Summary
In dit experiment wordt een muis in zijn staartader geïnjecteerd met Rhodamine B isothiocyanaat-dextran die bloedvaten kan bevlekken. Nadat de lever is blootgesteld en gefixeerd, kan een specifiek deel van de lever worden geselecteerd om het diepe weefsel in het levende lichaam te observeren met behulp van multifotonenmicroscopie.
Abstract
Het observeren van de intravasculaire dynamiek van leverweefsel van muizen stelt ons in staat om verdere diepgaande observaties en studies uit te voeren naar weefselgerelateerde ziekten van de muizenlever. Een muis wordt geïnjecteerd met een kleurstof die bloedvaten kan bevlekken. Om de muizenlever in vivo te observeren, wordt deze blootgesteld en in een frame bevestigd. Twee- en driedimensionale beelden van de bloedvaten in het leverweefsel worden verkregen met behulp van een multifotonenmicroscoop. Beelden van de weefsels op de geselecteerde locaties worden continu verkregen om veranderingen op lange termijn waar te nemen; de dynamische veranderingen van bloedvaten in de leverweefsels worden ook waargenomen. Multifotonenmicroscopie is een methode voor het observeren van cel- en celfunctie in diepe weefselsecties of organen. Multifotonenmicroscopie heeft gevoeligheid voor weefselmicrostructuur en maakt beeldvorming van biologische weefsels met een hoge ruimtelijke resolutie in vivo mogelijk, waardoor de biochemische informatie van de organisatie kan worden vastgelegd. Multifotonenmicroscopie wordt gebruikt om een deel van de lever te observeren, maar het fixeren van de lever om het beeld stabieler te maken is problematisch. In dit experiment wordt een speciale vacuümzuignap gebruikt om de lever te fixeren en een stabieler beeld van de lever onder de microscoop te verkrijgen. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om dynamische veranderingen van specifieke stoffen in de lever waar te nemen door dergelijke stoffen met kleurstoffen te markeren.
Introduction
Bloedvaten kunnen voedingsstoffen leveren voor verschillende orgaanweefsels van het menselijk lichaam en stoffen uitwisselen. Tegelijkertijd functioneren veel cytokinen, hormonen, medicijnen en cellen ook via vasculair transport naar specifieke locaties. Het observeren van vasculaire veranderingen in leverweefsel kan helpen bij het begrijpen van de verdeling van de bloedstroom in leverweefsel en het transport van stoffen, en helpen bij de analyse van bepaalde vasculaire gerelateerde ziekten1,2.
Er zijn veel manieren om de bloedvaten van de lever bij muizen te observeren. Onder hen heeft optische microscopie veel beperkingen bij het observeren van ondoorzichtig vasculair weefsel3. Multifotonenmicroscopie kan worden gebruikt om de bloedvaten van levende levers met niet-invasieve hoge resolutie 4 in beeld tebrengen. Niet alleen kunnen driedimensionale beelden van bloedvaten worden verkregen, maar de techniek kan ook worden gebruikt om het weefsel te helpen organiseren om biologische effecten daarin te observeren; bovendien kan het hele weefsel worden afgebeeld in plaats van alleen de microvessels zoals in computertomografie en magnetische resonantiebeeldvorming5.
Multifotonenmicroscopie kan worden gebruikt om verspreide fluorescerende signalen in diep levend weefsel effectief te detecteren, met minder fototoxiciteit6. Daarom kan de activiteit van levend weefsel worden gegarandeerd en kan de hoeveelheid schade worden verminderd. Multifotonenmicroscopie heeft een beter doordringend vermogen dan confocale microscopie, waardoor diepere lagen kunnen worden waargenomen7,wat unieke 3D-beeldvorming biedt. Multifotonenmicroscopie wordt nu vaak gebruikt bij beeldvorming van hersenzenuwen8 en is uitgebreid tot de studie van neuronale dynamica bij levende muizen9,10,11.
In dit experiment, na fluorescerende etikettering van muisbloedvaten, wordt de lever in een frame gefixeerd en is de dynamiek van bloedvaten in levend leverweefsel te zien met behulp van multifotonenmicroscopie. Dit experiment demonstreert hoe specifieke stoffen te markeren, multifotonenmicroscopie te gebruiken om een locatie in het weefsel te observeren, cellulaire gebeurtenissen in het intercellulaire weefsel te observeren, fotochemische metingen te doen12,13,14en de materiaaldynamiek in het levende weefsel te observeren15. Tumor endotheelmarker 1 (TEM1) is bijvoorbeeld geïdentificeerd als een nieuwe oppervlaktemarker die op de bloedvaten en stroma in veel solide tumoren wordt gereguleerd, waardoor eenketenig variabel fragment (scFv) 78 tegen TEM1 wordt gemarkeerd, en vervolgens kan multifotonenmicroscopie worden gebruikt voor de locatie van muis hemangioom en evaluatie van tumoren16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierenverzorging en procedures waren in overeenstemming met het beleid van het China Nanfang Hospital voor heide en welzijn (aanvraagnr: NFYY-2019-73).
1. Voorbereiding van de muis
- Verdoof de muis.
- Bereid natriumpentobarbital (50 mg/kg) voor in een spuit.
- Pak de muis (8 weken oude mannelijke C57BL/6) met de linkerhand zodat zijn buik naar boven is gericht en zijn hoofd lager is dan zijn staart. Desinfecteer de buikhuid met 75% alcohol.
- Houd de spuit in de rechterhand en doorboor de witte lijn van de buik met de naald iets naar de rechterkant van de huid met 3-5 mm. Zorg ervoor dat de spuitnaald en de huid zich in een hoek van 45° bevinden, injecteer het pentobarbital langzaam in de buikholte. Na het scheren, desinfecteert rond de incisieplaats van de muis 3 keer afwisselend met 75% alcohol en chloorhexidine-oplossing.
- Controleer of de anesthesie succesvol was door het ontbreken van een juiste reflex.
- Injecteer Rhodamine B isothiocyanaat–dextran in de staartader.
- Bereid 100 μL rhodamine B isothiocyanaat-dextran van 10 mg/ml in een spuit.
- Veeg de staart van de muis af met 75% alcohol.
- Houd de staart met de linkerhand vast, houd de spuit in de rechterhand met de naald evenwijdig aan de ader en injecteer de kleurstof van 100 μL.
- Stop het bloeden met een wattenstaafje na de injectie.
- Week de buikvacht van de muis met gaas bevochtigd met steriel water en scheer de buik van de muis met een scheermes, waarbij hij slagen maakt in de richting van de vacht. Na het scheren, desinfecteert rond de incisieplaats van de muis 3 keer afwisselend met 75% alcohol en chloorhexidine-oplossing.
- Na het afvegen van een verwarmingskussen met 75% alcohol, opent u het verwarmingskussen en plaatst u de muis op zijn rug in het verwarmingskussen om de lichaamstemperatuur op 37 °C te houden.
2. Het bevestigen van de muislever met het beeldvormingsframe van het lichaamsorgaan
OPMERKING: Het commerciële beeldvormingsframe voor orgels is nog niet vrijgegeven.
- Plaats een schone zuignap in een vaste positie.
- Installeer een orgaanbeeldvormingsarmatuur(aanvullende figuur 1)en veeg het verwarmingskussen en de zuignap af met 75% alcohol.
- Sluit de zuignap (5 mm diameter) aan op de vacuümpompslang en schakel de vacuümpomp in.
- Op een steriele tafel gesteriliseerd met 75% alcohol, desinfecteert rond de incisieplaats van de muis 3 keer afwisselend met 75% alcohol en chloorhexidine-oplossing, desinfecteert vervolgens rond de incisieplaats van de muis 3 keer afwisselend met 75% alcohol en chloorhexidine-oplossing, gebruikt vervolgens een chirurgische schaar om 2 cm huid van de onderste sternale rand van de muis af te snijden en de lever bloot te stellen.
- Plaats de muis samen met het verwarmingskussen op de houdervoet.
- Stel de orgelbeeldvormingsarmatuur zo in dat de zuignap de lever vasthoudt. Gebruik vervolgens een onderdruk van 30-35 kPa voor de zuigkracht, zodat de lever zich aan de zuignap hecht (Aanvullende figuur 2).
3. Het aanpassen van de multiphoton laser scanning microscoop
- Schakel de multifotonmicroscoop in en selecteer het objectief van 60x/1,00 W.
- Bevestig het frame en de muis onder de objectieve lens.
- Voeg een druppel normale zoutoplossing toe die de hele lens kan bedekken, die het midden van de zuignap is, en pas de objectieve lens aan om gewoon de normale zoutoplossing aan te raken.
- Dubbelklik op het computerpictogram om de lasersoftware in te schakelen en de schakelaar in te schakelen. Houd vervolgens de aan/uit-knop en de sluiter 3 s ingedrukt.
- Stel de golflengte in op 800 nm.
- Start de besturingssoftware van de microscoop met behulp van de computer.
- Stel laser 800 invoor de aanschafinstelling.
4. Observatie met behulp van multiphoton laser scanning microscoop
- Klik voor Besturingselement voor het verkrijgen vanafbeeldingen op de schakelaar Fluorescerend.
- Zorg ervoor dat de verlichting van de ruimte en apparatuur is uitgeschakeld. Gebruik de microscoop in een verduisterde omgeving om het geluidsniveau te verminderen.
- Open de sluiter van het lichtpad op de microscoop.
- Draai het fluorescentiefilter naar de vierde versnelling en trek aan de twee hendels van de optische schakelaar.
- Als u door het oculair kijkt, gebruikt u de grove en fijne scherpstel quasispiralen om de brandpuntsafstand aan te passen en gebruikt u de X/Y-assen om het gezichtsveld aan te passen om het doelgebied te vinden.
5. Multiphoton laser scanning micrografie
- Schakel de fluorescerende schakelaar op de software uit, schakel het fluorescerende filter naar de tweede versnelling (tweede versnelling is RXD1) en druk op de twee hendels van de optische schakelaar.
- Klik op Focus ×2 om een voorbeeld van het doelgebied te bekijken en de parameters voor acquisitie en beeldverwerving aan te passen (beeldresolutie: 1024).
- Druk op Control + C en pas de hoogspanning, versterking en offset aan (om het geluidsniveau te verminderen).
- Klik op Stoppen om het voorbeeld te stoppen, klik op de XY-knop om in twee dimensies te scannen en sla op na voltooiing ( Figuur1).
- Selecteer een gebied, klik op Diepteen vervolgens op Voorbeeld om de eindset en startset te selecteren (zie het volledige vereiste deel van het bloedvat) in de microscoopinstelling. Scan 3D-afbeeldingen en sla op na voltooiing (Figuur 2).
- Selecteer een regio, klik op Tijden pas andere parameters voor acquisitie- en beeldverwervingsbeheer aan (stapgrootte: 1 μm; Plakjes: 10; Tijd scan nummer: 40). Scan verschillende segmenten en sla op na voltooiing om bewegende beelden te verkrijgen (Video 1).
OPMERKING: Laat iemand de muizen verzorgen tijdens de scan en voeg dienovereenkomstig anesthesie toe. - Offer de muis op door nekdissectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De verdeling van bloedvaten in de lever is te zien in figuur 1, verkregen met behulp van multifotonenmicroscopie. Het bloedvat is verdeeld in een pluraliteit van takken die uit een stam komen en verdeeld naar de omringende ruimte. De buitenste omtrek van het bloedvat is rood, de binnenholte is donker en er zijn veel dingen binnenin. Hoe duidelijker het beeld, hoe dichter bij het observatievlak het is. Er zijn ook enkele rode vlekken in de buurt, waarschijnlijk omdat de kleurstof het omliggende weefsel doordringt om andere stoffen te bevlekken. In video 1zijn er niet-rode dingen die cellen kunnen zijn die in de rode bloedvaten bewegen. Aan het einde van de video worden sommige van deze dingen verduisterd. Dit komt waarschijnlijk omdat de vaste lever niet goed is gefixeerd in de loop van de tijd. Met deze methode kunt u gedurende 2 uur beeldvorming maken.
Figuur 1: De bloedvaten in het leverweefsel onder multifotonenmicroscopie. De bloedvaten zijn rood. Een tweedimensionaal beeld van het bloedvat met een resolutie van 2048 en een HV van 512, kan de rode bloedvaten na vlekken duidelijk in beeld brengen. Er zijn ook enkele rode vlekken in de buurt en de kleurstof kan ook het omliggende weefsel binnendringen om andere stoffen te verven. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Driedimensionaal beeld van levend leverweefsel in dezelfde positie. De dikte is 9 μm, de morfologie van de bloedvaten wordt vanuit verschillende hoeken waargenomen en dynamische beelden worden verzameld. Na de synthese worden de cellen in de bloedvaten (donker) zien stromen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Beeldvormingsframe van lichaamsorgaan. (a) Verwarmingskussen: Het handhaaft de lichaamstemperatuur van de muis. (b) Beugel: Het kan een basis bieden om de muis en de verstelbare zuignappositie met knoppen te plaatsen. (c) Zuignap: Deze wordt door de beugel bevestigd. De negatieve druk van de negatieve drukpomp zorgt ervoor dat de lever adsorbeert naar de transparante lens in het midden van de zuignap. (d) Flexibele pijp: Het verbindt de zuignap met de drukpomp. De drukpomp zorgt voor een negatieve druk op de zuignap. e) Centrifugebuis: De centrifugebuis in het midden van de flexibele buis kan de vloeistof vasthouden, om te voorkomen dat deze vloeistoffen in de vacuümpomp worden gezogen. (f) Negatieve drukpomp: Deze wordt door de flexibele buis met de zuignap verbonden. De negatieve drukpomp kan negatieve druk op de zuignap geven om de lever aan de lens vast te houden. Klik hier om deze afbeelding te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Een close-upbeeld van de lever bevestigd aan transparante lens. De transparante lens bevindt zich in het midden van de zuignap. De pomp zorgt voor negatieve druk op de zuignap om de lever te laten zuigen en de lever is bevestigd aan de transparante lens. Omdat de zuigbare lever een beetje weg is van de muis, wordt het effect van de ademhaling en de hartslag op artefacten verminderd. De transparante lens kan een stabiel zicht bieden voor de multifoton microscoop. Klik hier om deze afbeelding te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het observeren van een specifiek levend weefsel is een effectief middel om de veranderingen, lokalisatie en biologische effecten van het materiaal in het weefsel te begrijpen17. In dit experiment zijn de belangrijke stappen het fixeren van de lever met een orgaanbeeldvormingsarmatuur, dat het probleem van bewegingsartefacten als gevolg van ademhaling en hartslagen kan oplossen, en het gebruik van een multifotonmicroscoop voor observatie. Met behulp van deze methode worden de interne weefsels van de lever in vivo waargenomen door een multifotonenmicroscoop en worden de bloedvaten fluorescerend gelabeld om hun positie en driedimensionale structuur duidelijk te observeren. Deze methode kan worden gebruikt om specifieke effecten te observeren door een stof fluorescerend te labelen en de stof dynamisch in het levende weefsel te volgen om verdere visualisaties te bieden.
Multifotonenmicroscopie is geëvolueerd van een nieuwe techniek tot een onmisbaar hulpmiddel voor het verzamelen van informatie van cellulaire gebeurtenissen in een georganiseerde weefselomgeving. Het orgaan moet echter op zijn plaats worden bevestigd om een stabiel beeld te produceren, zodat de methode effectief kan zijn in het observeren van bepaalde weefsels en organen. Bewegingsartefacten van de ademhaling en de hartslag kunnen voorkomen dat de lever direct wordt afgebeeld, dus wordt een lichaamsorgaanarmatuur gebruikt, die het principe van vacuüm adsorptie gebruikt om het orgaan te beveiligen en beeldschudden te voorkomen. De vacuümkop kan ook een verscheidenheid aan lichaamsorganen repareren. Er bestaat echter een risico op weefselbreuk als de juiste negatieve druk niet wordt gebruikt of de beeldvormingstijd langer is dan 2 uur.
Hoewel de resolutie van multifotonenmicroscopie iets minder is dan die van confocale microscopie, wordt de penetratiediepte verhoogd tot 9-10 μm, waardoor beelden kunnen worden geleverd voor diepere weefselobservatie, cellulaire gebeurtenissen en materiële effecten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (81772133, 81902444), het Guangdong Natural Science Fund (2020A1515010269, 2020A1515011367), het Guangzhou Citizen Health Science and Technology Research Project (201803010034, 2019030107).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe x 2 | Hunan Pinan Medical Devices Technology | YA0551 | |
| 5 W heating pad | BiolinkOptics Technology | BL336 | |
| 75% absolute ethanol | Guangdong Guanghua Sci-Tech | 1.17113.023 | |
| Absorbent cotton ball | Healthy Sanitation Kingdom | ||
| Mouse surgical instrument | RWD Life Science | SP0001-G | Including scissors and tweezers |
| Multiphoton microscopy | Olympus | FV1200MPE | |
| Organ imaging fixture | BiolinkOptics Technology | BL336 | Including suction cup, hose, negative pressure pump and bracket |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | Sigma | R9379 | |
| Shaving machine | Lei Wa | RE-3201 | |
| Sodium pentobarbital | Sigma | P3761-25G |
References
- Wu, Z., et al. Multi-photon microscopy in cardiovascular research. Methods. 130, 79-89 (2017).
- Zhou, M., Ling, W., Luo, Y. Intrahepatic mass-forming cholangiocarcinoma growing in a giant hepatic hemangioma: A case report. Medicine (Baltimore). 98 (27), 16410 (2019).
- Werkmeister, E., et al. Multiphoton microscopy for blood vessel imaging: new non-invasive tools (Spectral SHG, FLIM). Clinical Hemorheology and Microcirculation. 37 (1-2), 77 (2007).
- Wang, H., et al. Does optical microangiography provide accurate imaging of capillary vessels?: validation using multiphoton microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (10), 1-5 (2014).
- Upputuri, P. K., Sivasubramanian, K., Mark, C. S., Pramanik, M. Recent developments in vascular imaging techniques in tissue engineering and regenerative medicine. Biomed Research International. 2015, 783983 (2015).
- Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. Journal of Microscopy. 243 (3), 221-226 (2011).
- Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys Journal. 75 (4), 2015-2024 (1998).
- Vogt, N. Chromatic multiphoton imaging of the whole brain. Nature Methods. 16 (6), 459 (2019).
- Bacskai, B. J., et al. Imaging of amyloid-β deposits in brains of living mice permits direct observation of clearance of plaques with immunotherapy. Nature Medicine. 7 (3), 369-372 (2001).
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385 (6612), 161-165 (1997).
- Liu, H., et al. In vivo Deep-Brain Structural and Hemodynamic Multiphoton Microscopy Enabled by Quantum Dots. Nano Letters. , (2019).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology. Methods. 128, 20-32 (2017).
- Shear, J. B. Peer Reviewed: Multiphoton-Excited Fluorescence in Bioanalytical Chemistry. Analytical Chemistry. 71 (17), 598-605 (1999).
- Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Yuan, X., et al. Characterization of the first fully human anti-TEM1 scFv in models of solid tumor imaging and immunotoxin-based therapy. Cancer Immunology & Immunotherapy. 66 (3), 367-378 (2017).
- Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Multiphoton microscopy in biological research. Current Opinion in Chemical Biology. 5 (5), 603-608 (2001).
