Summary
En la interfaz de disolventes orgánicos y acuosos, las proteínas anfifílicas a medida similares a la elastina se ensamblan en estructuras supramoleculares complejas como vesículas, fibras y coacervados desencadenados por parámetros ambientales. Los protocolos de montaje descritos producen compartimentos basados en membranas de proteínas (PMBC) con propiedades ajustables, lo que permite la encapsulación de varias cargas.
Abstract
Los bloques de construcción proteígicos a medida son candidatos versátiles para el montaje de estructuras supramoleculares como células mínimas, vehículos de administración de medicamentos y andamios enzimáticos. Debido a su biocompatibilidad y atún a nivel genético, las proteínas similares a la elastina (ELP) son bloques de construcción ideales para aplicaciones biotecnológicas y biomédicas. Sin embargo, el montaje de estructuras supramoleculares basadas en proteínas con propiedades fisioquímicas distintas y un buen potencial de encapsulación sigue siendo un reto.
Aquí proporcionamos dos protocolos eficientes para el autoensamblaje guiado de ELP anfifílicos en arquitecturas de proteínas supramoleculares como coacervados esféricos, fibras y vesículas estables. Los protocolos de montaje presentados generan compartimentos basados en membranas proteicas (PMBC) basados en ELP con propiedades fisicoquímicas adaptables. Los PBPC demuestran el comportamiento de separación de fases y revelan la fusión de membranadependiente del método y son capaces de encapsular moléculas de carga fluorescente químicamente diversas. Los PMBC resultantes tienen un alto potencial de aplicación como plataforma de formulación y entrega de medicamentos, célula artificial y espacio de reacción compartimentado.
Introduction
El montaje de estructuras supramoleculares para aplicaciones biotecnológicas es cada vez más importante1,2,3,4,5. Para el montaje de arquitecturas funcionales como coacervados, vesículas y fibras con las propiedades fisicoquímicas deseadas es importante comprender y controlar las propiedades fisicoquímicas y conformacionales de los componentes. Debido a la precisión molecular de las moléculas que se encuentran en la naturaleza, los bloques de construcción para las estructuras supramoleculares se basan cada vez más en lípidos, ácidos nucleicos o proteínas. En comparación con los polímeros sintéticos, los bloques de construcción proteíricos permiten un control preciso sobre las estructuras supramoleculares emergentes6 a nivel genético. La secuencia de aminoácidos primarios (aa) de los bloques de construcción de proteínas individuales codifica intrínsecamente la información para su potencial de ensamblaje desde el nivel molecular hasta el nivel macroscópico, así como la forma tridimensional y las propiedades físicas de la estructura supramolecular final7.
Los métodos reportados para el montaje de diferentes estructuras supramoleculares a menudo involucran proteínas anfifílicas como proteínas sensibles a la elastina sensibles a la temperatura (ELP)5,8,9, oleosina recombinante10y anfifes de proteínas artificiales11. Los métodos activados por temperatura han llevado al montaje de micelas4,10,12Fibras13Hojas14y vesículas9,15,16. Se han aplicado métodos de disolventes orgánicos para la formación de vesículas dinámicas a base de proteínas8,11,14. Hasta ahora, los protocolos aplicados para la formación de vesículas a menudo carecen de control de montaje sobre los conjuntos de tamaño de los micrómetros16,17o tienen un rendimiento de montaje limitado5. Además, algunas vesículas basadas en ELP informaron han deteriorado el potencial de encapsulación12o estabilidad limitada en el tiempo9. Abordando estos inconvenientes, los protocolos presentados permiten el autoensamblaje de estructuras supramoleculares de tamaño de micrómetro y sucrómetro con propiedades fisioquímicas distintas, buen potencial de encapsulación y estabilidad de largo plazo. Los ELP anfifílicos a medida se ensamblan en estructuras supramoleculares, abarcando el rango de coacervados esféricos y paquetes de fibra retorcida altamente ordenados hasta vesículas unilamelares dependiendo del protocolo aplicado y las condiciones ambientales asociadas. Los grandes compartimentos basados en membranas de proteínas vesiculares (PMBC) revelan todos los fenotipos principales, como la fusión por membrana y el comportamiento de separación de fase análogo a los liposomas. Los PMBC encapsulan eficientemente moléculas de carga fluorescente químicamente diversas que se pueden monitorear mediante microscopía de epifluorescencia simple. Los dominios ELP repetitivos utilizados en este estudio son bloques de construcción atractivos para arquitecturas supramoleculares basadas en proteínas18. La unidad de repetición de pentapéptido el ELP (VPGVG) es conocida por tolerar diferentes aa además de prolina en la cuarta posición (valina, V), preservando sus propiedades estructurales y funcionales19. El diseño de ELP anfifílicos que contienen dominios hidrófilos e hidrófobos distintivos se realizó insertando residuos de invitados aa (X) en la repetición VPGXG con hidrofobicidad, polaridad y carga distintas20. Dominios el ELP anfifílicos donde está equipado con fenilalanina hidrófoba (F) o isoleucina (I) mientras que el dominio hidrófilo contenía ácido glutámico cargado (E) o arginina (R) como residuos de invitado. Una lista de construcciones elP anfifílicas elegibles y las correspondientes secuencias aa se puede encontrar en la información suplementaria y referencias8,21. Todos los bloques de construcción están equipados con pequeños tintes fluorescentes o proteínas fluorescentes para su visualización mediante microscopía de fluorescencia. mEGFP y otras proteínas fluorescentes se fusionaron n terminalmente a los dominios hidrófilos de los anfifílicos ELP. Los colorantes orgánicos se conjugaron a través de una cepa libre de cobre promovida por la cicloadición alquino-azida (SPAAC) a un aminoácido no natural (UAA) introducido co-traduccionalmente. La incorporación co-traduccional de la UAApara-azidofenilalanina (pAzF)22permite la modificación N-terminal del dominio ELP hidrófilo. De esta manera el tinte fluorescente verde BDP-FL-PEG4-DBCO (BDP) o cualquier molécula fluorescente pequeña con un ciclooctino tenso se puede utilizar como sonda fluorescente. La incorporación exitosa del uAA pAzF y la cicloadición del tinte a través de SPAAC se puede confirmar fácilmente a través de LC-MS/MS debido a la ionización eficiente de los péptidos trippticos correspondientes8. Este pequeño tinte orgánico se aplicó para ampliar la opción de disolvente para los protocolos de montaje, ya que las proteínas fluorescentes son incompatibles con la mayoría de los disolventes orgánicos. A continuación se describen los dos protocolos de montaje más eficientes para estructuras supramoleculares desarrolladas en nuestro laboratorio. El método de hinchazón THF sólo es compatible con el ELP anfifílico modificado con tinte orgánico. Por el contrario, el método de extrusión de 1 butanol (BuOH) es compatible con muchas proteínas como sonda fluorescente, por ejemplo, mEGFP, ya que el método descrito preserva completamente la fluorescencia de estas proteínas de fusión. Además, la encapsulación de moléculas pequeñas y el comportamiento de fusión vesicular funcionan mejor empleando el método de extrusión BuOH.
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Protocol
1. Diseño y clonación de proteínas anfifílicas similares a la elastina (ELP)
- Clonar y diseñar las construcciones como se describe en otros lugares8,20. Hay plásmidos disponibles bajo petición.
2. Expresión, purificación y preparación de proteínas
- Expresión de F20E20-mEGFP y F20E20-mCherry
- Inocular la cultura de expresión principal de la precultura nocturna a unaDo6 de 0,3. Incubar a 37oC, 200 rpm en medio estéril de 400 ml LB complementado con antibióticos apropiados en un matraz de 2 L.
- Preparar la solución de stock IPTG (1 M) para la inducción del cultivo de expresión en agua ultrapura.
- Cuando se alcance OD600 0.5–0.8, agregue IPTG al cultivo de expresión a una concentración final de 1 mM y reduzca la temperatura de incubación a 20 oC. Permitir la expresión a 20oC durante aproximadamente 20 h a 200 rpm.
- Expresión de ELP anfifílico que contiene UAA pAzF
- Inocular el cultivo de expresión principal desde el precultivo de E. coli durante la noche que contiene los dos plásmidos pEVOL pAzF y, por ejemplo, pET28-NMBL-(TAG)R40F20-his a una DO600 de 0.3 (ver información complementaria para secuencias de aminoácidos). Incubar a 37oC, 200 rpm en medio estéril de 400 ml LB complementado con kanamicina y cloramphenicol en un matraz de 2 L.
- Prepare una solución de stock de 100 mM pAzF en agua ultrapura. Para 10 ml de solución de material pAzF, pesar 206,2 mg de pAzF y resuspenderlo en 8 ml de agua ultrapura. Para disolver el pAzF elevar el pH de la solución con 3 M NaOH y mezclar vigorosamente. Cuando se disuelva pAzF, baje cuidadosamente el pH a 10,5 y añada agua ultrapura a un volumen final de 10 ml. Utilice un filtro estéril (0,22 m) y alícuota la solución en tubos de reacción de 2 ml.
- Prepare una solución de stock IPTG de 1 M en agua ultrapura y una solución de stock de 20% de arabinosa en agua ultrapura.
- Cuando se alcanza OD600 0.5–0.8, agregue pAzF al cultivo de expresión a una concentración final de 2 mM. Cultivo de incubación para 10 min, 37oC, 200 rpm para permitir la suposición de pAzF.
- Inducir la expresión de la proteína diana y la expresión de la necesaria tRNA/t-RNA sintetasa mediante la adición simultánea de IPTG (1 mM) y arabinosa (2%) y reducir la temperatura de incubación a 20 oC.
- Permitir la expresión a 20oC durante aproximadamente 20 h a 200 rpm. Cultivo de expresión de la cosecha por centrifugación a 4oC, 4000 x g,40 min.
- Lisis celular y purificación de proteínas
- Resuspender el pellet de E. coli en tampón de lisis (10 ml por litro de cultivo; 50 mM Tris-HCl pH 8, 500 mM NaCl, 4 M urea, 0.25% Tritón X-100) que contiene lisozima (0,1 mg/ml) y PMSF (0,1 mM). Incubar durante 30 minutos sobre hielo y congelar y descongelar dos veces después sumergiendo la muestra en nitrógeno líquido.
- Sonicar la suspensión (30%, 15 veces, 30 s: 10 s romper) y limpiar el lisado a través de centrifugación (4 oC, 10.000 x g durante 40 min).
- Purificar proteínas mediante cromatografía de afinidad (por ejemplo, en una columna de níquel de 1 ml utilizando un sistema FPLC conectado a un colector de fracciones; véase Tabla de materiales). Eluir la proteína con tampón de elución (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, urea de 4 M, imidazol de 250-500 mM) y almacenar a 4 oC hasta su posterior procesamiento.
- Analice la eficiencia de purificación a través de SDS-PAGE.
3. Modificación del tinte de LOSP a través de SPAAC
- Estimar aproximadamente la concentración de la solución ELP. Una absorciónde 280 para la evaluación de la concentración no es valiosa ya que la secuencia pAzF-R40F20 carece de aminoácidos que absorben en el rango UV. Por lo tanto, un anfifílico ELP previamente liofilizado y ponderado se puede utilizar como referencia para la comparación de bandas SDS PAGE. Mediante la comparación del valor gris sumado de las bandas SDS PAGE de las soluciones ELP con concentraciones conocidas y se puede estimar la concentración aproximada de la muestra.
- Añadir 1 l de colorante fluorescente BDP-FL-PEG4-DBCO (solución de stock de 10 mM; concentración final de 20 M) a 500 ml de solución de ELP (20 m). Incubar la reacción durante unas 10 h a 15oC, mientras tiembla y está protegido de la luz.
- Para un uso posterior, dializar la reacción para eliminar el BDP excesivo.
- Equilibrar una membrana de diálisis (por ejemplo, corte de 12 kDa) en agua ultrapura durante 10 minutos. Cortar la membrana de diálisis en el tamaño correcto que se colocará en la parte superior de la abertura de un tubo de reacción que contenga la solución ELP en la que se ha hecho clic. Para fijar la membrana de diálisis en la abertura, coloque una tapa del tubo de reacción con el núcleo perforado en la abertura, cerrando así el tubo.
- Coloque el tubo de reacción boca abajo en el tampón elegido. Intercambie el búfer (2–5 L) dos veces después de la diálisis durante al menos 3 horas cada vez. Retire las burbujas de aire atrapadas entre la membrana de diálisis y el tampón para garantizar una diálisis exitosa.
4. Protocolo de hinchazón thF
- Solución ELP homogénea de dialíze contra el tampón de fosfato o tris (10 mM) con pH estable 7,5 para eliminar sales y compuestos restantes de la purificación de su etiqueta.
- Prepare el liofilizador y enfríe hasta la temperatura inicial para el secado por congelación.
- Aliquot la solución de proteína dializada en tubos de reacción de 1,5 ml (50-500 ml por tubo) y congelación por choque en nitrógeno líquido. Para evitar la mezcla no deseada de diferentes soluciones proteicas durante el secado por congelación, las tapas con un pequeño orificio se pueden colocar en la parte superior del tubo de reacción para sellarlo parcialmente.
- Saque las muestras de proteínacongelada del nitrógeno líquido e colóquelas inmediatamente en el liofilizador para comenzar a secarse con congelación. El secado por congelación se termina cuando la muestra está completamente seca (aproximadamente 24-48 h). Posteriormente, ventile los ElP anfifílicos liofilizados con N2seco, luego cierre inmediatamente las tapas del tubo de reacción para evitar el contacto con la humedad del aire.
- Añadir el THF puro a las muestras liofilizadas (ELP, 5-10 m) y colocar la solución en un sonicador de baño de agua que contenga agua helada durante 15 minutos para permitir la hinchazón de la ELP en THF.
- Precalentar un termociclador a 30–60 oC para la formación de vesículas o hasta 90 oC para la formación de fibra y preparar nuevos tubos de reacción que contengan agua ultrapura o tampón (50 mM NaH2PO4/Na2HPO4, 50 mM NaCl, pH 5–13). Los coacervados esféricos se ensamblan predominantemente a 20oC dentro del pH 9–13. La formación de la vesícula se favorece a 50–60 oC entre pH 7 y 9. La formación de fibra se induce predominentamente por encima de 60oC entre pH 5 y 12.
- Después del paso de sonicación, coloque la solución ELP/THF, así como la solución de agua ultrapura o tampón preparada en el termociclador y caliente hasta la temperatura deseada durante 5 min. Cuando se alcanza la temperatura, la solución de ELP/THF precalentada debe estratificarse cuidadosamente encima de la solución precalentada de agua ultrapura o tampón. Una separación clara de las dos fases con una interfaz distinta debe ser visible.
- Colocar la mezcla en el termociclador de nuevo e incubar durante 20 minutos para permitir la formación de vesículas o fibra en la interfaz. Después, deje que las muestras se enfríen a temperatura ambiente durante 10 minutos antes del análisis mediante microscopía de fluorescencia o diálisis.
- Solución de dializar que contiene las estructuras supramoleculares contra agua ultrapura o tampón (50 mM NaH2PO4/Na2HPO4, 50 mM NaCl, pH 7–10).
5. Protocolo de extrusión BuOH
- Preparar una solución ELP de 1–50 m en agua ultrapura o tampón (50 mM PB pH 7,5, 100 mM de NaCl, puede contener hasta 4 M de urea). La concentración de la solución anfifílica ELP F20R20-mEGFP y F20R20-mCherry se puede determinar utilizando los coeficientes de extinción molar (F20R20-mEGFP A280 a 22015 M-1 cm-1 y F20R20-mCherry A280 a 34380 M-1 cm-1) (ver información complementaria para secuencias de aa).
- Agregue entre un 10% y un 20% (v/v) 1-butanol e mezcle inmediatamente la solución pipeteando hacia arriba y hacia abajo o dibujándola a través de una jeringa varias veces. Se puede aplicar una pipeta común de 100 ml o una jeringa Hamilton equipada con una aguja de 0,25 x 25 mm. La turbidez de la solución durante la mezcla debe aumentar, lo que indica la formación de vesículas. 1-octanol 5%–15% (v/v) también se puede utilizar para la extrusión de vesículas en lugar de 1-butanol.
- Con el fin de lograr una distribución de tamaño estrecho, extruya las vesículas utilizando un mini extrusor a través de una membrana con un tamaño de poro de 1 m a temperatura ambiente. El tamaño de membrana utilizado para la extrusión determina el límite de tamaño superior de las vesículas.
- Dializar las vesículas como se describió anteriormente (paso 3.3) para eliminar el 1-butanol residual.
6. Encapsulación de tinte con el protocolo de extrusión BuOH
- Mezclar aproximadamente 40 l de solución el IPL en Tris-HCl de 10 mM, pH 8 con 1 L Dextran Texas Red (0,0025 mg/ml de concentración final).
- Agregue 10 ml de BuOH a la solución y extruya de 5 a 10 veces a través de una jeringa equipada con una aguja de 0,25 x 25 mm.
7. Análisis de estructuras supramoleculares mediante microscopía de fluorescencia
- Coloque un anillo de refuerzo en un portaobjetos de vidrio y presione firmemente el lado adhesivo al vidrio.
- Añadir 5 l de la muestra al interior del anillo de refuerzo y colocar un resbalón de la cubierta en la parte superior.
- Selle la muestra con esmalte de uñas en los bordes del deslizamiento de la cubierta para evitar la evaporación de la muestra durante el análisis.
- Realizar la microscopía de fluorescencia como se describió anteriormente8.
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Representative Results
Desarrollo de protocolos para la producción de vesículas
La Figura 1 describe los dos métodos diferentes de preparación de vesículas. El método de hinchazón THF en el lado izquierdo se compone de tres pasos sucesivos y da como resultado diferentes conjuntos supramoleculares del ELP dependiendo de la temperatura. En la Figura 1A, las imágenes de microscopía de epifluorescencia muestran vesículas ensambladas a partir de BDP-R20F20 y estructuras fibrilares ensambladas a partir de BDP-R40F20. El método BuOH, ilustrado en el lado derecho conduce exclusivamente a la formación de vesículas ELP, produciendo alrededor de dos órdenes de magnitud más vesículas en comparación con el método de hinchazón THF. La ilustración esquemática muestra el proceso de preparación de las vesículas BuOH. Para la preparación de la vesícula en la Figura 1B BDP-R40F20 se mezcló con 10-15% (v/v) BuOH y se prepararon vesículas mediante extrusión de la mezcla.
Orientación del autoensamblaje supramolecular en diferentes estructuras
La Figura 2 muestra una ilustración esquemática e imágenes de epifluorescencia de diferentes estructuras supramoleculares ensambladas a partir de BDP-R40F20 a través del protocolo de hinchazón THF. En este caso se utilizó BDP-R40F20 liofilizado para los diferentes protocolos de montaje. El pH del tampón y la temperatura del proceso de montaje se ajustaron para formar coacervados, fibrillas o vesículas. Los coacervados representados en la Figura 2A tienen un diámetro de 1-2 m y se ensamblan a partir de BDP-R40F20 a 20 oC y pH 13. El ajuste de la temperatura de montaje a 90 oC da como resultado la formación de haces de nanofibra(Figura 2B)a pH 4–13 probados con BDP-R40F20. Las vesículas estables se pueden montar a partir del ELP a una temperatura de 50 oC y pH 7(Figura2C). Pequeños errores en uno de los pasos cruciales en el protocolo de montaje pueden conducir a la formación de agregados representados en la Figura 2D.
Encapsulación de diferentes cargas
La Figura 3 muestra la encapsulación de diferentes cargas en el lumen vesícula de las vesículas ensambladas a partir de F20R20-mEGFP a través del método de extrusión BuOH. Para la encapsulación del tinte cargado positivamente Atto Rho13 en la Figura 3A, el tinte se mezcló con la solución ELP acuosa antes de la adición de BuOH (15% v/v) y la extrusión de la mezcla. Las imágenes de microscopía confocal muestran las vesículas formadas por F20R20-mEGFP en el canal verde, el tinte rojo AttoRho13 en el canal rojo y el canal combinado resultante muestra la encapsulación exitosa dentro del lumen vesícula.
El polisacárido Dextran Red 3000 se encapsulaba correctamente utilizando el método de extrusión BuOH como se describió anteriormente. Las imágenes grabadas en canal verde representan las vesículas formadas por F20R20-mEGFP mientras que el canal rojo muestra la carga de polisacárido. La imagen verde y roja combinada en el cuadro 3B confirma la encapsulación exitosa de Dextran Red 3000 en el lumen vesícula.
Compatibilidad de componentes de membrana y separación de fase de las vesículas BuOH mixtas antes/después de la extrusión
La Figura 4 muestra el comportamiento de separación de fase y fusión de los anfifílicos ELP al mezclar bloques de construcción de PMBC individuales frente a poblaciones de PMBC ensambladas. La mezcla de bloques de construcción ELP anfifílicos (F20R20-mEGFP y F20R20-mCherry) antes del ensamblaje de PMBC conduce a moléculas distribuidas homogéneamente dentro de la membrana PMBC ensamblada. La distribución homogénea de los fluoróforos y anfiferas ELP asociados es evidente al fusionar el canal rojo y verde de las respectivas imágenes de fluorescencia. Al mezclar las poblaciones de vesículas ensambladas a partir de F20R20-mEGFP o F20R20-mCherry, los parches de membrana claramente visibles de fluorescencia roja o verde son evidentes inmediatamente después de la mezcla. Esto indica que se producen eventos de fusión PMBC de PMBC sin amitamiento sin amaño y que estas membranas fusionadas y sus componentes permanecen separados por al menos 20 minutos. Un comportamiento de fase similar se conoce a partir de balsas de lípidos, dentro de las membranas lipídicas23.
Figura 1: Ilustración del método de hinchazón THF y el método de extrusión BuOH para el autoensamblaje guiado de ELP anfifílicos en estructuras supramoleculares como vesículas o fibras. Flujo de trabajo esquemático e imágenes representativas de epifluorescencia de (A) el método de hinchazón THF con BDP-R20F20 y BDP-R40F20, lo que da como resultado diferentes estructuras supramoleculares dependiendo de la temperatura y el pH y (B) el método de extrusión BuOH que produce exclusivamente vesículas de BDP-R40F20 (barra de escala 2 m). Esta cifra ha sido modificada de Schreiber et al. 20198. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Mediante la aplicación del método de hinchazón THF BDP-R40F20 se autoensambla en diferentes estructuras supramoleculares. Las condiciones ambientales aplicadas durante el protocolo de montaje (por ejemplo, temperatura o pH) determinan la estructura supramolecular predominante formada. Las estructuras supramoleculares representativas en las condiciones respectivas durante el montaje fueron monitoreadas a través de microscopía de epifluorescencia y van desde coacervados (A) y (B) fibrillas hasta (C) vesículas estables. (D) El fallo en el ensamblaje de estructuras definidas durante el protocolo de hinchazón thF conduce a la formación de agregados inespecíficos (barra de escala 2 m). Esta cifra se ha modificado a partir de8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Diferentes cargas se pueden encapsular dentro de las vesículas ELP utilizando el método de extrusión BuOH. (A) muestra imágenes confocales representativas de las vesículas F20R20-mEGFP con el tinte encapsulado cargado positivamente AttoRho13 y (B) la encapsulación del polisacárido dextran rojo (barra de escala 5 m). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Compatibilidad de componentes de membrana y comportamiento de fusión de membranas vesículas ensambladas a partir de F20R20 a través del método de extrusión BuOH. (A) La mezcla de la solución fluorescente de proteína F20R20-mEGFP y F20R20-mCherry antes de la extrusión de jeringa conduce a membranas PMBC con proteínas anfifílicas distribuidas homogéneamente visibles en canal verde (imagen izquierda), canal rojo (imagen media) y canal combinado (imagen derecha). (B) Los PMBC ensamblados a partir de F20R20-mEGFP o F20R20-mCherry y mezclados posteriormente a través de la extrusión de jeringa conducen a parches de anfifílico ELP separados dentro de las membranas PMBC. Los anfifílicos ELP separados dentro de la membrana son visibles después de la fusión pmBC durante al menos 20 minutos en canal verde (imagen izquierda), canal rojo (imagen media) y el canal combinado (imagen derecha). Las barras de escala corresponden a 5 m. Esta cifra ha sido modificada de Schreiber et al. 20198. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Un fallo al seguir los protocolos descritos para el montaje de estructuras supramoleculares definidas conduce principalmente a la formación de agregados inespecíficos(Figura 2,IV) o a anfifílicos ELP distribuidos homogéneos. Los pasos críticos del protocolo se discuten a continuación:
Para un alto rendimiento de expresión del ELP anfifílico, una temperatura relativamente baja de 20oC es óptima. Para una purificación exitosa basada en la afinidad de la ELP anfifílica se demostró que una concentración de urea de 4 M en el tampón de lisis solubiliza mejor el ELP anfifílico y aumentar el rendimiento proteico en la fracción de elución soluble. Si se desean concentraciones más bajas de urea en el tampón de lisis, se debe probar la purificación de afinidad para las construcciones individuales. 2 M urea funcionó también para algunas construcciones, especialmente para aquellas donde la etiqueta His se fusionó con el dominio hidrófilo y por lo tanto todavía puede unir la resina. Un paso de purificación adicional después de la purificación de su etiqueta a través de cromatografía de exclusión de tamaño también puede aumentar el rendimiento de la vesícula.
En caso de aplicar el protocolo THF-swelling, el ELP anfifílico debe ser etiquetado con un tinte orgánico fluorescente para su visualización. Es importante destacar que para el etiquetado BDP de la ELP anfifílica (ver información suplementaria para secuencias de aminoácidos que contienen UAA pAzF) a través de SPAAC es la ausencia de cualquier reductante como TCEP, TDT y mercaptoetanol en todos los tampones de purificación. Esto es necesario para evitar la azide bien reportada a la reducción de amina de pAzF antes de la reacciónSPAAC 24.
La estequiometría de reacción exacta del tinte a el ELP anfifílico (por ejemplo, pAzF-R40F20) no es crucial, ya que no es necesario etiquetar cada molécula ELP para la visualización de vesículas simples a través de microscopía de epifluorescencia. Por lo tanto, la correlación de una banda de gel SDS de referencia y la muestra liofilizada ponderada correspondiente sólo es necesaria una vez para cada construcción de proteína. Sin embargo, si se desea un rendimiento de etiquetado cercano al 100%, basta con una proporción de 1:1 equivalentes de tinte a las moléculas ELP. En nuestro laboratorio se analizaron el PAR anfifílico muy similares para ser etiquetados completamente en una adición equimolar de BDP (datos aún no publicados).
Para la preparación de vesículas utilizando el método de hinchazón THF, los pasos más críticos son la hinchazón de ELP anfifílico liofilizado y la posterior estratificación de esta solución en la parte superior de la fase de tampón acuoso. Por lo tanto, el ELP anfifílico recién liofilizado debe ser lo más anhidro posible, lo que se puede lograr mediante la ventilación del liofilizador con gas nitrógeno seco y el cierre inmediato de las tapas del tubo de reacción. Si está disponible, se debe utilizar un THF seco sellado en el tabique para aumentar el rendimiento de la vesícula, pero THF p.a. (>99,5%) sin tabique funciona también. El paso de estratificación al hincharse el ELP anfifílico en el THF seco debe ejecutarse con mucho cuidado. La estratificación exitosa de las dos soluciones de temperatura controlada conduce a un límite de fase claramente visible entre la fase orgánica y la fase acuosa. El paso de estratificación inicial debe llevarse a cabo lentamente a pesar de que las temperaturas elevadas conducen a la mezcla inducida térmicamente de estas fases. La turbidez emergente de la solución se debe a la dispersión de la luz de vesículas formadas, fibras o coacervados. En las muestras de control que carecen de la proteína, no aparece turbidez aunque se notifican estructuras de pequeño tamaño (hasta 200 nm) para la interfaz de agua THF25. El paso de estratificación THF es el paso más crítico y propenso a la falla del protocolo de hinchazón. Después del paso de incubación, las estructuras supramoleculares se pueden dializar contra el tampón o el agua ultrapura. Se debe utilizar preferentemente la misma solución acuosa que se aplicó para el montaje inicial con el fin de mantener la osmolaridad y evitar la hinchazón o encogimiento de las vesículas ensambladas. Después de la diálisis, las vesículas, las fibras y los coacervados suelen ser estables durante al menos una semana. Dependiendo de los parámetros ambientales durante el montaje a menudo una pequeña proporción de otras estructuras supramoleculares además de la estructura principal están presentes si se aplica el método de hinchazón THF8. El método THF descrito aumenta el rendimiento del ensamblaje de la vesícula en un orden de magnitud, mientras que la extrusión BuOH mejora el rendimiento en tres órdenes de magnitud en comparación con nuestro método in vitro publicado anteriormente5.
El método de extrusión BuOH se aplica para obtener estructuras vesiculares exclusivamente estables con alta reproducibilidad, eludiendo fibras y coacervados esféricos. Este método es menos propenso a errores y compatible con proteínas fluorescentes. Por lo tanto, se pueden aplicar F20R20-mEGFP o F20R20-mCherry, así como BDP-R40F20 o BDP-E20F20. El único paso crítico es la rápida mezcla de la solución proteica acuosa después de la adición de 10%–20% v/v BuOH. La concentración de F20R20-mEGFP o F20R20-mCherry debe ser de alrededor de 1–15 M. Mediante la aplicación de vesículas del método de extrusión De BuOH se pueden montar en agua ultrapura o tampón que contiene hasta 5 M DeNaCl o 4 M urea y pH que van de 5 a 8. Los PMBCextados extruidos en 20% v/v BuOH se pueden almacenar durante al menos 6 meses a 4oC conservando su estructura vesicular. Para reducir la distribución del tamaño de la vesícula, se pueden extruir utilizando un mini extrusor a través de una membrana de 0,2-1 m de tamaño de poro. Esta extrusión de poros se puede hacer directamente después de la adición de BuOH a la ELP anfifílica o después del montaje de la vesícula. Si los PMBC están demasiado concentrados para la toma de imágenes, las vesículas ensambladas en BuOH se pueden diluir mediante la mezcla rápida utilizando un tampón acuoso que contenga 10%–20% v/v BuOH.
La principal limitación del método de extrusión de BuOH es que la diálisis por PMBC contra los búferes acuosos a menudo da lugar a un rendimiento vesícula deficiente. Además, no se puede excluir la presencia de BuOH residual en el espacio de membrana, ya que los ácidos grasos simples fueron capaces de incorporarse a la membrana PMBC21. Por lo tanto, las membranas PMBC pueden estar en cierta medida compuestas de mitades de proteínas y alkanol.
La encapsulación de moléculas de carga químicamente diversas funciona mejor utilizando el método de extrusión BuOH. Además, DMSO como disolvente para la solución en stock del tinte a capturar aumenta la eficiencia de encapsulación del tinte. Para encapsular la carga delicada, se puede utilizar 5%–10% v/v 1-octanol para el montaje de PMBC y se ha demostrado que es mejor compatible, en comparación con BuOH, con enzimas encapsuladas funcionales como DNA-ligase o TEV proteasa21,26. Sin embargo, debido a la longitud de cadena más corta de n-butanol se puede dializar contra el tampón acuoso en contraste con 1-octanol, que no es capaz de impregnar la membrana de diálisis aplicada. Otra limitación del método es que las temperaturas aplicadas y los valores de pH necesarios para controlar la formación de supraestructura deseada pueden afectar la actividad enzimática. En el trabajo futuro, se debe establecer purificación de afinidad o purificación de exclusión de tamaño para separar las moléculas no encapsuladas frente a las moléculas encapsuladas sin deteriorar la integridad de la membrana vesícula.
A diferencia de los métodos de rehidratación de película16,17 los protocolos aquí descritos permiten el montaje de tamaños de vesículas superiores a 600 nm. Esto permite el seguimiento de eventos de fusión en tiempo real a través de la microscopía de epifluorescencia simple y la observación de la separación de fase de membrana8. En comparación con el montaje vesicular activado por temperatura de ELP9 anfifílico, los protocolos descritos aquí producen PMBC con una estabilidad de largo tiempo de hasta 6 meses. Sin embargo, la principal desventaja es la necesidad de disolvente orgánico para la formación de la estructura. Aunque BuOH preserva completamente la integridad y la función de las proteínas fluorescentes27 (datos no mostrados), la actividad de las enzimas encapsuladas puede estar restringida por disolvente orgánico residual y debe probarse individualmente. Sin embargo, las reacciones catalíticas que involucran ADN- ligasa, TEV-proteasa y lipasa se han llevado a cabo con éxito dentro del espacio luminal de las vesículas, montados por 1-octanol o BuOH extrusión26,21. Además, a pesar de que la diálisis THF después del montaje es muy poco problemática y se preserva la integridad de la vesícula, la eliminación de BuOH con frecuencia resulta en la pérdida de integridad vesícula debido a razones desconocidas.
Los protocolos descritos permiten a los investigadores ensamblar estructuras supramoleculares de tamaño de micrómetros y sucrómetros con propiedades fisicoquímicas distintas, buenas propiedades de encapsulación y estabilidad de largo plazo. Estas estructuras supramoleculares se pueden aplicar para el diseño de células mínimas26 o investigación celular artificial21,encapsulación enzimática, o formulación de fármacos. Los PMBC funcionales presentados son candidatos más prometedores para la administración de medicamentos, ya que sus bloques de construcción no son inmunogénicos28,exhiben un comportamiento de fusión dinámico y permiten una encapsulación de carga diversa.
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Disclosures
Los autores no declaran intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Los autores agradecen al BMBF el apoyo financiero y al Centro de Análisis de Sistemas Biológicos (ZBSA) por proporcionar el centro de investigación. Estamos agradecidos a P. G. Schultz, TSRI, La Jolla, California, EE. UU. por proporcionar el plásmido pEVOL-pAzF. Agradecemos al personal del Centro de Imágenes de Vida (LIC) en el Centro de Análisis de Sistemas Biológicos (ZBSA) de la Universidad Albert-Ludwigs-Universidad freiburgpor su ayuda con sus recursos de microscopía confocal, y el excelente apoyo en la grabación de imágenes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 µm and 0.2 µm Steril Filter | VWR | ||
| 1,4-Dithiothreitol | Merck | ||
| 1-butanol. >99.5% p.a. | Roth | ||
| 2log DNA ladder | NEB | ||
| 2-Mercaptoethanol | Roth | ||
| 50 mL Falcon tubes | VWR | ||
| 79249 Alkyne Mega Stokes dye | Sigma Aldrich | ||
| Acetic acid glacial | VWR | ||
| Acetonitrile, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | ||
| Ampicillin sodium-salt, 99% | Roth | ||
| BDP-FL-PEG4-DBCO | Jena Bioscience | ||
| Biofuge | Heraeus | ||
| Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm) | Thermo Scientific | ||
| Brillant Blue G250 (Coomassie) | Roth | ||
| BspQI | NEB | ||
| Camera DS Qi1 | Nikon | ||
| Centrifuge 5417r | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5810r | Eppendorf | ||
| CF-400-Cu square mesh copper grid | EMS | ||
| Chloramphenicol | Roth | ||
| CompactStar CS 4 | VWR | ||
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral | Life Technologies | ||
| Digital sonifier | Branson | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Applichem | ||
| Dnase I | Applichem | ||
| EarI | NEB | ||
| EcoRI-HF | NEB | ||
| Environmental shaker incubator ES-20 | Biosan | ||
| Ethanol absolute | Roth | ||
| Ethidium bromide solution | Roth | ||
| Filter supports | Avanti | ||
| Glass plates | Bio-Rad | ||
| Glycerol Proteomics Grade | Amresco | ||
| Glycin | Applichem | ||
| H4-Azido-Phe-OH | Bachhem | ||
| Heat plate MR HeiTec | Heidolph | ||
| HindIII | NEB | ||
| HisTrap FF crude column | GE Life Sciences | Nickel column | |
| Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a. | Merck | ||
| Illuminator ix 20 | INTAS | ||
| Illuminator LAS-4000 | Fujifilm | ||
| Imidazole | Merck | ||
| Immersions oil for microscopy | Merck | ||
| Incubators shakers Unimax 1010 | Heidolph | ||
| Inkubator 1000 | Heidolph | ||
| IPTG, >99% | Roth | ||
| Kanamycinsulfate | Roth | ||
| L(+)-Arabinose | Roth | ||
| Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE | Sartorius | ||
| LB-Medium | Roth | ||
| Lyophilizer Alpha 2-4 LSC | Christ | ||
| Lysozyme, 20000 U/mg | Roth | ||
| Microscope CM 100 | Philips | ||
| Microscope Eclipse TS 100 | Nikon | ||
| Microscopy cover glasses (15 x 15 mm) | VWR | ||
| Microscopy slides | VWR | ||
| Microwave | Studio | ||
| Mini-Extruder Set | Avanti Polar Lipids | ||
| NaCl, >99.5%, p.a. | Roth | ||
| Natriumhydroxid pellets | Roth | ||
| Ni-NTA Agarose, PerfectPro | 5 Prime | ||
| Nucleopore Track-Etch Membrane | Avanti | ||
| PH meter 766 calimatic | Knick | ||
| Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF) | Roth | ||
| Polypropylene Columns (1 mL) | Qiagen | ||
| PowerPac basic | BioRad | ||
| Propanol-2-ol | Emplura | ||
| Protein ladder 10-250 kDa | NEB | ||
| Recirculating cooler F12 | Julabo | ||
| Reinforcement rings | Herma | ||
| SacI HF | NEB | ||
| SDS Pellets | Roth | ||
| Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4 | VWR | ||
| Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate | VWR | ||
| T4 DNA Ligase | NEB | ||
| TEMED | Roth | ||
| TexasRed Dextran-Conjugate | MolecularProbes | ||
| Thermomix comfort | Eppendorf | ||
| THF, >99.5% p.a. | Acros | ||
| Triton X 100 | Roth | ||
| Trypton/Pepton from Casein | Roth | ||
| Ultrasonic cleaner | VWR | ||
| Urea p.a. | Roth | ||
| Vacuum pump 2.5 | Vacuubrand | ||
| XbaI | NEB | ||
| XhoI | NEB | ||
| ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V) | Roth |
References
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