Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Kovalent fastsättning av enstaka molekyler för AFM-baserad force spectroscopy

Published: March 16, 2020 doi: 10.3791/60934
Automatic Translation
1, 1, 1,3, 2, 1,3
1Institute of Physical Chemistry, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, 2Chair in Polymer Chemistry, Saarland University, 3Cluster of Excellence livMatS at FIT - Freiburg Center for Interactive Materials and Bioinspired Technologies, University of Freiburg

Summary

Kovalent fastsättning av sondmolekyler till atomkraftsmikroskopi (AFM) cantilever tips är en viktig teknik för att undersöka deras fysiska egenskaper. Detta gör det möjligt för oss att bestämma stretching kraft, desorption kraft och längd polymerer via AFM-baserade enda molekyl kraft spektroskopi med hög reproducerbarhet.

Abstract

Atomic force microscopy (AFM)-baserad enda molekyl kraft spektroskopi är ett idealiskt verktyg för att undersöka interaktioner mellan en enda polymer och ytor. För en sann enda molekyl experiment, kovalent fastsättning av sonden molekylen är viktigt eftersom först då kan hundratals kraft-förlängning spår med en och samma enda molekyl erhållas. Många spår är i sin tur nödvändiga för att bevisa att en enda molekyl ensam är sonderade. Dessutom är passivation avgörande för att förhindra oönskade interaktioner mellan den enda sondmolekylen och AFM-cantileverspetsen samt mellan AFM-kantileverspetsen och den underliggande ytan. Funktionsprotokollet som presenteras här är tillförlitligt och kan enkelt appliceras på en mängd olika polymerer. Karakteristiska enstaka molekylhändelser (dvs. sträckor och platåer) detekteras i kraftförlängningsspåren. Från dessa händelser kan fysiska parametrar som stretchingkraft, desorptionskraft och desorptionslängd erhållas. Detta är särskilt viktigt för den exakta undersökningen av stimuli-responsiva system på enmolekylnivå. Som exemplariska system poly(etenglykol) (PEG), poly( N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) och polystyren (PS) sträcks och desorbed från SiOx (för PEG och PNiPAM) och från hydrofoba självmonterade monoytor (för PS) i vattenmiljö.N

Introduction

Sedan dess uppfinning på 1980-talet1, atomkraft mikroskop (AFM) har blivit en av de viktigaste bildteknikerna inom naturvetenskap med subnanometer rumslig upplösning, sub-piconewton kraftupplösning och möjligheten att mäta i olika lösningsmedel och temperaturförhållanden2,3,44,5,6,7.

Förutom bildframställning8,9, används AFM för att utföra enmolekylkraftspektroskopi (SMFS) som ger insikt i självhäftande interaktioner mellan en enda polymer och ytor, fysiska egenskaper hos enskilda polymerer och utfällningsmekanismer för proteiner7,,10,,11,12,13,1414,15,16. I ett vanligt SMFS-experiment kommer den funktionäriserade cantileverspetsen i kontakt med en yta så att polymeren vid AFM-cantileverspetsen physisorbs till denna yta. Genom att dra tillbaka AFM-cantileverspetsen från ytan omvandlas en ändring av avböjningen av AFM-cantilever till en kraft som leder till en kraftförlängningskurva4. Fysiska parametrar såsom sträckkraft, desorptionskraft och desorptionslängd kan bestämmas beroende på olika parametrar såsom draghastighet, uppehållstid på ytan, indragsdjup i ytan, temperatur, lösningsmedel17,,18 och olika ytor som substrat, polymerfilmer eller stödda lipidbilayers19,20,,21,22. Dessutom kan en polymer undersökas i olika rumsliga riktningar, vilket undersöker friktionsegenskaperna hos polymeren23,24,25,26.

En kovalent fastsättning av den undersökta polymeren till en AFM-kantileverspets är nödvändig för sådana studier. Således förhindrar en hög avkastning av enstaka molekyl händelser med en och samma polymer bunden till en AFM cantilever spets någon bias av resultaten på grund av kalibrering av fjäderkonstanten av AFM cantilever27,28, varierande fästpunkter29 eller varierande polymerer (med olika konturer längder) såsom i fallet med nanofiske experiment30,31,32. Också, interaktioner med andra polymerer samt i genomsnitt effekter kan allmänt förebyggas18,28. För kovalent fastsättning av en polymer till AFM cantilever spets, olika typer av kemiska modifieringar kan tillämpas, varav många sammanfattas i boken av Hermanson33. Amin och thiol-baserade länka reaktioner samt klicka kemi representerar de vanligaste metoderna i AFM cantilever spets funktionalisering34,35,36,37,38,39,40,41,42.36 Becke et al.40 visar hur man använder 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid (EDC)/NHS kemi för att fästa ett protein på en AFM-cantilever spets. Men dessa funktionella grupper tenderar att crosslink, vilket leder till en förlust av funktionalitet43,44. Dessutom visar karbodiimider en tendens att snabb hydrolys i lösning43. Maleimide och thiol grupper är i allmänhet mer stabila och visar inte crosslinking reaktioner. Det presenterade protokollet är en optimering av de tidigare publicerade protokollen som anges i referenserna35,39.

Här presenteras ett tillförlitligt funktionaliseringsprotokoll som enkelt kan anpassas till ett stort antal olika polymerer, oavsett egenskaper som konturlängd eller hydroforbicitet. Tre olika polymerer valdes som exempel: hydrofil polyetenglykol (PEG)Noch poly( N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) samt hög mola massa hydrofoba polystyren (PS). För att ge en kovalent bindningsförmåga med en lämplig länkningsmolekyl valdes de tre polymererna ut för att ha en telechelic thiol moiety som funktionell slutgrupp. Länkermolekylen i sig är vanligtvis en kort PEG-polymer med två aktiva platser, en silanegrupp i ena änden och en maleimidegrupp i andra änden. Den förstnämnda möjliggör en kovalent fastsättning till AFM-kantileverspetsen och den senare en bindande reaktion med tiagruppen av den funktionella masspolymeren med hög molar. Dessutom fungerar inaktiva PEG-länkarmolekyler som ett passivationsskikt för att förhindra oönskade interaktioner mellan sondpolymeren och AFM-cantileverspetsen samt mellan AFM-kantileverspetsen och den underliggande ytan.

Protocol

SE Bild 1 för en schematisk översikt.

1. Reagens inställning

OBS: De polymerer som används för detta protokoll är: maleimid-polyetenglykol-trietoxysilane (silane-PEG-mal, 5 kDa), tia-polyetenglykol-tia (HS-PEG-SH, 35NkDa), thiol avslutade poly( N-isopropylacrylamide) (PNiPAM-SH, 637 kDa) och tiada avslutade polystyren (PS-SH, 1,3 mDa).

  1. Förbered den väldefinierade och höga molar massan PNiPAM-SH via atom överföring radikal polymerisering, följt av omvandling och minskning av den funktionella slutgruppen för införandet av en tiaol moiety, som beskrivs i litteraturen18. Se figur 1 för detaljerade strukturer.
  2. För förvaring av kemikalier, förbered mindre alikvoter i ett torrhandsboxsystem med kväveatmosfär för att undvika exponering för atmosfäriskt syre och fukt. PEG och PNiPAM är hygroskopiska45,46 och funktionella slutgrupper av PEG, PNiPAM och PS är kända för att bli lätt oxideras när de lagras vid omgivande förhållanden33,47,48. Alla kemikalier måste förvaras vid -20 °C.
  3. Använd analytiska lösningsmedel eller högre. Dessutom, använd ultrarent vatten för att skölja AFM cantilevers chips och glas eftersom enstaka molekyl experiment är mycket känsliga för all kontaminering.

2. Installation av utrustning

OBS: Använd pincett och bägare av rostfritt stål eller glas. Använd inverterade pincett för ett säkert grepp (t.ex. modell R3 SA med låg fjäderkonstant).

  1. Förbered RCA-lösningen (ultrarent vatten, väteperoxid och ammoniak (5:1:1)) för att rengöra glas och pincett.
  2. Lägg kärlen i en bägare och fyll den med RCA tills glas eller pincett är helt täckta.
  3. Värm bägaren från steg 2.2 för 1 h vid 80 °C.
  4. Skölj kärlen därefter med ultrarent vatten tills ingen stickande lukt är fastställd längre (minst tre gånger).
  5. Torra glas och pincett i en ugn (120 °C).

3. Tips funktionalisering

OBS: Alla steg bör utföras i en rökhuva för att undvika inandning av organiska ångor. Dessutom krävs handskar, labbrock och ögonskydd. Använd nitril- eller latexhandskar för varje steg för att undvika kontaminering. Använd lösningsmedelsresistenta handskar när du använder toluen. Alla steg, om inte annat anges, görs på RT. Använd färsk utrustning och handskar för varje steg för att undvika eventuell korskontaminering.

  1. Utför ytaktivering genom att applicera syreplasma på AFM-cantilever-chippet MLCT-Bio-DC.
    OBS: Plasmabehandlingens effektivitet för ytterligare funktionaliseringssteg skalar med syrehalten i plasmakammaren.
    1. Använd nyrengjorda pincett för att placera AFM-kantileverchips i en plasmakammare (40 kHz, 600 W).
    2. Använd specialmodifierat aktiveringsprogram: evakuering (0,1 mbar) – översvämningar med syre till ett tryck på: 0,2 mbar (4 min) – plasmaprocess (effekt: 40%, varaktighet: 2 min, processtryck: 0,2 mbar).
    3. Ventilera kammaren och fortsätt med steg 3.2.2 omedelbart för att förhindra att föroreningar till AFM-cantileverchips luftas.
  2. Silanisering och PEGylation
    Tidsinställning är en viktig parameter mellan stegen. Förbered lösningar så fräscha som möjligt under väntetiderna. Maleimide grupper är föremål för hydrolys i vattenhaltiga medier och tiols lätt bli oxideras till disulfids i lösning33,47 hindrar AFM spets funktionalisering reaktioner.
    1. Förbered en silane-PEG-mal lösning i toluen (1,25 mg/ml) i lösningsmedelsresistenta plast- eller glasrör och häll 6 ml av lösningen i platta Petri-rätter, 3 ml vardera.
      OBS: Om bindning av flera sondpolymerer observeras i SMFS-experimentet kan blandning av sillane-PEG-mal med icke-funktionell silane-PEG minska antalet förankringspunkter. För justering av passivationsskiktet PEG med olika massor (dvs. konturlängder) kan användas27.
    2. Inkubera AFM cantilever chips omedelbart efter steg 3.1.3 i silane-PEG-mal lösning (upp till 10 marker per Petri skålen) för 3 h vid 60 ° C35.
    3. Ta petriskålar ur ugnen och låt lösningen svalna i minst 10 min.
    4. Skölj varje AFM-cantilever-chip noggrant. Minska kapillärkrafternas inverkan på AFM-kantilevernnär du passerar gränssnittet mellan luftlösningsmedel, till exempel genom att luta dessa marker något när de doppar i lösningen.
      1. För PEG- och PS-polymerer, skölj tre gånger med toluen.
      2. För PNiPAM polymer, skölj en gång med toluen och två gånger med etanol.
    5. Välj minst två AFM-cantilever-chips som kontroll AFM-cantileverchips, hoppa över steg 3.3 och skölj dem enligt följande för att öka lösningsmedlets polaritet:
      1. För PEG- och PS-polymerer, skölj två gånger med etanol och en gång med ultrarent vatten.
      2. För PNiPAM-polymer, skölj två gånger med ultrarent vatten.
        OBS: Kontroll AFM cantilever chips har gått igenom alla funktionaliseringssteg utom polymertillsatsen (steg 3.3). De tjänar till att bevisa renligheten av funktionaliseringsprocessen, AFM cantilever chip innehavaren systemet, ytor och lösningsmedel som används för SMFS experimentet.
  3. Kovalent polymerfastsättning
    OBS: Även om AFM cantilever spetsen förväntas vara helt täckt med maleimide grupper, det finns bara några bindande platser för den enda sond polymer, eftersom maleimide genomgår hydrolys i vatten som leder till inaktiva PEGs47. Dessa inaktiva pegs fungerar som ett passivationsskikt, enligt beskrivningen ovan.
    1. Inkubera AFM cantilever chips direkt efter steg 3.2.5 i en av följande polymerlösningar i 3 ml Petri-rätter. Om respektive polymer inte löses upp ordentligt, använd ett 40 °C vattenbad och rör om lösningen väl.
      OBS: Eftersom användningen av tialer avslutade polymerer kan leda till bildandet av disulfidbindningar som hämmar reaktionen med maleimidgrupperna av silane-PEG-mal rekommenderas ett reducermedel, särskilt om steg 3.3 appliceras i vattenlösliga polymerer33.
      1. För PEG- och PS-polymerer ska du använda en koncentration på 1,25 mg/ml i toluen under 1 h vid 60 °C.
      2. För PNiPAM-polymerer, använd en koncentration på 1,25 mg/ml i etanol i 3 timmar vid RT.
        OBS: Om bindning av flera sondpolymerer observeras i SMFS-experimentet bör polymerens koncentration minskas.
    2. Skölj noggrant varje AFM-cantilever-chip.
      1. För PEG- och PS-polymerer, skölj två gånger med toluen, två gånger med etanol och en gång med ultrarent vatten efter en 10 min svalka.
      2. För PNiPAM-polymerer, skölj två gånger med etanol och två gånger med ultrarent vatten.
    3. Förvara varje AFM-cantilever-chip separat i en liten (1 ml) Petriskål fylld med ultrarent vatten vid 4 °C tills användning i ett experiment.

4. Ytberedning

  1. Kiseloxidrån
    OBS: Denna yta användes för SMFS med PEG och PNiPAM.
    1. Skär en kiseloxid rån i små bitar med hjälp av en diamantkniv.
    2. Lägg kiseloxidbitarna separat i mikrocentrifugrören och fyll dessa rör med etanol.
    3. Sonicate kiseloxid bitar i 10 min.
    4. Skölj kiseloxidbitarna med etanol två gånger och torka dem under ett kväveflöde noggrant. Använd silikonoxidbitarna omedelbart.
  2. Självmonterade monolayer av hydrofoba alkane tia på guld (SAM)
    OBS: Denna yta användes för SMFS med PS. Se litteratur39,49 för mer information om SAMs.
    1. Använd ett guldbelagt silikonrån (A [100], 5 nm titan, 100 nm guld) för att utföra steg 4.1.1 – 4.1.4.
    2. Inkubera ytdelarna i en 1-dodekantioollösning (2 mM) i 18 timmar.
    3. Skölj de nyberedda SAMs i etanol två gånger.
    4. Torra SAMs med kväveflöde för direkt användning eller förvara dem i etanol i upp till 4 dagar för senare användning.

5. Datainsamling

OBS: Alla mätningar som visas här utfördes i ultrarent vatten med en Cypher ES AFM med hjälp av en värme- och kylprovsfas för temperaturvariation. I allmänhet kan alla afms som ger möjlighet att mäta i vätskor användas.

  1. Sätt in det funktionära AFM-cantilever-chippet i AFM.
  2. Limma den beredda ytan i en provhållare som är lämplig för mätning i vätskor (t.ex. högupplöst reningsgrad 101RF eller ett UV-härdbart lim).
    OBS: Dessa limningsmedel är mycket inert och resistenta mot ett stort antal polära lösningsmedel. Limmets motståndskraft mot icke-polära lösningsmedel (t.ex. toluen eller hexan) eller höga temperaturer bör kontrolleras före användning.
  3. Sänk ned AFM-cantilever-chippet och sondprovet i vätskan, här: ultrarent vatten.
    OBS: En lösningsmedelsdroppe (ca 100 μL) kan deponeras på AFM-kantileverschiphållaren. Att täcka AFM-cantilever-chippet med lösningsmedel minskar kapillärkrafter, som annars skulle fungera på AFM-kantilevernnär du närmar sig provytan som passerar genom gränssnittet mellan luftlösningsmedel.
  4. Justera vid behov temperaturen och låt systemet jämställas.
    OBS: Temperaturförändringar kan resultera i en deformation av AFM-cantilever på grund av en bimetallisk effekt för AFM-cantilevers med en reflekterande beläggning som aluminium eller guld. Jämvikt bör utföras bort från ytan (flera μm) tills ingen ytterligare ändring av avböjningssignalen observeras (upp till 15 min för MLCT-Bio-DC).
  5. Variera temperaturen slumpmässigt för att utesluta eventuella effekter av åldrandet av funktionaliseringen. Se till att de temperaturer som används inte leder till en irreversibel böjning av AFM-kantilever.
    OBS: Eventuella temperatureffekter på lösningsmedelsegenskaper (t.ex. avdunstning eller förändringar i viskositet) kan hämma dina experiment. I de presenterade exemplen varierades temperaturen över ett intervall på upp till 40 K i steg om 10 K med vatten som lösningsmedel (t.ex. från 278 K till 318 K).
  6. Närma dig ytan för att bestämma InvOLS (omvänd optisk spakkänslighet) genom att ta kraftförlängningskurvor på en hård yta (t.ex. kiseloxid). För detta, ta avböjningssignalen för fotodetektorn (i V) vs piezo avstånd och bestämma lutningen på den del som representerar indrag av AFM cantilever spets i den underliggande ytan (motbjudande regim) med hjälp av en linjär funktion. För att minska fel, ta genomsnittet av minst fem värden för att få det slutliga InvOLS-värdet. För ytterligare information, se litteraturen4,39.
    OBS: InvOLS kan endast beslutas på ett tillförlitligt sätt på hårda ytor. När det gäller experiment på mjuka ytor eller gränssnitt se till att du placerar en hård yta nära dina mjuka ytor. Sedan kan InvOLS-kalibreringen göras före eller efter dina mjuka ytexperiment utan att behöva demontera AFM-installationen.
  7. För fjäderkonstant bestämning, flytta AFM-kantilevertill en höjd med varken attraktiva eller motbjudande interaktioner mellan AFM-cantileverspets och yta (flera μm). Registrera sedan ett termiskt brusspektrum där effektspektraldensiteten (PSD) vs frekvens ritas. Följande steg utförs vanligtvis av automatiserade inbyggda funktioner i kommersiell AFM-programvara: för det första analyseras det förvärvade värmebullerspektrumet genom att montera en funktion på PSD, t.ex. Passformen görs upp till ett minimum mellan den första och andra resonansen. För det andra bestäms området under den monterade delen av PSD vs frekvensområdet som representerar den genomsnittliga kvadratiska förskjutningen av AFM-cantilever i vertikal riktning. Slutligen används ekpartitionssatsen för att erhålla AFM-kantileverkraftkonstanten28,50.
    OBS: Ett lämpligt frekvensområde bör användas som omfattar den första resonanstoppen i AFM-kantilever. För att få ett tillfredsställande signal-brusförhållande bör minst 10 PSD-skivor ackumuleras med högsta möjliga frekvensupplösning.
  8. Starta experimentet. Diagram med kraftgenom att ta kraftförlängningskurvor på ett rutnätsliknande sätt (t.ex. 10 x 10 poäng för ett område på 20 x 20 μm2)för att undvika lokala yteffekter (t.ex. föroreningar, förskjutningar) och för att genomsnittliga olika ytområden.
    OBS: Typiska parametrar är en draghastighet på 1 μm/s och en provtagningshastighet på 5 kHz för att säkerställa tillräcklig upplösning. Provtagningshastigheten bör anpassas när draghastigheten varieras. Indragningsavståndet bör anpassas till den uppmätta polymerens kontur- eller desorptionslängd (ca. dubbelt så lång längd).
  9. Använd och variera uppehållstiden mot ytan så att den enda polymeren kan fastna på ytan (vanligtvis 0 – 5 s).
  10. Upprepa bestämningen av InvOLS och fjäderkonstanten i slutet av experimentet för att kontrollera systemets konsistens och stabilitet.
    OBS: För stark vidhäftning mellan polymer och yta kan kalibreringen göras efter det faktiska experimentet för att bevara funktionaliseringen.

6. Utvärdering av uppgifter

För datautvärdering användes en specialskriven programvara baserad på Igor Pro för att utföra följande steg.

  1. Konvertera den råa avböjningssignalen (i Volt) till kraftvärden (i Newtons) genom multiplikation med den inspelade InvOLS och den beslutsamma fjäderkonstanten.
  2. Subtrahera avböjningen av AFM-cantilever (efter multiplikation av den råa avböjningssignalen med InvOLS) från det avstånd som drivs av piezoelementen i vertikal riktning för att erhålla den verkliga förlängningen (spets-ytavstånd)4.
  3. Korrigera de kraftförlängningskurvor som erhålls för drift genom att montera en linjär funktion till baslinjen efter den senaste händelsen och subtrahera samma från kraftförlängningskurvan. Den monterade delen bör utgöra en tillräcklig förlängning från ytan där varken attraktiva eller motbjudande interaktioner observeras mellan AFM-kantileverspets och underliggande yta. Sedan ställs originalplanen in på nollaxeln.
    OBS: När det gäller mätningar på mycket reflekterande ytor som guld kan störningar förekomma. Dessa resulterar från partiell reflektion av laserstrålen från ytan och från baksidan av AFM cantilever. Så, den erhållna kraft-förlängning kurvor kan visa en sinusformad kraft signal artefakt längs den vertikala förlängningen. Detta är en artefakt som hämmar de slutliga kraftvärdena. För att fortfarande ta hänsyn till dessa kraftförlängningskurvor är en korrigering möjlig (figur 2).
  4. Om störningarna visas i kraftförlängningskurvorna väljer du en representativ force-extension-kurva (upprullningskurva) som inte visar några andra händelser än möjligen en topp med ospecifik vidhäftning och samma sinusoidala artefakt (dvs. amplitud och fas) (figur 2A).
    OBS: Jämna ut den representativa kraftförlängningskurvan för att erhålla störningens lågfrekvensmönster.
  5. Välj en kraftförlängningskurva som ska korrigeras (bild 2B).
  6. Överlägg båda kraftförlängningskurvorna från steg 6.4. och 6,5. för att se till att båda visar samma sinusoidala artefakt (dvs. amplitud och fas) (bild 2C).
  7. Subtrahera den (utjämnade) representativa kraftförlängningskurvan från kraftförlängningskurvan som ska korrigeras, vilket leder till en rak snarare än en bihåleformad baslinje(figur 2D).
    OBS: Se till att den ospecifika vidhäftningstoppen för den representativa kurvan skiljer sig från alla enstaka molekylhändelser som visas i kurvorna som ska korrigeras. Valet av representativ kurva är i själva verket avgörande för en korrekt korrigering.

Representative Results

Följande exempel visar resultat av enkel molekyl stretching och desorption av polymererna PEG, PNiPAM och PS. Alla AFM cantilever tips funktionellas med protokollet ovan. PEG och PNiPAM mättes på SiOx med temperaturvariation. För en detaljerad diskussion om de resulterande temperaturberoende sträckkurvorna för PEG och PNiPAM, se Kolberg et al.18 Ett annat kraftförlängningsmotiv är en platå med konstant kraft (t.ex. när desorbing PS från självmonterade monolayers av metyl avslutade alkane tioler på guld (SAM) i vatten4,27,39,51).

Exempel 1: Stretching av PEG och PNiPAM i vatten
Den temperaturberoende stretching beteende i vatten mättes med hjälp av enda PNiPAM och PEG polymerer kovalent bunden till en AFM cantilever spets i ena änden och physisorbed på en SiOx yta i andra änden. Efter kalibreringoch ren kontroll experiment (mindre än 2% av kraft-förlängning kurvor visar enda molekyl händelser), minst två kraft kartor spelades in för varje AFM cantilever. Det temperaturberoende experimentet utfördes genom att registrera minst en kraftkarta vid varje temperatur. När endast ett fåtal stretching händelser dök upp, respektive AFM cantilever kasserades och nästa AFM cantilever av chipet togs (vanligtvis i ordningen C, B, D och E av MLCT-Bio-DC). För PEG:s exemplariska data observerades en enda stretchinghändelse i 95 av 500 uppmätta kraftförlängningskurvor (19 %). För PNiPAM visade 252 av 600 force-extension kurvor ett stretchingmönster (42%). För en bättre jämförelse av kraftförlängningskurvorna genererades en enda huvudkurva för varje temperatur. För detta ändamål valdes endast de kurvor med en stretchinghändelse till minst 500 pN, där konformationsfluktuationer och lösningsmedelseffekter är försumbara,52. Det slutliga antalet sträckor som beaktades var 3 på 278 K, 7 på 298 K och 4 på 318 K för PEG och 4 på 278 K, 3 på 298 K och 3 på 318 K för PNiPAM18.

Proceduren för att generera huvudkurvor anges i figur 3. De valda kraftförlängningskurvorna(figur 3A)skalas om till en längd L0 (förlängning med en kraft av 500 pN), se figur 3B. Vidhäftningstoppen visar en stor variation av ospecifik vidhäftning mellan ytan och AFM-cantileverspetsen, men påverkar inte polymerstretchingbeteendet. Efter sammanslagningen av de omskalade kraftförlängningskurvorna beräknas de i genomsnitt av en binominalutjämning enligt figur 3C. För detta, en Gaussian filter veck data med normaliserade koefficienter som härrör från Pascals triangel på en nivå som motsvarar utjämning parameter2053. Slutligen erhålls en huvudkurva för varje temperatur som anges i figur 3D. Zoom-in visar det område där temperatureffekten på force-extension-beteendet är mest uttalad.

En jämförelse av temperaturen beteende PEG (A) och PNiPAM (B) finns i figur 4. För PEG observerades en minskning av sträckkraften med ökande temperatur. En ökning med cirka 5% av omskalad förlängning vid 100 pN observerades när temperaturen ökade från 278 till 318 K. För PNiPAM kan en motsatt temperaturberoende förskjutning avslöjas. En minskning med cirka 1% av omskalad förlängning vid 100 pN observerades när temperaturen höjdes från 278 till 328 K. Dessutom kunde den stretchingfria energin erhållas från kraftförlängningshuvudkurvorna genom att bestämma området under kurvan för ett givet kraftvärde. Detta skulle kunna användas för att extrahera energiska och entropiska bidrag av stretching fri energi med hjälp av molekylär dynamik (MD) simuleringar18.

Exempel 2: Desorption av PS från en SAM-yta i vatten
Desorptionen av PS från en SAM-yta i vatten kan användas för att bestämma desorptionskraften och längden och därmed kvantifiera den hydrofoba interaktionen. Efter kalibrering en inspelades minst två kraftkartor på två olika platser på ytan. När polymertillsatsen lyckades visade kraftförlängningskurvorna platåer av konstant kraft, som karakteristiskt drag, figur 5A och figur 5C. Platåliknande desorption observeras när dynamiken i de sonderade bindningarna är mycket snabbare än draghastigheten för AFM-cantileverspetsen (kvasijämvikt). Desorption krafter platå-liknande kraft-förlängning kurvor direkt ger vidhäftning fri energi genom att integrera kraft-förlängning spår54. De har använts för att bestämma elektrostatiska, dispersiva och hydrofoba interaktioner samt friktionsegenskaper hos enskilda polymerer på ytor i flytande miljö2,4,23,51,54,55.

Varje platå av konstant kraft var utrustad med en sigmoidal kurva för att bestämma desorption kraft och desorption längd, som sedan ritades i histogram. Histogrammen var försedda med en Gaussian för att extrahera det maximala värdet och standardavvikelsen. För en bättre översikt visades desorptionskraft och längdvärden tillsammans i ett scatter-diagram, enligt figur 5B och figur 5D.

För polystyren på SAM i vatten motsvarar de bestämda desorptionskrafterna tidigare erhållna värden19,23. Eftersom desorptionslängden korrelerar med polymerkonturlängden51kan desorptionslängdsfördelningen användas som ett bevis på den kovalenta bindningen av respektive polymer till AFM-kantileverspetsen via sin funktionella ändgrupp. Således fungerar desorptionslängden som ett fingeravtryck.

För mer än en polymer fäst vid AFM-kantileverspetsen kan kaskader av platåer (diskreta steg) observeras i kraftförlängningskurvorna56. Varje platå representerar desorption av en polymer vid en annan förlängning. Experimentet som gavs i figur 5C och figur 5D visade ett typiskt fall av två polymerer knutna till AFM-kantileverspetsen samtidigt. Genom att montera den slutliga bristningen kunde en bimodal fördelning hittas för desorptionslängden, medan desorptionskraften visade en smal fördelning. I detta fall kunde den mindre desorptionslängden hittas i 90% av kraftförlängningskurvorna, antingen som en enda platå eller som en extra platå på den längre platån, enligt figur 5C. Den högre desorptionslängden hittades i 37% av de erhållna kraftförlängningskurvorna. Fördelningen av desorptionslängd kan således användas för att bestämma antalet olika polymerer som är fästa vid AFM-kantileverspetsen. I allmänhet är en smal fördelning av desorptionslängdsvärdena en bra indikation på att en och samma enda polymer undersöktes i de erhållna kraftförlängningskurvorna. Samtidigt kan en superposition av respektive krafter-förlängning användas för att avgöra om en och samma enda polymer har mätts.

Efter att ha visat kovalent bindning av en enda PS-polymer kan ytterligare experiment med denna PS-polymer utföras varierande substrat (fast yta samt polymerfilmer), lösningsmedelsförhållanden, temperatur, draghastighet eller uppehållstid.

Figure 1
Bild 1: Schematisk översikt över spetsfunktionaliseringsprocessen. Inkluderar kemisk modifiering av AFM-kantileverspetsen efter (1) plasmaaktivering (2) silanisering/PEGylation och (3) polymertillsats. Dessutom visas de detaljerade kemiska strukturerna hos de polymerer som används, nämligen PEG, PNiPAM och PS. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Eliminering av störningar i kraftförlängningskurvor. (A) Hitta en kraft-förlängning kurva som visar en sinusformad kraft signal artefakt längs förlängningen men har ingen enda molekyl stretching händelse. (B)Välj en kraftförlängningskurva med en enda molekylhändelse, som ska korrigeras från den sinusformade artefakten. (C)Överlagra kurvorna för att kontrollera om de sinusformade artefakterna i kurvorna verkligen matchar. (D)Genom att subtrahera kraftförlängningskurvan(A)från(B)erhålls en kraftförlängningskurva med en rak baslinje. Även om vidhäftningstoppen inte kan användas för vidare analys korrigeras kraftförlängningskurvan nu för artefakten som leder till mycket mer exakta kraftvärden i regionen av den enda molekylhändelsen (här: > 0,2 μm förlängning). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Bestämning av huvudkurvor från force-extension-kurvor av PEG vid 298 K. (A)Experimentella data vid 298 K, med hjälp av 7 kraftförlängningskurvor. Efter omskalning till en längd L0 med en kraft på 500 pN (B)kan kraftförlängningskurvorna slås samman och i genomsnitt beräknas genom tvånominell utjämning som får en huvudkurva (C). De omskalade kurvorna anges som punkter medan huvudkurvan visas som en solid linje. Slutligen kan de erhållna huvudkurvorna för olika temperaturer jämföras(D). Zoom-in anger det område där temperatureffekten på force-extension-beteendet är mest uttalad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Jämförelse av de temperaturberoende huvudkurvorna i PNiPAM och PEG. För PEG observeras en ökning av omskalad förlängning vid 100 pN (mellankraftsintervall) när temperaturen höjs(A),medan en motsatt temperaturberoende förskjutning för PNiPAM avslöjas (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Analys av kraftförlängningskurvor av PS på SAM i vatten. (A)Exemplarisk force-extension kurva (blå) med en sigmoidal passform av platån (lila). Dessutom markerar pilarna den bestämda kraften (röd) och längden (grön) av platån. Desorptionskraft- och desorptionslängdsvärden som erhålls av sigmoidalanfall visas i ett spridningsområde och de resulterande histogrammen är utrustade med en Gaussian. b)De fastställda genomsnittliga desorptionskraft- och desorptionslängdsvärdena är (112 ± 6) pN och (659 ± 7) nm, varvid 93 % av kraftförlängningskurvorna uppvisar sådana enstaka platåhändelser. c)Exemplarisk force-extension kurva (blå) för två polymerer som är fästa vid AFM-kantileverspetsen samtidigt. Här visar desorptionskraften en unimodal fördelning med ett genomsnittligt kraftvärde på (117 ± 5) pN, medan en bimodal fördelning kan hittas för desorptionslängden som leder till genomsnittliga längdvärden på (656 ± 9) nm och (1050 ± 16) nm. (D)90 % av de samplade kraftförlängningskurvorna uppvisar endast enstaka platåhändelser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

AFM-baserade SMFS är ett av de viktigaste verktygen för att undersöka interaktioner med enmolekyler inom polymerfysik. För en sann enda molekyl experiment, kovalent fastsättning av sonden polymer till en AFM cantilever spets är viktigt.

Många tidigare verk är baserade på nanofiske experiment, särskilt för PNiPAM, där polymerer adsorberas på en yta och sedan sträcks genom att slumpmässigt plocka dem från substratet med hjälp av en AFM cantilever spets30,31. Detta kan förändra resultaten och leda till feltolkning av den enda molekylen beteende. Där kan kooperativa effekter dominera resultaten eftersom interaktioner med angränsande polymerer inte kan uteslutas. Detta har en stor inverkan på resultaten, särskilt för polymerer som visar betydligt annorlunda beteende i bulk jämfört med enstaka isolerade molekyler57,58.

Funktionsprotokollet som presenteras här är tillförlitligt och kan enkelt appliceras på olika polymerer, oavsett deras konturlängd, hydroforbicitet eller monomerernas sterichinder. Dessutom tillhandahålls en passivation för att förhindra oönskade interaktioner mellan den enda sondpolymeren och AFM-kantileverspetsen samt mellan AFM-kantileverspetsen och den underliggande ytan. Dessutom visas utvärderingen av force-extension-kurvor som visar stretchinghändelser. Där föreslås ett förfarande för bestämning av huvudkraftförlängningskurvor. Detta ger ett bättre sätt att avslöja, t.ex. Dessutom tillhandahålls analys av enstaka molekyldesorptionhändelser med konstanta kraftplatåer. Dessutom ges ett enkelt sätt att korrigera sinusoidala kraftsignalartefakter i kraft-förlängningskurvor som annars kan försämra experimentets resultat.

Jämfört med Stetter et al.39reduceras det funktionaliseringsförfarande som presenteras här till tre steg i stället för fyra och procedurens robusthet förbättras. Den stora fördelen med att utföra PEGylation och silanisering i ett steg är att få en bättre kontrollerad reaktion och att öka avkastningen. Dessutom behöver färre lösningar förberedas och färre sköljsteg krävs. Detta minskar ansträngningen och tiden för beredning och ökar reproducerbarheten. Dessutom är flytta AFM cantilevers alltid en viktig del av funktionaliseringsprocessen. En överföring från en lösning till den andra riskerar alltid att starkt påverka funktionaliseringskvaliteten på grund av överföringar via luftvattengränssnittet eller att förlora AFM-cantilevers genom felaktig användning av pincett.

För att bevisa korrekt kovalent fastsättning av en enda polymer till en AFM-kantileverspets måste olika villkor uppfyllas. För det första är kontroll AFM-kantileverav av stor betydelse och bör förberedas för varje funktionalisering. Funktionaliseringsprocessen och vätskecellen för att utföra experimenten anses endast vara rena, om ett litet antal kraftförlängningskurvor visar sträckor eller platåer i kontrollexperimentet (i de presenterade exemplen mindre än 2 %).

Ett tydligt stretchingmönster utan ytterligare droppar eller maxima är viktigt för att ha rätt enda molekyl stretching händelser. Dessutom bör beroendet av bristningkraft på kraftbelastningshastigheten vid bristning eller det fullständiga elastiska svaret från sträckningskurvan analyseras för att utesluta samtidig desorption av flera polymerer59,60. För PEG och PNiPAM visade 19% och 42% av kraftförlängningskurvorna som togs på olika positioner på ytan ett sådant stretchingmönster. För att få stretching händelser, physisorption av polymeren till respektive underliggande yta måste vara stark. Annars observeras en platåliknande desorptionhändelse. Detta är ännu mer avgörande för att upptäcka stretching händelser vid höga krafter (upp till 500 pN eller mer). Eftersom denna starka fysisorption inte uppfylls för varje kraft-förlängning kurva, avkastningen av sådana händelser är mindre än för ren platå-liknande desorption händelser. Som ett alternativ kan starkt hålla grupper som katekol eller chemisorption mellan polymer och underliggande yta användas. Detta kräver dock att ytterligare funktionella grupper eller kopplingsplatser införs vid polymeren61,,62.

Polymerens massa (dvs. konturlängd) ger ett värdefullt fingeravtryck. Även om massan inte direkt kan översättas till den uppmätta konturlängden av följande skäl, är längdfördelningen mycket värdefull för att definiera händelser med en molekyl. När det gäller en PNiPAM-polymer med låg polydispersity (中= 1,28) fann vi betydande skillnader i förlängningsvärdena för de erhållna stretchinghändelserna (och därmed i polymerlängden) i experimenten. En anledning till detta kan vara bestämningen av polymerlängden och dess fördelning. I storlek-uteslutning kromatografi (SEK), en relativ vikt av målet polymerbestäms i jämförelse med standarder som PS eller poly (metyl metakrylat) (PMMA)63. Den förmodade relativa vikten förväntas avvika från den absoluta molekylvikten eftersom målpolymerens hydrodynamiska radie och standarden kan skilja sig avsevärt. Dessutom kan silane skiktet oligomerized av falska vatten i toluen under funktionaliseringsprocessen. Fastsättningen av sådana oligomers till AFM-kantileverspetsen leder till ett mer flexibelt lager med färre ankarpunkter64. Polymerens fästpunkt till silikonskiktet kanske inte nödvändigtvis ligger i spetsen som leder till en förskjutning av de upptäckta längdvärdena29. Medan en polymermodell som maskliknande kedja (WLC) eller den fritt ledade kedjan (FJC) modellen inte kan återge respektive force-extension beteende för PEG eller PNiPAM ordentligt över hela förlängningsområdet18,29,4141,65,66, en sådan polymer modell kan vara värdefullt för andra polymera och proteinsystem10,15,,67,68.

Kovalent fastsättning av en enda PS-polymer (med en konturlängd på mer än 1 μm) anses endast vara framgångsrik, när ett stort antal kraftförlängningskurvor visar en tillräckligt lång platå med konstant kraft (figur 5). En platå som härrör från desorbing en enda polymer definieras av en enda skarp droppe av en konstant kraft till baslinjen vid en viss förlängning, som anges i figur 5A. Om fler polymerer är fästa vid AFM-kantileverspetsen observeras en kaskad av platåer56 (figur 5C). Platånlängd (desorptionslängd), korrelerad med polymerkonturlängden51, måste vara betydligt längre än någon vidhäftningstopp på grund av ospecifik vidhäftning av AFM-cantileverspetsen till den underliggande ytan (här omkring 200 nm). Funktioner som endast visas i en enda kraftförlängningskurva bör inte tolkas. I de presenterade experimenten visade minst 80 av 100 kurvor en platå längre än 200 nm i minst två kraftkartor på två olika platser på ytan. Dessutom visar fördelningen av desorptionslängder, med hjälp av spridningsområden som anges i figur 5B och 5D,om och hur många polymerer som är bundna till AFM-kantileverspetsen. När det gäller PS fungerade en smal fördelning av desorptionskraft och längd som tagits från platåer i kraftförlängningskurvorna som bevis på ett framgångsrikt kovalent fastsättning. Detta bevisade slutligen framgången av functionalizationprotokollet. Därför rekommenderar vi starkt att presentera sådana kraft- och längdfördelningar i publikationer.

Utvärdering av kraftförlängningskurvor med inbyggda algoritmer som utgör många förinställda parametrar bör göras varsamt. Skäl en fast provtagningshastighet är till exempel inte lämplig för varje tillämpad draghastighet eller att en automatisk utjämning av kraftförlängningskurvorna kan vara i genomsnitt viktiga detaljer. Vanligtvis en korrekt förståelse av respektive utvärderingsförfarande kan förhindra fel i utvärderingsförfarandet, som i sin tur starkt kan påverka de slutliga resultaten av en AFM-baserade SMFS experiment.

Sammanfattningsvis presenterar vi ett funktionsiseringsprotokoll som är tillförlitligt och lätt kan appliceras på en mängd olika polymerer. Dessutom presenteras en korrekt utvärdering av enmolekylkraftförlängningskurvor, vilket gör det möjligt att bestämma fysiska parametrar som sträckkraft, desorptionskraft och desorptionslängd. De presenterade protokollen och procedurerna är värdefulla för undersökning av stimuli-responsiva system på enmolekylnivå.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har något konkurrerande ekonomiskt intresse.

Acknowledgments

B.N.B. och T.H. erkänner finansiering från Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Tyska forskningsstiftelsen) inom ramen för Tysklands spetsforskningsstrategi – EXC-2193/1 – 390951807, gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzstrategie des Bundes und der Länder – EXC-2193/1 – 390951807, och bevilja HU 997/1-13 (projekt # 420798410). M.G. erkänner delvis stöd inom ramen för LOEWE-projektet iNAPO av Hessenstate Ministry of Higher Education, Research and the Arts. Vi tackar Dr Wolfgang Bronner och Dr Agne Zukauskaite från Fraunhofer Institute for Applied Solid State Physics IAF för donation av högkvalitativa guldbelagda kisel rån.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Dodecanethiol (≥98%) Sigma-Aldrich, USA 417364-500ML Used for SAM
Ammonia solution (30%) Roth, Germany CP17.2 Used for cleaning
Cypher ES Asylum Research, an Oxford Instruments company, USA - AFM
Ethanol (≥99.9%) Roth, Germany PO76.1 Solvent
Gold coated silicon wafer Fraunhofer Institute for Applied Solid State Physics IAF, Germany - Used for SAM
High Resolution Replicating Compound Microset Products Ltd, UK 101RF Bonding agent
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich, USA H1009 Used for cleaning
Igor Pro Wavemetrics, USA - Software environment
Tetra-30-LF-PC Diener Electronic, Germany - Plasma chamber
Maleimide-polyethylene glycol-triethoxysilane Creative PEG works, USA PHB-1923 Linker polymer
MLCT-Bio-DC Bruker, USA MLCT-Bio-DC AFM cantilever
Prime CZ-Si wafer, n-type (Phosphor) TTV < 10 µm MicroChemicals, Germany WSA40600250 P1314SNN1 Silicon wafer
Purelab Chorus 1, 18.2 MΩ cm Elga LabWater, Germany 10034-540 Ultrapure water source
R3 SA Vomm GmbH, Germany 5803 Blank Tweezers
Thiol terminated poly(N-isopropylacrylamide) Gallei Group, Saarland University, Germany - PNiPAM probe polymer
Thiol terminated polystyrene Polymer Source, Canada P40722-SSH PS probe polymer
Thiol-polyethylene glycol-thiol Creative PEGWorks, USA PSB-615 PEG probe polymer
Toluene (99.99%) Fisher Chemicals T324-500 Solvent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Physical Review Letters. 56 (9), 930-933 (1986).
  2. Hugel, T., Seitz, M. The Study of Molecular Interactions by AFM Force Spectroscopy. Macromolecular Rapid Communications. 22 (13), 989-1016 (2001).
  3. Butt, H. -J., Cappella, B., Kappl, M. Force measurements with the atomic force microscope: Technique, interpretation and applications. Surface Science Reports. 59 (1-6), 1 (2005).
  4. Balzer, B. N., Hugel, T. Single-Molecule Detection and Manipulation. Reference Module in Materials Science and Materials Engineering. Hashmi, S. , Elsevier. Amsterdam. (2016).
  5. Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).
  6. Edwards, D. T., Faulk, J. K., LeBlanc, M. -A., Perkins, T. T. Force Spectroscopy with 9-μs Resolution and Sub-pN Stability by Tailoring AFM Cantilever Geometry. Biophysical journal. 113 (12), 2595-2600 (2017).
  7. Alsteens, D., et al. Nanomechanical mapping of first binding steps of a virus to animal cells. Nature Nanotechnology. 12 (2), 177-183 (2017).
  8. Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy. Nature. 468, 72-76 (2010).
  9. Shibata, M., et al. Real-space and real-time dynamics of CRISPR-Cas9 visualized by high-speed atomic force microscopy. Nature Communications. 8 (1), 1-9 (2017).
  10. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  11. Oesterhelt, F., Oesterhelt, D., Pfeiffer, M., Engel, A., Gaub, H. E., Müller, D. J. Unfolding pathways of individual bacteriorhodopsins. Science. 288 (5463), New York, N.Y. 143-146 (2000).
  12. Hugel, T., Holland, N. B., Cattani, A., Moroder, L., Seitz, M., Gaub, H. E. Single-molecule optomechanical cycle. Science. 296 (5570), New York, N.Y. 1103-1106 (2002).
  13. Yu, H., Siewny, M. G. W., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins. Science. 355 (6328), New York, N.Y. 945-950 (2017).
  14. Erlich, K. R., Sedlak, S. M., Jobst, M. A., Milles, L. F., Gaub, H. E. DNA-free directed assembly in single-molecule cut-and-paste. Nanoscale. 11 (2), 407-411 (2019).
  15. Rico, F., Russek, A., González, L., Grubmüller, H., Scheuring, S. Heterogeneous and rate-dependent streptavidin-biotin unbinding revealed by high-speed force spectroscopy and atomistic simulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (14), 6594-6601 (2019).
  16. Löf, A., et al. Multiplexed protein force spectroscopy reveals equilibrium protein folding dynamics and the low-force response of von Willebrand factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (38), 18798-18807 (2019).
  17. Kienle, S., Liese, S., Schwierz, N., Netz, R. R., Hugel, T. The effect of temperature on single-polypeptide adsorption. Chemphyschem : a European journal of chemical physics and physical chemistry. 13 (4), 982-989 (2012).
  18. Kolberg, A., et al. Opposing Temperature Dependence of the Stretching Response of Single PEG and PNiPAM Polymers. Journal of the American Chemical Society. 141 (29), 11603-11613 (2019).
  19. Balzer, B. N., et al. Cohesion Mechanisms of Polystyrene-Based Thin Polymer Films. Macromolecules. 46 (18), 7406-7414 (2013).
  20. Balzer, B. N., et al. Adhesion property profiles of supported thin polymer films. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (13), 6300-6306 (2013).
  21. Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction: The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Phases. Biophysical journal. 107 (5), 1167-1175 (2014).
  22. Schwierz, N., Krysiak, S., Hugel, T., Zacharias, M. Mechanism of Reversible Peptide-Bilayer Attachment: Combined Simulation and Experimental Single-Molecule Study. Langmuir. 32 (3), 810-821 (2016).
  23. Balzer, B. N., et al. Nanoscale Friction Mechanisms at Solid-Liquid Interfaces. Angewandte Chemie International Edition. 52 (25), 6541-6544 (2013).
  24. Balzer, B. N., Kienle, S., Gallei, M., von Klitzing, R., Rehahn, M., Hugel, T. Stick-Slip Mechanisms at the Nanoscale. Soft Materials. 12, 106-114 (2014).
  25. Kühner, F., Erdmann, M., Sonnenberg, L., Serr, A., Morfill, J., Gaub, H. E. Friction of single polymers at surfaces. Langmuir. 22 (26), 11180-11186 (2006).
  26. Grebíková, L., Gojzewski, H., Kieviet, B. D., Klein Gunnewiek, M., Vancso, G. J. Pulling angle-dependent force microscopy. The Review of Scientific Instruments. 88 (3), 33705 (2017).
  27. Geisler, M., et al. Hydrophobic and Hofmeister effects on the adhesion of spider silk proteins onto solid substrates: an AFM-based single-molecule study. Langmuir. 24 (4), 1350-1355 (2008).
  28. Pirzer, T., Hugel, T. Atomic force microscopy spring constant determination in viscous liquids. Review of Scientific Instruments. 80 (3), 35110 (2009).
  29. Liese, S., et al. Hydration Effects Turn a Highly Stretched Polymer from an Entropic into an Energetic Spring. ACS Nano. 11 (1), 702-712 (2017).
  30. Cui, S., Pang, X., Zhang, S., Yu, Y., Ma, H., Zhang, X. Unexpected Temperature-Dependent Single Chain Mechanics of Poly(N-isopropyl-acrylamide) in Water. Langmuir. 28 (11), 5151-5157 (2012).
  31. Liang, X., Nakajima, K. Nanofishing of a Single Polymer Chain: Temperature-Induced Coil-Globule Transition of Poly(N -isopropylacrylamide) Chain in Water. Macromolecular Chemistry and Physics. 219 (3), 1700394 (2018).
  32. Zhang, W., Zou, S., Wang, C., Zhang, X. Single Polymer Chain Elongation of Poly(N -isopropylacrylamide) and Poly(acrylamide) by Atomic Force Microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 104 (44), 10258-10264 (2000).
  33. Hermanson, G. T. Bioconjugate techniques - 3rd Edition. , Academic Press. San Diego. (2013).
  34. Leitner, M., et al. Single-molecule AFM characterization of individual chemically tagged DNA tetrahedra. ACS Nano. 5 (9), 7048-7054 (2011).
  35. Walder, R., et al. Rapid Characterization of a Mechanically Labile α-Helical Protein Enabled by Efficient Site-Specific Bioconjugation. Journal of the American Chemical Society. 139 (29), 9867-9875 (2017).
  36. Tang, J., et al. High-affinity tags fused to s-layer proteins probed by atomic force microscopy. Langmuir. 24 (4), 1324-1329 (2008).
  37. Wildling, L., et al. Linking of sensor molecules with amino groups to amino-functionalized AFM tips. Bioconjugate Chemistry. 22 (6), 1239-1248 (2011).
  38. Maity, S., Viazovkina, E., Gall, A., Lyubchenko, Y. A. A Metal-free Click Chemistry Approach for the Assembly and Probing of Biomolecules. Journal of Nature and Science. 2 (4), 187 (2016).
  39. Stetter, F. W. S., Kienle, S., Krysiak, S., Hugel, T. Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (96), e52456 (2015).
  40. Becke, T. D., et al. Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58167 (2018).
  41. Ott, W., et al. Elastin-like Polypeptide Linkers for Single-Molecule Force Spectroscopy. ACS Nano. 11 (6), 6346-6354 (2017).
  42. Newton, R., et al. Combining confocal and atomic force microscopy to quantify single-virus binding to mammalian cell surfaces. Nature Protocols. 12 (11), 2275-2292 (2017).
  43. Staros, J. V., Wright, R. W., Swingle, D. M. Enhancement by N-hydroxysulfosuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Analytical Biochemistry. 156 (1), 220-222 (1986).
  44. Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters. Analytical Biochemistry. 185 (1), 131-135 (1990).
  45. Baird, J. A., Olayo-Valles, R., Rinaldi, C., Taylor, L. S. Effect of Molecular Weight, Temperature, and Additives on the Moisture Sorption Properties of Polyethylene Glycol. Journal of Pharmaceutical Sciences. 99 (1), 154-168 (2010).
  46. Halperin, A., Kröger, M., Winnik, F. M. Poly(N-isopropylacrylamide) Phase Diagrams: Fifty Years of Research. Angewandte Chemie International Edition. 54 (51), 15342-15367 (2015).
  47. Barradas, R. G., Fletcher, S., Porter, J. D. The hydrolysis of maleimide in alkaline solution. Canadian Journal of Chemistry. 54 (9), 1400-1404 (1976).
  48. Kharasch, N., Tarbell, D. S. Chapter 10 - The Mechanism of Oxidation of Thiols to Disulfides. Organic Sulfur Compounds. , 97-102 (1961).
  49. Folkers, J. P., Laibinis, P. E., Whitesides, G. M. Self-assembled monolayers of alkanethiols on gold: comparisons of monolayers containing mixtures of short- and long-chain constituents with methyl and hydroxymethyl terminal groups. Langmuir. 8 (5), 1330-1341 (1992).
  50. Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Review of Scientific Instruments. 64 (7), 1868-1873 (1998).
  51. Krysiak, S., Liese, S., Netz, R. R., Hugel, T. Peptide desorption kinetics from single molecule force spectroscopy studies. Journal of the American Chemical Society. 136 (2), 688-697 (2014).
  52. Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H. E., Netz, R. R. Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory. Physical Review Letters. 94 (4), 48301 (2005).
  53. Marchand, P., Marmet, L. Binomial smoothing filter: A way to avoid some pitfalls of least-squares polynomial smoothing. Review of Scientific Instruments. 54 (8), 1034-1041 (1983).
  54. Horinek, D., et al. Peptide adsorption on a hydrophobic surface results from an interplay of solvation, surface, and intrapeptide forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2842-2847 (2008).
  55. Friedsam, C., Gaub, H. E., Netz, R. R. Adsorption energies of single charged polymers. EPL (Europhysics Letters). 72 (5), 844-850 (2005).
  56. Scherer, A., Zhou, C., Michaelis, J., Brauchle, C., Zumbusch, A. Intermolecular Interactions of Polymer Molecules Determined by Single-Molecule Force Spectroscopy. Macromolecules. 38 (23), 9821-9825 (2005).
  57. Abbott, L. J., Tucker, A. K., Stevens, M. J. Single Chain Structure of a Poly(N-isopropylacrylamide) Surfactant in Water. The Journal of Physical Chemistry B. 119 (9), 3837-3845 (2015).
  58. Okano, T., Bae, Y. H., Jacobs, H., Kim, S. W. Thermally on-off switching polymers for drug permeation and release. Journal of Controlled Release. 11 (1), 255-265 (1990).
  59. Sulchek, T., Friddle, R. W., Noy, A. Strength of multiple parallel biological bonds. Biophysical journal. 90 (12), 4686-4691 (2006).
  60. Sulchek, T. A., et al. Dynamic force spectroscopy of parallel individual Mucin1-antibody bonds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (46), 16638-16643 (2005).
  61. Krysiak, S., Wei, Q., Rischka, K., Hartwig, A., Haag, R., Hugel, T. Adsorption mechanism and valency of catechol-functionalized hyperbranched polyglycerols. Beilstein Journal of Organic Chemistry. 11, 828-836 (2015).
  62. Jobst, M. A., Schoeler, C., Malinowska, K., Nash, M. A. Investigating receptor-ligand systems of the cellulosome with AFM-based single-molecule force spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (82), e50950 (2013).
  63. Trathnigg, B. Determination of MWD and chemical composition of polymers by chromatographic techniques. Progress in Polymer Science. 20 (4), 615-650 (1995).
  64. Blass, J., Albrecht, M., Wenz, G., Zang, Y. N., Bennewitz, R. Single-molecule force spectroscopy of fast reversible bonds. Physical Chemistry Chemical Physics. 19 (7), 5239-5245 (2017).
  65. Oesterhelt, F., Rief, M., Gaub, H. E. Single molecule force spectroscopy by AFM indicates helical structure of poly(ethylene-glycol) in water. New Journal of Physics. 1, 1-11 (1999).
  66. Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. Quantifying thiol-gold interactions towards the efficient strength control. Nature Communications. 5, 4348 (2014).
  67. Lyu, X., Song, Y., Feng, W., Zhang, W. Direct Observation of Single-Molecule Stick-Slip Motion in Polyamide Single Crystals. ACS Macro Letters. 7 (6), 762-766 (2018).
  68. Hugel, T., et al. Elasticity of Single Polyelectrolyte Chains and Their Desorption from Solid Supports Studied by AFM Based Single Molecule Force Spectroscopy. Macromolecules. 34 (4), 1039-1047 (2001).

Tags

Kemi enda molekyl kraftspektroskopi atomkraftmikroskop vidhäftning funktionalisering PEGylation
Kovalent fastsättning av enstaka molekyler för AFM-baserad force spectroscopy
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kolberg, A., Wenzel, C., Hugel, T.,… More

Kolberg, A., Wenzel, C., Hugel, T., Gallei, M., Balzer, B. N. Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (157), e60934, doi:10.3791/60934 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter