Summary
Neste experimento, um rato é injetado em sua veia traseira com isotocianato Rhodamine B-dextran que pode manchar vasos sanguíneos. Depois que o fígado é exposto e fixo, uma parte específica do fígado pode ser selecionada para observar o tecido profundo no corpo vivo usando microscopia multifotícula.
Abstract
Observar a dinâmica intravascular do tecido hepático do camundongo nos permite realizar observações e estudos mais aprofundados sobre doenças relacionadas ao tecido do fígado de camundongos. Um rato é injetado com um corante que pode manchar vasos sanguíneos. Para observar o fígado do rato in vivo, ele é exposto e fixado em uma moldura. Imagens bidimensionais dos vasos sanguíneos no tecido hepático são obtidas usando um microscópio multifotono. As imagens dos tecidos nos locais selecionados são adquiridas continuamente para observar alterações a longo prazo; as mudanças dinâmicas dos vasos sanguíneos nos tecidos hepáticos também são observadas. Microscopia multifotítica é um método para observar a função celular e celular em seções de tecido profundo ou órgãos. A microscopia multifotônica tem sensibilidade à microestrutura tecidual e permite a imagem de tecidos biológicos em alta resolução espacial in vivo, proporcionando a capacidade de capturar as informações bioquímicas da organização. A microscopia multifotônio é usada para observar parte do fígado, mas fixar o fígado para tornar a imagem mais estável é problemático. Neste experimento, uma ventosa especial é usada para consertar o fígado e obter uma imagem mais estável do fígado sob o microscópio. Além disso, este método pode ser usado para observar alterações dinâmicas de substâncias específicas no fígado, marcando tais substâncias com corantes.
Introduction
Os vasos sanguíneos podem fornecer nutrientes para vários tecidos de órgãos do corpo humano, e trocar substâncias. Ao mesmo tempo, muitas citocinas, hormônios, drogas e células também funcionam através do transporte vascular para locais específicos. Observar alterações vasculares no tecido hepático pode ajudar na compreensão do fluxo sanguíneo no tecido hepático e no transporte de substâncias, e auxiliar na análise de certas doenças vasculares1,2.
Há muitas maneiras de observar os vasos sanguíneos do fígado em camundongos. Entre elas, a microscopia óptica tem muitas limitações na observação do tecido vascular opaco3. A microscopia multifotúna pode ser usada para imaginar os vasos sanguíneos de fígados vivos com alta resolução não invasiva4. Não só podem ser obtidas imagens tridimensionais dos vasos sanguíneos, mas a técnica também pode ser usada para ajudar a organizar o tecido para observar efeitos biológicos; além disso, todo o tecido pode ser imageado em vez de apenas os microvexis como na tomografia computadorizada e ressonância magnética5.
A microscopia multifotônio pode ser usada para detectar efetivamente sinais fluorescentes dispersos em tecido vivo profundo, com menos fototoxicidade6. Portanto, a atividade do tecido vivo pode ser garantida, e a quantidade de dano pode ser reduzida. A microscopia multifotônio tem melhor poder penetrante do que a microscopia confocal, permitindo que camadas mais profundas sejam observadas7, fornecendo imagens 3D únicas. A microscopia multifotônio é agora frequentemente usada na imagem dos nervos cranianos8 e foi estendida ao estudo da dinâmica neuronal em camundongos vivos9,10,11.
Neste experimento, após a rotulagem fluorescente dos vasos sanguíneos do rato, o fígado é fixado em uma estrutura, e a dinâmica dos vasos sanguíneos no tecido hepático vivo pode ser vista usando microscopia multifotítica. Este experimento demonstra como marcar substâncias específicas, usar microscopia multifotônica para ajudar a observar um local dentro do tecido, observar eventos celulares no tecido intercelular, fazer medições fotoquímicas12,13,14, e observar a dinâmica material dentro do tecido vivo15. Por exemplo, o marcador endotelial tumoral 1 (TEM1) foi identificado como um novo marcador de superfície regulado nos vasos sanguíneos e estroma em muitos tumores sólidos, marcando fragmento variável de cadeia única (scFv) 78 contra TEM1, e então microscopia multifotona pode ser usada para localização de hemangioma de camundongos e avaliação de tumores16.
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Protocol
Todos os cuidados e procedimentos de animais estavam de acordo com as políticas do Hospital China Nanfang para saúde e bem-estar (aplicação NFYY-2019-73).
1. Preparação do rato
- Anestesiar o rato.
- Prepare pentobarbital de sódio (50 mg/kg) em uma seringa.
- Pegue o mouse (C57BL/6 masculino de 8 semanas de idade) com a mão esquerda para que sua barriga esteja virada para cima e sua cabeça fique mais baixa que sua cauda. Desinfete a pele abdominal com 75% de álcool.
- Segurando a seringa na mão direita, fure a linha branca do abdômen com a agulha ligeiramente para o lado direito da pele por 3-5 mm. Certifique-se de que a agulha da seringa e a pele estão em um ângulo de 45°, injete o pentobarbital lentamente na cavidade abdominal. Após a barba, desinfeta ao redor do local de incisão do rato 3 vezes alternadamente com 75% de álcool e solução de clorexidina.
- Verifique se a anestesia foi bem sucedida pela falta de um reflexo de direito.
- Injete isothiocyanato-dextran de Rhodamine B na veia caudal.
- Prepare 100 μL de 10 mg/mL Rhodamine B isothiocyanato-dextran em uma seringa.
- Limpe a cauda do rato com 75% de álcool.
- Segure a cauda com a mão esquerda, segure a seringa na mão direita com a agulha paralela à veia e injete o corante de 100 μL.
- Pare o sangramento com um cotonete depois da injeção.
- Mergulhe a pele abdominal do rato com gaze molhada com água estéril, e raspe o abdômen do rato usando uma navalha, fazendo traços na direção da pele. Após a barba, desinfeta ao redor do local de incisão do rato 3 vezes alternadamente com 75% de álcool e solução de clorexidina.
- Depois de limpar uma almofada de aquecimento com 75% de álcool, abra a almofada de aquecimento e coloque o mouse de costas na almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal a 37 °C.
2. Fixação do fígado do rato com a estrutura de imagem do órgão corporal
NOTA: O quadro de imagem do órgão comercial ainda não foi divulgado.
- Coloque uma ventosa limpa em uma posição fixa.
- Instale uma luminária de imagem de órgão(Figura Suplementar 1) e limpe a almofada de aquecimento e a ventosa com 75% de álcool.
- Conecte a ventosa (5 mm de diâmetro) à mangueira da bomba de vácuo e ligue a bomba de vácuo.
- Em uma mesa estéril esterilizada com 75% de álcool, desinfeta ao redor do local de incisão do camundongo 3 vezes alternadamente com 75% de álcool e solução de clorexidina, em seguida, desinfeta ao redor do local de incisão do rato 3 vezes alternadamente com 75% de álcool e solução de clorexidina, em seguida, usar tesoura cirúrgica para cortar 2 cm de pele da borda severa inferior do rato e expor o fígado.
- Coloque o mouse junto com a almofada de aquecimento na base do suporte.
- Ajuste a luminária de imagem do órgão para que a ventosa segure o fígado. Em seguida, use uma pressão negativa de 30-35 kPa para sucção para que o fígado se anexe ao copo de sucção(Figura Suplementar 2).
3. Ajustando o microscópio de varredura a laser multifotônio
- Ligue o microscópio multifotono e selecione o objetivo de 60x/1.00 W.
- Fixar o quadro e o mouse sob a lente objetiva.
- Adicione uma gota de soro fisiológico normal que pode cobrir toda a lente, que é o centro da ventosa, e ajustar a lente objetiva para apenas tocar o soro fisiológico normal.
- Clique duas vezes no ícone do computador para ativar o software laser e ativar o interruptor. Em seguida, pressione e segure o botão de alimentação e o obturador por 3 s.
- Defina o comprimento de onda para 800 nm.
- Inicie o software operacional do microscópio usando o computador.
- Para a Configuração de Aquisição,ajuste Laser 800.
4. Observação usando microscópio de varredura a laser multifotônio
- Para controle de aquisição deimagens, clique no interruptor fluorescente.
- Certifique-se de que as luzes da sala e do equipamento estão desligadas. Para reduzir os níveis de ruído, use o microscópio em um ambiente escurecido.
- Abra o obturador do caminho de luz no microscópio.
- Gire o filtro de fluorescência para a quarta marcha e puxe as duas alavancas do interruptor óptico.
- Olhando através da ocular, use os quasispirals de foco grosseiro e fino para ajustar a distância focal, e use os eixosX/Y para ajustar o campo de visão para encontrar a área alvo.
5. Micrografia de varredura a laser multifotônio
- Desligue o interruptor fluorescente no software, troque o filtro fluorescente para a segunda marcha (a segunda marcha é RXD1) e empurre as duas alavancas do interruptor óptico.
- Clique em Focus ×2 para visualizar a área de destino e ajustar a configuração de aquisição e os parâmetros de controle de aquisição de imagens (resolução de imagem: 1024).
- Pressione o controle + C e ajuste a alta tensão, ganho e deslocamento (para reduzir os níveis de ruído).
- Clique em Parar para interromper a visualização, clique no botão XY para digitalizar em duas dimensões e salvar após a conclusão(Figura 1).
- Selecione uma região, clique em Profundidadee, em seguida, visualize para selecionar o conjunto final e o conjunto de início (veja a parte completa necessária do vaso sanguíneo) na configuração do microscópio. Digitalize imagens 3D e salve após a conclusão(Figura 2).
- Selecione uma região, clique em Timee ajuste outros parâmetros de configuração de aquisição e controle de aquisição de imagens (Tamanho da etapa: 1 μm; Fatias: 10; Número de varredura de tempo: 40). Digitalize diferentes fatias e salve após a conclusão para obter imagens em movimento(Vídeo 1).
NOTA: Tenha alguém cuidando dos ratos durante o exame e adicione anestesia em conformidade. - Sacrifique o rato por dissecção do pescoço.
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Representative Results
A distribuição dos vasos sanguíneos no fígado pode ser vista na Figura 1,obtida por meio de microscopia multifotona. O vaso sanguíneo é dividido em uma pluralidade de ramos emanando de um tronco e distribuídos para o espaço circundante. A circunferência externa do vaso sanguíneo é vermelha, a cavidade interna é escura, e há muitas coisas dentro. Quanto mais clara a imagem, mais perto do plano de observação ela é. Há também algumas manchas vermelhas ao redor, provavelmente porque o corante penetra no tecido circundante para manchar outras substâncias. No Vídeo 1,há coisas não vermelhas que podem ser células se movendo nos vasos sanguíneos vermelhos. No final do vídeo, algumas dessas coisas são escurecidas. Isso é provavelmente porque o fígado fixo não foi bem consertado ao longo do tempo. Este método permitirá imagens por 2 horas.
Figura 1: Os vasos sanguíneos do tecido hepático sob microscopia multifotúna. Os vasos sanguíneos estão vermelhos. Uma imagem bidimensional do vaso sanguíneo com resolução de 2048 e um HV de 512, pode claramente imaginar os vasos sanguíneos vermelhos após a coloração. Há também algumas manchas vermelhas ao redor, e o corante também pode penetrar no tecido circundante para tingir outras substâncias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagem tridimensional do tecido hepático vivo na mesma posição. A espessura é de 9 μm, a morfologia dos vasos sanguíneos é observada de diferentes ângulos, e imagens dinâmicas são coletadas. Após a síntese, as células dos vasos sanguíneos (escuros) são vistas fluindo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Estrutura de imagem de órgãos corporais. (a) Almofada de aquecimento: Mantém a temperatura corporal do mouse. (b) Suporte: Pode fornecer uma base para colocar o mouse e a posição da ventosa ajustável com botões. (c) Copo de sucção: É fixado pelo suporte. A pressão negativa fornecida pela bomba de pressão negativa faz com que o fígado adsorb para a lente transparente no centro do copo de sucção. (d) Tubo flexível: Conecta a ventosa com a bomba de pressão. A bomba de pressão fornece pressão negativa para o copo de sucção. (e) Tubo de centrífuga: O tubo de centrífuga no meio do tubo flexível pode segurar o líquido, para evitar que esses líquidos sejam sugados para dentro da bomba de vácuo. (f) Bomba de pressão negativa: Está conectada à ventosa pelo tubo flexível. A bomba de pressão negativa pode fornecer pressão negativa ao copo de sucção para fazer o fígado grudar na lente. Clique aqui para baixar este número.
Figura suplementar 2: Uma imagem de close-up do fígado presa à lente transparente. A lente transparente está no centro da ventosa. A bomba fornece pressão negativa ao copo de sucção para fazê-lo sugar o fígado e o fígado é preso à lente transparente. Como o fígado com cara de sucção está um pouco longe do rato, o efeito da respiração e dos batimentos cardíacos nos artefatos é reduzido. A lente transparente pode fornecer uma visão estável para o microscópio multifotono. Clique aqui para baixar este número.
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Discussion
Observar um tecido vivo específico é um meio eficaz de compreender as mudanças, localização e efeitos biológicos do material dentro do tecido17. Neste experimento, os passos importantes são a fixação do fígado com uma fixação de imagem de órgão, que pode resolver o problema dos artefatos de movimento devido à respiração e batimentos cardíacos, e o uso de um microscópio multifotônio para observação. Usando este método, os tecidos internos do fígado in vivo são observados através de um microscópio multifotônio, e os vasos sanguíneos são rotulados fluorescentemente para observar claramente sua posição e estrutura tridimensional. Este método pode ser usado para observar efeitos específicos rotulando fluorescentemente uma substância e seguindo dinamicamente a substância no tecido vivo para fornecer visualizações adicionais.
A microscopia multifotual evoluiu de ser uma nova técnica para se tornar uma ferramenta indispensável para coletar informações de eventos celulares em um ambiente de tecido organizado. No entanto, o órgão deve ser fixado no lugar para produzir uma imagem estável para que o método possa ser eficaz na observação de certos tecidos e órgãos. Artefatos de movimento da respiração e dos batimentos cardíacos podem impedir que o fígado seja diretamente imageado, de modo que uma fixação de órgão corporal é usada, que usa o princípio da adsorção a vácuo para proteger o órgão e evitar o shake de imagem. O mandril a vácuo também pode consertar uma variedade de órgãos do corpo. No entanto, há o risco de ruptura tecidual se a pressão negativa apropriada não for usada ou o tempo de imagem se estender além de 2h.
Embora a resolução da microscopia multifotona seja ligeiramente menor que a da microscopia confocal, a profundidade de penetração é aumentada para 9-10 μm, permitindo o fornecimento de imagens para observação mais profunda do tecido, eventos celulares e efeitos materiais.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (81772133, 81902444), o Fundo de Ciência Natural de Guangdong (2020A1515010269, 2020A1515011367), o Projeto de Pesquisa em Ciência e Tecnologia em Saúde Cidadã de Guangzhou (201803010034, 201903010072) e o Projeto de Inovação Médica Militar (17CXZ008).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe x 2 | Hunan Pinan Medical Devices Technology | YA0551 | |
| 5 W heating pad | BiolinkOptics Technology | BL336 | |
| 75% absolute ethanol | Guangdong Guanghua Sci-Tech | 1.17113.023 | |
| Absorbent cotton ball | Healthy Sanitation Kingdom | ||
| Mouse surgical instrument | RWD Life Science | SP0001-G | Including scissors and tweezers |
| Multiphoton microscopy | Olympus | FV1200MPE | |
| Organ imaging fixture | BiolinkOptics Technology | BL336 | Including suction cup, hose, negative pressure pump and bracket |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | Sigma | R9379 | |
| Shaving machine | Lei Wa | RE-3201 | |
| Sodium pentobarbital | Sigma | P3761-25G |
References
- Wu, Z., et al. Multi-photon microscopy in cardiovascular research. Methods. 130, 79-89 (2017).
- Zhou, M., Ling, W., Luo, Y. Intrahepatic mass-forming cholangiocarcinoma growing in a giant hepatic hemangioma: A case report. Medicine (Baltimore). 98 (27), 16410 (2019).
- Werkmeister, E., et al. Multiphoton microscopy for blood vessel imaging: new non-invasive tools (Spectral SHG, FLIM). Clinical Hemorheology and Microcirculation. 37 (1-2), 77 (2007).
- Wang, H., et al. Does optical microangiography provide accurate imaging of capillary vessels?: validation using multiphoton microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (10), 1-5 (2014).
- Upputuri, P. K., Sivasubramanian, K., Mark, C. S., Pramanik, M. Recent developments in vascular imaging techniques in tissue engineering and regenerative medicine. Biomed Research International. 2015, 783983 (2015).
- Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. Journal of Microscopy. 243 (3), 221-226 (2011).
- Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys Journal. 75 (4), 2015-2024 (1998).
- Vogt, N. Chromatic multiphoton imaging of the whole brain. Nature Methods. 16 (6), 459 (2019).
- Bacskai, B. J., et al. Imaging of amyloid-β deposits in brains of living mice permits direct observation of clearance of plaques with immunotherapy. Nature Medicine. 7 (3), 369-372 (2001).
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385 (6612), 161-165 (1997).
- Liu, H., et al. In vivo Deep-Brain Structural and Hemodynamic Multiphoton Microscopy Enabled by Quantum Dots. Nano Letters. , (2019).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology. Methods. 128, 20-32 (2017).
- Shear, J. B. Peer Reviewed: Multiphoton-Excited Fluorescence in Bioanalytical Chemistry. Analytical Chemistry. 71 (17), 598-605 (1999).
- Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Yuan, X., et al. Characterization of the first fully human anti-TEM1 scFv in models of solid tumor imaging and immunotoxin-based therapy. Cancer Immunology & Immunotherapy. 66 (3), 367-378 (2017).
- Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Multiphoton microscopy in biological research. Current Opinion in Chemical Biology. 5 (5), 603-608 (2001).
