Summary
En este experimento, un ratón se inyecta en su vena trasera con isoticianato-dextrano Rhodamine B que puede manchar los vasos sanguíneos. Después de que el hígado está expuesto y fijo, una parte específica del hígado se puede seleccionar para observar el tejido profundo en el cuerpo vivo utilizando microscopía multifotónica.
Abstract
Observar la dinámica intravascular del tejido hepático del ratón nos permite realizar observaciones y estudios más profundos sobre las enfermedades relacionadas con los tejidos del hígado del ratón. Un ratón se inyecta con un tinte que puede manchar los vasos sanguíneos. Para observar el hígado del ratón in vivo, se expone y fija en un marco. Las imágenes bidimensionales y tridimensionales de los vasos sanguíneos del tejido hepático se obtienen utilizando un microscopio multifotófonos. Las imágenes de los tejidos en los sitios seleccionados se adquieren continuamente para observar cambios a largo plazo; también se observan los cambios dinámicos de los vasos sanguíneos en los tejidos hepáticos. La microscopía multifotónica es un método para observar la función celular y celular en secciones u órganos de tejido profundo. La microscopía multifotónica tiene sensibilidad a la microestructura tisular y permite la toma de imágenes de tejidos biológicos a alta resolución espacial in vivo, proporcionando la capacidad de capturar la información bioquímica de la organización. Microscopía multifoto se utiliza para observar parte del hígado, pero arreglar el hígado para hacer la imagen más estable es problemático. En este experimento, se utiliza una ventosa de vacío especial para arreglar el hígado y obtener una imagen más estable del hígado bajo el microscopio. Además, este método se puede utilizar para observar cambios dinámicos de sustancias específicas en el hígado marcando tales sustancias con colorantes.
Introduction
Los vasos sanguíneos pueden proporcionar nutrientes para varios tejidos de órganos del cuerpo humano, e intercambiar sustancias. Al mismo tiempo, muchas citoquinas, hormonas, medicamentos y células también funcionan a través del transporte vascular a lugares específicos. Observar los cambios vasculares en el tejido hepático puede ayudar a entender la distribución del flujo sanguíneo en el tejido hepático y el transporte de sustancias, y ayudar en el análisis de ciertas enfermedades relacionadas con la vascular1,2.
Hay muchas maneras de observar los vasos sanguíneos del hígado en ratones. Entre ellos, la microscopía óptica tiene muchas limitaciones en la observación del tejido vascular opaco3. Microscopía multifotónica se puede utilizar para imagen de los vasos sanguíneos de hígados vivos con alta resolución no invasiva4. No sólo se pueden obtener imágenes tridimensionales de los vasos sanguíneos, sino que la técnica también se puede utilizar para ayudar a organizar el tejido para observar los efectos biológicos en los mismo; además, todo el tejido se puede imaginar en lugar de sólo los microvessels como en la tomografía computarizada y la resonancia magnética5.
Microscopía multifotónica se puede utilizar para detectar eficazmente señales fluorescentes dispersas en tejido vivo profundo, con menos fototoxicidad6. Por lo tanto, la actividad del tejido vivo se puede asegurar, y la cantidad de daño se puede reducir. La microscopía multifotónica tiene mejor potencia penetrante que la microscopía confocal, lo que permite observar capas más profundas7,proporcionando imágenes 3D únicas. La microscopía multifotónica se utiliza ahora a menudo en los nervios craneales por imágenes8 y se ha extendido al estudio de la dinámica neuronal en ratones vivos9,10,11.
En este experimento, después del etiquetado fluorescente de los vasos sanguíneos de ratón, el hígado se fija en un marco, y la dinámica de los vasos sanguíneos en el tejido hepático vivo se puede ver utilizando microscopía multifotónica. Este experimento demuestra cómo marcar sustancias específicas, utilizar microscopía multifotónica para ayudar a observar una ubicación dentro del tejido, observar eventos celulares en el tejido intercelular, hacer mediciones fotoquímicas12,13,14,y observar la dinámica del material dentro del tejido vivo15. Por ejemplo, el marcador endotelial tumoral 1 (TEM1) ha sido identificado como un nuevo marcador de superficie regulado en los vasos sanguíneos y el estroma en muchos tumores sólidos, marcando el fragmento variable de una sola cadena (scFv) 78 contra TEM1, y luego la microscopía multifotona se puede utilizar para la localización y evaluación del hemangioma del ratón16.
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Protocol
Todos los cuidados y procedimientos de los animales se ajustaban a las políticas del Hospital Nanfang de China para la salud y el bienestar (aplicación No: NFYY-2019-73).
1. Preparación del ratón
- Anestesia el ratón.
- Preparar pentobarbital sódico (50 mg/kg) en una jeringa.
- Coge el ratón (macho de 8 semanas C57BL/6) con la mano izquierda para que su vientre esté mirando hacia arriba y su cabeza sea más baja que su cola. Desinfectar la piel abdominal con un 75% de alcohol.
- Sosteniendo la jeringa en la mano derecha, perfore la línea blanca del abdomen con la aguja ligeramente hacia el lado derecho de la piel por 3-5 mm. Asegúrese de que la aguja de la jeringa y la piel estén en un ángulo de 45°, inyecte el pentobarbital lentamente en la cavidad abdominal. Después del afeitado, desinfecta alrededor del sitio de incisión del ratón 3 veces alternativamente con 75% de alcohol y solución de clorhexidina.
- Compruebe si la anestesia tuvo éxito por la falta de un reflejo corrector.
- Inyectar rhodamina B isoticianato-dextrano en la vena caudal.
- Preparar 100 μL de 10 mg/ml de isoticianato-dextrano de ródamina B en una jeringa.
- Limpie la cola del ratón con un 75% de alcohol.
- Sujete la cola con la mano izquierda, sostenga la jeringa en la mano derecha con la aguja paralela a la vena e inyecte el tinte de 100 μL.
- Detenga el sangrado con un hisopo de algodón después de la inyección.
- Remoje el pelaje abdominal del ratón con gasa mojada con agua estéril y afeite el abdomen del ratón con una navaja, haciendo trazos en la dirección del pelaje. Después del afeitado, desinfecta alrededor del sitio de incisión del ratón 3 veces alternativamente con 75% de alcohol y solución de clorhexidina.
- Después de limpiar una almohadilla de calefacción con un 75% de alcohol, abra la almohadilla de calefacción y coloque el ratón sobre su espalda en la almohadilla de calefacción para mantener su temperatura corporal a 37 °C.
2. Fijación del hígado del ratón con el marco de imágenes del órgano corporal
NOTA: El marco comercial de imágenes de órganos aún no se ha lanzado.
- Coloque una ventosa limpia en una posición fija.
- Instale un accesorio de imagen de órgano(Figura Suplementaria 1)y limpie la almohadilla de calefacción y la ventosa con un 75% de alcohol.
- Conecte la ventosa (5 mm de diámetro) a la manguera de la bomba de vacío y encienda la bomba de vacío.
- En una mesa estéril esterilizada con un 75% de alcohol, desinfecta alrededor del sitio de incisión del ratón 3 veces alternativamente con 75% de alcohol y solución chlorhexidina, luego desinfecta alrededor del sitio de incisión del ratón 3 veces alternativamente con 75% de alcohol y solución chlorhexidina, luego use tijeras quirúrgicas para cortar 2 cm de piel del borde inferior del esternón del ratón y exponer el hígado.
- Coloque el ratón junto con la almohadilla de calefacción en la base del soporte.
- Ajuste el accesorio de imágenes de órganos para que la ventosa contenga el hígado. A continuación, utilice una presión negativa de 30-35 kPa para la succión para que el hígado se une a la ventosa (Figura suplementaria 2).
3. Ajuste del microscopio de escaneo láser multifotófonos
- Encienda el microscopio multifotón y seleccione el objetivo de 60x/1.00 W.
- Corrija el marco y el ratón debajo de la lente objetiva.
- Añade una gota de solución salina normal que pueda cubrir toda la lente, que es el centro de la ventosa, y ajusta la lente objetivo para tocar la solución salina normal.
- Haga doble clic en el icono del ordenador para activar el software láser y encender el interruptor. A continuación, mantenga pulsado el botón de encendido y el obturador durante 3 s.
- Ajuste la longitud de onda a 800 nm.
- Inicie el software operativo del microscopio con el ordenador.
- Para la configuración de adquisición, establezca Láser 800.
4. Observación utilizando microscopio de escaneo láser multifotófonos
- En Control de adquisición deimágenes, haga clic en el conmutador Fluorescent.
- Asegúrese de que las luces de la habitación y del equipo estén apagadas. Para reducir los niveles de ruido, utilice el microscopio en un entorno oscurecido.
- Abra el obturador de la trayectoria de la luz en el microscopio.
- Gire el filtro de fluorescencia a la cuarta marcha y tire de las dos palancas del interruptor óptico.
- Mirando a través del ocular, utilice los quasispirals de enfoque grueso y fino para ajustar la distancia focal, y utilice los ejes X/Y para ajustar el campo de visión para encontrar el área objetivo.
5. Micrografía de escaneo láser multifotófono
- Apague el interruptor fluorescente del software, cambie el filtro fluorescente a la segunda marcha (el segundo engranaje es RXD1) y empuje las dos palancas del interruptor óptico.
- Haga clic en Centrar ×2 para obtener una vista previa del área de destino y ajustar la configuración de adquisición y los parámetros de control de adquisición de imágenes (resolución de imagen: 1024).
- Pulse Control + C y ajuste el alto voltaje, ganancia y desplazamiento (para reducir los niveles de ruido).
- Haga clic en Detener para detener la vista previa, haga clic en el botón XY para escanear en dos dimensiones y guárdelo después de la finalización (Figura 1).
- Seleccione una región, haga clic en Profundidady, a continuación, vista previa para seleccionar el conjunto final y el conjunto de inicio (consulte la parte completa requerida del vaso sanguíneo) en el ajuste Microscopio. Escanear imágenes 3D y guardar después de la finalización (Figura 2).
- Seleccione una región, haga clic en Tiempoy ajuste otros parámetros de configuración de adquisición y control de adquisición de imágenes (Tamaño del paso: 1 μm; Rodajas: 10; Número de escaneo de tiempo: 40). Escanee diferentes sectores y guarde después de la finalización para obtener imágenes en movimiento (Vídeo 1).
NOTA: Pida a alguien que cuide a los ratones durante el análisis y agregue anestesia en consecuencia. - Sacrificar el ratón por disección del cuello.
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Representative Results
La distribución de los vasos sanguíneos en el hígado se puede ver en la Figura 1,obtenida utilizando microscopía multifotónica. El vaso sanguíneo se divide en una pluralidad de ramas que emanan de un tronco y se distribuyen al espacio circundante. La circunferencia externa del vaso sanguíneo es roja, la cavidad interna es oscura y hay muchas cosas dentro. Cuanto más clara sea la imagen, más cerca del plano de observación será. También hay algunas manchas rojas alrededor, probablemente porque el tinte penetra en el tejido circundante para manchar otras sustancias. En video 1,hay cosas no rojas que podrían ser células que se mueven en los vasos sanguíneos rojos. Al final del video, algunas de estas cosas se oscurecen. Esto es probablemente porque el hígado fijo no se ha fijado bien con el tiempo. Este método permitirá la toma de imágenes durante 2 horas.
Figura 1: Los vasos sanguíneos del tejido hepático bajo microscopía multifotónica. Los vasos sanguíneos son rojos. Una imagen bidimensional del vaso sanguíneo con una resolución de 2048 y un VH de 512, puede imaginar claramente los vasos sanguíneos rojos después de la tinción. También hay algunas manchas rojas alrededor, y el tinte también puede penetrar en el tejido circundante para teñir otras sustancias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imagen tridimensional del tejido hepático vivo en la misma posición. El espesor es de 9 μm, la morfología de los vasos sanguíneos se observa desde diferentes ángulos, y se recogen imágenes dinámicas. Después de la síntesis, las células de los vasos sanguíneos (oscuros) se ven fluyendo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1: Marco de imágenes de órganos corporales. (a) Almohadilla de calentamiento: Mantiene la temperatura corporal del ratón. (b) Soporte: Puede proporcionar una base para colocar el ratón y la posición ajustable de la ventosa con perillas. (c) Ventosa: Se fija por el soporte. La presión negativa proporcionada por la bomba de presión negativa hace que el hígado adsorb a la lente transparente en el centro de la ventosa. (d) Tubo flexible: Conecta la ventosa con la bomba de presión. La bomba de presión proporciona presión negativa a la ventosa. (e) Tubo centrífuga: El tubo centrífuga en el medio de la tubería flexible puede contener el líquido, para evitar que estos líquidos sean absorbidos en la bomba de vacío. (f) Bomba de presión negativa: Está conectada a la ventosa por el tubo flexible. La bomba de presión negativa puede proporcionar presión negativa a la ventosa para que el hígado se adhiera a la lente. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura suplementaria 2: Una imagen de primer plano del hígado unido a la lente transparente. La lente transparente está en el centro de la ventosa. La bomba proporciona presión negativa a la ventosa para que succiona el hígado y el hígado está unido a la lente transparente. Debido a que el hígado con cara de succión está un poco lejos del ratón, el efecto de la respiración y los latidos del corazón en los artefactos se reduce. La lente transparente puede proporcionar una vista estable para el microscopio multifotófonos. Haga clic aquí para descargar esta figura.
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Discussion
Observar un tejido vivo específico es un medio eficaz para comprender los cambios, la localización y los efectos biológicos del material dentro del tejido17. En este experimento, los pasos importantes son la fijación del hígado con un accesorio de imágenes de órganos, que puede resolver el problema de los artefactos de movimiento debido a la respiración y los latidos del corazón, y el uso de un microscopio multifotófonos para la observación. Utilizando este método, los tejidos internos del hígado in vivo se observan a través de un microscopio multifotófonos, y los vasos sanguíneos están etiquetados fluorescentemente para observar claramente su posición y estructura tridimensional. Este método se puede utilizar para observar efectos específicos etiquetando fluorescentemente una sustancia y siguiendo dinámicamente la sustancia en el tejido vivo para proporcionar más visualizaciones.
La microscopía multifotónica ha evolucionado de ser una técnica novedosa para convertirse en una herramienta indispensable para recopilar información de eventos celulares en un entorno de tejido organizado. Sin embargo, el órgano debe fijarse en su lugar para producir una imagen estable para que el método pueda ser eficaz en la observación de ciertos tejidos y órganos. Los artefactos de movimiento de la respiración y el latido del corazón pueden evitar que el hígado se imagine directamente, por lo que se utiliza un accesorio de órgano corporal, que utiliza el principio de adsorción al vacío para asegurar el órgano y evitar el movimiento de la imagen. El mandril de vacío también puede fijar una variedad de órganos corporales. Sin embargo, existe el riesgo de ruptura del tejido si no se utiliza la presión negativa adecuada o el tiempo de diagnóstico por imágenes se extiende más allá de 2 h.
Aunque la resolución de microscopía multifotónica es ligeramente menor que la de la microscopía confocal, la profundidad de penetración se incrementa a 9-10 μm, lo que permite el suministro de imágenes para una observación más profunda del tejido, eventos celulares y efectos materiales.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81772133, 81902444), el Fondo de Ciencias Naturales de Guangdong (2020A1515010269, 2020A1515011367), el Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología de la Salud Ciudadana de Guangzhou (201803010034, 201903010072) y el Proyecto militar de innovación médica (17CXZ008).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe x 2 | Hunan Pinan Medical Devices Technology | YA0551 | |
| 5 W heating pad | BiolinkOptics Technology | BL336 | |
| 75% absolute ethanol | Guangdong Guanghua Sci-Tech | 1.17113.023 | |
| Absorbent cotton ball | Healthy Sanitation Kingdom | ||
| Mouse surgical instrument | RWD Life Science | SP0001-G | Including scissors and tweezers |
| Multiphoton microscopy | Olympus | FV1200MPE | |
| Organ imaging fixture | BiolinkOptics Technology | BL336 | Including suction cup, hose, negative pressure pump and bracket |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | Sigma | R9379 | |
| Shaving machine | Lei Wa | RE-3201 | |
| Sodium pentobarbital | Sigma | P3761-25G |
References
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