wird die Penetrationstiefe auf 9-10 m erhöht, was die Bereitstellung von Bildern für tiefere Gewebebeobachtung, zelluläre Ereignisse und materielle Effekte ermöglicht.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81772133, 81902444), dem Guangdong Natural Science Fund (2020A1515010269, 2020A1515011367), dem Guangzhou Citizen Health Science and Technology Research Project (201803010034, 201903010072) und dem Military Medical Innovation Project (17CXZ008).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe x 2 | Hunan Pinan Medical Devices Technology | YA0551 | |
| 5 W heating pad | BiolinkOptics Technology | BL336 | |
| 75% absolute ethanol | Guangdong Guanghua Sci-Tech | 1.17113.023 | |
| Absorbent cotton ball | Healthy Sanitation Kingdom | ||
| Mouse surgical instrument | RWD Life Science | SP0001-G | Including scissors and tweezers |
| Multiphoton microscopy | Olympus | FV1200MPE | |
| Organ imaging fixture | BiolinkOptics Technology | BL336 | Including suction cup, hose, negative pressure pump and bracket |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | Sigma | R9379 | |
| Shaving machine | Lei Wa | RE-3201 | |
| Sodium pentobarbital | Sigma | P3761-25G |
References
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