Summary
Bu deneyde, kuyruk damarına kan damarlarını lekeleyebilen Rhodamine B izotiyosiyanat-dektran enjekte edilir. Karaciğer açığa çıktıktan ve sabitlendikten sonra multifotoğraf mikroskopisi kullanılarak canlı vücuttaki derin dokuyu gözlemlemek için karaciğerin belirli bir kısmı seçilebilir.
Abstract
Fare karaciğer dokusunun intravasküler dinamiklerini gözlemlemek, fare karaciğerinin doku ile ilgili hastalıkları hakkında daha derinlemesine gözlemler ve çalışmalar yapmamızı sağlar. Bir fareye kan damarlarını lekeleyebilecek bir boya enjekte edilir. Fare karaciğerini in vivo olarak gözlemlemek için, bir çerçeveye maruz kalır ve sabitlenir. Karaciğer dokusundaki kan damarlarının iki ve üç boyutlu görüntüleri çoktoğraf mikroskop kullanılarak elde edilir. Seçilen yerlerdeki dokuların görüntüleri, uzun süreli değişiklikleri gözlemlemek için sürekli olarak elde edilir; karaciğer dokularındaki kan damarlarının dinamik değişimleri de gözlenir. Multifotoğraf mikroskopisi, derin doku bölümlerinde veya organlarda hücre ve hücre fonksiyonlarını gözlemlemek için kullanılan bir yöntemdir. Multifotoğraf mikroskopisi doku mikroyapısına duyarlıdır ve biyolojik dokuların yüksek mekansal çözünürlükte in vivo olarak görüntülenmesini sağlayarak kuruluşun biyokimyasal bilgilerini yakalama olanağı sağlar. Multifotoğraf mikroskopisi karaciğerin bir kısmını gözlemlemek için kullanılır, ancak görüntüyü daha kararlı hale getirmek için karaciğeri sabitlemek sorunludur. Bu deneyde, karaciğeri düzeltmek ve mikroskop altında karaciğerin daha istikrarlı bir görüntüsünü elde etmek için özel bir vakum emme kabı kullanılır. Ek olarak, bu yöntem, bu tür maddeleri boyalarla işaretleyerek karaciğerdeki belirli maddelerin dinamik değişikliklerini gözlemlemek için kullanılabilir.
Introduction
Kan damarları insan vücudunun çeşitli organ dokuları için besin sağlayabilir ve madde alışverişi yapabilir. Aynı zamanda, birçok sitokin, hormon, ilaç ve hücre de belirli yerlere damar nakli yoluyla çalışır. Karaciğer dokusundaki damar değişikliklerinin gözlemlenmesi, karaciğer dokusundaki kan akışının dağılımını ve maddelerin taşınmasını anlamaya yardımcı olabilir ve bazı damarla ilgili hastalıkların analizine yardımcı olabilir1,2.
Farelerde karaciğerin kan damarlarını gözlemlemenin birçok yolu vardır. Bunlar arasında optik mikroskopinin opak vasküler dokuyu gözlemlemede birçok sınırlaması vardır3. Multifotoğraf mikroskopisi, canlı karaciğerlerin kan damarlarını noninvaziv yüksek çözünürlüklü olarak görüntülemek için kullanılabilir4. Sadece kan damarlarının üç boyutlu görüntüleri elde etmekle kalmaz, aynı zamanda teknik, buradaki biyolojik etkileri gözlemlemek için dokuyu düzenlemeye yardımcı olmak için de kullanılabilir; ayrıca, bilgisayarlı tomografi ve manyetik rezonans görüntülemede olduğu gibi sadece mikrovesseller yerine tüm doku görüntülenebilir5.
Multifotoğraf mikroskopisi, derin canlı dokudaki dağınık floresan sinyallerini daha az fototoksikite ile etkili bir şekilde tespit etmek için kullanılabilir6. Bu nedenle, canlı dokunun aktivitesi sağlanabilir ve hasar miktarı azaltılabilir. Multifon mikroskopi, konfokal mikroskopiden daha iyi nüfuz gücüne sahiptir ve daha derin katmanların gözlenmesine izin verir7, benzersiz 3D görüntüleme sağlar. Multifotoğraf mikroskopisi artık kraniyal sinirlerin8 görüntülenmesinde sıklıkla kullanılmaktadır ve canlı farelerde nöronal dinamiklerin incelenmesine kadar genişletilmiştir9,10,11.
Bu deneyde fare kan damarlarının floresan etiketlenerek bir çerçeveye sabitlenmiş olması ve canlı karaciğer dokusundaki kan damarlarının dinamikleri multifotoğraf mikroskopisi kullanılarak görülebilir. Bu deney, belirli maddelerin nasıl işaretlenerek, doku içindeki bir konumu gözlemlemeye yardımcı olmak için multifotoğraf mikroskopisinin nasıl kullanılacağını, hücreler arası dokudaki hücresel olayları gözlemlemeyi, fotokimyasal ölçümlerin12 , 13,14ve canlı dokunun içindeki malzeme dinamiklerini gözlemlemeyi göstermektedir15. Örneğin, tümör endotel belirteci 1 (TEM1), birçok katı tümörde kan damarlarında ve stromada yukarı doğru sıralanmış, tek zincirli değişken parça (scFv) 78'i TEM1'e karşı işaretleyen yeni bir yüzey belirteci olarak tanımlanmıştır ve daha sonra fare hemanjiomunun yeri ve tümörlerin değerlendirilmesi için multifotoni mikroskopisi kullanılabilir16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan bakım ve prosedürleri, heath ve refah için Çin Nanfang Hastanesi politikalarına uygundu (uygulama No: NFYY-2019-73).
1. Fare hazırlığı
- Fareyi uyuştur.
- Bir şırıngamda sodyum pentobarbital (50 mg/kg) hazırlayın.
- Fareyi (8 haftalık erkek C57BL/6) sol elle tutun, böylece karnı yukarı bakacak ve başı kuyruğundan daha düşük olacaktır. Karın derisini% 75 alkolle dezenfekte edin.
- Şırıngayı sağ elde tutarak, karın beyaz çizgisini iğne ile cildin sağ tarafına hafifçe 3-5 mm delin. Şırınga iğnesinin ve cildin 45° açıyla olduğundan emin olun, pentobarbital'ı yavaşça karın boşluğuna enjekte edin. Tıraş olduktan sonra, farenin kesi bölgesinin etrafını% 75 alkol ve Klorheksidin çözeltisi ile dönüşümlü olarak 3 kez dezenfekte eder.
- Anestezinin sağ refleks eksikliği nedeniyle başarılı olup olmadığını kontrol edin.
- Kaudal damara Rhodamine B izotiyosiyanat-dektran enjekte edin.
- Bir şırınna 100 μL 10 mg/mL Rhodamine B izotiyosiyanat-dektran hazırlayın.
- Farenin kuyruğunu% 75 alkolle silin.
- Kuyruğu sol elle tutun, şırıngayı damara paralel iğne ile sağ elinizde tutun ve 100 μL boyayı enjekte edin.
- Enjeksiyondan sonra pamuklu çubukla kanamayı durdurun.
- Farenin karın kürkü steril su ile ıslatılmış gazlı bezle ıslatın ve farenin karnını bir jilet kullanarak tıraş edin, kürk yönünde vuruşlar yapın. Tıraş olduktan sonra, farenin kesi bölgesinin etrafını% 75 alkol ve Klorheksidin çözeltisi ile dönüşümlü olarak 3 kez dezenfekte eder.
- % 75 alkol içeren bir ısıtma yastığını sildikten sonra, ısıtma yastığını açın ve vücut sıcaklığını 37 ° C'de korumak için fareyi ısıtma yastığına sırt üzerine yerleştirin.
2. Fare karaciğerini vücut organı görüntüleme çerçevesiyle sabitleme
NOT: Ticari organ görüntüleme çerçevesi henüz piyasaya sürülmemiştir.
- Temiz bir vantuz sabit bir konuma yerleştirin.
- Bir organ görüntüleme fikstürü takın (Ek Şekil 1) ve ısıtma yastığını ve emme kabını% 75 alkolle silin.
- Emme kabını (5 mm çapında) vakum pompası hortumuna bağlayın ve vakum pompasını açın.
- % 75 alkol ile sterilize edilmiş steril bir masada, farenin kesi bölgesinin etrafını% 75 alkol ve Klorheksidin çözeltisi ile dönüşümlü olarak 3 kez dezenfekte eder, daha sonra% 75 alkol ve Klorheksidin çözeltisi ile farenin kesi bölgesinin etrafını 3 kez dezenfekte eder, ardından farenin alt sternal sınırından 2 cm deri kesmek ve karaciğeri ortaya çıkarmak için cerrahi makas kullanır.
- Fareyi tutucu tabanındaki ısıtma yastığı ile birlikte yerleştirin.
- Organ görüntüleme fikstürünü, emme kabı karaciğeri tutabilecek şekilde ayarlayın. Daha sonra emme için 30-35 kPa negatif basınç kullanın, böylece karaciğer emme kabına bağlanır(Ek Şekil 2).
3. Multifotoğraf lazer tarama mikroskobu ayarlama
- Çoktoğraf mikroskobu açın ve 60x/1.00 W hedefini seçin.
- Çerçeveyi ve fareyi objektif lensin altına sabitle.
- Emme kabının merkezi olan lensin tamamını kaplayabilen bir damla normal salin ekleyin ve objektif lensi normal saline dokunacak şekilde ayarlayın.
- Lazer yazılımını açmak ve anahtarı açmak için bilgisayar simgesine çift tıklayın. Ardından güç düğmesini ve deklanşöre 3 sn basılı tutun.
- Dalga boylarını 800 nm olarak ayarlayın.
- Bilgisayarı kullanarak mikroskop işletim yazılımını başlatın.
- Edinme Ayarıiçin Lazer 800'ü ayarlayın.
4. Multifotoğraf lazer tarama mikroskobu kullanılarak gözlem
- Görüntü Alma Denetimiiçin Floresan anahtarını tıklatın.
- Oda ve ekipman ışıklarının kapalı olduğundan emin olun. Gürültü seviyelerini azaltmak için mikroskobu karanlık bir ortamda kullanın.
- Mikroskopta ışık yolu deklanşörini açın.
- Floresan filtresini dördüncü vitese döndürün ve optik anahtarın iki kolunu çekin.
- Göz merceğinden bakarak, odak uzaklığını ayarlamak için kaba ve ince odaklama kuasispirallerini kullanın ve hedef alanı bulmak için görüş alanını ayarlamak için X/Y eksenlerini kullanın.
5. Multifotoğraf lazer tarama mikrografisi
- Yazılımdaki floresan anahtarını kapatın, floresan filtreyi ikinci vitese geçirin (ikinci vites RXD1'dir) ve optik anahtarın iki kolunu itin.
- Hedef alanı önizlemek ve alım ayarını ve görüntü alma kontrol parametrelerini ayarlamak için Odak ×2'ye tıklayın (görüntü çözünürlüğü: 1024).
- Control + C tuşlarına basın ve yüksek voltajı, kazancı ve ofseti ayarlayın (gürültü seviyelerini azaltmak için).
- Önizlemeyi durdurmak için Durdur'a tıklayın, iki boyutta taramak için XY düğmesini tıklatın ve tamamlandıktan sonra kaydedin (Şekil 1).
- Bir bölge seçin, Derinlik'i tıklatın ve ardından Mikroskop ayarında bitiş kümesini ve başlangıç kümesini seçmek için Önizleme 'yi tıklatın (kan damarının gerekli kısmının tamamına bakın). 3D görüntüleri tarayın ve tamamlandıktan sonra kaydedin (Şekil 2).
- Bir bölge seçin, Zaman'a tıklayın ve diğer alım ayarını ve görüntü alma kontrol parametrelerini ayarlayın (Adım Boyutu: 1 μm; Dilimler: 10; Zaman Tarama Numarası: 40). Hareketli görüntüler elde etmek için farklı dilimleri tarayın ve tamamlandıktan sonra kaydedin (Video 1).
NOT: Tarama sırasında birinin farelere bakması ve buna göre anestezi eklemesi gerekir. - Fareyi boyun diseksiyonu ile kurban edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Karaciğerdeki kan damarlarının dağılımı, multifotoğraf mikroskopisi kullanılarak elde edilen Şekil 1'degörülebilir. Kan damarı, bir gövdeden yayılan dalların çoğulluğuna ayrılır ve çevredeki alana dağıtılır. Kan damarının dış çevresi kırmızı, iç boşluğu karanlık ve içinde birçok şey var. Görüntü ne kadar netse, gözlem düzlemine o kadar yakın olur. Ayrıca etrafta bazı kırmızı lekeler vardır, muhtemelen boya diğer maddeleri lekelamak için çevredeki dokuya nüfuz ettiği için. Video 1'de, kırmızı kan damarlarında hareket eden hücreler olabilecek kırmızı olmayan şeyler vardır. Videonun sonunda, bunlardan bazıları karartılmış. Bunun nedeni muhtemelen sabit karaciğerin zamanla iyi sabitlenmemiş olmasıdır. Bu yöntem 2 saat boyunca görüntülemeye izin verecektir.
Şekil 1: Multifotoğraf mikroskopisi altında karaciğer dokusundaki kan damarları. Kan damarları kırmızı. 2048 çözünürlüğe ve 512 HV'ye sahip kan damarının iki boyutlu bir görüntüsü, lekelemeden sonra kırmızı kan damarlarını net bir şekilde görüntüleyebilir. Etrafta bazı kırmızı lekeler de vardır ve boya diğer maddeleri boyamak için çevredeki dokuya da nüfuz edebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Aynı pozisyonda yaşayan karaciğer dokusunun üç boyutlu görüntüsü. Kalınlık 9 μm'dir, kan damarlarının morfolojisi farklı açılardan gözlenir ve dinamik görüntüler toplanır. Sentezden sonra kan damarlarındaki hücreler (koyu) akar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Vücut organı görüntüleme çerçevesi. (a) Isıtma yastığı: Fare gövdesi sıcaklığını korur. (b) Braket: Fareyi ve ayarlanabilir emiş kabı konumunu düğmelerle yerleştirmek için bir taban sağlayabilir. (c) Emme kabı: Braket ile sabitlenir. Negatif basınç pompasının sağladığı negatif basınç, karaciğerin emme kabının ortasındaki şeffaf lense adsorbe etmesine neden olur. (d) Esnek boru: Emme kabını basınç pompasına bağlar. Basınç pompası emme kabına negatif basınç sağlar. (e) Santrifüj tüpü: Esnek borunun ortasındaki santrifüj tüpü, bu sıvıların vakum pompasına emilmesini önlemek için sıvıyı tutabilir. (f) Negatif basınçlı pompa: Emiş kabına esnek boru ile bağlanır. Negatif basınç pompası, karaciğerin lense tutunmasını sağlamak için emme kabına negatif basınç sağlayabilir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 2: Şeffaf lense bağlı karaciğerin yakın çekim görüntüsü. Şeffaf lens emme kabının ortasındadır. Pompa, karaciğeri emmesi için emme kabına negatif basınç sağlar ve karaciğer şeffaf lense bağlanır. Emme yüzlü karaciğer fareden biraz uzakta olduğundan, nefes almanın ve kalp atışının eserler üzerindeki etkisi azalır. Şeffaf lens, multifotoğraf mikroskobu için kararlı bir görünüm sağlayabilir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Belirli bir canlı dokuyu gözlemlemek, dokunun içindeki malzemenin değişikliklerini, lokalizasyonunu ve biyolojik etkilerini anlamanın etkili bir yoludur17. Bu deneyde, önemli adımlar karaciğeri solunum ve kalp atışlarına bağlı hareket eserleri sorununu çözebilen bir organ görüntüleme fikstürü ile sabitlemek ve gözlem için çoktoğraf mikroskobu kullanmaktır. Bu yöntem kullanılarak, karaciğer in vivo iç dokuları multifotoğraf mikroskop ile gözlenir ve kan damarları konumlarını ve üç boyutlu yapılarını net bir şekilde gözlemlemek için floresan olarak etiketlenir. Bu yöntem, bir maddeyi floresan olarak etiketleyerek ve daha fazla görselleştirme sağlamak için canlı dokudaki maddeyi dinamik olarak takip ederek belirli etkileri gözlemlemek için kullanılabilir.
Multifotoğraf mikroskopisi, yeni bir teknik olmaktan, organize bir doku ortamında hücresel olaylardan bilgi toplamak için vazgeçilmez bir araç haline gelmiştir. Bununla birlikte, yöntemin belirli doku ve organları gözlemlemede etkili olabilmesi için organın kararlı bir görüntü üretmek için yerinde sabitlenmesi gerekir. Hareket eserlerinin nefes almasını ve kalp atışı karaciğerin doğrudan görüntü almasını engelleyebilir, bu nedenle organı sabitlemek ve görüntü sarsıntısını önlemek için vakum adsorpsiyon ilkesini kullanan bir vücut organı fikstürü kullanılır. Vakum aynası ayrıca çeşitli vücut organlarını da sabitleyebilir. Ancak uygun negatif basınç kullanılmadığı veya görüntüleme süresi 2 saatin üzerine kadar uzayıyorsa doku yırtılması riski vardır.
Multifon mikroskopinin çözünürlüğü konfokal mikroskopiden biraz daha az olmasına rağmen, penetrasyon derinliği 9-10 μm'ye yükseltilir ve daha derin doku gözlemi, hücresel olaylar ve malzeme etkileri için görüntülerin sağlanmasını sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81772133, 81902444), Guangdong Doğa Bilimleri Fonu (2020A1515010269, 2020A1515011367), Guangzhou Yurttaş Sağlık Bilim ve Teknoloji Araştırma Projesi (201803010034, 201903010072) ve Askeri Tıbbi İnovasyon Projesi (17CXZ008).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe x 2 | Hunan Pinan Medical Devices Technology | YA0551 | |
| 5 W heating pad | BiolinkOptics Technology | BL336 | |
| 75% absolute ethanol | Guangdong Guanghua Sci-Tech | 1.17113.023 | |
| Absorbent cotton ball | Healthy Sanitation Kingdom | ||
| Mouse surgical instrument | RWD Life Science | SP0001-G | Including scissors and tweezers |
| Multiphoton microscopy | Olympus | FV1200MPE | |
| Organ imaging fixture | BiolinkOptics Technology | BL336 | Including suction cup, hose, negative pressure pump and bracket |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | Sigma | R9379 | |
| Shaving machine | Lei Wa | RE-3201 | |
| Sodium pentobarbital | Sigma | P3761-25G |
References
- Wu, Z., et al. Multi-photon microscopy in cardiovascular research. Methods. 130, 79-89 (2017).
- Zhou, M., Ling, W., Luo, Y. Intrahepatic mass-forming cholangiocarcinoma growing in a giant hepatic hemangioma: A case report. Medicine (Baltimore). 98 (27), 16410 (2019).
- Werkmeister, E., et al. Multiphoton microscopy for blood vessel imaging: new non-invasive tools (Spectral SHG, FLIM). Clinical Hemorheology and Microcirculation. 37 (1-2), 77 (2007).
- Wang, H., et al. Does optical microangiography provide accurate imaging of capillary vessels?: validation using multiphoton microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (10), 1-5 (2014).
- Upputuri, P. K., Sivasubramanian, K., Mark, C. S., Pramanik, M. Recent developments in vascular imaging techniques in tissue engineering and regenerative medicine. Biomed Research International. 2015, 783983 (2015).
- Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. Journal of Microscopy. 243 (3), 221-226 (2011).
- Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys Journal. 75 (4), 2015-2024 (1998).
- Vogt, N. Chromatic multiphoton imaging of the whole brain. Nature Methods. 16 (6), 459 (2019).
- Bacskai, B. J., et al. Imaging of amyloid-β deposits in brains of living mice permits direct observation of clearance of plaques with immunotherapy. Nature Medicine. 7 (3), 369-372 (2001).
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385 (6612), 161-165 (1997).
- Liu, H., et al. In vivo Deep-Brain Structural and Hemodynamic Multiphoton Microscopy Enabled by Quantum Dots. Nano Letters. , (2019).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology. Methods. 128, 20-32 (2017).
- Shear, J. B. Peer Reviewed: Multiphoton-Excited Fluorescence in Bioanalytical Chemistry. Analytical Chemistry. 71 (17), 598-605 (1999).
- Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Yuan, X., et al. Characterization of the first fully human anti-TEM1 scFv in models of solid tumor imaging and immunotoxin-based therapy. Cancer Immunology & Immunotherapy. 66 (3), 367-378 (2017).
- Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Multiphoton microscopy in biological research. Current Opinion in Chemical Biology. 5 (5), 603-608 (2001).
