Summary
In questo esperimento, un topo viene iniettato nella sua vena di coda con isotiocianato-dextran rhodamina B che può macchiare i vasi sanguigni. Dopo che il fegato è stato esposto e fissato, una parte specifica del fegato può essere selezionata per osservare il tessuto profondo nel corpo vivente utilizzando la microscopia multifotona.
Abstract
Osservare la dinamica intravascolare del tessuto epatico del topo ci consente di condurre ulteriori osservazioni e studi approfonditi sulle malattie legate ai tessuti del fegato di topo. Un topo viene iniettato con un colorante in grado di macchiare i vasi sanguigni. Per osservare il fegato di topo in vivo, è esposto e fissato in una cornice. Immagini bidimensionali e tridimensionali dei vasi sanguigni nel tessuto epatico sono ottenute utilizzando un microscopio multifotono. Le immagini dei tessuti nei siti selezionati vengono continuamente acquisite per osservare cambiamenti a lungo termine; si osservano anche i cambiamenti dinamici dei vasi sanguigni nei tessuti epatici. La microscopia multifotona è un metodo per osservare la funzione cellulare e cellulare in sezioni o organi di tessuti profondi. La microscopia multifotona ha sensibilità alla microstruttura tissutale e consente l'imaging di tessuti biologici ad alta risoluzione spaziale in vivo, fornendo la capacità di catturare le informazioni biochimiche dell'organizzazione. La microscopia multifotona viene utilizzata per osservare parte del fegato, ma fissare il fegato per rendere l'immagine più stabile è problematico. In questo esperimento, una speciale ventosa sottovuoto viene utilizzata per fissare il fegato e ottenere un'immagine più stabile del fegato al microscopio. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per osservare cambiamenti dinamici di sostanze specifiche nel fegato contrassegnando tali sostanze con coloranti.
Introduction
I vasi sanguigni possono fornire nutrienti per vari tessuti d'organo del corpo umano e scambiare sostanze. Allo stesso tempo, molte citochine, ormoni, farmaci e cellule funzionano anche attraverso il trasporto vascolare in luoghi specifici. Osservare i cambiamenti vascolari nel tessuto epatico può aiutare a comprendere la distribuzione del flusso sanguigno nel tessuto epatico e il trasporto di sostanze e aiutare nell'analisi di alcune malattievascolari 1,2.
Ci sono molti modi per osservare i vasi sanguigni del fegato nei topi. Tra questi, la microscopia ottica ha molte limitazioni nell'osservare il tessuto vascolare opaco3. La microscopia multifotonina può essere utilizzata per immaginare i vasi sanguigni dei fegati viventi ad alta risoluzione non invasiva4. Non solo è possibile ottenere immagini tridimensionali dei vasi sanguigni, ma la tecnica può anche essere utilizzata per aiutare a organizzare il tessuto per osservarne gli effetti biologici; inoltre, l'intero tessuto può essere immaginato piuttosto che solo le microvessel come nella tomografia computerizzata e nella risonanza magnetica5.
La microscopia multifotona può essere utilizzata per rilevare efficacemente segnali fluorescenti sparsi nel tessuto vivente profondo, con meno fototossicità6. Pertanto, l'attività del tessuto vivente può essere garantita e la quantità di danno può essere ridotta. La microscopia multifotona ha una migliore potenza penetrante rispetto alla microscopia confocale, consentendo diosservare strati più profondi 7,fornendo immagini 3D uniche. La microscopia multifotonico è ora spesso utilizzata nell'imaging dei nervi cranici8 ed è stata estesa allo studio della dinamica neuronale nei topi vivi9,10,11.
In questo esperimento, dopo l'etichettatura fluorescente dei vasi sanguigni del topo, il fegato è fissato in una cornice e la dinamica dei vasi sanguigni nel tessuto epatico vivente può essere vista usando la microscopia multifotonici. Questo esperimento dimostra come contrassegnare sostanze specifiche, utilizzare la microscopia multifotona per aiutare a osservare una posizione all'interno del tessuto, osservare eventi cellulari nel tessuto intercellulare, effettuare misurazioni fotochimiche12,13,14e osservare la dinamica del materiale all'interno del tessuto vivente15. Ad esempio, il marcatore endoteliale tumorale 1 (TEM1) è stato identificato come un nuovo marcatore di superficie upregolato sui vasi sanguigni e sullo stroma in molti tumori solidi, segnando il frammento variabile a catena singola (scFv) 78 contro TEM1, e quindi la microscopia multifotona può essere utilizzata per la posizione dell'emangioma del topo e la valutazione dei tumori16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutte le cure e le procedure per gli animali erano conformi alle politiche dell'ospedale di Nanfang in Cina per la salute e il benessere (domanda n. : NFYY-2019-73).
1. Preparazione del mouse
- Anestetizza il mouse.
- Preparare il pentobarbital di sodio (50 mg/kg) in una siringa.
- Afferra il topo (maschio C57BL/6 di 8 settimane) con la mano sinistra in modo che la sua pancia sia rivolta verso l'alto e la sua testa sia inferiore alla coda. Disinfettare la pelle addominale con il 75% di alcol.
- Tenendo la siringa nella mano destra, perforare la linea bianca dell'addome con l'ago leggermente sul lato destro della pelle di 3-5 mm. Assicurarsi che l'ago della siringa e la pelle siano ad un angolo di 45°, iniettare lentamente il pentobarbital nella cavità addominale. Dopo la rasatura, disinfetta intorno al sito di incisione del topo 3 volte alternativamente con soluzione di alcol e clorexidina al 75%.
- Controlla se l'anestesia ha avuto successo per la mancanza di un riflesso di destra.
- Iniettare rhodamina B isotiocianato-dextran nella vena caudale.
- Preparare 100 μL di 10 mg/mL Rhodamine B isotiocianato-dextran in una siringa.
- Pulire la coda del topo con il 75% di alcol.
- Tenere la coda con la mano sinistra, tenere la siringa nella mano destra con l'ago parallelo alla vena e iniettare il colorante da 100 μL.
- Fermare il sanguinamento con un batuffolo di cotone dopo l'iniezione.
- Immergere la pelliccia addominale del topo con una garza bagnata con acqua sterile e radere l'addome del topo usando un rasoio, facendo colpi nella direzione della pelliccia. Dopo la rasatura, disinfetta intorno al sito di incisione del topo 3 volte alternativamente con soluzione di alcol e clorexidina al 75%.
- Dopo aver pulito una pastiglia riscaldante con il 75% di alcol, aprire la pastiglia riscaldante e posizionare il mouse sulla schiena nella pastiglia di riscaldamento per mantenere la temperatura corporea a 37 °C.
2. Fissare il fegato del topo con il telaio di imaging dell'organo del corpo
NOTA: Il telaio di imaging degli organi commerciale non è ancora stato rilasciato.
- Posizionare una ventosa pulita in posizione fissa.
- Installare un apparecchio per l'imaging di organi (Figura complementare 1) e pulire il pad riscaldante e la ventosa con il 75% di alcol.
- Collegare la ventosa (diametro 5 mm) al tubo della pompa per vuoto e accendere la pompa per vuoto.
- Su un tavolo sterile sterilizzato con il 75% di alcol, disinfetta intorno al sito di incisione del topo 3 volte alternativamente con soluzione di alcol e clorexidina al 75%, quindi disinfetta intorno al sito di incisione del topo 3 volte alternativamente con soluzione di alcol e clorexidina al 75%, quindi usa forbici chirurgiche per tagliare 2 cm di pelle dal bordo sternale inferiore del mouse ed esporre il fegato.
- Posizionare il mouse insieme al tappetino riscaldante sulla base del supporto.
- Regolare l'apparecchio di imaging degli organi in modo che la ventosa trattiene il fegato. Quindi utilizzare una pressione negativa di 30-35 kPa per l'aspirazione in modo che il fegato si attacchi alla ventosa (Figura complementare 2).
3. Regolazione del microscopio a scansione laser multifotono
- Accendere il microscopio multifotono e selezionare l'obiettivo 60x/1.00 W.
- Fissare il telaio e il mouse sotto l'obiettivo.
- Aggiungere una goccia di soluzione salina normale in grado di coprire l'intera lente, che è il centro della ventosa, e regolare l'obiettivo per toccare semplicemente la normale salina.
- Fare doppio clic sull'icona del computer per accendere il software laser e accendere l'interruttore. Quindi tenere premuto il pulsante di accensione e l'otturatore per 3 s.
- Impostare la lunghezza d'onda su 800 nm.
- Avviare il software operativo del microscopio utilizzando il computer.
- Per l'impostazione diacquisizione , impostare Laser 800.
4. Osservazione con microscopio a scansione laser multifotono
- Per Controllo acquisizione immagini ,fare clic sull'interruttore Fluorescent.
- Assicurarsi che le luci della stanza e dell'attrezzatura siano spente. Per ridurre i livelli di rumore, utilizzare il microscopio in un ambiente oscurato.
- Aprire l'otturatore del percorso della luce al microscopio.
- Ruotare il filtro a fluorescenza fino alla quarta marcia e tirare le due leve dell'interruttore ottico.
- Guardando attraverso l'oculare, utilizzare i quasispirali di messa a fuoco grossolani e fini per regolare la lunghezza focale e utilizzare gli assi X/ Y perregolare il campo visivo per trovare l'area di destinazione.
5. Micrografia a scansione laser multifotono
- Spegnere l'interruttore fluorescente sul software, passare il filtro fluorescente al secondo ingranaggio (il secondo ingranaggio è RXD1) e spingere le due leve dell'interruttore ottico.
- Fare clic su Messa a fuoco ×2 per visualizzare in anteprima l'area di destinazione e regolare l'impostazione di acquisizione e i parametri di controllo dell'acquisizione dell'immagine (risoluzione dell'immagine: 1024).
- Premere Ctrl + C e regolare l'alta tensione, il guadagno e l'offset (per ridurre i livelli di rumore).
- Fare clic su Interrompi per interrompere l'anteprima, fare clic sul pulsante XY per eseguire la scansione in due dimensioni e salvare dopo il completamento (Figura 1).
- Selezionare un'area, fare clic su Profonditàe quindi su Anteprima per selezionare il set finale e iniziare il set (vedere la parte completa richiesta del vaso sanguigno) nell'impostazione Microscopio. Scansionare le immagini 3D e salvarle dopo il completamento (Figura 2).
- Selezionate un'area, fate clic su Tempo (Time)e regolate altri parametri di impostazione di acquisizione e controllo dell'acquisizione di immagini (Step Size: 1 μm; Fette: 10; Numero di scansione dell'ora: 40). Scansiona diverse sezioni e risparmia dopo il completamento per ottenere immagini in movimento (Video 1).
NOTA: Avere qualcuno che si prende cura dei topi durante la scansione e aggiungere l'anestesia di conseguenza. - Sacrifica il topo per dissezione del collo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La distribuzione dei vasi sanguigni nel fegato può essere vista nella figura 1, ottenuta utilizzando la microscopia multifotona. Il vaso sanguigno è diviso in una pluralità di rami che emanano da un tronco e distribuiti nello spazio circostante. La circonferenza esterna del vaso sanguigno è rossa, la cavità interna è buia e ci sono molte cose all'interno. Più chiara è l'immagine, più vicino al piano di osservazione è. Ci sono anche alcune macchie rosse intorno, probabilmente perché il colorante penetra nel tessuto circostante per macchiare altre sostanze. Nel video 1, ci sono cose non rosse che potrebbero essere cellule che si muovono nei vasi sanguigni rossi. Alla fine del video, alcune di queste cose sono oscurate. Questo probabilmente perché il fegato fisso non è stato riparato bene nel tempo. Questo metodo consentirà l'imaging per 2 ore.
Figura 1: I vasi sanguigni nel tessuto epatico sotto microscopia multifotona. I vasi sanguigni sono rossi. Un'immagine bidimensionale del vaso sanguigno con una risoluzione del 2048 e un HV di 512, può chiaramente immaginare i vasi sanguigni rossi dopo la colorazione. Ci sono anche alcune macchie rosse intorno, e il colorante può anche penetrare nel tessuto circostante per tingere altre sostanze. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagine tridimensionale del tessuto epatico vivente nella stessa posizione. Lo spessore è di 9 μm, la morfologia dei vasi sanguigni si osserva da diverse angolazioni e vengono raccolte immagini dinamiche. Dopo la sintesi, le cellule nei vasi sanguigni (scure) sono viste fluire. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura complementare 1: Fotogramma di imaging di organi corporei. (a) Riscaldante: mantiene la temperatura corporea del mouse. (b) Staffa: Può fornire una base per posizionare il mouse e la posizione regolabile della ventosa con manopole. (e) Ventosa: è fissata dalla staffa. La pressione negativa fornita dalla pompa a pressione negativa fa sì che il fegato adsorba alla lente trasparente al centro della ventosa. dTuboflessibile: collega la ventosa alla pompa di pressione. La pompa di pressione fornisce una pressione negativa alla ventosa. etubo di centrifuga: Il tubo di centrifuga al centro del tubo flessibile può contenere il liquido, per evitare che questi liquidi vengano aspirati nella pompa per vuoto. (f) Pompa a pressione negativa: è collegata alla ventosa dal tubo flessibile. La pompa a pressione negativa può fornire una pressione negativa alla ventosa per far aggrappare il fegato all'obiettivo. Clicca qui per scaricare questa cifra.
Figura complementare 2: Immagine ravvicinata del fegato attaccato all'obiettivo trasparente. L'obiettivo trasparente si trova al centro della ventosa. La pompa fornisce una pressione negativa alla ventosa per farlo succhiare il fegato e il fegato è attaccato alla lente trasparente. Poiché il fegato dalla faccia di aspirazione è un po 'lontano dal topo, l'effetto della respirazione e il battito cardiaco sugli artefatti è ridotto. L'obiettivo trasparente può fornire una vista stabile per il microscopio multifotono. Clicca qui per scaricare questa cifra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Osservare uno specifico tessuto vivente è un mezzo efficace per comprendere i cambiamenti, la localizzazione e gli effetti biologici del materiale all'interno del tessuto17. In questo esperimento, i passaggi importanti sono fissare il fegato con un apparecchio di imaging di organi, che può risolvere il problema degli artefatti del movimento a causa della respirazione e dei battiti cardiaci e l'uso di un microscopio multifotono per l'osservazione. Utilizzando questo metodo, i tessuti interni del fegato in vivo sono osservati attraverso un microscopio multifotono e i vasi sanguigni sono etichettati fluorescentmente per osservare chiaramente la loro posizione e la struttura tridimensionale. Questo metodo può essere utilizzato per osservare effetti specifici etichettando fluorescentmente una sostanza e seguendo dinamicamente la sostanza nel tessuto vivente per fornire ulteriori visualizzazioni.
La microscopia multifotona si è evoluta dall'essere una nuova tecnica per diventare uno strumento indispensabile per raccogliere informazioni da eventi cellulari in un ambiente tissutale organizzato. Tuttavia, l'organo deve essere fissato in posizione per produrre un'immagine stabile in modo che il metodo possa essere efficace nell'osservare determinati tessuti e organi. Gli artefatti del movimento dalla respirazione e dal battito cardiaco possono impedire al fegato di essere direttamente immaginato, quindi viene utilizzato un apparecchio per organo del corpo, che utilizza il principio dell'adsorbimento del vuoto per fissare l'organo e prevenire lo scuotimento dell'immagine. Il mandrino sottovuoto può anche fissare una varietà di organi corporei. Tuttavia, c'è il rischio di rottura dei tessuti se non viene utilizzata la pressione negativa appropriata o se il tempo di imaging si estende oltre 2 ore.
Sebbene la risoluzione della microscopia multifotona sia leggermente inferiore a quella della microscopia confocale, la profondità di penetrazione è aumentata a 9-10 μm, consentendo la fornitura di immagini per l'osservazione più profonda dei tessuti, eventi cellulari ed effetti materiali.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (81772133, 81902444), dal Fondo per le scienze naturali del Guangdong (2020A1515010269, 2020A1515011367), il Progetto di ricerca scientifica e tecnologica sulla salute dei cittadini di Guangzhou (201803010034, 201903010072) e il Progetto militare di innovazione medica (17CXZ008).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe x 2 | Hunan Pinan Medical Devices Technology | YA0551 | |
| 5 W heating pad | BiolinkOptics Technology | BL336 | |
| 75% absolute ethanol | Guangdong Guanghua Sci-Tech | 1.17113.023 | |
| Absorbent cotton ball | Healthy Sanitation Kingdom | ||
| Mouse surgical instrument | RWD Life Science | SP0001-G | Including scissors and tweezers |
| Multiphoton microscopy | Olympus | FV1200MPE | |
| Organ imaging fixture | BiolinkOptics Technology | BL336 | Including suction cup, hose, negative pressure pump and bracket |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | Sigma | R9379 | |
| Shaving machine | Lei Wa | RE-3201 | |
| Sodium pentobarbital | Sigma | P3761-25G |
References
- Wu, Z., et al. Multi-photon microscopy in cardiovascular research. Methods. 130, 79-89 (2017).
- Zhou, M., Ling, W., Luo, Y. Intrahepatic mass-forming cholangiocarcinoma growing in a giant hepatic hemangioma: A case report. Medicine (Baltimore). 98 (27), 16410 (2019).
- Werkmeister, E., et al. Multiphoton microscopy for blood vessel imaging: new non-invasive tools (Spectral SHG, FLIM). Clinical Hemorheology and Microcirculation. 37 (1-2), 77 (2007).
- Wang, H., et al. Does optical microangiography provide accurate imaging of capillary vessels?: validation using multiphoton microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (10), 1-5 (2014).
- Upputuri, P. K., Sivasubramanian, K., Mark, C. S., Pramanik, M. Recent developments in vascular imaging techniques in tissue engineering and regenerative medicine. Biomed Research International. 2015, 783983 (2015).
- Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. Journal of Microscopy. 243 (3), 221-226 (2011).
- Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys Journal. 75 (4), 2015-2024 (1998).
- Vogt, N. Chromatic multiphoton imaging of the whole brain. Nature Methods. 16 (6), 459 (2019).
- Bacskai, B. J., et al. Imaging of amyloid-β deposits in brains of living mice permits direct observation of clearance of plaques with immunotherapy. Nature Medicine. 7 (3), 369-372 (2001).
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385 (6612), 161-165 (1997).
- Liu, H., et al. In vivo Deep-Brain Structural and Hemodynamic Multiphoton Microscopy Enabled by Quantum Dots. Nano Letters. , (2019).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology. Methods. 128, 20-32 (2017).
- Shear, J. B. Peer Reviewed: Multiphoton-Excited Fluorescence in Bioanalytical Chemistry. Analytical Chemistry. 71 (17), 598-605 (1999).
- Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Yuan, X., et al. Characterization of the first fully human anti-TEM1 scFv in models of solid tumor imaging and immunotoxin-based therapy. Cancer Immunology & Immunotherapy. 66 (3), 367-378 (2017).
- Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Multiphoton microscopy in biological research. Current Opinion in Chemical Biology. 5 (5), 603-608 (2001).
