Summary
이 실험에서 마우스는 혈관을 얼룩지게 할 수있는 로다민 B 이소티오카네이트 -dextran과 꼬리 정맥에 주입됩니다. 간이 노출되고 고정된 후에, 간의 특정 부분은 다광 현미경 검사를 사용하여 살아있는 바디에 있는 깊은 조직을 관찰하기 위하여 선택될 수 있습니다.
Abstract
마우스 간 조직의 내트라바산 역학을 관찰하면 마우스 간의 조직 관련 질병에 대한 심층관찰 및 연구를 더욱 심층적인 관찰할 수 있습니다. 마우스는 혈관을 얼룩지게 할 수 있는 염료를 주입합니다. 생체 내에서 마우스 간을 관찰하기 위해, 그것은 노출되어 프레임에 고정된다. 간 조직에서 혈관의 2 차원 및 3 차원 이미지는 다광 현미경을 사용하여 수득된다. 선택한 사이트의 조직의 이미지는 장기적인 변화를 관찰하기 위해 지속적으로 획득됩니다. 간 조직에 있는 혈관의 동적 변경은 또한 관찰됩니다. 다광현미경검사는 깊은 조직 단면 또는 기관에서 세포 및 세포 기능을 관찰하는 방법입니다. 다광 현미경 검사는 조직 미세 구조에 감도를 가지며 생체 내에서 높은 공간 해상도에서 생물학적 조직의 이미징을 가능하게하여 조직의 생화학 적 정보를 캡처 할 수있는 기능을 제공합니다. 다광현미경검사는 간 일부를 관찰하는 데 사용되지만 간을 고정하여 이미지를 보다 안정적으로 만드는 것은 문제가 된다. 이 실험에서, 특수 진공 흡입 컵은 간을 고치고 현미경의 밑에 간보다 안정적인 심상을 얻기 위하여 이용됩니다. 또한, 이 방법은 염료로 이러한 물질을 표시하여 간에서 특정 물질의 동적 변화를 관찰하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
혈관은 인체의 다양한 장기 조직에 영양분을 제공하고 물질을 교환 할 수 있습니다. 동시에, 많은 사이토카인, 호르몬, 약물 및 세포는 또한 특정 위치로 혈관 수송을 통해 기능. 간 조직의 혈관 변화를 관찰하면 간 조직에서혈량의 분포와 물질의 운반을 이해하는 데 도움이 될 수 있으며, 특정 혈관 관련 질환의 분석을돕는다 1,2.
마우스에서 간 혈관을 관찰 하는 많은 방법이 있다. 그 중에서도 광학 현미경 검사법은 불투명혈관 조직3을관찰하는 데 많은 한계를 가지고 있다. 다광 현미경 검사는 비침습적 고해상도4를가진 살아있는 간의 혈관을 이미지하기 위하여 이용될 수 있습니다. 뿐만 아니라 혈관의 3 차원 이미지를 얻을 수 있습니다., 하지만 기술은 또한 그 안에 생물학적 효과를 관찰 하는 조직을 구성 하는 데 도움이 사용할 수 있습니다.; 더욱이, 전체 조직은 계산된 단층 촬영 및 자기 공명 화상 진찰5에서와같이 마이크로혈관만이 아니라 심영상될 수 있다.
다광 현미경 검사는 광독성6이적은 깊은 살아있는 조직에서 산란된 형광 신호를 효과적으로 검출하는 데 사용될 수 있다. 따라서 살아있는 조직의 활성을 보장할 수 있으며 손상의 양을 줄일 수 있습니다. 다광 현미경 검사는 공초점 현미경 검사법보다 더 나은 관통 전력을 가지고 있으며, 더 깊은 층을 관찰 할 수 있게7,독특한 3D 이미징을 제공합니다. 다광현미경검사는 이제 종종 이미징 두개골 신경8에 사용되며 살아있는 마우스9,10,11에서신경 역학의 연구로 확장되었다.
이 실험에서는 마우스 혈관의 형광 라벨링 후, 간은 프레임에 고정되고, 살아있는 간 조직에서 혈관의 역학은 다광산 현미경을 사용하여 볼 수 있다. 본 실험은 특정 물질을 표시하고, 다광현미경을 사용하여 조직 내의 위치를 관찰하고, 세포간 조직에서 세포 간 사건을 관찰하고, 광화학 적측정(12,13,14)을하고, 살아있는조직(15)내부의 물질 역학을 관찰하는 방법을 보여 준다. 예를 들어, 종양 내피 마커 1(TEM1)은 많은 고형 종양에서 혈관 및 기질상에 상응한 새로운 표면 마커로 확인되었으며, TEM1에 대한 단일 연쇄 가변 단편(scFv) 78을 표시한 다음, 다중광 현미경 검사법은 마우스 혈관진종 위치 및 종양16의평가에 사용될 수 있다.
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Protocol
모든 동물 관리 및 절차는 히스와 웰빙에 대한 중국 난팡 병원 정책에 따라했다 (응용 프로그램 번호: NFYY-2019-73).
1. 마우스 준비
- 마우스를 마취합니다.
- 주사기에 펜토바르비탈 나트륨(50 mg/kg)을 준비합니다.
- 마우스(8주된 남성 C57BL/6)를 왼손으로 잡아 배가 위를 향하고 머리가 꼬리보다 낮을 수 있도록 하십시오. 75%의 알코올로 복부 피부를 소독하십시오.
- 오른손에 주사기를 잡고, 3-5mm피부의 오른쪽에 바늘로 복부 흰색 선을 관통한다. 주사기 바늘과 피부가 45° 각도에 있는지 확인하고 펜토바르비탈을 복강에 천천히 주입하십시오. 면도 후 마우스 절개 부위 주변을 3번 번 소독하여 75%의 알코올과 클로르헤시딘 용액을 번갈아 사용합니다.
- 마취가 올바른 반사의 부족에 의해 성공적이었는지 확인하십시오.
- 로다민 B 이소토오카네이트-dextran을 카우달 정맥에 넣습니다.
- 10 mg/mL 로다민 B 이소토오카네이트-디엑스트라넨의 100 μL을 주사기에 준비한다.
- 마우스의 꼬리를 75%의 알코올로 닦으부습니다.
- 왼손으로 꼬리를 잡고, 정맥과 평행하게 바늘로 오른손에 주사기를 잡고, 100 μL 염료를 주입한다.
- 주입 후 면봉으로 출혈을 멈춥시다.
- 살균수로 젖은 거즈로 마우스의 복부 털을 담그고 면도기로 마우스의 복부를 면도하여 모피 방향으로 스트로크합니다. 면도 후 마우스 절개 부위 주변을 3번 번 소독하여 75%의 알코올과 클로르헤시딘 용액을 번갈아 사용합니다.
- 75%의 알코올로 가열 패드를 닦은 후, 가열 패드를 열고, 37 °C에서 체온을 유지하기 위해 가열 패드에 뒷면에 마우스를 배치합니다.
2. 신체 장기 이미징 프레임으로 마우스 간 고정
참고: 상업적인 기관 화상 진찰 프레임은 아직 풀어 놓이지 않았습니다.
- 깨끗한 흡입 컵을 고정 된 위치에 놓습니다.
- 장기 이미징기구(보조 도 1)를설치하고 가열 패드와 흡입 컵을 75% 알코올로 닦아냅니다.
- 진공 펌프 호스에 진공 패드 (직경 5mm)를 연결하고 진공 펌프를 켭니다.
- 75%의 알코올로 살균된 멸균 테이블에서 마우스 절개 부위 주변을 75%의 알코올과 클로레시딘 용액으로 3번 번 소독한 다음 마우스 절개 부위 주변을 75%의 알코올및 클로레시딘 용액으로 3배 번 소독한 다음 수술용 가위를 사용하여 간암의 2cm를 잘라냅니다.
- 마우스를 홀더 베이스에 가열 패드와 함께 놓습니다.
- 흡입 컵이 간을 보유할 수 있도록 장기 이미징 기구를 조정합니다. 그런 다음 흡입에 30-35 kPa의 음압을 사용하여 간이 흡입 컵(보충 도 2)에부착되도록합니다.
3. 다광레이저 스캐닝 현미경 조정
- 다광현미경을 켜고 60x/1.00 W 목표를 선택합니다.
- 목표 렌즈 아래에 프레임과 마우스를 고정합니다.
- 흡입 컵의 중심인 렌즈 전체를 덮을 수 있는 일반 식염수를 추가하고, 일반 식염수를 터치하기 위해 목표 렌즈를 조정합니다.
- 컴퓨터 아이콘을 두 번 클릭하여 레이저 소프트웨어를 켜고 스위치를 켭니다. 그런 다음 전원 버튼과 셔터를 3s로 누르고 누릅니다.
- 파장을 800 nm로 설정합니다.
- 컴퓨터를 사용하여 현미경 작동 소프트웨어를 시작합니다.
- 획득 설정의경우 레이저 800을설정합니다.
4. 다광레이저 스캐닝 현미경을 이용한 관찰
- 이미지 수집 제어를위해 형광 스위치를 클릭합니다.
- 방과 장비 조명이 꺼져 있는지 확인합니다. 소음 수준을 줄이려면 어두운 환경에서 현미경을 사용하십시오.
- 현미경의 라이트 패스 셔터를 엽니다.
- 형광 필터를 네 번째 기어로 회전시키고 광학 스위치의 두 레버를 당깁니다.
- 접안렌즈를 살펴보면, 거칠고 미세한 초점 준나선형을 사용하여 초점 거리를 조정하고 X/Y 축을 사용하여 시야를 조정하여 대상 영역을 찾습니다.
5. 다광 레이저 스캐닝 현미경
- 소프트웨어의 형광 스위치를 끄고 형광 필터를 두 번째 기어(두 번째 기어는 RXD1)로 전환하고 광학 스위치의 두 레버를 밀어 넣습니다.
- 포커스 ×2를 클릭하여 대상 영역을 미리 보고 획득 설정 및 이미지 수집 제어 매개 변수(이미지 해상도: 1024)를 조정합니다.
- 제어 + C를 누르고 고전압, 게인 및 오프셋을 조정합니다(소음 수준을 줄이기 위해).
- 미리보기를 중지하려면 중지를 클릭하고 XY 버튼을 클릭하여 두 차원으로 스캔하고 완료 후 저장합니다(그림1).
- 지역을 선택하고 깊이를클릭한 다음 미리 보기를 클릭하여 최종 세트를 선택하고 현미경 설정에서 집합을 시작합니다(혈관의 전체 필수 부분 참조). 3D 이미지를 스캔하고 완료 후 저장(그림 2).
- 지역을 선택하고 시간을클릭하고 다른 획득 설정 및 이미지 수집 제어 매개 변수를 조정합니다(단계 크기: 1 μm; 슬라이스: 10; 시간 스캔 번호: 40). 다른 슬라이스를 스캔하고 완료 후 저장하여 움직이는 이미지를 얻습니다(비디오 1).
참고 : 누군가가 스캔 중에 마우스를 돌보고 그에 따라 마취를 추가해야합니다. - 목 해부로 마우스를 희생합니다.
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Representative Results
간에서 혈관의 분포는 다광현미경검사를 사용하여 수득된 도 1에서볼 수 있다. 혈관은 트렁크에서 방출되는 복수의 가지로 나누어 주변 공간으로 분배된다. 혈관의 외주는 빨간색이며 내부 구멍은 어둡고 내부에는 많은 것들이 있습니다. 이미지가 명확해질수록 관측 평면에 가깝습니다. 염료가 주변 조직을 침투하여 다른 물질을 얼룩지게 하기 때문에 붉은 반점도 있습니다. 비디오 1에서는적혈구에서 움직이는 세포가 될 수 있는 비적색것들이 있습니다. 동영상이 끝나면 이러한 것들 중 일부가 어두워져 있습니다. 이것은 아마도 고정 된 간 시간이 지남에 잘 고정 되지 않은 때문에. 이 방법은 2 시간 동안 이미징을 허용합니다.
그림 1: 다광 현미경 검사의 밑에 간 조직에 있는 혈관. 혈관은 빨간색입니다. 2048년의 해상도와 512의 HV를 가진 혈관의 2차원 이미지는 염색 후 적혈구를 명확하게 이미지할 수 있다. 주위에 몇몇 빨간 반점이 있고, 염료는 또한 그밖 물질을 염색하기 위하여 주변 조직을 관통할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 같은 위치에서 살아있는 간 조직의 입체 이미지. 두께는 9 μm이며 혈관의 형태는 다른 각도에서 관찰되며 동적 이미지가 수집됩니다. 합성 후 혈관 (어두운)의 세포가 흐르는 것을 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 1: 바디 장기 화상 진찰 프레임. (a)가열 패드 : 마우스 체온을 유지합니다. (b)브래킷: 마우스와 조정 가능한 흡입컵 위치를 손잡이로 배치하는 베이스를 제공할 수 있습니다. (c)흡입 컵 : 브래킷에 의해 고정됩니다. 음압 펌프에 의해 제공되는 음압은 흡입 컵의 중심에 있는 투명 렌즈에 간을 흡착하게 합니다. (d)유연한 파이프 : 그것은 압력 펌프와 흡입 컵을 연결합니다. 압력 펌프는 흡입 컵에 부정적인 압력을 제공합니다. (e)원심분리기 튜브: 유연한 파이프 의 중간에 있는 원심분리기 튜브는 액체를 보유할 수 있으며, 이러한 액체가 진공 펌프로 빨려 들어가는 것을 방지할 수 있다. (f)음압 펌프: 유연한 파이프에 의해 흡입 컵에 연결되어 있습니다. 음압 펌프는 흡입 컵에 부정적인 압력을 제공하여 간이 렌즈에 달라 붙도록 할 수 있습니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보조 도 2: 투명 렌즈에 부착된 간클로즈업 이미지. 투명 렌즈는 흡입 컵의 중심에 있습니다. 펌프는 흡입 컵에 부정적인 압력을 제공하여 간을 빨아들이고 간이 투명 렌즈에 부착되도록합니다. 흡입 얼굴 간은 마우스에서 조금 떨어져 있기 때문에, 호흡의 효과와 유물에 심장 박동감소. 투명 렌즈는 다광광 현미경에 대한 안정적인 뷰를 제공할 수 있습니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
특정 살아있는 조직을 관찰하는 것은 조직 내부의 물질의 변화, 국소화 및 생물학적 효과를 이해하는 효과적인수단이다(17) 이 실험에서 중요한 단계는 호흡과 심장 박동으로 인한 운동 유물의 문제를 해결할 수있는 장기 이미징 기구로 간을 고정하고 관찰을위한 다광자 현미경을 사용하는 것입니다. 이 방법을 이용하여, 생체 내 간의 내부 조직은 다광 현미경을 통해 관찰되고, 혈관은 형광으로 표시되어 그들의 위치와 3차원 구조를 명확하게 관찰한다. 이 방법은 형광으로 물질을 라벨링하고 추가 시각화를 제공하기 위해 살아있는 조직에서 물질을 동적으로 따라가하여 특정 효과를 관찰하는 데 사용할 수 있습니다.
다광현미경검사는 조직화된 조직 환경에서 세포 이벤트에서 정보를 수집하기 위한 필수 도구가 되기 위해 새로운 기술에서 진화했습니다. 그러나, 기관은 특정 조직 및 장기를 관찰하는 데 효과적일 수 있도록 안정적인 이미지를 생성하기 위해 제자리에 고정되어야 한다. 호흡과 심장 박동에서 운동 유물직접 적으로 이미지되는 간을 방지 할 수 있습니다, 그래서 기관 기구가 사용, 이는 장기를 확보하고 이미지 흔들림을 방지하기 위해 진공 흡착의 원리를 사용합니다. 진공 척은 또한 바디 기관의 각종 을 고칠 수 있습니다. 그러나 적절한 음압이 사용되지 않거나 이미징 시간이 2h 를 초과하면 조직 파열의 위험이 있습니다.
다광현미경검사의 분해능은 공초점 현미경검사의 해상도보다 약간 적지만, 침투 깊이는 9-10 μm로 증가하여 조직 관찰, 세포 발생 및 물질적 효과를 위한 이미지의 제공을 가능하게 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 중국 국립 자연과학 재단(81772133)의 지원을 받았습니다. 8190244), 광동자연과학기금(2020A1515010269, 2020A1515011367), 광저우시민건강과학기술연구프로젝트(201803010034, 201903010072), 군사의료혁신사업(108X7).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe x 2 | Hunan Pinan Medical Devices Technology | YA0551 | |
| 5 W heating pad | BiolinkOptics Technology | BL336 | |
| 75% absolute ethanol | Guangdong Guanghua Sci-Tech | 1.17113.023 | |
| Absorbent cotton ball | Healthy Sanitation Kingdom | ||
| Mouse surgical instrument | RWD Life Science | SP0001-G | Including scissors and tweezers |
| Multiphoton microscopy | Olympus | FV1200MPE | |
| Organ imaging fixture | BiolinkOptics Technology | BL336 | Including suction cup, hose, negative pressure pump and bracket |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | Sigma | R9379 | |
| Shaving machine | Lei Wa | RE-3201 | |
| Sodium pentobarbital | Sigma | P3761-25G |
References
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