Summary
В этом эксперименте, мышь вводится в его хвостовой вены с родамин B изотиоцианат-декстран, который может испачкать кровеносные сосуды. После того, как печень подвергается воздействию и фиксированной, определенная часть печени может быть выбран для наблюдения глубоких тканей в живом теле с помощью мультифотонной микроскопии.
Abstract
Наблюдение за внутрисосудистой динамикой тканей печени мыши позволяет проводить дальнейшие углубленные наблюдения и исследования заболеваний печени мыши, связанных с тканями. Мышь вводится с красителем, который может окрашивать кровеносные сосуды. Для наблюдения мыши печени in vivo, он подвергается и фиксируется в кадре. Двух- и трехмерные изображения кровеносных сосудов в тканях печени получены с помощью многофотонного микроскопа. Изображения тканей на выбранных участках постоянно приобретаются для наблюдения за долгосрочными изменениями; также наблюдаются динамические изменения кровеносных сосудов в тканях печени. Мультифотонная микроскопия является методом наблюдения за клеточной и клеточной функцией в глубоких секциях тканей или органах. Мультифотонная микроскопия имеет чувствительность к микроструктуре тканей и позволяет осуществлять визуализацию биологических тканей с высоким пространственным разрешением in vivo, обеспечивая возможность захвата биохимической информации организации. Мультифотонная микроскопия используется для наблюдения части печени, но фиксация печени, чтобы сделать изображение более стабильным является проблематичным. В этом эксперименте используется специальная вакуумная присоска для фиксации печени и получения более стабильного изображения печени под микроскопом. Кроме того, этот метод можно использовать для наблюдения за динамическими изменениями специфических веществ в печени путем маркировки таких веществ красителями.
Introduction
Кровеносные сосуды могут обеспечить питательными веществами различные органные ткани человеческого организма, а также обмениваться веществами. В то же время, многие цитокины, гормоны, наркотики и клетки также функционируют через сосудистый транспорт в определенные места. Наблюдение за сосудистыми изменениями в тканях печени может помочь в понимании распределения кровотока в тканях печени и транспортировки веществ, а также помочь в анализе некоторых сосудистыхзаболеваний 1,2.
Есть много способов наблюдать кровеносные сосуды печени у мышей. Среди них оптическая микроскопия имеет много ограничений в наблюдении непрозрачной сосудистой ткани3. Мультифотонная микроскопия может быть использована для изображения кровеносных сосудов живой печени с неинвазивным высоким разрешением4. Не только трехмерные изображения кровеносных сосудов могут быть получены, но метод также может быть использован, чтобы помочь организовать ткани для наблюдения биологического воздействия в нем; кроме того, вся ткань может быть изображена, а не только микровесселей, как в компьютерной томографии и магнитно-резонанснойтомографии 5.
Мультифотонная микроскопия может быть использована для эффективного обнаружения рассеянных флуоресцентных сигналов в глубокой живой ткани, с меньшейфототоксичности 6. Таким образом, активность живой ткани может быть обеспечена, и сумма ущерба может быть уменьшена. Мультифотонная микроскопия имеет лучшую проникающую силу, чем конфокальные микроскопии, что позволяет болееглубокие слои, которые будут наблюдаться 7, обеспечивая уникальную 3D-изображения. Мультифотонная микроскопия в настоящее время часто используется в визуализациичерепных нервов 8 и была распространена на изучение нейрональной динамики уживых мышей 9,10,11.
В этом эксперименте, после флуоресцентной маркировки кровеносных сосудов мыши, печень фиксируется в раме, а динамику кровеносных сосудов в живой ткани печени можно увидеть с помощью мультифотонной микроскопии. Этот эксперимент демонстрирует, как маркировать конкретные вещества, использовать мультифотонную микроскопию, чтобы помочь наблюдать расположение в ткани, наблюдать клеточные события в межклеточной ткани, делатьфотохимические измерения 12,13,14, и наблюдать за динамикой материала внутри живойткани 15. Например, эндотелиальный маркер опухоли 1 (TEM1) был определен как новый маркер поверхности, регулируемый на кровеносных сосудах и строме во многих твердых опухолях, отмечая одноко цепной переменный фрагмент (scFv) 78 против TEM1, а затем мультифотонную микроскопию можно использовать для расположения гемангиомы мышии оценки опухолей 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все уход за животными и процедуры были в соответствии с политикой Больницы Нанфанг Китая для здоровья и благополучия (применение No: NFYY-2019-73).
1. Подготовка мыши
- Обезботь мышь.
- Приготовьте пентобарбитал натрия (50 мг/кг) в шприце.
- Возьмите мышь (8-недельный самец C57BL/6) левой рукой, чтобы ее живот обращен вверх, а голова ниже хвоста. Дезинфицировать брюшную кожу 75% алкоголем.
- Держа шприц в правой руке, проколоть белую линию живота с помощью иглы слегка в правую сторону кожи на 3-5 мм. Убедитесь, что шприц иглы и кожи находятся под углом 45 ",, вводить пентобарбитал медленно в брюшной полости. После бритья, дезинфицирует вокруг места разреза мыши 3 раза поочередно с 75% алкоголя и хлоргексидина раствора.
- Проверьте, была ли анестезия успешной из-за отсутствия правильного рефлекса.
- Ввиший родамин Б изотиоцианат-декстран в каудальную вену.
- Приготовьте 100 л 10 мг/мл родамина B изотиоцианата-декстрана в шприце.
- Протрите хвост мыши 75% алкоголя.
- Держите хвост левой рукой, держите шприц в правой руке иглой параллельно вене и ввишать краситель 100 МЛ.
- Остановите кровотечение с помощью ватным тампоном после инъекции.
- Замочите мех мыши в брюшной полости марлей, смоченной стерильной водой, и побрить живот мыши с помощью бритвы, делая удары в направлении меха. После бритья, дезинфицирует вокруг места разреза мыши 3 раза поочередно с 75% алкоголя и хлоргексидина раствора.
- После вытирания грелки с 75% алкоголя, откройте грелку, и поместите мышь на спину в грелку для поддержания температуры тела на 37 градусов по Цельсию.
2. Фиксация печени мыши с рамкой изображения органов тела
ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерческая рамка для визуализации органов еще не выпущена.
- Поместите чистую присоску в фиксированное положение.
- Установите прибор для визуализации органов(дополнительный рисунок 1)и протрите грелку и присоску с 75% алкоголя.
- Подключите присоску (диаметр 5 мм) к шлангу вакуумного насоса и включите вакуумный насос.
- На стерильном столе стерилизованы с 75% алкоголя, дезинфицирует вокруг места разреза мыши 3 раза поочередно с 75% алкоголя и хлоргексидина раствор, затем дезинфицирует вокруг места разреза мыши 3 раза поочередно с 75% алкоголя и хлоргексидина раствор, а затем использовать хирургические ножницы, чтобы отрезать 2 см кожи от нижней кормовой границы мыши и подвергать печени.
- Поместите мышь вместе с грелкой на основание держателя.
- Отрегулируйте приспособление изображения органа так, что чашка всасывания держит печеночную. Затем используйте отрицательное давление 30-35 кПа для всасывания так, чтобы печень прикрепляется к присоске(дополнительный рисунок 2).
3. Корректировка многофотонного лазерного сканирующего микроскопа
- Включите мультифотонный микроскоп и выберите цель 60x/1.00 W.
- Зафиксим рамку и мышь под объективом.
- Добавьте каплю нормального солевого раствора, который может покрыть весь хрусталик, который является центром присоски, и настроить объектив цели, чтобы просто коснуться нормального солевого раствора.
- Дважды нажмите на значок компьютера, чтобы включить лазерное программное обеспечение и включить переключатель. Затем нажмите и удерживайте кнопку питания и затвор в течение 3 с.
- Установите длину волны до 800 нм.
- Запустите микроскоп операционного программного обеспечения с помощью компьютера.
- Для настройки приобретения,установить лазер 800.
4. Наблюдение с помощью мультифотонного лазерного сканирующего микроскопа
- Для управления приобретением изображенийнажмите на флуоресцентный переключатель.
- Убедитесь, что комната и оборудование свет выключен. Чтобы снизить уровень шума, используйте микроскоп в затемненной среде.
- Откройте затвор световой дорожки на микроскопе.
- Поверните фильтр флуоресценции на четвертую передачу и потяните два рычага оптического переключателя.
- Просматривая окуляр, используйте грубые и тонкие фокусировочные квазиспиралы для регулировки фокусного длины и используйте осиX/Y для регулировки поля зрения, чтобы найти целевую область.
5. Мультифотонная лазерная сканирующая микрография
- Выключите флуоресцентный переключатель программного обеспечения, переключите флуоресцентный фильтр на вторую передачу (вторая передача RXD1) и нажмите два рычага оптического переключателя.
- Нажмите на Focus ×2, чтобы просмотреть целевую область и настроить параметры управления приобретением и приобретением изображений (разрешение изображения: 1024).
- Управление прессой и C и регулировка высокого напряжения, усиления и смещения (для снижения уровня шума).
- Нажмите Остановить, чтобы остановить предварительный просмотр, нажмите кнопку XY для сканирования в двух измерениях, и сохранить после завершения(рисунок 1).
- Выберите область, нажмите на Глубину,а затем предварительный просмотр, чтобы выбрать набор конца и начать набор (см. полную требуемую часть кровеносных сосудов) в настройках микроскопа. Сканирование 3D изображений и сохранить после завершения(рисунок 2).
- Выберите регион, нажмите на Timeи отрегулируйте другие параметры управления приобретением и изображением (Step Size: 1 мкм; Ломтики: 10; Номер сканирования времени: 40). Сканирование различных срезов и сохранить после завершения, чтобы получить движущиеся изображения (Видео 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Есть кто-то заботиться о мышах во время сканирования и добавить анестезии соответственно. - Пожертвуй мышью путем вскрытия шеи.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Распределение кровеносных сосудов в печени можно увидеть на рисунке 1, полученномс помощью мультифотонной микроскопии. Кровеносный сосуд делится на множество ветвей, исходящих из ствола и распределенных по окружающему пространству. Внешняя окружность кровеносных сосудов красная, внутренняя полость темная, и внутри много вещей. Чем яснее изображение, тем ближе к плоскости наблюдения оно. Есть также некоторые красные пятна вокруг, вероятно, потому, что краситель проникает в окружающие ткани, чтобы испачкать другие вещества. В видео 1, Есть некрасные вещи, которые могут быть клетки, движущиеся в красных кровеносных сосудах. В конце видео, некоторые из этих вещей затемнены. Это, вероятно, потому, что фиксированная печень не была исправлена хорошо с течением времени. Этот метод позволит изображения в течение 2 часов.
Рисунок 1: Кровеносные сосуды в тканях печени под мультифотонной микроскопией. Кровеносные сосуды красные. Двумерное изображение кровеносных сосудов с разрешением 2048 года и HV 512, может четко изображение красных кровеносных сосудов после окрашивания. Есть также некоторые красные пятна вокруг, и краситель может также проникать в окружающие ткани, чтобы покрасить другие вещества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Трехмерное изображение живой ткани печени в том же положении. Толщина составляет 9 мкм, морфология кровеносных сосудов наблюдается под разными углами, собираются динамические изображения. После синтеза, клетки в кровеносных сосудах (темные) видны течет. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная цифра 1: Кадр для визуализации органов тела. (a) Нагревательный блокнот: Он поддерживает температуру тела мыши. b)кронштейн: Он может обеспечить основание для того чтобы поместить мышь и регулируемое положение чашки всасывания с ручками. c)Присоска: Она фиксируется кронштейном. Отрицательное давление, оказываемое отрицательным давлением насоса вызывает печень адсорб к прозрачной линзы в центре присоски. d) Гибкая труба: она соединяет присоску с насосом давления. Насос давления обеспечивает отрицательное давление на присоску. e)Центрифуга трубки: центрифуга трубки в середине гибкой трубы может держать жидкость, чтобы предотвратить эти жидкости от всасывается в вакуумный насос. f)Отрицательный насос давления: он подключен к присоске гибкой трубой. Отрицательное давление насос может обеспечить негативное давление на присоску, чтобы печень цепляться за объектив. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнительная цифра 2: крупным планом изображение печени прилагается к прозрачной линзы. Прозрачный объектив находится в центре присоски. Насос обеспечивает отрицательное давление на присоску, чтобы сделать его сосать печень и печень прилагается к прозрачной линзы. Поскольку всасывающая печень немного от мыши, эффект дыхания и сердцебиение на артефакты уменьшается. Прозрачный объектив может обеспечить стабильный обзор для мультифотонного микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наблюдение за конкретной живой ткани является эффективным средством понимания изменений, локализации и биологического воздействия материала внутриткани 17. В этом эксперименте важными шагами являются фиксация печени с помощью прибора для визуализации органов, который может решить проблему движения артефактов из-за дыхания и сердцебиения, а также использование многофотонного микроскопа для наблюдения. Используя этот метод, внутренние ткани печени in vivo наблюдаются через мультифотонный микроскоп, а кровеносные сосуды флуоресцентно помечены, чтобы четко наблюдать их положение и трехмерную структуру. Этот метод может быть использован для наблюдения за конкретными эффектами флуоресцентно маркировки вещества и динамически следующие вещества в живой ткани, чтобы обеспечить дальнейшую визуализацию.
Мультифотонная микроскопия превратилась из нового метода в незаменимый инструмент для сбора информации о клеточных событиях в организованной среде тканей. Тем не менее, орган должен быть установлен на месте, чтобы произвести стабильный образ, так что метод может быть эффективным в наблюдении определенных тканей и органов. Движение артефактов от дыхания и сердцебиение может предотвратить печень от непосредственного изображения, так что орган тела приспособление используется, который использует принцип вакуумного adorption для обеспечения органа и предотвращения изображения встряхнуть. Вакуумный патрон может также исправить различные органы тела. Тем не менее, существует риск разрыва тканей, если соответствующее отрицательное давление не используется или время визуализации выходит за рамки 2 ч.
Хотя разрешение мультифотонной микроскопии немного меньше, чем у конфокальных микроскопии, глубина проникновения увеличивается до 9-10 мкм, что позволяет предоставление изображений для более глубокого наблюдения тканей, клеточных событий и материальных эффектов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81772133, 81902444), Гуандун природных наук фонда (2020A1515010269, 2020A1515011367), Гуанчжоу гражданина науки и техники научно-исследовательский проект (201803010034, 201903010072), и военно-медицинский инновационный проект (17CX-008).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe x 2 | Hunan Pinan Medical Devices Technology | YA0551 | |
| 5 W heating pad | BiolinkOptics Technology | BL336 | |
| 75% absolute ethanol | Guangdong Guanghua Sci-Tech | 1.17113.023 | |
| Absorbent cotton ball | Healthy Sanitation Kingdom | ||
| Mouse surgical instrument | RWD Life Science | SP0001-G | Including scissors and tweezers |
| Multiphoton microscopy | Olympus | FV1200MPE | |
| Organ imaging fixture | BiolinkOptics Technology | BL336 | Including suction cup, hose, negative pressure pump and bracket |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | Sigma | R9379 | |
| Shaving machine | Lei Wa | RE-3201 | |
| Sodium pentobarbital | Sigma | P3761-25G |
References
- Wu, Z., et al. Multi-photon microscopy in cardiovascular research. Methods. 130, 79-89 (2017).
- Zhou, M., Ling, W., Luo, Y. Intrahepatic mass-forming cholangiocarcinoma growing in a giant hepatic hemangioma: A case report. Medicine (Baltimore). 98 (27), 16410 (2019).
- Werkmeister, E., et al. Multiphoton microscopy for blood vessel imaging: new non-invasive tools (Spectral SHG, FLIM). Clinical Hemorheology and Microcirculation. 37 (1-2), 77 (2007).
- Wang, H., et al. Does optical microangiography provide accurate imaging of capillary vessels?: validation using multiphoton microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (10), 1-5 (2014).
- Upputuri, P. K., Sivasubramanian, K., Mark, C. S., Pramanik, M. Recent developments in vascular imaging techniques in tissue engineering and regenerative medicine. Biomed Research International. 2015, 783983 (2015).
- Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. Journal of Microscopy. 243 (3), 221-226 (2011).
- Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys Journal. 75 (4), 2015-2024 (1998).
- Vogt, N. Chromatic multiphoton imaging of the whole brain. Nature Methods. 16 (6), 459 (2019).
- Bacskai, B. J., et al. Imaging of amyloid-β deposits in brains of living mice permits direct observation of clearance of plaques with immunotherapy. Nature Medicine. 7 (3), 369-372 (2001).
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385 (6612), 161-165 (1997).
- Liu, H., et al. In vivo Deep-Brain Structural and Hemodynamic Multiphoton Microscopy Enabled by Quantum Dots. Nano Letters. , (2019).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology. Methods. 128, 20-32 (2017).
- Shear, J. B. Peer Reviewed: Multiphoton-Excited Fluorescence in Bioanalytical Chemistry. Analytical Chemistry. 71 (17), 598-605 (1999).
- Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Yuan, X., et al. Characterization of the first fully human anti-TEM1 scFv in models of solid tumor imaging and immunotoxin-based therapy. Cancer Immunology & Immunotherapy. 66 (3), 367-378 (2017).
- Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Multiphoton microscopy in biological research. Current Opinion in Chemical Biology. 5 (5), 603-608 (2001).
