Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Instrueret samling af elastin-lignende proteiner i definerede supramolekylære strukturer og cargo indkapsling in Vitro

Published: April 8, 2020 doi: 10.3791/60935
* These authors contributed equally

Summary

På grænsefladen af organiske og vandige opløsningsmidler samles skræddersyede amfifile elastin-lignende proteiner i komplekse supramolekylære strukturer såsom vesikler, fibre og coacervater udløst af miljømæssige parametre. De beskrevne montageprotokoller giver Protein Membrane-Based Compartments (PMBC' er) med tunable-egenskaber, hvilket muliggør indkapsling af forskellige laster.

Abstract

Skræddersyede proteinholdige byggesten er alsidige kandidater til samling af overmolekylære strukturer såsom minimale celler, lægemiddelleveringskøretøjer og enzymstilladser. På grund af deres biokompatibilitet og tunabilitet på det genetiske niveau er Elastin-lignende proteiner (ELP) ideelle byggesten til bioteknologiske og biomedicinske anvendelser. Ikke desto mindre er samling af proteinbaserede supramolekylære strukturer med forskellige fysiokemiske egenskaber og gode indkapslingspotentiale fortsat udfordrende.

Her leverer vi to effektive protokoller for guidet selvsamling af amfifile ELPs i supramolekylære proteinarkitekturer som sfæriske coacervates, fibre og stabile vesikler. De præsenterede montageprotokoller genererer proteinmembranbaserede rum (PMBC'er) baseret på ELPs med fleksible fysisk kemiske egenskaber. PMBC'er demonstrerer faseseparationsadfærd og afslører metodeafhængig membranfusion og er i stand til at indkapsle kemisk mangfoldige fluorescerende lastmolekyler. De resulterende PMBC'er har et højt applikationspotentiale som lægemiddelformulering og leveringsplatform, kunstig celle og opdelt reaktionsrum.

Introduction

Samling af overmolekylære strukturer til bioteknologiske anvendelser får stadig større betydning1,2,3,4,5. Til samling af funktionelle arkitekturer som coacervater, vesikler og fibre med ønskede fysisk-kemiske egenskaber er det vigtigt at forstå og kontrollere komponenternes fysisk-kemiske og konformationelle egenskaber. På grund af molekylpræcisionen af molekyler, der findes i naturen, er byggestenene til supramolekylære strukturer i stigende grad baseret på lipider, nukleinsyrer eller proteiner. Sammenlignet med syntetiske polymerer giver proteinholdige byggesten mulighed for præcis kontrol over spirende supramolekylære strukturer6 på det genetiske niveau. Den primære aminosyresekvens (aa) af de enkelte proteinbyggestener koder i sig selv informationen for deres samlingspotentiale fra molekylop til makroskopisk niveau samt den tredimensionelle form og fysiske egenskaber af den endelige overmolekylære struktur7.

Rapporterede metoder til samling af forskellige supramolekylære strukturer involverer ofte amfifile proteiner såsom temperaturfølsomme elastin-lignende proteiner (ELP)5,8,9, rekombinant oleosin10og kunstige proteinamfifile11. Temperatur udløste metoder har ført til samling af micelles4,10,12Fibre13Ark14og vesikler9,15,16. Metoder, der involverer organiske opløsningsmidler, er blevet anvendt til dannelse af dynamiske proteinbaserede vesikler8,11,14. Hidtil anvendes protokoller for vesikel dannelse ofte mangler samling kontrol over mikrometer mellemstore forsamlinger16,17eller har begrænset samlingudbytte5. Desuden har nogle rapporterede ELP-baserede vesikler forringet indkapslingspotentialet12eller begrænset stabilitet over tid9. Løse disse ulemper, de præsenterede protokoller muliggøre selv-samling af mikrometer og sub mikrometer størrelse supramolekylære strukturer med forskellige fysiokemiske egenskaber, god indkapsling potentiale og lang tid stabilitet. Skræddersyede amfifile ELPs samles i supramolekylære strukturer, der spænder over området fra sfæriske coacervates og højt bestilte snoede fiberbundter til unilamellar vesikler afhængigt af den anvendte protokol og tilhørende miljøforhold. Store vesikulære proteinmembranbaserede rum (PMBC) afslører alle de vigtigste fænotyper såsom membranfusion og faseseparationsadfærd svarende til liposomer. PMBC'er indkapsler effektivt kemisk forskellige fluorescerende lastmolekyler, som kan overvåges ved hjælp af simpel epifluorescensmikroskopi. De gentagne ELP-domæner, der anvendes i denne undersøgelse, er attraktive byggesten for proteinbaserede supramolekylære arkitekturer18. ELP pentapeptid repeat unit (VPGVG) er kendt for at tolerere forskellige aa udover proline på den fjerde position (valin, V), samtidig med at dens strukturelle og funktionelle egenskaber19. Udformningen af amfifile ELPs indeholdende karakteristiske hydrofile og hydrofobiske domæner blev realiseret ved at indsætte aa gæst rester (X) i VPGXG gentage med særskilt hydrophobicity, polaritet, og afgift20. Amphiphilic ELP domæner, hvor udstyret med hydrofob phenylalanin (F) eller isoleucine (I), mens den hydrofile domæne indeholdt opkrævet glutaminsyre (E) eller arginin (R) som gæst rester. En liste over støtteberettigede amfifile ELP konstruktioner og tilsvarende aa sekvenser kan findes i de supplerende oplysninger og referencer8,21. Alle byggesten, hvor udstyret enten med små fluorescerende farvestoffer eller fluorescerende proteiner til visualisering via fluorescens mikroskopi. mEGFP og andre fluorescerende proteiner blev N-terminalt smeltet til de hydrofile domæner af ELP amfifile . Organiske farvestoffer blev konjugeret via kobber-fri stamme fremmes alkyne-azide cycloaddition (SPAAC) til en co-translationelt indført unaturlig aminosyre (UAA). Den samoversættelse af ULApara-azidophenylalanin (pAzF)22n-terminal-ændring af det hydrofile ELP-domæne. På denne måde er det grønne fluorescerende farvestof BDP-FL-PEG4-DBCO (BDP) eller et lille fluorescerende molekyle med en anstrengt cyclooctyne kan anvendes som fluorescerende sonde. Vellykket inkorporering af UAA pAzF og cycloaddition af farvestoffet via SPAAC kan let bekræftes via LC-MS/MS på grund af effektiv ionisering af de tilsvarende tryptiske peptider8. Dette lille organiske farvestof blev anvendt til at udvide valget af opløsningsmiddel til samleprotokoller, da fluorescerende proteiner er uforenelige med de fleste organiske opløsningsmidler. De to mest effektive montageprotokoller til overmolekylære strukturer, der er udviklet i vores laboratorium, er beskrevet nedenfor. THF hævelse metode er kun kompatibel med organisk farvestof modificeret amfifile ELP. I modsætning hertil er ekstruderingsmetoden 1-butanol (BuOH) kompatibel med mange proteiner som fluorescerende sonde fx mEGFP, da den beskrevne metode fuldt ud bevarer fluorescensen af disse fusionsproteiner. Desuden fungerer indkapslingen af små molekyler og vesikulær fusionsadfærd bedst ved at anvende BuOH ekstruderingsmetoden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Design og kloning af amfifile elastinlignende proteiner (ELPs)

  1. Klon og design konstruktionerne som beskrevet andetsteds8,20. Plasmider kan bestilles.

2. Proteinekspression, rensning og præparat

  1. Udtryk for F20E20-mEGFP og F20E20-mCherry
    1. Pode hovedudtrykskultur fra natten før kultur til en OD600 på 0,3. Inkuber ved 37 °C, 200 rpm i sterilt 400 ml LB-medium suppleret med tilegnet antibiotika i en 2 L kolbe.
    2. Forbered IPTG-stamopløsning (1 M) til induktion af udtrykskulturen i ultrarent vand.
    3. Når OD600 0,5-0,8 er nået, tilsættes IPTG til udtrykskultur til en endelig koncentration på 1 mM og inkubationstemperaturen reduceres til 20 °C. Lad udtrykket være ved 20 °C i ca. 20 timer ved 200 omdrejninger i minuttet.
  2. Ekspression af amfifil ELP indeholdende UAA pAzF
    1. Inokulere hovedudtrykskulturen fra dag til dag E. coli pre-kultur, der indeholder de to plasmider pEVOL pAzF og f.eks.600 Inkuber ved 37 °C, 200 rpm i sterilt 400 ml LB-medium suppleret med kanamycin og chloramphenicol i en 2 L kolbe.
    2. Forbered 100 mM pAzF stamopløsning i ultrarent vand. For 10 ml pAzF-stamopløsning vejes 206,2 mg pAzF og suspenderes igen i 8 ml ultrarent vand. For at opløse pAzF hæve pH-værdien af opløsningen med 3 M NaOH og blandes kraftigt. Når pAzF opløses, skal pH forsigtigt sænkes til 10,5 og der tilsættes ultrarent vand til et endeligt volumen på 10 ml. Brug et sterilt filter (0,22 μm) og aliquot opløsningen i 2 ml reaktionsrør.
    3. Forbered 1 M IPTG stamopløsning i ultrarent vand og 20% arabinose stamopløsning i ultrarent vand.
    4. Når OD600 0,5-0,8 er nået, skal du føje pAzF til udtrykskulturen til en endelig koncentration på 2 mM. Inkuberkultur i 10 min, 37 °C, 200 omdrejninger i minuttet for at give mulighed for pAzF-optagelse.
    5. Inducer ekspression af målprotein og ekspression af den nødvendige tRNA/t-RNA-synthetase ved samtidig tilsætning af IPTG (1 mM) og arabinose (2%) inkubationstemperaturen til 20 °C.
    6. Lad udtrykket være ved 20 °C i ca. 20 timer ved 200 omdrejninger i minuttet. Høstekspressionskultur ved centrifugering ved 4 °C, 4000 x g, 40 min.
  3. Cellelyse og proteinrensning
    1. Resuspender E. coli-pelleti lysisbufferen (10 ml pr. liter kultur; 50 mM Tris-HCl pH 8, 500 mM NaCl, 4 M urea, 0,25% Triton X-100), der indeholder lysozym (0,1 mg/ml) og PMSF (0,1 mM). Inkuber i 30 minutter på is og fryses og tøs to gange derefter ved nedsænkning af prøven i flydende nitrogen.
    2. Sonikere suspensionen (30%, 15 gange, 30 s: 10 s pause) og rydde lysatet via centrifugering (4 °C, 10.000 x g i 40 min).
    3. Rense protein ved hjælp af affinitetkromatografi (f.eks. på en 1 ml nikkelkolonne ved hjælp af et FPLC-system, der er tilsluttet en fraktionsopsamler; se Materialetabel). Elute proteinet med elueringsbuffer (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 4 M urinstof, 250-500 mM imidazol) og opbevares ved 4 °C indtil videre forarbejdning.
    4. Analysér rensningseffektiviteten via SDS-PAGE.

3. Dye-ændring af ELPs via SPAAC

  1. Groft skøn over koncentrationen af ELP-opløsningen.  En280 absorption for koncentration evaluering er ikke værdifuld, da pAzF-R40F20 sekvens mangler aminosyrer absorberende i UV-området. Derfor kan en tidligere lyophilized og vægtet ELP amfifil bruges som reference for SDS PAGE band sammenligning. Gennem sammenligning af den opsummerede grå værdiintesitet af SDS PAGE-bånd fra ELP-opløsninger med kendte koncentrationer og din prøve kan den ru koncentration af din prøve estimeres.
  2. Der tilsættes 1 μL fluorescerende farvestof BDP-FL-PEG4-DBCO (10 mM stamopløsning; 20 μM slutkoncentration) til 500 μL ELP-opløsning (~20 μM). Reaktionen inkuberes i ca. 10 timer ved 15 °C, mens den rystes og beskyttes mod lys.
  3. Til videre brug dialyze reaktionen for at fjerne overdreven BDP.
    1. Ækvilibrer en dialysemembran (f.eks. 12 kDa cutoff) i ultrarent vand i 10 min. Skær dialysemembranen i den korrekte størrelse, der skal placeres oven på åbningen af et reaktionsrør, der indeholder den klikkede ELP-opløsning. For at fikse dialysemembranen i åbningen skal der placeres et reaktionsrørlåg med udstanset kerne på åbningen, hvorved røret lukkes.
    2. Anbring reaktionsrøret på hovedet i den valgte buffer. Der udskiftes bufferen (2-5 L) to gange efter dialyse i mindst 3 timer hver gang. Fjern eventuelle luftbobler, der er fanget mellem dialysemembranen og bufferen, for at sikre vellykket dialyse.

4. THF hævelse protokol

  1. Dialyze homogen ELP-opløsning mod fosfat eller tris buffer (10 mM) med stabil pH 7.5 for at fjerne salte og resterende forbindelser fra hans-tag rensning.
  2. Forbered lyophilizer og køle ned til starttemperatur til frysetørring.
  3. Aliquot den dialyserede proteinopløsning i 1,5 ml reaktionsrør (50-500 μL pr. rør) og chokfrysning i flydende nitrogen. For at undgå uønsket blanding af forskellige proteinopløsninger under frysetørring kan hætter med et lille hul sættes oven på reaktionsrøret for at forsegle det delvist.
  4. Tag de frosne proteinprøver ud af det flydende kvælstof og læg dem straks i frysetørret. Frysetørring er færdig, når prøven er helt tør (ca. 24-48 timer). Derefter ventileres lyophiliseret amfifile ELPs med tør N2, derefter straks lukke reaktionsrøret låg for at undgå kontakt med luftfugt.
  5. Der tilsættes ren THF til de frysede prøver (ELP, 5-10 μM) og anbringes i en vandbadssoonator, der indeholder isvand, i 15 minutter for at give mulighed for hævelse af ELP i THF.
  6. Forvarm en termocycler til 30-60 °C for vesikeldannelse eller op til 90 °C for fiberdannelse, og forbered nye reaktionsrør, der indeholder enten ultrarent vand eller buffer (50 mM NaH2PO4/Na2HPO4, 50 mM NaCl, pH 5-13). Sfæriske coacervater samles overvejende ved 20 °C i pH 9-13. Vesikeldannelse foretrækkes ved 50-60 °C mellem pH 7 og 9. Fiberdannelse er prædominent induceret over 60 °C mellem pH 5 og 12.
  7. Efter sonikeringstrinnet anbringes ELP/THF-opløsningen samt den forberedte ultrarene vand- eller bufferopløsning i termocycleren og opvarmes op til den ønskede temperatur i 5 min. Når temperaturen er nået, skal den forvarmede ELP/THF-opløsning omhyggeligt stratificeres oven på den forvarmede ultrarene vand- eller bufferopløsning. En klar adskillelse af de to faser med en særskilt grænseflade bør være synlig.
  8. Placer blandingen i termocycleren igen og inkuber i 20 min for at give mulighed for vesikel eller fiberdannelse ved grænsefladen. Derefter skal prøverne køle ned til stuetemperatur i 10 minutter før analyse via fluorescensmikroskopi eller dialyse.
  9. Dialyzeopløsning indeholdende supramolekylære strukturer mod ultrarent vand eller buffer (50 mM NaH2PO4/Na2HPO4, 50 mM NaCl, pH 7-10).

5. BuOH ekstrudering protokol

  1. Der fremstilles en 1-50 μM ELP-opløsning i ultrarent vand eller buffer (50 mM PB pH 7.5, 100 mM NaCl, kan indeholde op til 4 M urinstof). Koncentrationen af den amfifile ELP F20R20-mEGFP og F20R20-mCherry opløsning kan bestemmes ved hjælp af molar udslettelseskoefficienter (F20R20-mEGFP A280 = 22015 M-1 cm-1 og F20R20-mCherry A280 = 34380 M-1 cm-1) (se supplerende oplysninger for aa sekvenser).
  2. Der tilsættes 10%-20% (v/v) 1-butanol, og opløsningen blandes straks ved at pipettere op og ned eller trække den op gennem en sprøjte flere gange. Der kan påføres en almindelig 100 μL pipette eller Hamilton-sprøjte udstyret med en nål på 0,25 x 25 mm. Opløsningens turbiditet under blanding bør øges, hvilket indikerer dannelse af vesikel. 1-octanol 5%-15% (v/v) kan også bruges til vesikelekstrudering i stedet for 1-butanol.
  3. For at opnå en smal størrelsefordeling ekstrudere vesikler ved hjælp af en miniekstruder gennem en membran med en porestørrelse på 1 μm ved stuetemperatur. Membranen størrelse, der anvendes til ekstrudering bestemmer den øverste størrelse cutoff af vesiklerne.
  4. Dialyze vesiklerne som beskrevet ovenfor (trin 3.3) for at fjerne resterende 1-butanol.

6. Dye indkapsling med BuOH ekstrudering protokol

  1. Ca. 40 μL ELP-opløsning blandes i 10 mM Tris-HCl, pH 8 med 1 μL Dextran Texas Red (0,0025 mg/ml endelig koncentration).
  2. Der tilsættes 10 μL BuOH til opløsningen, og 5-10 gange ekstrudere gennem en sprøjte udstyret med en nål på 0,25 x 25 mm.

7. Analyse af overmolekylære strukturer ved hjælp af fluorescensmikroskopi

  1. Anbring en forstærkningsring på en glasrutsjebane, og tryk klæbesiden fast på glasset.
  2. Der tilsættes 5 μL af prøven på indersiden af forstærkningsringen, og der anbringes en dækselpå toppen.
  3. Prøven forsegles med neglelak i kanterne af dækstrækket for at undgå fordampning af prøven under analyse.
  4. Mikroskopi af fluorescens som tidligere beskrevet8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokoludvikling for vesikelproduktion
Figur 1 skitserer de to forskellige vesikeltilberedningsmetoder. THF hævelse metode på venstre side er sammensat af tre på hinanden følgende trin og resulterer i forskellige overmolekylære forsamlinger af ELP afhængigt af temperaturen. I figur 1A viser mikroskopi af epifluorescens vesikler samlet fra BDP-R20F20 og fibrillary strukturer samlet fra BDP-R40F20. Den BuOH metode, illustreret på højre side udelukkende fører til dannelsen af ELP vesikler, giver omkring to størrelsesordener flere vesikler i forhold til THF hævelse metode. Den skematisk illustration viser forberedelsesprocessen af BuOH vesikler. For vesikelpræparat i figur 1B BDP-R40F20 blev blandet med 10-15% (v/v) BuOH og vesikler blev fremstillet ved ekstrudering af blandingen.

Vejledende supramolekylær selvsamling i forskellige strukturer
Figur 2 viser en skematisk illustration og epifluorescens billeder af forskellige supramolekylære strukturer samlet fra BDP-R40F20 via THF hævelse protokol. I dette tilfælde blev det sat BDP-R40F20 til de forskellige montageprotokoller. bufferens pH og temperaturen i samleprocessen blev justeret til enten coacervater, fibriller eller vesikler. De coacervater, der er afbildet i figur 2A, er 1-2 μm i diameter og blev samlet fra BDP-R40F20 ved 20 °C og pH 13. Justering af samletemperaturen til 90 °C resulterer i dannelsen af nanofiberbundter (figur 2B) ved pH 4-13 testet med BDP-R40F20. Stabile vesikler kan samles fra ELP ved en temperatur på 50 °C og pH 7 (Figur 2C). Små fejl ved et af de afgørende trin i samleprotokollen kan føre til dannelse af aggregater, der er afbildet i figur 2D.

Indkapsling af forskellig last
Figur 3 viser indkapslingen af forskellig last i vesikellumen af vesikler, der er samlet fra F20R20-mEGFP via BuOH-ekstruderingsmetoden. Ved indkapslingen af det positivt ladede farvestof Atto Rho13 i figur 3Ablev farvestoffet blandet med den vandige ELP-opløsning før tilsætning af (15% v/v) BuOH og sprøjtekstrudering af blandingen. De konfokale mikroskopi billeder viser vesikler dannet af F20R20-mEGFP i den grønne kanal, det røde farvestof AttoRho13 i den røde kanal og den deraf følgende fusionerede kanal viser den vellykkede indkapsling inde i vesikel lumen.

Polysaccharid Dextran Red 3000 blev indkapslet med succes ved hjælp af BuOH ekstruderingsmetoden som beskrevet ovenfor. Billeder optaget i grøn kanal viser vesiklerne dannet af F20R20-mEGFP, mens den røde kanal viser polysaccharidlasten. Flettet grønt og rødt billede i figur 3B bekræfter den vellykkede Dextran Red 3000-indkapsling i vesikellumen.

Membrankomponentkompatibilitet og faseadskillelse af blandede BuOH-vesikler før/efter ekstrudering
Figur 4 viser ELP-amfifile' faseseparationog fusionsadfærd ved blanding af enkelte PMBC-byggesten versus samlede PMBC-populationer. Blanding af amfifile ELP byggesten (F20R20-mEGFP og F20R20-mCherry) før PMBC samling fører til homogent fordelt molekyler inden for den samlede PMBC membran. Den homogene fordeling af fluorophorer og tilhørende ELP-amfifile er tydelig ved sammenlægning en rød og grøn kanal af de respektive fluorescens billeder. Ved at blande vesikelpopulationer samlet fra enten F20R20-mEGFP eller F20R20-mCherry tydeligt synlige membran pletter af rød eller grøn fluorescens er indlysende umiddelbart efter blanding. Dette indikerer, at DER forekommer PMBC-fusionshændelser med forskelligt mærkede PMBC'er, og at disse sammensmeltende membraner og deres bestanddele forbliver fase adskilt i mindst 20 min. En lignende fase adfærd er kendt fra lipid flåder, inden lipid membraner23.

Figure 1
Figur 1: Illustration af THF-hævelsesmetoden og BuOH-ekstruderingsmetoden til den styrede selvsamling af amfifile ELPs i supramolekylære strukturer såsom vesikler eller fibre. Skematisk arbejdsgang og repræsentative epifluorescensbilleder af (A) THF-hævelsesmetoden med BDP-R20F20 og BDP-R40F20, hvilket resulterer i forskellige overmolekylære strukturer afhængigt af temperatur og pH og (B) BuOH ekstruderingsmetoden, der udelukkende giver vesikler fra BDP-R40F20 (skalabar 2 μm). Dette tal er blevet ændret fra Schreiber et al. 20198. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Ved at anvende THF-hævelsesmetoden BDP-R40F20 samles selv i forskellige overmolekylære strukturer. De miljøforhold, der anvendes under samleprotokollen (f.eks. temperatur eller pH), bestemmer den overvejende supramolekylære struktur, der dannes. Repræsentative supramolekylære strukturer under de respektive forhold under samlingen blev overvåget via epifluorescensmikroskopi og spænder fra (A) coacervater og (B) fibriller til (C) stabile vesikler. (D) Svigt i samlingen af definerede strukturer under THF-hævelsesprotokollen fører til dannelse af uspecifikke aggregater (skalabar 2 μm). Dette tal er blevet ændret fra8. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Forskellige laster kan indkapsles i ELP-vesikler ved hjælp af BuOH-ekstruderingsmetoden. (A) viser repræsentative konfokale billeder af F20R20-mEGFP vesikler med indkapslet positivt ladet farvestof AttoRho13 og (B) indkapslingen af polysaccharid dextran rød (skala bar 5 μm). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Membrankomponentkompatibilitet og fusionsadfærd af vesikelmembraner samlet fra F20R20 via BuOH ekstruderingsmetode. (A) Blanding af fluorescerende F20R20-mEGFP og F20R20-mCherry protein opløsning før sprøjteekstrudering fører til PMBC membraner med homogent fordelt amfifile proteiner synlige i grøn kanal (venstre billede), rød kanal (midterste billede), og fusioneret kanal (højre billede). (B) PMBC'er samlet fra enten F20R20-mEGFP eller F20R20-mCherry og blandes efterfølgende via udtrusing af sprøjte til adskilte ELP-amfifile pletter i PMBC-membranerne. De separerede ELP-amfifile i membranen er synlige efter PMBC-fusion i mindst 20 min i grøn kanal (venstre billede), rød kanal (mellembillede) og den fusionerede kanal (højre billede). Skalastængersvarer til 5 μm. Dette tal er blevet ændret fra Schreiber et al. 20198. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En fejl, der følger de beskrevne protokoller for samling af definerede overmolekylære strukturer, fører hovedsagelig enten til dannelsen af uspecifikke aggregater (figur 2,IV) eller til homogent distribuerede ELP-amfifile. Kritiske trin i protokollen er beskrevet nedenfor:

For højt udtryksudbytte af den amfifile ELP er en relativt lav temperatur på 20°C optimal. For vellykket affinitet baseret rensning af den amfifile ELP en urinstof koncentration på 4 M i lysis buffer blev vist sig at bedst opløse den amfifile ELP og øge proteinudbyttet i den opløselige eluion fraktion. Hvis der ønskes lavere urinstofkoncentrationer i lysisbufferen, skal affinitetsrensningtestes for de enkelte konstruktioner. 2 M urea fungerede også for nogle konstruktioner, især for dem, hvor Hans-tag blev smeltet til det hydrofile domæne og derfor stadig i stand til at binde harpiksen.  En yderligere rensning skridt efter Hans-tag rensning via størrelse udelukkelse kromatografi kan øge vesikel udbytte samt.

I tilfælde af anvendelse af THF-hævelse protokol, den amfifile ELP skal mærkes med en fluorescerende organisk farvestof til visualisering. Det er vigtigt for BDP-mærkningen af den amfifile ELP (se supplerende oplysninger om aminosyresekvenser, der indeholder UAA pAzF) via SPAAC, er fraværet af reduktiv såsom TCEP, DTT eller β-mercaptoethanol i alle rensningsbuffere. Dette er nødvendigt for at undgå brøndrapporteret azide til aminreduktion af pAzF før SPAAC-reaktionen24.

Den nøjagtige reaktion stoichiometri af farvestof til amfifile ELP (f.eks pAzF-R40F20) er ikke afgørende, da det ikke er nødvendigt at mærke hver enkelt ELP molekyle for simpel vesikel visualisering via epifluorescens mikroskopi. Derfor er korrelationen mellem et reference-SDS-gelbånd og den tilsvarende vægtede frysetørrede prøve kun nødvendig én gang for hver proteinkonstruktion. Men hvis tæt på 100% mærkning udbytte ønskes et forhold på 1:1 ækvivalenter farvestof til ELP molekyler er tilstrækkelig. Meget lignende amfifile ELPs blev analyseret i vores laboratorium for at være fuldt mærket på en ækvimomtilsætning af BDP (data endnu ikke offentliggjort).

For vesikel præparat ved hjælp af THF hævelse metode, de mest kritiske trin er hævelse af lyophilized amfifile ELP og efterfølgende lagdeling af denne opløsning på toppen af den vandige buffer fase. Derfor bør den nylyophiliserede amfifile ELP være så vandfri som muligt, hvilket kan opnås ved ventilation af lyophilizer med tør nitrogengas og øjeblikkelig lukning af reaktionsrørets låg. Hvis septum forseglet tør THF bør anvendes til at øge vesikeludbyttet, men THF p.a. (>99.5%) uden septum virker så godt. Stratificeringskridtet ved hævelse af den amfifile ELP i tør THF bør udføres meget omhyggeligt. Vellykket lagdeling af de to temperaturstyrede opløsninger fører til en klart synlig fasegrænse mellem organisk og vandig fase. Det første stratificeringstrin bør udføres langsomt, selv om forhøjede temperaturer fører til termisk induceret blanding af disse faser. Emergent turbiditet af opløsningen skyldes lys spredning af dannede vesikler, fibre eller coacervates. I kontrolprøver mangler protein, ingen turbiditet vises selv små størrelser (op til 200 nm) er rapporteret for THF vand-interface25. THF stratificering skridt er den mest kritiske og fiasko tilbøjelige trin i hævelse protokol. Efter inkubationstrinnet kan de supramolekylære strukturer dialyseres mod buffer eller ultrarent vand. Fortrinsvis bør den samme vandige opløsning anvendes, som blev anvendt til indledende samling for at opretholde osmolaritet og forhindre hævelse eller indskrænkning af de samlede vesikler. Efter dialyse, vesikler, fibre og coacervates er normalt stabile i mindst en uge. Afhængigt af de miljømæssige parametre under monteringen er der ofte en lille del af andre overmolekylære strukturer ud over hovedstrukturen, hvis THF-hævelsesmetoden anvendes8. Den beskrevne THF metode øger vesikel forsamling udbytte med en størrelsesorden, mens BuOH ekstrudering forbedrer udbyttet med tre størrelsesordener i forhold til vores tidligere offentliggjort in vitro metode5.

BuOH ekstruderingsmetoden anvendes til at opnå udelukkende stabile vesikulære strukturer med høj reproducerbarhed, omgåfibre og sfæriske coacervates. Denne metode er mindre fejltilbøjelige og kompatibel med fluorescerende proteiner. Derfor kan F20R20-mEGFP eller F20R20-mCherry anvendes samt BDP-R40F20 eller BDP-E20F20. Det eneste kritiske skridt er den hurtige blanding af den vandige proteinopløsning efter tilsætning af 10%-20% v/v BuOH. F20R20-mEGFP- eller F20R20-mCherry-koncentrationen skal være omkring 1-15 μM. Ved at anvende BuOH ekstruderingmetode kan vesikler samles i ultrarent vand eller buffer indeholdende op til 5 M NaCl eller 4 M urinstof og pH fra 5 til 8. Ekstruderet PMBC'er i 20% v/v BuOH kan opbevares i mindst 6 måneder ved 4°C, samtidig med at deres vesikulære struktur bevares. For at indsnævre vesikelstørrelsesfordelingen kan de ekstruderes ved hjælp af en miniekstruder gennem en membran på 0,2-1 μm porestørrelse. Denne pore ekstrudering kan gøres umiddelbart efter BuOH tilføjelse til den amfifile ELP eller efter vesikel forsamling. Hvis PMBC'er er for koncentrerede til billeddannelse, kan samlede vesikler i BuOH fortyndes ved hurtig blanding ved hjælp af vandig buffer, der indeholder 10%-20% v/v BuOH.

Den største begrænsning af BuOH ekstrudering metode er, at PMBC dialyse mod vandige buffere ofte resulterer i dårlig vesikel udbytte. Endvidere kan tilstedeværelsen af resterende BuOH i membranrummet ikke udelukkes, da simple fedtsyrer var i stand til at inkorporere i PMBCmembranen 21. Derfor kan PMBC membraner til en vis grad være sammensat af protein og alkanol moieties.

Indkapsling af kemisk forskellige lastmolekyler fungerer bedst ved hjælp af BuOH ekstruderingsmetoden. Endvidere øger DMSO som opløsningsmiddel til den stamopløsning af farvestoffet, der skal opfanges, farvestoffets indkapslingseffektivitet. For sart elast, der skal indkapslet, 5%-10% v/v 1-octanol kan bruges til PMBC samling og har vist sig at være bedre kompatible, sammenlignet med BuOH, med funktionelle indkapslet enzymer såsom DNA-ligase eller TEV protease21,26. Men på grund af den kortere kædelængde af n-butanol kan den dialyseres mod vandig buffer i modsætning til 1-octanol, som ikke er i stand til at gennemsyre den påførte dialysemembran. En anden metodebegrænsning er, at de anvendte temperaturer og pH-værdier, der er nødvendige for at kontrollere den ønskede overstrukturdannelse, kan påvirke enzymaktiviteten. I fremtidige arbejde bør der etableres rensning af affinitet eller størrelsesekskludering for at adskille ikke-indkapslet versus indkapslet molekyler uden forringet vesikelmembranintegritet.

I modsætning til film rehydrering metoder16,17 heri beskrevne protokoller gør det muligt samling af vesikler størrelser større end 600 nm. Dette gør det muligt at overvåge fusionshændelser i realtid ved hjælp af simpel mikroskopi af epifluorescens og observation af membranfaseseparation8. Sammenlignet med temperatur udløst vesikulær samling af amfifile ELP9 de protokoller, der er beskrevet her giver PMBC med en lang tid stabilitet på op til 6 måneder. Men den største ulempe er behovet for organisk opløsningsmiddel til strukturdannelse. Selvom BuOH fuldt ud bevarer fluorescerende proteiners integritet og funktion27 (data, der ikke er vist), kan aktiviteten af indkapslede enzymer begrænses af restorganisk opløsningsmiddel og skal testes individuelt. Men, katalytiske reaktioner involverer DNA- ligase, TEV-protease og lipase er blevet gennemført med succes inden for luminal rum vesikler, samlet af 1-octanol eller BuOH ekstrudering26,21. Derudover, selv om THF dialyse efter samling er meget uproblematisk og vesikel integritet bevares, BuOH fjernelse ofte resulterer i tab af vesikel integritet på grund af ukendte årsager.

De beskrevne protokoller gør det muligt for forskere at samle mikrometer og sub mikrometer størrelse supramolekylære strukturer med forskellige fysisk-kemiske egenskaber, gode indkapsling segenskaber, og lang tid stabilitet. Disse supramolekylære strukturer kan anvendes til design af minimalceller26 eller kunstig celleforskning21,enzymindkapsling eller lægemiddelformulering. De præsenterede funktionelle PMBC'er er yderligere lovende kandidater til levering af lægemidler, da deres byggesten ikke er immungene28,udviser dynamisk fusionsadfærd og giver mulighed for forskellige lastindkapsling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne takker BMBF for finansiel støtte og Center for Biological Systems Analysis (ZBSA) for at yde forskningsfaciliteten. Vi er taknemmelige for P. G. Schultz, TSRI, La Jolla, Californien, USA for at give plasmid pEVOL-pAzF. Vi takker personalet i Life Imaging Center (LIC) i Center for Biological Systems Analysis (ZBSA) af Albert-Ludwigs-University Freiburg for hjælp med deres konfokale mikroskopi ressourcer, og den fremragende støtte i billedoptagelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 µm and 0.2 µm Steril Filter VWR
1,4-Dithiothreitol Merck
1-butanol. >99.5% p.a. Roth
2log DNA ladder NEB
2-Mercaptoethanol Roth
50 mL Falcon tubes VWR
79249 Alkyne Mega Stokes dye Sigma Aldrich
Acetic acid glacial VWR
Acetonitrile, anhydrous, 99.8% Sigma-Aldrich
Ampicillin sodium-salt, 99% Roth
BDP-FL-PEG4-DBCO Jena Bioscience
Biofuge Heraeus
Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm) Thermo Scientific
Brillant Blue G250 (Coomassie) Roth
BspQI NEB
Camera DS Qi1 Nikon
Centrifuge 5417r Eppendorf
Centrifuge 5810r Eppendorf
CF-400-Cu square mesh copper grid EMS
Chloramphenicol Roth
CompactStar CS 4 VWR
Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral Life Technologies
Digital sonifier Branson
Dimethylsulfoxide (DMSO) Applichem
Dnase I Applichem
EarI NEB
EcoRI-HF NEB
Environmental shaker incubator ES-20 Biosan
Ethanol absolute Roth
Ethidium bromide solution Roth
Filter supports Avanti
Glass plates Bio-Rad
Glycerol Proteomics Grade Amresco
Glycin Applichem
H4-Azido-Phe-OH Bachhem
Heat plate MR HeiTec Heidolph
HindIII NEB
HisTrap FF crude column GE Life Sciences Nickel column
Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a. Merck
Illuminator ix 20 INTAS
Illuminator LAS-4000 Fujifilm
Imidazole Merck
Immersions oil for microscopy Merck
Incubators shakers Unimax 1010 Heidolph
Inkubator 1000 Heidolph
IPTG, >99% Roth
Kanamycinsulfate Roth
L(+)-Arabinose Roth
Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE Sartorius
LB-Medium Roth
Lyophilizer Alpha 2-4 LSC Christ
Lysozyme, 20000 U/mg Roth
Microscope CM 100 Philips
Microscope Eclipse TS 100 Nikon
Microscopy cover glasses (15 x 15 mm) VWR
Microscopy slides VWR
Microwave Studio
Mini-Extruder Set Avanti Polar Lipids
NaCl, >99.5%, p.a. Roth
Natriumhydroxid pellets Roth
Ni-NTA Agarose, PerfectPro 5 Prime
Nucleopore Track-Etch Membrane Avanti
PH meter 766 calimatic Knick
Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF) Roth
Polypropylene Columns (1 mL) Qiagen
PowerPac basic BioRad
Propanol-2-ol Emplura
Protein ladder 10-250 kDa NEB
Recirculating cooler F12 Julabo
Reinforcement rings Herma
SacI HF NEB
SDS Pellets Roth
Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4 VWR
Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate VWR
T4 DNA Ligase NEB
TEMED Roth
TexasRed Dextran-Conjugate MolecularProbes
Thermomix comfort Eppendorf
THF, >99.5% p.a. Acros
Triton X 100 Roth
Trypton/Pepton from Casein Roth
Ultrasonic cleaner VWR
Urea p.a. Roth
Vacuum pump 2.5 Vacuubrand
XbaI NEB
XhoI NEB
ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V) Roth

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elzoghby, A. O., Samy, W. M., Elgindy, N. A. Protein-based nanocarriers as promising drug and gene delivery systems. Journal of Controlled Release. 161 (1), 38-49 (2012).
  2. Jang, Y., Champion, J. A. Self-Assembled Materials Made from Functional Recombinant Proteins. Accounts of Chemical Research. 49 (10), 2188-2198 (2016).
  3. Timmermans, S. B. P. E., van Hest, J. C. M. Self-assembled nanoreactors based on peptides and proteins. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 35, 26-35 (2018).
  4. Dreher, M. R., et al. Temperature Triggered Self-Assembly of Polypeptides into Multivalent Spherical Micelles. Journal of the American Chemical Society. 130 (2), 687-694 (2008).
  5. Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).
  6. Matsuurua, K. Rational design of self-assembled proteins and peptides for nano- and micro-sized architectures. RSC Advances. 4 (6), 2942-2953 (2013).
  7. Rocklin, G. J., et al. Global analysis of protein folding using massively parallel design, synthesis, and testing. Science. 357 (6347), 168-175 (2017).
  8. Schreiber, A., Stühn, L. G., Huber, M. C., Geissinger, S. E., Rao, A., Schiller, S. M. Self-Assembly Toolbox of Tailored Supramolecular Architectures Based on an Amphiphilic Protein Library. Small. 15 (30), 1900163 (2019).
  9. Jang, Y., Hsieh, M. -C., Dautel, D., Guo, S., Grover, M. A., Champion, J. A. Understanding the Coacervate-to-Vesicle Transition of Globular Fusion Proteins to Engineer Protein Vesicle Size and Membrane Heterogeneity. Biomacromolecules. 20 (9), 3494-3503 (2019).
  10. Vargo, K. B., Sood, N., Moeller, T. D., Heiney, P. A., Hammer, D. A. Spherical micelles assembled from variants of recombinant oleosin. Langmuir: the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (38), 11292-11300 (2014).
  11. Bellomo, E. G., Wyrsta, M. D., Pakstis, L., Pochan, D. J., Deming, T. J. Stimuli-responsive polypeptide vesicles by conformation-specific assembly. Nature Materials. 3 (4), 244-248 (2004).
  12. Martín, L., Castro, E., Ribeiro, A., Alonso, M., Rodríguez-Cabello, J. C. Temperature-Triggered Self-Assembly of Elastin-Like Block Co-Recombinamers:The Controlled Formation of Micelles and Vesicles in an Aqueous Medium. Biomacromolecules. 13 (2), 293-298 (2012).
  13. Li, Y., Rodriguez-Cabello, J. C., Aparicio, C. Intrafibrillar Mineralization of Self-Assembled Elastin-Like Recombinamer Fibrils. ACS Applied Materials & Interfaces. , (2017).
  14. Vargo, K. B., Parthasarathy, R., Hammer, D. A. Self-assembly of tunable protein suprastructures from recombinant oleosin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (29), 11657-11662 (2012).
  15. Park, W. M., Champion, J. A. Thermally Triggered Self-Assembly of Folded Proteins into Vesicles. Journal of the American Chemical Society. 136 (52), 17906-17909 (2014).
  16. Vogele, K., et al. Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments. Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).
  17. Vogele, K., et al. In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth. Journal of Visualized Experiments. (148), e59831 (2019).
  18. Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2015).
  19. Urry, D. W., et al. Elastin: a representative ideal protein elastomer. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).
  20. Huber, M. C., Schreiber, A., Wild, W., Benz, K., Schiller, S. M. Introducing a combinatorial DNA-toolbox platform constituting defined protein-based biohybrid-materials. Biomaterials. 35 (31), 8767-8779 (2014).
  21. Schreiber, A., Huber, M. C., Schiller, S. M. Prebiotic Protocell Model Based on Dynamic Protein Membranes Accommodating Anabolic Reactions. Langmuir. 35 (29), 9593-9610 (2019).
  22. Chin, J. W., Santoro, S. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. Addition of p-Azido-l-phenylalanine to the Genetic Code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  23. Sonnino, S., Prinetti, A. Membrane domains and the "lipid raft" concept. Current Medicinal Chemistry. 20 (1), 4-21 (2013).
  24. Bräse, S., Gil, C., Knepper, K., Zimmermann, V. Organische Azide - explodierende Vielfalt bei einer einzigartigen Substanzklasse. Angewandte Chemie. 117 (33), 5320-5374 (2005).
  25. Li, Z., et al. Large-Scale Structures in Tetrahydrofuran–Water Mixture with a Trace Amount of Antioxidant Butylhydroxytoluene (BHT). The Journal of Physical Chemistry B. 115 (24), 7887-7895 (2011).
  26. Huber, M. C., Schreiber, A., Schiller, S. M. Minimalist Protocell Design: A Molecular System Based Solely on Proteins that Form Dynamic Vesicular Membranes Embedding Enzymatic Functions. ChemBioChem. 20 (20), 2618-2632 (2019).
  27. Raghunathan, G., et al. A comparative study on the stability and structure of two different green fluorescent proteins in organic co-solvent systems. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 18 (2), 342-349 (2013).
  28. Sallach, R. E., et al. Long-term biostability of self-assembling protein polymers in the absence of covalent crosslinking. Biomaterials. 31 (4), 779-791 (2010).

Tags

Kemi elastin-lignende proteiner proteinbaserede vesikler proteinfibre lægemiddelfremføringssystemer selvsamling proteinmembran
Instrueret samling af elastin-lignende proteiner i definerede supramolekylære strukturer og cargo indkapsling in Vitro
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schreiber, A., Stühn, L. G.,More

Schreiber, A., Stühn, L. G., Geissinger, S. E., Huber, M. C., Schiller, S. M. Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro. J. Vis. Exp. (158), e60935, doi:10.3791/60935 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter