Summary
この実験では、マウスを血管を染色できるローダミンBイソチオシアネート-デキストランで尾静脈に注射します。肝臓が露出して固定された後、肝臓の特定の部分を選択して、多光子顕微鏡を用いて生体内の深部組織を観察することができる。
Abstract
マウス肝組織の血管内ダイナミクスを観察することで、マウス肝臓の組織関連疾患に関するさらなる詳細な観察と研究を行うことができます。マウスは、血管を汚すことができる染料を注入されます。生体内でマウス肝臓を観察するために、フレーム内に露出して固定する。肝臓組織における血管の2つの3次元画像は、多光子顕微鏡を用いて得られる。選択した部位の組織の画像は、長期的な変化を観察するために継続的に取得されます。肝臓組織の血管の動的変化も観察される。多光子顕微鏡は、深部組織切片または器官における細胞および細胞機能を観察するための方法である。多光子顕微鏡は組織の微細構造に対する感受性を有し、生体内で高い空間分解能での生体組織のイメージングを可能にし、組織の生化学的情報を捕捉する能力を提供する。多光子顕微鏡は肝臓の一部を観察するために使用されるが、画像をより安定させるために肝臓を固定することは問題である。この実験では、特別な真空吸引カップを使用して肝臓を固定し、顕微鏡下で肝臓のより安定した画像を得る。また、この方法は、色素でそのような物質をマークすることにより、肝臓の特定の物質の動的変化を観察するために使用することができます。
Introduction
血管は、人体の様々な臓器組織に栄養素を提供し、物質を交換することができます。同時に、多くのサイトカイン、ホルモン、薬物および細胞はまた、特定の場所への血管輸送を介して機能する。肝臓組織の血管変化を観察することは、肝臓組織の血流の分布および物質の輸送を理解するのに役立ち、また、ある血管関連疾患の解析に役立つ1,2。
マウスの肝臓の血管を観察する方法はたくさんあります。中でも、光学顕微鏡検査は、不透明血管組織3を観察する上で多くの制限を有する。多光子顕微鏡は、非侵襲的な高分解能4を有する生きた肝臓の血管を画像化するために使用することができる。血管の3次元画像が得られるだけでなく、この技術は、その中の生物学的効果を観察するために組織を整理するのにも役立ちます。さらに、コンピュータ断層撮影や磁気共鳴画像5のように、組織全体をマイクロ血管ではなく画像化することができる。
多光子顕微鏡検査は、より少ない光毒性6で、深部の生体組織における散乱蛍光シグナルを効果的に検出するために使用することができる。したがって、生体組織の活性を確保することができ、そして損傷の量を減らすことができる。多光子顕微鏡は共焦点顕微鏡よりも貫通力が優れ、より深い層を7個観察し、ユニークな3Dイメージングを提供します。多光子顕微鏡は現在、脳神経8のイメージングにしばしば使用され、生きたマウス9、10、11における神経動態の研究に拡張されている。
本実験では、マウス血管の蛍光標識後、肝臓をフレームに固定し、多光子顕微鏡を用いて生きた肝臓組織における血管の動態を見ることができる。この実験は、特定の物質をマークし、多光子顕微鏡を使用して組織内の位置を観察し、細胞間組織における細胞事象を観察し、光化学測定12、13、14を行い、生体組織15内の物質的ダイナミクスを観察する方法を示す。例えば、腫瘍内皮マーカー1(TEM1)は、多くの固形腫瘍において血管および間質に上調節された新規表面マーカーとして同定されており、TEM1に対して単鎖可変フラグメント(scFv)78をマーキングし、そしてその後、多光子顕微鏡をマウス血管腫の位置および腫瘍の評価に使用することができる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
すべての動物のケアと手順は、ヒースと幸福のための中国南方病院の方針に従っていました(アプリケーションNo:NFYY-2019-73)。
1. マウスの準備
- マウスを麻酔します。
- 注射器にペントバルビタールナトリウム(50mg/kg)を準備します。
- マウス(8週齢の雄C57BL/6)を左手でつかみ、腹が上向きになり、頭が尾よりも低くなるようにします。75%アルコールで腹部の皮膚を消毒します。
- 右手に注射器を持ち、3~5mmずつ針で腹部白線を突き刺す。注射針と皮膚が45°の角度であることを確認し、ペントバルビタールを腹腔にゆっくりと注入します。 シェービング後、マウスの切開部位の周囲を75%アルコールとクロルヘキシジン溶液と交互に3回消毒する。
- 正しい反射の欠如によって麻酔が成功したかどうかを確認してください。
- ローダミンBイソチオシアネート-デキストランを尾静脈に注入する。
- 10 mg/mL ローダミンBイソチオシアネート-デキストランをシリンジに100 μL用意します。
- 75%のアルコールでマウスの尾を拭きます。
- 尾を左手で持ち、右手の注射器を静脈に平行な針で持ち、100μLの染料を注入します。
- 注射後に綿棒で出血を止める。
- 無菌水で濡らしたガーゼでマウスの腹部の毛皮を浸し、かみそりを使ってマウスの腹部を剃り、毛皮の方向にストロークを作ります。シェービング後、マウスの切開部位の周囲を75%アルコールとクロルヘキシジン溶液と交互に3回消毒する。
- 75%のアルコールで加熱パッドを拭いた後、加熱パッドを開け、マウスを加熱パッドの背面に置き、体温を37°Cに保ちます。
2. マウス肝臓を身体器官イメージングフレームで固定する
メモ:市販の臓器イメージングフレームはまだリリースされていません。
- 清潔な吸引カップを固定位置に配置します。
- 臓器イメージングフィクスチャ(補足図1)を取り付け、75%アルコールで加熱パッドと吸引カップを拭きます。
- 吸引カップ(直径5mm)を真空ポンプホースに接続し、真空ポンプをオンにします。
- 75%のアルコールで殺菌された無菌表では、75%のアルコールとクロルヘキシジン溶液と交互にマウスの切開部位の周りを3回消毒し、75%のアルコールとクロルヘキシジン溶液でマウスの切開部位の周りを3回殺菌し、手術用ハサミを使用して下皮の2cmを切り落とし、マウスの境界部から皮膚の2cmを切断する。
- ホルダーベースに加熱パッドと一緒にマウスを置きます。
- 吸引カップが肝臓を保持するように臓器イメージングフィクスチャを調整します。次に、肝臓が吸引カップに付着するように、吸引に30〜35 kPaの負圧を使用する(補足図2)。
3. 多光子レーザー顕微鏡の調整
- マルチフォトン顕微鏡をオンにして、60x/1.00 Wの目的を選択します。
- フレームとマウスを対物レンズの下に固定します。
- 吸引カップの中心であるレンズ全体を覆うことができる通常の生理液線の滴を加え、通常の生理液線に触れるだけである対物レンズを調整します。
- コンピュータアイコンをダブルクリックしてレーザーソフトウェアをオンにし、スイッチをオンにします。次に、電源ボタンとシャッターを3 sの長押しします。
- 波長を800 nmに設定します。
- コンピュータを使用して、顕微鏡操作ソフトウェアを起動します。
- 取得設定に対しては、レーザー 800を設定します。
4. 多光子レーザー顕微鏡による観察
- [ 画像取得コントロール] で 、[蛍光 ]スイッチをクリックします。
- 部屋と機器の照明が消灯していることを確認します。騒音レベルを下げるには、暗い環境で顕微鏡を使用してください。
- 顕微鏡のライトパスシャッターを開きます。
- 蛍光フィルターを第4の歯車に回転させ、光スイッチの2つのレバーを引きます。
- 接眼レンズを見て、焦点距離を調整するために粗く細かい焦点を合わせる準渦巻きを使用し 、X/Y 軸を使用して、ターゲット領域を見つけるために視野を調整します。
5. 多光子レーザー走査顕微鏡
- ソフトウェアの蛍光スイッチをオフにし、蛍光フィルターを第2のギア(セカンドギアはRXD1)に切り替え、光スイッチの2つのレバーを押します。
- フォーカス ×2 をクリックしてターゲット領域をプレビューし、取得設定と画像取得制御パラメータを調整します (画像解像度: 1024)。
- コントロール+Cを押して、高電圧、ゲイン、オフセットを調整します(ノイズレベルを下げます)。
- [Stop]をクリックしてプレビューを停止し、[XY]ボタンをクリックして 2 つのディメンションでスキャンし、完了後に保存します (図 1)。
- 領域を選択し、[深さ]をクリックし、[プレビュー]をクリックして、終了セットを選択し、顕微鏡設定でセットを開始します(血管の完全な必要部分を参照)。3D画像をスキャンして、完了後に保存します(図2)。
- リージョンを選択し、 時間をクリックして、他の取得設定と画像取得制御パラメータを調整します(ステップサイズ:1 μm;スライス: 10;タイムスキャン番号:40)。異なるスライスをスキャンし、完了後に保存して、動画を取得します (ビデオ 1)。
注:誰かがスキャン中にマウスの世話をし、それに応じて麻酔を追加してもらいます。 - 首の解剖によってマウスを犠牲にする。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
肝臓における血管の分布は、多光子顕微鏡を用いて得られた 図1に示されている。血管は、幹から発せられる複数の枝に分かれ、周囲の空間に分布する。血管の外周は赤く、内腔は暗く、内部には多くのものがあります。画像が鮮明であるほど、観察の平面に近くなります。色素が周囲の組織を貫通して他の物質を染色するため、周りにいくつかの赤い斑点もあります。 ビデオ1では、赤い血管の中を動く細胞である可能性のある赤以外のものがあります。ビデオの最後に、これらのもののいくつかは暗くなります。これはおそらく、固定肝臓が時間の経過とともに十分に固定されていないためです。この方法では、2時間のイメージングが可能です。
図1:多光子顕微鏡下の肝臓組織の血管。血管は赤い。2048の分解能および512のHVの血管の2次元のイメージは、明らかに染色後の赤い血管をイメージすることができる。また、周りにはいくつかの赤い斑点があり、染料はまた、他の物質を染めるために周囲の組織を貫通することができます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:同じ位置にある生きた肝臓組織の3次元画像。厚さは9μmで、血管の形態は異なる角度から観察され、動的な画像が収集されます。合成後、血管内の細胞(暗い)が流れているのが見られます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:身体臓器イメージングフレーム。() 加熱パッド: マウスの体温を維持します。(b)ブラケット:それは、マウスとノブで調整可能な吸引カップの位置を配置するためのベースを提供することができます。(c)吸引カップ:ブラケットで固定されています。負圧ポンプによって供給される負圧は、肝臓が吸引カップの中央にある透明レンズに吸着する原因となる。(d)フレキシブルパイプ:吸引カップと圧力ポンプを接続します。圧力ポンプは吸引のコップに否定的な圧力を提供する。(e)遠心管:フレキシブルパイプの中央にある遠心管は液体を保持することができ、液体が真空ポンプに吸い込まれるのを防ぎます。(f)負圧ポンプ:フレキシブルパイプで吸引カップに接続します。負圧ポンプは、肝臓がレンズにしがみつくように吸引カップに負圧を与えることができます。こちらをダウンロードしてください。
補助図2:透明レンズに取り付けられた肝臓のクローズアップ画像。 透明レンズは吸引カップの中央にあります。ポンプは、肝臓を吸うように吸引カップに負圧を提供し、肝臓は透明なレンズに取り付けられています。吸引面の肝臓はマウスから少し離れているため、呼吸と心拍が人工物に及ぼす影響が軽減されます。透明レンズは、多光子顕微鏡の安定した視野を提供することができる。 こちらをダウンロードしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
特定の生体組織を観察することは、組織17内の物質の変化、局在、および生物学的影響を理解する有効な手段である。この実験では、呼吸や心拍による動きの問題を解決できる臓器イメージングフィクスチャで肝臓を固定し、観察に多光子顕微鏡を使用することが重要です。この方法を用いて、生体内の肝臓の内部組織を多光子顕微鏡で観察し、血管を蛍光標識してその位置や立体構造を明確に観察する。この方法は、物質を蛍光標識し、生体組織内の物質に動的に従うことによって特定の効果を観察し、さらなる可視化を提供するために使用することができる。
多光子顕微鏡は、組織化された組織環境で細胞イベントから情報を収集するための不可欠なツールとなる新しい技術から進化してきました。しかし、特定の組織や臓器の観察に効果的に行うことができるように、安定した画像を生成するために臓器を固定する必要があります。呼吸や心拍からの動きのアーティファクトは、肝臓が直接画像化されるのを防ぐことができるので、真空吸着の原理を使用して臓器を固定し、画像の揺れを防ぐ身体器官の備品が使用されます。真空チャックはまた、様々な身体器官を固定することができます。しかし、適切な陰圧が使用されない場合や、撮像時間が2時間を超える場合には、組織破裂のリスクがある。
多光子顕微鏡の分解能は共焦点顕微鏡の解像度よりわずかに少ないが、浸透深度は9~10μmに増加し、より深い組織観察、細胞イベント、物質効果に対する画像の提供が可能となる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は中国国立自然科学財団(81772133、 81902444)、広東自然科学基金(2020A1515010269、2020A15011367)、広州市民健康科学技術研究プロジェクト(201803010034、201903010072)、軍事医療イノベーションプロジェクト(170ZZ)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe x 2 | Hunan Pinan Medical Devices Technology | YA0551 | |
| 5 W heating pad | BiolinkOptics Technology | BL336 | |
| 75% absolute ethanol | Guangdong Guanghua Sci-Tech | 1.17113.023 | |
| Absorbent cotton ball | Healthy Sanitation Kingdom | ||
| Mouse surgical instrument | RWD Life Science | SP0001-G | Including scissors and tweezers |
| Multiphoton microscopy | Olympus | FV1200MPE | |
| Organ imaging fixture | BiolinkOptics Technology | BL336 | Including suction cup, hose, negative pressure pump and bracket |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | Sigma | R9379 | |
| Shaving machine | Lei Wa | RE-3201 | |
| Sodium pentobarbital | Sigma | P3761-25G |
References
- Wu, Z., et al. Multi-photon microscopy in cardiovascular research. Methods. 130, 79-89 (2017).
- Zhou, M., Ling, W., Luo, Y. Intrahepatic mass-forming cholangiocarcinoma growing in a giant hepatic hemangioma: A case report. Medicine (Baltimore). 98 (27), 16410 (2019).
- Werkmeister, E., et al. Multiphoton microscopy for blood vessel imaging: new non-invasive tools (Spectral SHG, FLIM). Clinical Hemorheology and Microcirculation. 37 (1-2), 77 (2007).
- Wang, H., et al. Does optical microangiography provide accurate imaging of capillary vessels?: validation using multiphoton microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (10), 1-5 (2014).
- Upputuri, P. K., Sivasubramanian, K., Mark, C. S., Pramanik, M. Recent developments in vascular imaging techniques in tissue engineering and regenerative medicine. Biomed Research International. 2015, 783983 (2015).
- Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. Journal of Microscopy. 243 (3), 221-226 (2011).
- Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys Journal. 75 (4), 2015-2024 (1998).
- Vogt, N. Chromatic multiphoton imaging of the whole brain. Nature Methods. 16 (6), 459 (2019).
- Bacskai, B. J., et al. Imaging of amyloid-β deposits in brains of living mice permits direct observation of clearance of plaques with immunotherapy. Nature Medicine. 7 (3), 369-372 (2001).
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385 (6612), 161-165 (1997).
- Liu, H., et al. In vivo Deep-Brain Structural and Hemodynamic Multiphoton Microscopy Enabled by Quantum Dots. Nano Letters. , (2019).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology. Methods. 128, 20-32 (2017).
- Shear, J. B. Peer Reviewed: Multiphoton-Excited Fluorescence in Bioanalytical Chemistry. Analytical Chemistry. 71 (17), 598-605 (1999).
- Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Yuan, X., et al. Characterization of the first fully human anti-TEM1 scFv in models of solid tumor imaging and immunotoxin-based therapy. Cancer Immunology & Immunotherapy. 66 (3), 367-378 (2017).
- Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Multiphoton microscopy in biological research. Current Opinion in Chemical Biology. 5 (5), 603-608 (2001).
