Summary
在有机溶剂和水性溶剂的界面上，定制的两栖乳素样蛋白质组装成复杂的超分子结构，如由环境参数触发的囊泡、纤维和焦质。所述装配协议产生具有可调特性的蛋白质膜型隔间 （PMBC），能够封装各种货物。
Abstract
定制蛋白质积木是超分子结构（如最小细胞、药物输送车辆和酶支架）组装的多功能候选物。由于其生物相容性和遗传性，弹性蛋白（ELP）是生物技术和生物医学应用的理想构建基块。然而，以蛋白质为基础的超分子结构的组装具有独特的物理化学特性和良好的封装潜力仍然具有挑战性。
在这里，我们提供两种高效的协议，引导两栖ELPs自组装成超分子蛋白结构，如球形角质、纤维和稳定囊泡。提交的装配协议基于具有适应性物理化学特性的ElP生成蛋白膜基隔间（PMBC）。PMBC 演示相分离行为并揭示方法依赖膜融合，并能够封装化学多样化的荧光货物分子。由此产生的PMBC作为药物配方和输送平台、人工细胞和分段反应空间具有很高的应用潜力。
Introduction
用于生物技术应用的超分子结构的组装变得越来越重要。,2,3,4,5对于具有所需物理化学特性的功能性结构（如锥形、囊泡和纤维）的组装，了解和控制这些部件的物理化学和构象特性非常重要。由于在自然界中发现的分子的分子精度，超分子结构的构建基块越来越多地基于脂质、核酸或蛋白质。与合成聚合物相比，蛋白质积木能够精确控制基因水平上的新兴超分子结构6。单个蛋白质构建基块的主要氨基酸（aa）序列本质上编码了从分子到宏观水平的信息，以及最终超分子结构7的三维形状和物理特性。
报告用于组装不同超分子结构的方法通常涉及两栖蛋白，如温度敏感弹性蛋白（ELP）5,8,9， 重组烯烃10和人工蛋白质两栖动物11.温度触发方法导致云母的组装4,10,12纤维13床单14和囊泡9,15,16.有机溶剂在形成基于动态蛋白的囊泡方面应用了方法8,11,14.到目前为止，用于囊泡形成的应用协议通常缺乏对微米大小的装配体的装配控制16,17或装配产量有限5.此外，一些报告的基于ELP的囊泡有削弱封装电位12或久而久之的稳定性有限9.针对这些缺点，所提出的协议使微数和亚微米大小的超分子结构能够自我组装，具有明显的物理化学特性、良好的封装电位和长期稳定。定制的两栖ELP组装成超分子结构，范围从球形锥形和高度有序的扭曲纤维束到单层囊泡，具体取决于应用的协议和相关环境条件。大型孔径蛋白膜基隔间（PMBC）揭示了所有主要表型，如膜融合和相分离行为，类似于脂质体。PMBC 可有效封装化学多样化的荧光货运分子，这些分子可以使用简单的异位荧光显微镜进行监测。本研究中使用的重复ELP域是蛋白质超分子结构的有吸引力的构建基块18.ELP 五角苷酸重复单元 （VPGVG） 已知可以耐受除第四位置的 proline（瓦林、V）之外的不同 aa，同时保持其结构和功能特性19.含有独特亲水性和疏水域的两栖ELP的设计通过在VPGXG重复中插入具有明显疏水性、极性和电荷的aaguest残留物（X）来实现20.两栖ELP域，其中配备了疏水性苯丙氨酸 （F） 或异硫氨酸 （I），而亲水域含有带电谷氨酸 （E） 或精氨酸 （R） 作为客人残留物。可在补充信息和参考中找到符合条件的两栖ELP构造和相应的 aa 序列列表8,21.所有构建基块，其中配备了小荧光染料或荧光蛋白，通过荧光显微镜进行可视化。mEGFP和其他荧光蛋白是N终端融合到ELP两栖爱好者的亲水域。有机染料通过无铜菌株结合，促进烷基苯-azide环增剂（SPAAC）与共同翻译引入的不天然氨基酸（UAA）。UAA的共同翻译合并para-阿齐多芬丙氨酸 （pAzF）22允许对亲水ELP域进行N端修改。通过这种方式，绿色荧光染料BDP-FL-PEG4-DBCO （BDP） 或任何具有紧绷环状素的小荧光分子可用作荧光探针。成功加入UAA pAzF并通过SPAAC对染料进行环化，可通过LC-MS/MS轻松确认，因为相应的试性肽具有有效的电化8.由于荧光蛋白与大多数有机溶剂不相容，因此应用这种小型有机染料拓宽了装配协议的溶剂选择范围。下面介绍了我们实验室开发的两种最有效的超分子结构装配协议。THF 膨胀方法仅与有机染料改性两栖 ELP 兼容。相反，1-丁醇（BuOH）挤出方法与许多蛋白质兼容，如mEGFP，因为所述方法完全保存了这些融合蛋白的荧光。此外，使用 BuOH 挤出方法，小分子的封装和车辆融合行为效果最佳。
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Protocol
1. 两栖弹性蛋白（ELPs）的设计与克隆
- 克隆和设计构造，如其他地方描述的8，,20。质粒可应要求提供。
2. 蛋白质表达、纯化和制备
- F20E20-mEGFP 和 F20E20-mCherry 的表达式
- 接种主要表达文化，从一夜的战前文化到OD600的0.3。在37°C下孵育，在无菌400 mL LB介质中孵育200rpm，并在2升烧瓶中补充抗生素。
- 准备 IPTG 库存解决方案 （1 M），用于诱导超纯水中的表达培养。
- 当达到 OD600 0.5_0.8 时，将 IPTG 添加到表达培养到最终浓度 1 mM，并将孵育温度降低至 20°C。在 20°C 下允许表达，在 200 rpm 下进行大约 20 小时。
- 含有UAA pAzF的两栖ELP的表达
- 接种来自隔夜大肠杆菌预培养的主要表达培养，含有两个质粒pEVOL pAzF，例如pET28-NMBL-（TAG）R40F20-他的OD600的0.3（见氨基酸序列的补充信息）。在37°C下孵育，在无菌400 mL LB介质中孵育200 rpm，在2升烧瓶中补充卡那霉素和氯霉素。
- 在超纯水中制备 100 mM pAzF 库存解决方案。对于 10 mL 的 pAzF 库存溶液，重量为 206.2 mg pAzF，并在 8 mL 超纯水中重新悬浮。要溶解 pAzF，用 3 M NaOH 提高溶液的 pHH，并大力混合。当 pAzF 溶解时，小心地将 pH 降至 10.5，并将超纯水添加到最终体积为 10 mL。使用无菌过滤器 （0.22 μm） 和 2 mL 反应管中的溶液等值。
- 在超纯水中制备 1 M IPTG 库存解决方案，在超纯水中制备 20% 的阿拉伯糖库存解决方案。
- 当达到 OD600 0.5_0.8 时，将 pAzF 添加到表达式区域性到最终浓度为 2 mM。孵育培养10分钟，37°C，200 rpm，允许pAzF上升。
- 通过同时添加 IPTG （1 mM） 和阿拉伯糖 （2%） 诱导靶蛋白的表达和必要的 tRNA/t-RNA 合成酶的表达并将孵化温度降至20°C。
- 在 20°C 下允许表达，在 200 rpm 下进行大约 20 小时。在4°C、4000 x g、40分钟时通过g离心采集表达培养。
- 细胞水清和蛋白质纯化
- 在裂酶缓冲液中重新悬浮大肠杆菌颗粒（每升培养物10毫升;50 mM Tris-HCl pH 8、500 mM NaCl、4 M尿素、0.25%Triton X-100），含有裂酶（0.1毫克/毫升）和PMSF（0.1mM）。在冰上孵育30分钟，然后将样品浸入液氮中，冷冻和解冻两次。
- 声波悬浮液（30%，15次，30秒：10秒断），并通过离心（4°C，10，000 x g，40 分钟）清除液化 g。
- 使用亲和色谱来纯化蛋白质（例如，使用连接到分数收集器的FPLC系统在1 mL镍柱上;参见材料表）。用洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl，500 mM NaCl，4 M尿素，250~500 mm imidazole）将蛋白质与洗脱液缓冲液（50 mM Tris-HCl）一起，储存在4°C，直到进一步加工。
- 通过 SDS-PAGE 分析净化效率。
3. 通过SPAAC对ElPs进行染料改性
- 粗略估计 ELP 溶液的浓度。 280浓度评估的吸收没有价值，因为pAzF-R40F20序列缺乏紫外线范围内吸收的氨基酸。因此，以前嗜血和加权的ELP两栖动物可以作为SDS PAGE波段比较的参考。通过比较来自ELP溶液的SDS PAGE波段的灰值浓度与已知浓度和样品的粗略浓度可以估计您的样品的粗糙浓度。
- 将1 μL的荧光染料BDP-FL-PEG4-DBCO（10 mM库存溶液;20μM最终浓度）加入到500μL的ELP溶液（+20μM）。在15°C下孵育反应约10小时，同时摇动并保护光线。
- 为进一步使用，可分二化反应以去除过多的 BDP。
- 将透析膜（例如12 kDa切断）在超纯水中平分10分钟。将透析膜切成正确的尺寸，置于含有点击ELP溶液的反应管开口的顶部。要将透析膜固定在开口处，在开口上放置一个带打孔芯的反应管盖，从而关闭管。
- 将反应管倒置在所选缓冲器中。每次透析后，将缓冲液（2~5 L）更换两次，每次至少3小时。清除透析膜和缓冲液之间的任何气泡，以确保透析成功。
4. THF 膨胀协议
- 用稳定的pH 7.5对磷酸盐或三聚物缓冲液（10 mM）进行硅质的ELP溶液，以去除其标签纯化中的盐和剩余化合物。
- 准备冻干剂，冷却至开始温度，进行冷冻干燥。
- 在1.5 mL反应管（每管50~500μL）和液氮中的冲击冻结中，对分蛋白溶液进行分清蛋白溶液。为了避免在冷冻干燥过程中意外混合不同的蛋白质溶液，可以在反应管顶部放置带有小孔的盖子，以将其部分密封。
- 从液氮中抽取冷冻蛋白样品，并立即将其放入冻干剂中，开始冷冻干燥。当样品完全干燥（约 24~48 h）时，冷冻干燥完成。随后，用干燥的N2呼吸冻血性嗜血性ELP，然后立即关闭反应管盖，以避免与空气湿气接触。
- 将纯THF添加到冻干样品（ELP，5~10 μM），并将溶液放入含有冰水的水浴声波器中15分钟，以允许THF中ELP膨胀。
- 将热循环器预热至 30~60°C，用于囊泡形成或高达 90°C 的纤维形成，并准备含有超纯水或缓冲液的新反应管（50 mM NaH2PO4/Na2HPO4、50mM NaCl、pH 5-13）。球形锥形在 pH 9–13 内主要在 20°C 下组装。在pH 7和9之间的50~60°C下，囊泡形成受到青睐。纤维形成在pH5和12之间预先诱导超过60°C。
- 在声波步骤后，将 ELP/THF 溶液以及准备好的超纯水或缓冲液放入热循环器中加热至所需温度 5 分钟。当温度达到时，预热的ELP/THF溶液应在预热的超纯水或缓冲液之上小心分层。应看到具有不同接口的两个阶段的明确分离。
- 再次将混合物放入热循环器中，孵育20分钟，以便在界面处形成囊泡或纤维。之后，让样品冷却到室温10分钟，然后通过荧光显微镜或透析进行分析。
- 含有超纯水或缓冲液超分子结构的硅藻溶液（50 mM NaH2PO4/Na2HPO4、50mM NaCl、pH 7-10）。
5. BuOH 挤出协议
- 在超纯水或缓冲液中制备 1×50 μM ELP 溶液（50 mM PB pH 7.5，100 mM NaCl，可能含有高达 4 M 尿素）。两栖ELP F20R20-mEGFP和F20R20-mCherry溶液的浓度可以使用摩尔消光系数（F20R20-mEGFP A280 = 22015M-1 cm-1和 F20R20-mCherry A280 = 34380 M-1 cm-1）来确定（参见a序列的补充信息）。
- 加入10%~20%（v/v）1-丁醇，通过上下移液或多次通过注射器绘制溶液，立即混合溶液。可使用带有 0.25 x 25 mm 针的常用 100 μL 移液器或汉密尔顿注射器。混合过程中溶液的浊度应增加，表明囊泡形成。1-辛烷醇 5%~15%（v/v） 也可用于囊泡挤出，而不是 1-丁醇。
- 为了实现窄尺寸分布，在室温下，使用微型挤出机通过孔径为1 μm的膜进行挤出囊泡。用于挤出的膜尺寸决定了囊泡的上尺寸切口。
- 如上所述（步骤3.3）对囊泡进行透析，以去除残留的1丁醇。
6. 使用 BuOH 挤出协议进行染料封装
- 将大约 40 μL ELP 溶液混合在 10 mM Tris-HCl 中，pH 8 与 1 μL Dextran 德州红（0.0025 mg/mL 最终浓度）混合。
- 在溶液中加入 10 μL 的 BuOH，并通过配备 0.25 x 25 mm 针头的注射器挤出 5~10 次。
7. 利用荧光显微镜分析超分子结构
- 在玻璃滑轨上放置一个增强环，并将粘合侧牢固地压到玻璃上。
- 将样品的 5 μL 添加到增强环内部，并在顶部放置盖板。
- 用指甲油密封样品盖玻片边缘，避免样品在分析过程中蒸发。
- 进行荧光显微镜，如前所述8。
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Representative Results
囊泡生产协议开发
图 1概述了两种不同的囊泡制备方法。左侧的 THF 膨胀方法由连续三个步骤组成，并根据温度产生不同的超分子总成。在图1中，外荧显微镜图像显示由BDP-R20F20组装的囊泡和从BDP-R40F20组装的纤维结构。在右侧图示的BuOH方法专门导致ELP囊泡的形成，与THF膨胀方法相比，产生约两个数量级的囊泡。原理图图显示了 BuOH 囊泡的制备过程。对于图 1B BDP-R40F20 中的囊泡制备，与 10-15% （v/v） BuOH 混合，通过混合物的挤出制备囊泡。
引导超分子自组装到不同的结构
图 2显示了通过 THF 膨胀协议从 BDP-R40F20 组装的不同超分子结构的原理图和表位荧光图像。在这种情况下，冻干化 BDP-R40F20 用于不同的装配协议。缓冲器的pH和装配过程的温度被调整成结节、纤维或囊泡。图2A中所示的焦化石直径为1⁄2μm，由BDP-R40F20在20°C和pH13下组装而成。将装配温度调整到90°C，在pH4-13测试BDP-R40F20时形成纳米纤维束（图2B）。稳定的囊泡可以在50°C和pH7的温度下从ELP组装（图2C）。在程序集协议中的关键步骤之一出现小错误可能导致图 2D中所示的聚合的形成。
不同货物的封装
图 3显示了通过 BuOH 挤出方法从 F20R20-mEGFP 组装的囊泡囊中的不同货物的封装。对于图3A中带电染料Atto Rho13的封装，在加入（15%v/v）BuOH和注射器挤出混合物之前，该染料与水性ELP溶液混合。共聚焦显微镜图像显示由绿色通道中的F20R20-mEGFP形成的囊泡，红色通道中的红色染料AttoRho13，以及由此形成的合并通道，显示了囊泡流明内的成功封装。
如上所述，使用 BuOH 挤出方法成功封装了多糖 Dextran Red 3000。在绿色通道中记录的图像描绘了由F20R20-mEGFP形成的囊泡，而红色通道则显示多糖货物。图 3B中合并的绿色和红色图像证实了 Dextran Red 3000 封装到囊泡流明中的成功。
挤压前后混合BuOH囊泡的膜分量兼容性和相分离
图 4显示了 ELP 两栖动物在混合单个 PMBC 构建基块与组装的 PMBC 种群时相分离和融合行为。在 PMBC 组装之前混合两栖 ELP 构建基块（F20R20-mEGFP 和 F20R20-mCherry），导致组装的 PMBC 膜内出现均匀分布的分子。在合并相应荧光图像的红色和绿色通道后，荧光波和相关的ELP两栖动物的同质分布是显而易见的。通过混合从F20R20-mEGFP或F20R20-mCherry组装的囊泡体，在混合后立即明显可见的红色或绿色荧光膜片。这表明，PMBC 融合事件不同标记的PMBC发生，这些熔融膜及其成分保持相分离至少20分钟。类似的相位行为是从脂质筏，在脂质膜23内已知的。
图1：THF膨胀法和BuOH挤出法的插图，用于引导双亲ELPs自组装成超分子结构，如囊泡或纤维。采用 BDP-R20F20 和ABDP-R40F20 的 THF 膨胀方法的原理图工作流程和代表性的外氟化图像，根据温度和 pH 值和 （B）产生的 BuOH 挤出方法，仅产生 BDP-R40F20 （刻度杆 2 μm） 的囊泡，这个数字是从施赖伯等人2019年8.请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：通过将THF膨胀方法BDP-R40F20自组装到不同的超分子结构中。在装配协议（例如温度或pH）中应用的环境条件决定了形成的主要超分子结构。在装配过程中，在各自条件下的代表性超分子结构通过外皮显微镜进行监测，范围从（A）锥体和（B）纤维到（C）稳定囊泡。（D） 在 THF 膨胀协议期间，在固定结构的组装失败导致形成非特异性聚合（刻度柱 2 μm）。这个数字从8修改。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 3：使用 BuOH 挤出方法，可以将不同的货物封装在 ELP 囊泡中。（A） 显示了具有代表性的 F20R20-mEGFP 囊泡的共聚焦图像，带有封装正电荷染料 AttoRho13 和 （B） 多糖 dextran 红色（刻度棒 5 μm）的封装。请点击此处查看此图形的较大版本。
图4：通过BuOH挤出方法从F20R20组装的囊泡膜膜膜的膜分量兼容性和融合行为。（A） 在注射器挤出之前混合荧光F20R20-mEGFP和F20R20-mCherry蛋白溶液，导致PMBC膜具有均匀分布的两栖蛋白，可见于绿色通道（左图）、红色通道（中间图像）和合并通道（右图）。（B） PMBC 由 F20R20-mEGFP 或 F20R20-mCherry 组装而成，随后通过注射器挤出混合，导致 PMBC 膜内分离的 ELP 两栖恋斑块。在 PMBC 融合至少 20 分钟后，在绿色通道（左图）、红色通道（中间图像）和合并通道（右图）中，膜内的分离 ELP 两栖动物可见。刻度柱对应于 5 μm。这个数字是从施赖伯等人2019年8.请点击此处查看此图形的较大版本。
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Discussion
在遵循所述协议以组装定义的超分子结构时出现故障，主要导致非特异性聚合体的形成（图2，IV），或导致均匀分布的ELP-两栖动物。协议的关键步骤如下：
对于两栖ELP的高表达率，相对低温20°C是最佳选择。为了成功纯亲性ELP进行亲和纯化，在溶质缓冲液中尿素浓度为4M，经验证可最好地溶解两栖ELP，提高可溶性洗脱分数中的蛋白质产量。如果需要在水解缓冲液中降低尿素浓度，则必须针对各个构造测试亲和力纯化。2 M 尿素也适用于某些结构，尤其是对于那些 His-tag 被融合到亲水领域，因此仍然能够结合树脂的构造。 通过尺寸排除色谱法在其标签纯化后，额外的纯化步骤也可以增加囊泡产量。
在应用 THF 膨胀协议的情况下，需要用荧光有机染料标记对两栖 ELP 进行可视化。重要的是，通过SPAAC对两栖ELP的BDP标签（参见含有UAA pAzF的氨基酸序列的补充资料）是所有净化缓冲液中不存在任何还原剂，如TCEP、DTT或β-汞酮乙醇。这是必要的，以避免在SPAAC反应24之前，良好的报告阿齐德减少pAzF的胺。
染料对两栖ELP（例如pAzF-R40F20）的精确反应不一定，因为没有必要通过脱氟显微镜标记每个ELP分子，以便进行简单的囊泡可视化。因此，参考SDS凝胶带和相应的加权冻干样品的关联对于每种蛋白质构造只需要一次。然而，如果需要接近 100% 标记率，染料与 ELP 分子的比例为 1：1。"在我们的实验室中，对非常相似的两栖ELPs进行了分析，以在BDP的模样添加物上完全标记（数据尚未公布）。
对于使用 THF 膨胀方法进行囊泡制备，最关键的步骤是嗜血性两栖 ELP 的膨胀，以及随后在水缓冲相之上的此溶液的分层。因此，新鲜嗜血性两栖ELP应尽可能无水，这可以通过用干氮气 为冻干剂通风和反应管盖立即关闭来实现。如果可用，应使用隔膜密封干 THF 来增加囊泡产量，但 THF p.a. （>99.5%）没有隔膜工作， 以及.在干THF中膨胀两栖ELP时的分层步骤应非常仔细地执行。两种温控解决方案的成功分层可导致有机相和水相之间的明显相位边界。初始分层步骤应缓慢进行，即使温度升高导致这些相的热诱导混合。溶液的突发浊度是由于成形囊泡、纤维或焦质的光散射造成的。在缺乏蛋白质的控制样品中，没有浊度出现，因为THF水界面25报告有小尺寸的结构（高达200nm）。THF 分层步骤是膨胀协议中最关键且最容易失败的步骤。孵育步骤后，超分子结构可对缓冲液或超纯水进行解构。优先使用适用于初始装配的相同水溶液，以保持肌气肿，防止组装的囊泡肿胀或收缩。透析后，囊泡、纤维和锥体通常至少稳定一周。根据装配过程中的环境参数，如果应用THF膨胀方法8，则通常除了主结构外，还有一小部分其他超分子结构存在。所述THF方法将囊泡组装产量提高一个数量级，而BuOH挤出比我们以前发布的体外方法5提高了三个数量级。
BuOH挤出方法用于获得具有高可重复性、规避纤维和球形焦质的完全稳定的孔体结构。该方法不易出错，与荧光蛋白兼容。因此，F20R20-mEGFP 或 F20R20-mCherry 可以应用，也可以应用 BDP-R40F20 或 BDP-E20F20。唯一的关键步骤是在添加 10%-20% v/v BuOH 后快速混合水蛋白溶液。F20R20-mEGFP 或 F20R20-mCherry 浓度应在 1~15 μM 左右。通过应用 BuOH 挤出方法，囊泡可以组装在超纯水或缓冲液中，含有高达 5 M NaCl 或 4 M 尿素，pH 范围从 5 到 8。在 20% v/v BuOH 中挤出的 PMBC 可在 4°C 下至少存储 6 个月，同时保留其车辆结构。为了缩小囊泡尺寸分布，可以使用微型挤出机通过 0.2-1 μm 孔径的膜进行挤出。这种孔隙挤出可以直接在BuOH加入两栖ELP后或囊泡组装后完成。如果 PMBC 过于集中以进行成像，则 BuOH 中的组装囊泡可以通过快速混合稀释，使用含有 10%-20% v/v BuOH 的水缓冲液。
BuOH 挤出方法的主要局限性是，PMBC 对水缓冲液的透析通常会导致囊泡产量差。此外，不能排除膜空间内残留的BuOH的存在，因为简单的脂肪酸能够融入PMBC膜21。因此，PMBC膜可能在一定程度上由蛋白质和藻醇摩尔组成。
使用 BuOH 挤出方法，化学多样化的货物分子的封装效果最佳。此外，DMSO作为溶剂，用于采集染料的库存溶液，可提高染料封装效率。对于要封装的精密货物，5%-10%v/v 1-辛烷醇可用于PMBC组装，并且已被证明与BuOH相比，与功能封装酶（如DNA-联利酶或TEV蛋白酶21，26）相比，具有更好的兼容性。21,然而，由于n-丁醇的链长较短，它可以与1-辛烷醇相比，与1-辛烷醇相比，与水缓冲液进行解解，而1-辛烷醇不能渗透到应用的透析膜中。另一种方法限制是，控制所需的超结构形成所需的应用温度和pH值会影响酶活性。在未来的工作中，应建立亲和纯化或尺寸排除纯化，以分离非封装分子和封装分子，而不会使囊泡膜完整性下降。
与薄膜补水方法16、17相比，17本文所述协议使囊泡的组装尺寸大于600nm。这允许通过简单的外发显微镜和膜相分离8的观察来监测实时融合事件。与两栖ELP9的温度触发光洁度组装相比，此处描述的协议可产生PMBC，其长时间稳定性可达6个月。然而，主要缺点是需要有机溶剂的结构形成。尽管 BuOH 完全保持了荧光蛋白27的完整性和功能（未显示的数据），但封装酶的活性可能受残留有机溶剂的限制，必须单独测试。然而，涉及DNA-合体、TEV-蛋白酶和脂肪酶的催化反应在囊泡的亮度空间内成功进行，由1-辛烷醇或BuOH挤出26，21,21组装。此外，即使组装后的 THF 透析非常没有问题，并且囊泡完整性得以保留，但 BuOH 去除经常会导致因未知原因而丧失囊泡完整性。
所述协议使研究人员能够组装具有独特物理化学特性、良好封装特性和长时间稳定性的微米和亚微米大小的超分子结构。这些超分子结构可应用于最小细胞26或人工细胞研究21、酶封装或药物制剂的设计。提出的功能性PMBC是药物输送的进一步有希望的候选物，因为它们的构建基块不是免疫原性28，表现出动态融合行为，并允许不同的货物封装。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的财务利益。
Acknowledgments
作者感谢BMBF的财政支持和生物系统分析中心（ZBSA）提供的研究设施。我们感谢P.G.舒尔茨，TSRI，拉霍亚，加利福尼亚州，美国提供质粒pEVOL-pAzF。我们感谢弗赖堡大学生物系统分析中心（ZBSA）的生命成像中心（LIC）的工作人员帮助他们提供共聚焦显微镜资源，并在图像记录方面给予出色的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 µm and 0.2 µm Steril Filter | VWR | ||
| 1,4-Dithiothreitol | Merck | ||
| 1-butanol. >99.5% p.a. | Roth | ||
| 2log DNA ladder | NEB | ||
| 2-Mercaptoethanol | Roth | ||
| 50 mL Falcon tubes | VWR | ||
| 79249 Alkyne Mega Stokes dye | Sigma Aldrich | ||
| Acetic acid glacial | VWR | ||
| Acetonitrile, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | ||
| Ampicillin sodium-salt, 99% | Roth | ||
| BDP-FL-PEG4-DBCO | Jena Bioscience | ||
| Biofuge | Heraeus | ||
| Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm) | Thermo Scientific | ||
| Brillant Blue G250 (Coomassie) | Roth | ||
| BspQI | NEB | ||
| Camera DS Qi1 | Nikon | ||
| Centrifuge 5417r | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5810r | Eppendorf | ||
| CF-400-Cu square mesh copper grid | EMS | ||
| Chloramphenicol | Roth | ||
| CompactStar CS 4 | VWR | ||
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral | Life Technologies | ||
| Digital sonifier | Branson | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Applichem | ||
| Dnase I | Applichem | ||
| EarI | NEB | ||
| EcoRI-HF | NEB | ||
| Environmental shaker incubator ES-20 | Biosan | ||
| Ethanol absolute | Roth | ||
| Ethidium bromide solution | Roth | ||
| Filter supports | Avanti | ||
| Glass plates | Bio-Rad | ||
| Glycerol Proteomics Grade | Amresco | ||
| Glycin | Applichem | ||
| H4-Azido-Phe-OH | Bachhem | ||
| Heat plate MR HeiTec | Heidolph | ||
| HindIII | NEB | ||
| HisTrap FF crude column | GE Life Sciences | Nickel column | |
| Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a. | Merck | ||
| Illuminator ix 20 | INTAS | ||
| Illuminator LAS-4000 | Fujifilm | ||
| Imidazole | Merck | ||
| Immersions oil for microscopy | Merck | ||
| Incubators shakers Unimax 1010 | Heidolph | ||
| Inkubator 1000 | Heidolph | ||
| IPTG, >99% | Roth | ||
| Kanamycinsulfate | Roth | ||
| L(+)-Arabinose | Roth | ||
| Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE | Sartorius | ||
| LB-Medium | Roth | ||
| Lyophilizer Alpha 2-4 LSC | Christ | ||
| Lysozyme, 20000 U/mg | Roth | ||
| Microscope CM 100 | Philips | ||
| Microscope Eclipse TS 100 | Nikon | ||
| Microscopy cover glasses (15 x 15 mm) | VWR | ||
| Microscopy slides | VWR | ||
| Microwave | Studio | ||
| Mini-Extruder Set | Avanti Polar Lipids | ||
| NaCl, >99.5%, p.a. | Roth | ||
| Natriumhydroxid pellets | Roth | ||
| Ni-NTA Agarose, PerfectPro | 5 Prime | ||
| Nucleopore Track-Etch Membrane | Avanti | ||
| PH meter 766 calimatic | Knick | ||
| Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF) | Roth | ||
| Polypropylene Columns (1 mL) | Qiagen | ||
| PowerPac basic | BioRad | ||
| Propanol-2-ol | Emplura | ||
| Protein ladder 10-250 kDa | NEB | ||
| Recirculating cooler F12 | Julabo | ||
| Reinforcement rings | Herma | ||
| SacI HF | NEB | ||
| SDS Pellets | Roth | ||
| Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4 | VWR | ||
| Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate | VWR | ||
| T4 DNA Ligase | NEB | ||
| TEMED | Roth | ||
| TexasRed Dextran-Conjugate | MolecularProbes | ||
| Thermomix comfort | Eppendorf | ||
| THF, >99.5% p.a. | Acros | ||
| Triton X 100 | Roth | ||
| Trypton/Pepton from Casein | Roth | ||
| Ultrasonic cleaner | VWR | ||
| Urea p.a. | Roth | ||
| Vacuum pump 2.5 | Vacuubrand | ||
| XbaI | NEB | ||
| XhoI | NEB | ||
| ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V) | Roth |
References
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