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Chemistry

परिभाषित सुप्रामॉलिक्यूलर संरचनाओं और विट्रो में कार्गो एनकैप्सुलेशन में एलेस्टिन की तरह प्रोटीन की विधानसभा का निर्देश दिया

Published: April 8, 2020 doi: 10.3791/60935
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3,4,5,6
1Center for Biological Systems Analysis, University of Freiburg, 2Faculty of Biology, University of Freiburg, 3Freiburg Institute for Advanced Studies (FRIAS), University of Freiburg, 4BIOSS Centre for Biological Signalling Studies, University of Freiburg, 5IMTEK Department of Microsystems Engineering, University of Freiburg, 6Cluster of Excellence livMatS at FIT - Freiburg Center for Interactive Materials and Bioinspired Technologies, University of Freiburg
* These authors contributed equally

Summary

कार्बनिक और जलीय सॉल्वैंट्स के इंटरफेस पर, सिलवाया एम्फीफिलिक इलास्टिन जैसे प्रोटीन पर्यावरणीय मापदंडों द्वारा ट्रिगर किए गए वेसिकल्स, फाइबर और सहसरवेट जैसे जटिल अधिआणविक संरचनाओं में इकट्ठा होते हैं। वर्णित असेंबली प्रोटोकॉल में प्रोटीन झिल्ली-आधारित डिब्बे (पीएमबीसी) होते हैं, जो विभिन्न कार्गो के एन्कैप्सुलेशन को सक्षम करते हैं।

Abstract

सिलवाया प्रोटीनसियस बिल्डिंग ब्लॉक कम से कम कोशिकाओं, दवा वितरण वाहनों और एंजाइमों मचान जैसी अधिआणविक संरचनाओं की असेंबली के लिए बहुमुखी उम्मीदवार हैं। आनुवंशिक स्तर पर उनकी जैव अनुकूलता और ट्यूनेबिलिटी के कारण, एलेस्टिन जैसे प्रोटीन (ईएलपी) जैव प्रौद्योगिकीय और जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए आदर्श बिल्डिंग ब्लॉक हैं। फिर भी, अलग-अलग शारीरिक गुणों और अच्छे एनकैप्सुलेशन क्षमता के साथ प्रोटीन आधारित अधिआणविक संरचनाओं की असेंबली चुनौतीपूर्ण बनी हुई है।

यहां हम गोलाकार सहसेरवेट, फाइबर और स्थिर वेसिकल्स जैसे सुप्रामॉलिक प्रोटीन आर्किटेक्चर में एम्फीफिलिक ईएलपी के निर्देशित आत्म-असेंबली के लिए दो कुशल प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। प्रस्तुत असेंबली प्रोटोकॉल अनुकूलनीय भौतिकरासायनिक गुणों के साथ ईएलपी के आधार पर प्रोटीन झिल्ली-आधारित डिब्बे (पीएमबीसी) उत्पन्न करते हैं। पीएमबीसी चरण अलगाव व्यवहार प्रदर्शित करता है और विधि निर्भर झिल्ली संलयन को प्रकट करता है और रासायनिक रूप से विविध फ्लोरोसेंट कार्गो अणुओं को समझाना करने में सक्षम हैं। परिणामस्वरूप पीएमबीसी में दवा निर्माण और वितरण मंच, कृत्रिम सेल और विभाजित प्रतिक्रिया स्थान के रूप में एक उच्च आवेदन क्षमता है।

Introduction

जैव प्रौद्योगिकीय अनुप्रयोगों के लिए अधिआणविक संरचनाओं की असेंबली तेजी से महत्वपूर्ण होती जा रही है1,2,3,4,5। वांछित भौतिक रासायनिक गुणों के साथ कोसेर्वेट, वेसिकल्स और फाइबर जैसे कार्यात्मक आर्किटेक्चर की असेंबली के लिए घटकों के भौतिक रासायनिक और संरचना गुणों को समझना और नियंत्रित करना महत्वपूर्ण है। प्रकृति में पाए जाने वाले अणुओं की आणविक परिशुद्धता के कारण, सुप्राआणविक संरचनाओं के लिए निर्माण ब्लॉक लिपिड, न्यूक्लिक एसिड या प्रोटीन पर तेजी से आधारित होते हैं। सिंथेटिक पॉलिमर की तुलना में, प्रोटीनसियस बिल्डिंग ब्लॉक आनुवंशिक स्तर पर आकस्मिक अधिआणविक संरचनाओं6 पर सटीक नियंत्रण के लिए अनुमति देते हैं। व्यक्तिगत प्रोटीन बिल्डिंग का प्राथमिक अमीनो एसिड (एए) अनुक्रम आंतरिक रूप से आणविक से स्थूल स्तर तक अपनी असेंबली क्षमता के साथ-साथ अंतिम अधिआणविक संरचना7के तीन आयामी आकार और भौतिक गुणों के लिए जानकारी को एन्कोड करता है।

विभिन्न अधिआणविक संरचनाओं की असेंबली के लिए सूचित विधियों में अक्सर तापमान संवेदनशील इलास्टिन जैसे प्रोटीन (ईएलपी) जैसे एम्फीफिलिक प्रोटीन शामिल होते हैं5,8,9, पुनः संयोजन ओलियोसिन10और कृत्रिम प्रोटीन एम्फीफिल्स11. तापमान ट्रिगर तरीकों ने मिसेल की असेंबली को प्रेरित किया है4,10,12फाइबर13पत्रक14और वेसिकल्स9,15,16. गतिशील प्रोटीन आधारित वेसिकल्स के गठन के लिए कार्बनिक सॉल्वैंट्स से जुड़े तरीके लागू किए गए हैं8,11,14. अब तक, वेसिकल गठन के लिए लागू प्रोटोकॉल अक्सर माइक्रोमीटर आकार विधानसभाओं पर विधानसभा नियंत्रण की कमी16,17या सीमित विधानसभा उपज है5. इसके अलावा, कुछ रिपोर्ट ELP आधारित vesicles encapsulation क्षमता बिगड़ा है12या समय के साथ सीमित स्थिरता9. इन कमियों को संबोधित करते हुए, प्रस्तुत प्रोटोकॉल माइक्रोमीटर और उप माइक्रोमीटर आकार के अलग-अलग शारीरिक गुणों, अच्छी एनकैप्सुलेशन क्षमता और लंबे समय तक स्थिरता के साथ सुप्रामॉलिक संरचनाओं की आत्म-असेंबली को सक्षम करते हैं। सिलवाया एम्फीफिलिक ईएलपीएस अधिआणविक संरचनाओं में इकट्ठा होते हैं, जो गोलाकार सहएरवेट से सीमा में फैले होते हैं और एप्लाइड प्रोटोकॉल और संबद्ध पर्यावरणीय स्थितियों के आधार पर अति-व्यवस्थित फाइबर बंडलों को बेजोड़ वेसिकल्स में ले जाते हैं। बड़े वेसिकुलर प्रोटीन झिल्ली-आधारित डिब्बे (पीएमबीसी) सभी मुख्य फेनोटाइप जैसे झिल्ली संलयन और लिपोसोम के अनुरूप चरण पृथक्करण व्यवहार को प्रकट करते हैं। पीएमबीसी कुशलतापूर्वक रासायनिक रूप से विविध फ्लोरोसेंट कार्गो अणुओं को समाहित करते हैं, जिनकी सरल एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके निगरानी की जा सकती है । इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले दोहराव ईएलपी डोमेन प्रोटीन आधारित सुप्रामॉलिक्यूलर आर्किटेक्चर के लिए आकर्षक बिल्डिंग ब्लॉक हैं18. ईएलपी पेंटापेप्टाइड रिपीट यूनिट (वीपीजीवीजी) को अपने संरचनात्मक और कार्यात्मक गुणों को संरक्षित करते हुए चौथे स्थान (वैलिन, वी) पर प्रोलाइन के अलावा विभिन्न एए को बर्दाश्त करने के लिए जाना जाता है।19. विशिष्ट हाइड्रोफिलिक और हाइड्रोफोबिक डोमेन वाले एम्फीफिलिक ईएलपीएस के डिजाइन को अलग हाइड्रोफोबिसिटी, ध्रुवीकरण और चार्ज के साथ वीपीजीएक्सजी रिपीट में एए अतिथि अवशेष (एक्स) डालने से महसूस किया गया था।20. एम्फीफिलिक ईएलपी डोमेन जहां हाइड्रोफोबिक फिनाइलाइन (एफ) या आइसोल्यूसिन (I) से लैस है जबकि हाइड्रोफिलिक डोमेन में अतिथि अवशेषों के रूप में चार्ज ग्लूटामिक एसिड (ई) या आर्जिनिन (आर) शामिल थे। पात्र एम्फीफिलिक ईएलपी निर्माण और इसी एए दृश्यों की एक सूची पूरक जानकारी और संदर्भों में पाई जा सकती है8,21. सभी बिल्डिंग ब्लॉक जहां फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के माध्यम से दृश्य के लिए छोटे फ्लोरोसेंट रंगों या फ्लोरोसेंट प्रोटीन से लैस हैं। एमईएफएफपी और अन्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन ईएलपी एम्फीफिल्स के हाइड्रोफिलिक डोमेन में एन-मरणासन्न रूप से जुड़े हुए थे। कार्बनिक रंगों को कॉपर-फ्री स्ट्रेन के माध्यम से संयुग्मित किया गया था, जो एल्किन-अजाइड साइक्लोअसिल (स्पाएसी) को सह-अनुवाद द्वारा शुरू किए गए अप्राकृतिक अमीनो एसिड (यूएए) के लिए बढ़ावा दिया गया था। यूएए का सह-अनुवादात्मक समावेशpara-azidophenylalanine (pAzF)22हाइड्रोफिलिक ईएलपी डोमेन के एन-टर्मिनल संशोधन की अनुमति देता है। इस तरह ग्रीन फ्लोरोसेंट डाइस बीडीपी-एफएल-खूंटी4- डीबीसीओ (बीडीपी) या तनावपूर्ण साइक्लोओटिन वाले किसी भी छोटे फ्लोरोसेंट अणु को फ्लोरोसेंट प्रोब के तौर पर इस्तेमाल किया जा सकता है। यूएए pAzF के सफल समावेश और SPAAC के माध्यम से रंगे के साइक्लोअलावा को इसी ट्राइप्टिक पेप्टाइड्स के कुशल आयनीकरण के कारण एलसी-एमएस/एमएस के माध्यम से आसानी से पुष्टि की जा सकती है8. यह छोटा कार्बनिक रंग विधानसभा प्रोटोकॉल के लिए विलायक विकल्प को व्यापक बनाने के लिए लागू किया गया था, क्योंकि फ्लोरोसेंट प्रोटीन अधिकांश कार्बनिक सॉल्वैंट्स के साथ असंगत हैं। हमारी प्रयोगशाला में विकसित अधिआणविक संरचनाओं के लिए दो सबसे कुशल असेंबली प्रोटोकॉल नीचे वर्णित हैं। टीएचएफ सूजन विधि केवल कार्बनिक रंग संशोधित एम्फीफिलिक ईएलपी के साथ संगत है। इसके विपरीत, 1-ब्यूटानोल (BuOH) निष्कासन विधि फ्लोरोसेंट प्रोब जैसे mEGFP के रूप में कई प्रोटीन के साथ संगत है, क्योंकि वर्णित विधि पूरी तरह से इन संलयन प्रोटीन के फ्लोरेसेंस को बरकरार रखता है। इसके अलावा, छोटे अणुओं और वेसिकुलर फ्यूजन व्यवहार का एन्कैप्सुलेशन बुओह एक्सट्रूजन विधि को नियोजित करके सबसे अच्छा काम करता है।

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Protocol

1. एम्फीफिलिक इलास्टिन जैसे प्रोटीन (ईएलपी) का डिजाइन और क्लोनिंग

  1. क्लोन और डिजाइन के रूप में कहीं और वर्णित8,20. प्लाज्मिड अनुरोध पर उपलब्ध हैं।

2. प्रोटीन अभिव्यक्ति, शुद्धिकरण और तैयारी

  1. F20E20-mEGFP और F20E20-mCherry की अभिव्यक्ति
    1. रात ोंरात पूर्व संस्कृति से ०.३ के एक OD६०० के लिए मुख्य अभिव्यक्ति संस्कृति टीका । 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, बाँझ 400 मीटर पौंड माध्यम में 2 00 आरपीएम एक 2 एल फ्लास्क में विनियोजित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक।
    2. अल्ट्राप्योर पानी में अभिव्यक्ति संस्कृति को शामिल करने के लिए आईपीटीजी स्टॉक सॉल्यूशन (1 एम) तैयार करें।
    3. जब ओडी600 0.5-0.8 तक पहुंच जाता है, तो 1 mM की अंतिम एकाग्रता के लिए अभिव्यक्ति संस्कृति में आईपीटीजी जोड़ें और ऊष्मायन तापमान को 20 डिग्री सेल्सियस तक कम करें। 200 आरपीएम पर लगभग 20 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर अभिव्यक्ति की अनुमति दें।
  2. यूएए pAzF युक्त एम्फीफिलिक ईएलपी की अभिव्यक्ति
    1. रातोंरात ई. कोलाई पूर्व संस्कृति से टीका मुख्य अभिव्यक्ति संस्कृति दो प्लाज्मिड्स pEVOL pAzF और जैसे pET28-NMBL-(TAG) R40F20-0.3 के एक OD600 के लिए अपने (अमीनो एसिड दृश्यों के लिए पूरक जानकारी देखें) युक्त संस्कृति। 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, बाँझ 400 मीटर पौंड मीडियम में 200 आरपीएम को 2 एल फ्लास्क में कानामाइसिन और क्लोरम्फेनिकोल के साथ पूरक किया गया।
    2. अल्ट्राप्योर पानी में 100 एमएम पीएएसएफ स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें। pAzF स्टॉक समाधान के 10 mL के लिए, वजन 206.2 मिलीग्राम pAzF और अल्ट्राप्यूरी पानी के 8 mL में इसे फिर से निलंबित। pAzF को भंग करने के लिए 3 एम NaOH के साथ समाधान के पीएच बढ़ाने के लिए और सख्ती से मिश्रण । जब pAzF भंग हो जाता है, ध्यान से पीएच को 10.5 तक कम करें और 10 मीटर की अंतिम मात्रा में अल्ट्राप्यूरी पानी जोड़ें। बाँझ फिल्टर (0.22 माइक्रोन) का उपयोग करें और 2 मिलीग्राम प्रतिक्रिया ट्यूबों में समाधान को बहादें।
    3. अल्ट्राप्योर पानी में 1 एम आईपीटीजी स्टॉक सॉल्यूशन और अल्ट्राप्ली पानी में 20% अरबीनोज स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें।
    4. जब ओडी600 0.5-0.8 तक पहुंच जाता है, तो अभिव्यक्ति संस्कृति में 2 mM की अंतिम एकाग्रता में pAzF जोड़ें। 10 मिन, 37 डिग्री सेल्सियस, 200 आरपीएम के लिए इनक्यूबेट संस्कृति pAzF तेज करने के लिए अनुमति देने के लिए।
    5. आईपीटीजी (1 mM) और अरबीनोज (2%) और ऊष्मायन तापमान को 20 डिग्री सेल्सियस तक कम करें।
    6. 200 आरपीएम पर लगभग 20 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर अभिव्यक्ति की अनुमति दें। 4 डिग्री सेल्सियस, 4000 x ग्राम,40 मिन पर केंद्रीकरण द्वारा फसल अभिव्यक्ति संस्कृति।
  3. सेल लाइसिस और प्रोटीन शुद्धि
    1. लिसिस बफर (10 मिलीलीटर प्रति लीटर संस्कृति; 50 एम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8, 500 एमएम एनसीएल, 4 एम यूरिया, 0.25% ट्राइटन एक्स-100) में ई कोलाई गोली को फिर से निलंबित करें जिसमें लिसोज़िम (0.1 मिलीग्राम/एमएल) और पीएमएसएफ (0.1 एमएम) शामिल हैं। बर्फ और फ्रीज पर 30 मेंस के लिए इनक्यूबेट और तरल नाइट्रोजन में नमूने को जलमग्न करके दो बार बाद में गल जाता है।
    2. सोनीकेट निलंबन (30%, 15 गुना, 30 एस: 10 एस ब्रेक) और सेंट्रलाइज्ड (4 डिग्री सेल्सियस, 40 मिन के लिए 10,000 x ग्राम) के माध्यम से लाइसेट को साफ करें।
    3. एक अंश कलेक्टर से जुड़े एफपीएलसी प्रणाली का उपयोग करके 1 एमएल निकल कॉलम पर एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी (उदाहरण के लिए 1 एमएल निकल कॉलम का उपयोग करके प्रोटीन को शुद्ध करें; सामग्री की तालिकादेखें)। एल्यूटॉन बफर (50 एमएम ट्रिस-एचसीएल, 500 एमएम एनसीएल, 4 एम यूरिया, 250-500 एमएम इमिडाजोल) के साथ प्रोटीन को एल्यूट करें और आगे की प्रोसेसिंग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    4. एसडीएस-पेज के माध्यम से शुद्धिकरण दक्षता का विश्लेषण करें।

3. स्पाक के माध्यम से ईएलपीएस का उप-संशोधन

  1. मोटे तौर पर ईएलपी समाधान की एकाग्रता का अनुमान लगाएं।  एकाग्रता मूल्यांकन के लिए280 अवशोषण मूल्यवान नहीं है क्योंकि pAzF-R40F20 अनुक्रम में यूवी रेंज में अमीनो एसिड अवशोषित होने की कमी है। इसलिए, पहले से लिओफिलेइज्ड और भारित ईएलपी एम्फीफाइल का उपयोग एसडीएस पेज बैंड तुलना के संदर्भ के रूप में किया जा सकता है। ज्ञात सांद्रता के साथ ईएलपी समाधान से SDS पेज बैंड की अभिव्यक्त ग्रे मूल्य क्षमता की तुलना के माध्यम से और आपके नमूने के नमूने की किसी न किसी एकाग्रता का अनुमान लगाया जा सकता है।
  2. एएलपी समाधान (~ 20 माइक्रोन) के 500 माइक्रोन में फ्लोरोसेंट डाइस बीडीपी-एफएल-PEG4-DBCO (10 mM स्टॉक सॉल्यूशन; 20 माइक्रोएम फाइनल कंसंट्रेशन) के 1 माइक्रोन जोड़ें। प्रकाश से मिलाते और सुरक्षित रहते हुए 15 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 10 घंटे के लिए प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें।
  3. आगे के उपयोग के लिए, अत्यधिक बीडीपी को हटाने के लिए प्रतिक्रिया को डायलिज़ करें।
    1. 10 00 00 के लिए अल्ट्राप्योर पानी में डायलिसिस झिल्ली (जैसे 12 केडीए कटऑफ) को अलग करें। क्लिक किए गए ईएलपी समाधान वाले रिएक्शन ट्यूब के उद्घाटन के शीर्ष पर डायलिसिस झिल्ली को सही आकार में काट लें। खोलने में डायलिसिस झिल्ली को ठीक करने के लिए, खोलने पर मुक्का मारने वाले कोर के साथ एक प्रतिक्रिया ट्यूब ढक्कन रखें, इस प्रकार ट्यूब को बंद करें।
    2. चुनी हुई बफर में रिएक्शन ट्यूब को उल्टा रखें। हर बार कम से कम 3 घंटे के लिए डायलिसिस के बाद दो बार बफर (2-5 एल) का आदान-प्रदान करें। सफल डायलिसिस सुनिश्चित करने के लिए डायलिसिस झिल्ली और बफर के बीच फंसे किसी भी हवा के बुलबुले को हटा दें।

4. टीएचएफ सूजन प्रोटोकॉल

  1. अपने टैग शुद्धि से लवण और शेष यौगिकों को हटाने के लिए स्थिर पीएच 7.5 के साथ फॉस्फेट या ट्रिस बफर (10 एमएम) के खिलाफ डायलिज़ समरूप ईएलपी समाधान।
  2. लाइओफिलाइजर तैयार करें और फ्रीज-सुखाने के लिए तापमान शुरू करने के लिए ठंडा करें।
  3. अलीकोट 1.5 मिलीग्राम प्रतिक्रिया ट्यूब (50-500 माइक्रोन प्रति ट्यूब) में डायलिसि प्रोटीन समाधान और तरल नाइट्रोजन में शॉक फ्रीज। फ्रीज सुखाने के दौरान विभिन्न प्रोटीन समाधानों के अवांछित मिश्रण से बचने के लिए, एक छोटे छेद के साथ टोपियां प्रतिक्रिया ट्यूब के शीर्ष पर डाल दिया जा सकता है इसे आंशिक रूप से सील करने के लिए।
  4. फ्रोजन प्रोटीन के नमूनों को लिक्विड नाइट्रोजन से बाहर निकालें और फ्रीज सुखाने की शुरुआत करने के लिए तुरंत उन्हें लाइओफिलाइजर में रखें। फ्रीज सुखाने समाप्त हो गया है जब नमूना पूरी तरह से सूखी है (लगभग 24-48 घंटे) । बाद में, शुष्क एन2के साथ हवादार लिओफिलाइज्ड एम्फीफिलिक ईएलपीएस, फिर हवा की नमी के संपर्क से बचने के लिए तुरंत प्रतिक्रिया ट्यूब ढक्कन बंद करें।
  5. लिओफिलेइज्ड नमूनों (ईएलपी, 5-10 माइक्रोन) में शुद्ध टीएचएफ जोड़ें और हल को 15 मिन के लिए बर्फ के पानी वाले पानी वाले पानी के स्नान सोनिकेटर में रखें ताकि टीएचएफ में ईएलपी की सूजन की अनुमति दी जा सके।
  6. वेसिकल गठन के लिए 30-60 डिग्री सेल्सियस तक या फाइबर गठन के लिए 90 डिग्री सेल्सियस तक थर्मोसाइकिलर को पहले से गरम करें और अल्ट्राप्योर पानी या बफर (50 एमएम एनएएच2पीओ4/एनए2एचपीओ4,50 एमएम नैल, पीएच 5-13) वाले नए रिएक्शन ट्यूब तैयार करें। गोलाकार सहकारवाट मुख्य रूप से पीएच 9-13 के भीतर 20 डिग्री सेल्सियस पर इकट्ठा होते हैं। वेसिकल गठन पीएच 7 और 9 के बीच 50-60 डिग्री सेल्सियस पर इष्ट है। फाइबर गठन पीएच 5 और 12 के बीच 60 डिग्री सेल्सियस से ऊपर पूर्वोम रूप से प्रेरित होता है।
  7. सोनिकेशन स्टेप के बाद ईएलपी/टीएचएफ सॉल्यूशन के साथ-साथ थर्मोसाइकिलर में तैयार अल्ट्राप्योर वॉटर या बफर सॉल्यूशन रखें और 5 मिन के लिए इच्छित तापमान तक गर्म करें । जब तापमान पहले से गरम ELP/THF समाधान तक पहुंच जाता है ध्यान से पूर्व गरम अल्ट्राप्योर पानी या बफर समाधान के शीर्ष पर स्तरीकृत किया जाना चाहिए । एक अलग इंटरफेस के साथ दो चरणों का स्पष्ट अलगाव दिखाई देना चाहिए।
  8. मिश्रण को थर्मोसाइकिलर में फिर से रखें और इंटरफ़ेस पर वेसिकल या फाइबर गठन की अनुमति देने के लिए 20 सीन के लिए इनक्यूबेट करें। बाद में, नमूनों को फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी या डायलिसिस के माध्यम से विश्लेषण से पहले 10 मीटर के लिए कमरे के तापमान को ठंडा करने दें।
  9. अल्ट्राप्यूरी पानी या बफर (50 एमएम एनएएच2पीओ 4/एनए42एचपीओ4,50 एमएम एम एनसीएल, पीएच 7-10) के खिलाफ अधिआणविक संरचनाओं से युक्त डायलिसि समाधान।

5. BuOH निष्कासन प्रोटोकॉल

  1. अल्ट्राप्योर पानी या बफर (50 एमएम पीबी पीएच 7.5, 100 एम एम एनएसीएल, 4 एम यूरिया तक हो सकता है) में 1-50 माइक्रोएम ईएलपी समाधान तैयार करें। एम्फीफिलिक ईएलपी F20R20-mEGFP और F20R20-mCherry समाधान की एकाग्रता मोलर विलुप्त होने गुणांक (F20R20-mEGFP ए280 = 22015एम-1 सेमी-1 और F20R20-mCherry A280 = 34380M-1 सेमी -1)का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है (एक अनुक्रम के लिए पूरक जानकारी देखें)।
  2. 10%-20% (v/v) 1-ब्यूटानोल जोड़ें और तुरंत ऊपर और नीचे पाइपिंग या इसे कई बार सिरिंज के माध्यम से ड्राइंग द्वारा समाधान मिलाएं । 0.25 x 25 मिमी सुई से लैस एक आम 100 माइक्रोन पिपेट या हैमिल्टन सिरिंज लागू किया जा सकता है। मिश्रण के दौरान समाधान की टर्बिडिटी में वृद्धि होनी चाहिए, जो वेसिकल गठन का संकेत है। 1- ऑक्टेनॉल 5%- 15% (v/v) का इस्तेमाल वेसिकल एक्सट्रूशन के लिए भी 1-ब्यूटेनॉल के बजाय किया जा सकता है।
  3. एक संकीर्ण आकार वितरण प्राप्त करने के लिए, कमरे के तापमान पर 1 माइक्रोन के ताकना आकार के साथ झिल्ली के माध्यम से एक मिनी एक्सट्रूडर का उपयोग करके वेसिकल्स को बाहर निकालना। एक्सट्रूजन के लिए उपयोग किया जाने वाली झिल्ली का आकार वेसिकल्स के ऊपरी आकार की कटऑफ को निर्धारित करता है।
  4. अवशिष्ट 1-ब्यूटानोल को हटाने के लिए ऊपर वर्णित वेसिकल्स (चरण 3.3) के रूप में डायलिज़ करें।

6. BuOH निष्कासन प्रोटोकॉल के साथ Dye encapsulation

  1. 10 एम Tris-HCl में लगभग 40 μL ELP समाधान मिलाएं, पीएच 8 के साथ 1 μL Dextran टेक्सास लाल (0.0025 मिलीग्राम/
  2. समाधान के लिए BuOH के 10 μL जोड़ें और 0.25 x 25 मिमी सुई से लैस सिरिंज के माध्यम से 5-10 बार निकालें।

7. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके सुप्रामॉलिक्यूलर संरचनाओं का विश्लेषण

  1. कांच की स्लाइड पर एक सुदृढीकरण की अंगूठी रखें और ग्लास में चिपकने वाली तरफ मजबूती से दबाएं।
  2. सुदृढीकरण अंगूठी के अंदर के लिए नमूना के 5 μL जोड़ें और शीर्ष पर एक कवर पर्ची जगह है ।
  3. विश्लेषण के दौरान नमूने के वाष्पीकरण से बचने के लिए कवर स्लिप के किनारों पर नेल पॉलिश के साथ नमूने को सील करें।
  4. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी को बाहर करें जैसा कि पहले8वर्णित था ।

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Representative Results

वेसिकल उत्पादन के लिए प्रोटोकॉल विकास
चित्रा 1 दो अलग-अलग वेसिकल तैयारी विधियों को रेखांकित करता है। बाईं ओर THF सूजन विधि लगातार तीन चरणों से बना है और तापमान के आधार पर ELP के विभिन्न सुप्रामॉलिक्यूलर विधानसभाओं में परिणाम है। चित्रा 1A एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी छवियों में बीडीपी-आर 20एफ20 से इकट्ठे हुए वेसिकल्स और बीडीपी-आर 40एफ20 से इकट्ठे होने वाली फिब्रिलेरी संरचनाएं दिखाई देरही हैं। दाईं ओर सचित्र बुओएच विधि विशेष रूप से ईएलपी वेसिकल्स के गठन की ओर ले जाती है, जो टीएचएफ सूजन विधि की तुलना में परिमाण अधिक वेसिकल्स के दो आदेशों के बारे में पैदा होती है। योजनाबद्ध चित्रण BuOH vesicles की तैयारी की प्रक्रिया से पता चलता है। चित्रा 1B BDP-R40F20 में vesicle तैयारी के लिए 10-15% (v/v) BuOH और vesicles मिश्रण के निष्कासन के माध्यम से तैयार किया गया था ।

विभिन्न संरचनाओं में अधिआणविक स्व-असेंबली का मार्गदर्शन करना
चित्रा 2 THF सूजन प्रोटोकॉल के माध्यम से BDP-R40F20 से इकट्ठे विभिन्न अधिआणविक संरचनाओं की एक योजनाबद्ध चित्रण और एपिफ्लोरेसेंस छवियों को दिखाता है। इस मामले में लियोफिलेइज्ड बीडीपी-आर40एफ20 का उपयोग विभिन्न असेंबली प्रोटोकॉल के लिए किया गया था। बफर के पीएच और विधानसभा प्रक्रिया के तापमान को या तो coacervates, fibrils या vesicles बनाने के लिए समायोजित किया गया । चित्रा 2ए में चित्रित कोसरवेट व्यास में 1-2 माइक्रोन हैं और बीडीपी-आर 40एफ20 से 20 डिग्री सेल्सियस और पीएच 13 पर इकट्ठे हुए थे। विधानसभा के तापमान को 90 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचाने के परिणामस्वरूप बीडीपी-आर 40एफ20 के साथ परीक्षण किए गए पीएच 4-13 में नैनोफाइबर बंडल(चित्रा 2बी)का गठन होता है। स्थिर वेसिकल्स को ईएलपी से 50 डिग्री सेल्सियस और पीएच 7(चित्रा 2सी)के तापमान पर इकट्ठा किया जा सकता है। विधानसभा प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदमों में से एक पर छोटी गलतियों के कारण चित्रा 2डीमें चित्रित समुच्ग्रत का गठन हो सकता है ।

विभिन्न कार्गो का एन्कैप्सुलेशन
चित्रा 3 BuOH एक्सट्रूजन विधि के माध्यम से F20R20-mEGFP से इकट्ठे हुए वेसिकल ल्यूमेन में विभिन्न कार्गो के एन्कैप्सुलेशन को दिखाता है। चित्रा 3एमें सकारात्मक रूप से आवेशित रंगे आटो Rho13 के एन्कैप्सुलेशन के लिए, रंग (15% v/v) BuOH और मिश्रण की सिरिंज एक्सट्रूजन के अलावा से पहले जलीय एएलपी समाधान के साथ मिलाया गया था । कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवियां ग्रीन चैनल में F20R20-mEGFP से गठित वेसिकल्स दिखाती हैं, लाल चैनल में लाल रंग AttoRho13 और जिसके परिणामस्वरूप विलय चैनल वेसिकल ल्यूमेन के अंदर सफल एनकैप्सुलेशन दिखाता है।

पॉलीसैकराइड ड्रैसेन रेड 3000 को ऊपर वर्णित बुओएच एक्सट्रूजन विधि का उपयोग करके सफलतापूर्वक समझाया गया था। ग्रीन चैनल में दर्ज की गई छवियां F20R20-mEGFP से गठित वेसिकल्स को दर्शाती हैं जबकि लाल चैनल पॉलीसैकराइड कार्गो को दिखाता है। चित्रा 3बी में विलय हरी और लाल छवि वेसिकल ल्यूमेन में सफल Dextran लाल 3000 encapsulation की पुष्टि करें।

झिल्ली घटक अनुकूलता और मिश्रित BuOH vesicles के चरण जुदाई से पहले/
चित्रा 4 एकल पीएमबीसी बिल्डिंग ब्लॉकबनाम इकट्ठे पीएमबीसी आबादी के मिश्रण पर ईएलपी एम्फीफाइल्स के चरण अलगाव और संलयन व्यवहार को दर्शाता है। पीएमबीसी असेंबली से पहले एम्फीफिलिक ईएलपी बिल्डिंग ब्लॉक (F20R20-mEGFP और F20R20-mCherry) मिश्रण से इकट्ठे पीएमबीसी झिल्ली के भीतर समरूप रूप से वितरित अणु हो जाते हैं। फ्लोरोफोरस और संबद्ध ईएलपी एम्फीफिल्स का समरूप वितरण संबंधित फ्लोरेसेंस छवियों के लाल और हरे रंग के चैनल के विलय पर स्पष्ट है। F20R20-mEGFP या F20R20-mCherry से इकट्ठे हुए वेसिकल आबादी को मिलाकर मिश्रण के तुरंत बाद लाल या हरे रंग के फ्लोरेसेंस के झिल्ली पैच दिखाई देते हैं। यह इंगित करता है कि अलग-अलग लेबल वाले पीएमबीसी की पीएमबीसी फ्यूजन घटनाएं होती हैं और ये फ्यूजिंग झिल्ली और उनके घटक कम से कम 20 मिन के लिए अलग चरण रहते हैं। इसी तरह के चरण व्यवहार लिपिड राफ्ट से जाना जाता है, लिपिड झिल्ली23के भीतर ।

Figure 1
चित्रा 1: टीएचएफ सूजन विधि का चित्रण और वेसिकल्स या फाइबर जैसी सुप्रामॉलिक संरचनाओं में एम्फीफिलिक ईएलपी के निर्देशित आत्म-असेंबली के लिए बुओएच एक्सट्रूजन विधि। योजनाबद्ध कार्यप्रवाह और प्रतिनिधि ए(ए)बीडीपी-आर 20एफ20 और बीडीपी-आर 40एफ20 के साथ टीएचएफ सूजन विधि के परिणामस्वरूप तापमान और पीएच के आधार पर विभिन्न अधिआणविक संरचनाएं होती हैं और(बी)बुओएच एक्सट्रशन विधि विशेष रूप से बीडीपी-आर40एफ20 (स्केल बार 2 माइक्रोन) से वेसिकल्स उत्पन्न करती है। इस आंकड़े को श्राइबर एट अल 20198से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: टीएचएफ सूजन विधि बीडीपी-R40F20 को विभिन्न अधिआणविक संरचनाओं में स्वयं-असेंबल करके लागू करके। विधानसभा प्रोटोकॉल (जैसे तापमान या पीएच) के दौरान लागू पर्यावरणीय स्थितियां गठित मुख्य सुप्राआणविक संरचना का निर्धारण करती हैं। विधानसभा के दौरान संबंधित शर्तों पर प्रतिनिधि अधिआणविक संरचनाओं की निगरानी एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी और (ए) coacervates और (B) फाइब्रिल्स से (सी) स्थिर वेसिकल्स तक की सीमा के माध्यम से की गई थी। (D) टीएचएफ सूजन प्रोटोकॉल के दौरान परिभाषित संरचनाओं की असेंबली में विफलता से अविशिष्ट समुचेश (स्केल बार 2 माइक्रोन) का गठन होता है। इस आंकड़े को8से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: BuOH एक्सट्रूजन विधि का उपयोग करईटीपी वेसिकल्स के भीतर विभिन्न कार्गो को समझाया जा सकता है। (A)F20R20-mEGFP vesicles के प्रतिनिधि confocal छवियों को दर्शाता है, जो सकारात्मक रूप से आवेशित साये AttoRho13 और(B)पॉलीसैकराइड डीएक्सटन रेड (स्केल बार 5 माइक्रोन) के एन्कैप्सुलेशन के साथ समझाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: झिल्ली घटक अनुकूलता और वेसिकल झिल्ली के संलयन व्यवहार BuOH विसर्जन विधि के माध्यम से F20R20 से इकट्ठे हुए । (A)सिरिंज-एक्सट्रूजन से पहले फ्लोरोसेंट F20R20-mEGFP और F20R20-mCherry प्रोटीन समाधान का मिश्रण पीएमबीसी झिल्ली की ओर जाता है जिसमें ग्रीन चैनल (बाएं छवि), लाल चैनल (मध्य छवि), और विलय चैनल (दाएं छवि) में दिखाई देने वाले समरूप रूप से वितरित एम्फीफिलिक प्रोटीन दिखाई देते हैं। (ख)पीएमबीसी या तो F20R20-mEGFP या F20R20-mCherry से इकट्ठे हुए और बाद में सिरिंज एक्सट्रूजन के माध्यम से मिश्रित पीएमबीसी झिल्ली के भीतर अलग ELP अखाड़ा पैच करने के लिए सीसा । झिल्ली के भीतर अलग ईएलपी एम्फीफाइल्स ग्रीन चैनल (बाएं छवि), लाल चैनल (मध्य छवि), और विलय चैनल (दाएं छवि) में कम से कम 20 मिनट के लिए पीएमबीसी संलयन के बाद दिखाई देरहे हैं। स्केल बार 5 माइक्रोन के अनुरूप हैं। इस आंकड़े को श्राइबर एट अल 20198से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

परिभाषित अधिआणविक संरचनाओं की असेंबली के लिए वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करते समय एक गलती मुख्य रूप से या तो अविशिष्ट समुचेग़ा(चित्रा 2,चतुर्थ) के गठन या सजातीय रूप से वितरित ईएलपी-एम्फीफिल्स की ओर जाती है। प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरणों पर नीचे चर्चा की जाती है:

एम्फीफिलिक ईएलपी की उच्च अभिव्यक्ति उपज के लिए, 20 डिग्री सेल्सियस का अपेक्षाकृत कम तापमान इष्टतम है। एम्फीफिलिक ईएलपी की सफल आत्मीयता आधारित शुद्धि के लिए लाइसिस बफर में 4 एम की यूरिया एकाग्रता को एम्फीफिलिक ईएलपी को सबसे अच्छा घुलनशील एलुटिऑन अंश में बढ़ाने और प्रोटीन उपज में वृद्धि करने के लिए साबित हुआ था। यदि लिसिस बफर में कम यूरिया सांद्रता वांछित है, तो व्यक्तिगत निर्माण ों के लिए आत्मीयता शुद्धि की जांच की जानी चाहिए। 2 एम यूरिया के रूप में अच्छी तरह से कुछ निर्माण के लिए काम किया, विशेष रूप से उन लोगों के लिए जहां उसके टैग हाइड्रोफिलिक डोमेन के लिए जुड़े और इसलिए अभी भी राल बांधने में सक्षम था ।  आकार बहिष्कार क्रोमेटोग्राफी के माध्यम से अपने टैग शुद्धि के बाद एक अतिरिक्त शुद्धि कदम वेसिकल उपज के रूप में अच्छी तरह से बढ़ा सकते हैं ।

टीएचएफ-सूजन प्रोटोकॉल लागू करने के मामले में, एम्फीफिलिक ईएलपी को विज़ुअलाइज़ेशन के लिए फ्लोरोसेंट ऑर्गेनिक डाये के साथ लेबल करने की आवश्यकता होती है। महत्वपूर्ण बात यह है कि एम्फीफिलिक ईएलपी के बीडीपी लेबलिंग के लिए (एएए pAzF युक्त अमीनो एसिड दृश्यों के लिए पूरक जानकारी देखें) स्पाक के माध्यम से टीसीईपी, डीटीटी जैसे किसी भी अपचय की अनुपस्थिति है और न ही सभी शुद्धिकरण बफ़र्स में मर्काप्टोथेनॉल को। स्पाक रिएक्शन24से पहले पज़फ की अमीन कमी के लिए अच्छी तरह से रिपोर्ट किए गए अजाइड से बचने के लिए यह आवश्यक है ।

एम्फीफिलिक ईएलपी (जैसे pAzF-R40F20) के लिए डाइकी की सटीक प्रतिक्रिया महत्वपूर्ण नहीं है क्योंकि एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के माध्यम से सरल वेसिकल विज़ुअलाइज़ेशन के लिए हर एक ईएलपी अणु को लेबल करना आवश्यक नहीं है। इसलिए, एक संदर्भ एसडीएस जेल बैंड का सहसंबंध और इसी भारित लाइओफिलाइज्ड नमूना प्रत्येक प्रोटीन निर्माण के लिए केवल एक बार आवश्यक है। हालांकि, यदि 100% लेबलिंग उपज के करीब ईएलपी अणुओं के लिए 1:1 समकक्ष रंग का अनुपात वांछित है पर्याप्त है। बहुत ही इसी तरह के उभयचर ELPs हमारी प्रयोगशाला में विश्लेषण करने के लिए पूरी तरह से BDP के एक समतुल्य जोड़ पर लेबल किया गया (डेटा अभी तक प्रकाशित नहीं) ।

टीएचएफ सूजन विधि का उपयोग करके वेसिकल तैयारी के लिए, सबसे महत्वपूर्ण कदम लियोफिलेइज्ड एम्फीफिलिक ईएलपी की सूजन और जलीय बफर चरण के शीर्ष पर इस समाधान के बाद के स्तरीकरण हैं। इसलिए, हौसले से लिओफिलाइज्ड एम्फीफिलिक ईएलपी जितना संभव हो उतना निर्जल होना चाहिए, जिसे ड्राई नाइट्रोजन गैस के साथ लाइओफिलाइजर के वेंटिलेशन और रिएक्शन ट्यूब ढक्कन के तत्काल बंद होने से हासिल किया जा सकता है। यदि उपलब्ध है, पट सील सूखी THF vesicle उपज बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, लेकिन THF पीए (>99.5%) पट के बिना के रूप में अच्छी तरह से काम करता है। शुष्क टीएचएफ में एम्फीफिलिक ईएलपी सूजन पर स्तरीकरण कदम को बहुत सावधानी से निष्पादित किया जाना चाहिए। दो तापमान नियंत्रित समाधानों के सफल स्तरीकरण से कार्बनिक और जलीय चरण के बीच स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाली चरण सीमा होती है । प्रारंभिक स्तरीकरण कदम धीरे-धीरे आयोजित किया जाना चाहिए, भले ही ऊंचा तापमान इन चरणों के थर्मल प्रेरित मिश्रण के लिए सीसा। समाधान की आकस्मिक टर्बिडिटी गठित वेसिकल्स, फाइबर या कोसरवेट के प्रकाश बिखरने के कारण होती है। प्रोटीन की कमी वाले नियंत्रण नमूनों में, टीएचएफ वॉटर-इंटरफेस25के लिए छोटे आकार की संरचनाएं (200 एनएम तक) की रिपोर्ट के बावजूद कोई टर्बिडिटी दिखाई नहीं देती है। THF स्तरीकरण कदम सूजन प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण और विफलता प्रवण कदम है। ऊष्मायन कदम के बाद सुप्रामॉलिक्यूलर संरचनाओं को बफर या अल्ट्राप्यूरी पानी के खिलाफ डायलेज़ किया जा सकता है। अधिमानतः उसी जलीय समाधान का उपयोग किया जाना चाहिए जिसे ओस्मोलारिटी बनाए रखने और इकट्ठे वेसिकल्स की सूजन या सिकुड़ने से रोकने के लिए प्रारंभिक असेंबली के लिए लागू किया गया था। डायलिसिस के बाद, वेसिकल्स, फाइबर और कोसरवेट आमतौर पर कम से कम एक सप्ताह के लिए स्थिर होते हैं। विधानसभा के दौरान पर्यावरणीय मापदंडों के आधार पर अक्सर मुख्य संरचना के अलावा अन्य सुप्राआणविक संरचनाओं का एक छोटा सा अनुपात मौजूद होता है यदि टीएचएफ सूजन विधि8लागू की जाती है। वर्णित टीएचएफ विधि वेसिकल असेंबली यील्ड को परिमाण के एक क्रम तक बढ़ाती है जबकि बुओएच एक्सट्रूजन हमारे पहले प्रकाशित इन विट्रो विधि5की तुलना में परिमाण के तीन आदेशों की उपज में सुधार करता है ।

BuOH एक्सट्रूजन विधि उच्च प्रजनन क्षमता के साथ विशेष रूप से स्थिर वैसिकुलर संरचनाओं को प्राप्त करने के लिए लागू किया जाता है, फाइबर और गोलाकार सहएरवेट को दरकिनार करता है। यह विधि फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ कम त्रुटि प्रवण और संगत है। इसलिए F20R20-mEGFP या F20R20-mCherry के साथ ही BDP-R40F20 या BDP-E20F20 लागू किया जा सकता है । एकमात्र महत्वपूर्ण कदम 10%-20% v/v BuOH के अलावा जलीय प्रोटीन समाधान के तेजी से मिश्रण है । F20R20-mEGFP या F20R20-mCherry एकाग्रता 1-15 μM के आसपास होना चाहिए । BuOH एक्सट्रूजन विधि vesicles लागू करने से अल्ट्राप्योर पानी या बफर में 5 एम NaCl या 4 M यूरिया और पीएच 5 से 8 तक शामिल इकट्ठा किया जा सकता है । 20% v/v BuOH में निकाले गए पीएमबीसी को उनके वेसिकुलर संरचना को संरक्षित करते हुए कम से कम 6 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस तक संग्रहीत किया जा सकता है। वेसिकल आकार वितरण को संकीर्ण करने के लिए, उन्हें 0.2-1 माइक्रोन पोर आकार की झिल्ली के माध्यम से एक मिनी एक्सट्रूडर का उपयोग करके निकाला जा सकता है। यह पोर एक्सट्रूजन सीधे बीओएच के बाद एम्फीफिलिक ईएलपी के अलावा या वेसिकल असेंबली के बाद किया जा सकता है। यदि पीएमबीसी इमेजिंग के लिए भी केंद्रित हैं, तो बुओएच में इकट्ठे वेसिकल्स को 10%-20% v/v BuOH युक्त जलीय बफर का उपयोग करके तेजी से मिश्रण के माध्यम से पतला किया जा सकता है ।

BuOH निष्कासन विधि की प्रमुख सीमा यह है कि जलीय बफ़र्स के खिलाफ पीएमबीसी डायलिसिस अक्सर खराब वेसिकल उपज में परिणाम देता है। इसके अलावा, झिल्ली अंतरिक्ष के भीतर अवशिष्ट बुओएच की उपस्थिति को बाहर नहीं रखा जा सकता क्योंकि साधारण फैटी एसिड पीएमबीसी झिल्ली21में शामिल करने में सक्षम थे। इसलिए, पीएमबीसी झिल्ली कुछ हद तक प्रोटीन और क्षारीय मोईके से बनी हो सकती है।

रासायनिक रूप से विविध कार्गो अणुओं का एनकैप्सुलेशन बुओएच एक्सट्रूजन विधि का उपयोग करके सबसे अच्छा काम करता है। इसके अलावा, पर कब्जा करने के लिए रंगे के स्टॉक समाधान के लिए सॉल्व के रूप में डीएमएसओ, रंगे एनकैप्सुलेशन दक्षता को बढ़ाता है। नाजुक कार्गो को समझाया जा करने के लिए, पीएमबीसी असेंबली के लिए 5%-10% v/v 1-ऑक्टेनॉल का उपयोग किया जा सकता है और बुओएच की तुलना में बेहतर संगत साबित हो रहा है, जिसमें डीएनए-लिगासे या टीईवी प्रोटीज21,,26जैसे कार्यात्मक समझाया एंजाइम हैं। हालांकि, एन-ब्यूटानोल की छोटी श्रृंखला लंबाई के कारण इसे 1-ऑक्टेनॉल के विपरीत जलीय बफर के खिलाफ डायलिसिस किया जा सकता है, जो लागू डायलिसिस-झिल्ली को पार करने में सक्षम नहीं है। एक और विधि सीमा यह है कि वांछित सुप्रासंरचना गठन को नियंत्रित करने के लिए आवश्यक लागू तापमान और पीएच मूल्य एंजाइम गतिविधि को प्रभावित कर सकते हैं। भविष्य के काम में, आत्मीयता शुद्धि या आकार बहिष्कार शुद्धि को बिगड़ते वेसिकल झिल्ली अखंडता के बिना गैर-समझाया बनाम समझाया जाने वाले अणुओं को अलग करने के लिए स्थापित किया जाना चाहिए।

फिल्म रिहाइड्रेशन विधियों16के विपरीत,17 इसाइन वर्णित प्रोटोकॉल वेसिकल्स आकार की असेंबली को 600 एनएम से अधिक सक्षम करते हैं। यह सरल एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी और झिल्ली चरण पृथक्करण8के अवलोकन के माध्यम से वास्तविक समय संलयन घटनाओं की निगरानी की अनुमति देता है। तापमान की तुलना में एम्फीफिलिक ईएलपी9 के वेसिकुलर असेंबली शुरू हुए यहां वर्णित प्रोटोकॉल 6 महीने तक की लंबे समय तक स्थिरता के साथ पीएमबीसी की उपज करते हैं। हालांकि, मुख्य नुकसान संरचना गठन के लिए कार्बनिक विलायक की आवश्यकता है। हालांकि BuOH पूरी तरह से अखंडता और फ्लोरोसेंट प्रोटीन27 (डेटा नहीं दिखाया गया है) के कार्य को बरकरार रखता है, समझाया एंजाइमों की गतिविधि अवशिष्ट कार्बनिक विलायक द्वारा प्रतिबंधित किया जा सकता है और व्यक्तिगत रूप से परीक्षण किया जाना चाहिए । हालांकि, डीएनए-लिगास, टीईवी-प्रोटीज़ और लिपेस से जुड़ी उत्प्रेरक प्रतिक्रियाओं को वेसिकल्स के चमकदार स्थान के भीतर सफलतापूर्वक आयोजित किया गया है, जो 1-ऑक्टेनॉल या बुओएच एक्सट्रूजन26,,21द्वारा इकट्ठे किए गए हैं। इसके अतिरिक्त, भले ही विधानसभा के बाद THF डायलिसिस बहुत असमस्याग्रस्त है और वेसिकल अखंडता संरक्षित है, BuOH हटाने अक्सर अज्ञात कारणों के कारण वेसिकल अखंडता के नुकसान में परिणाम है ।

वर्णित प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को अलग भौतिक रासायनिक गुणों, अच्छे एनकैप्सुलेशन गुणों और लंबे समय की स्थिरता के साथ माइक्रोमीटर और उप माइक्रोमीटर आकार की सुप्रामॉलिकसंरचनाओं को इकट्ठा करने में सक्षम बनाता है। इन सुप्रामॉलिक संरचनाओं को न्यूनतम कोशिकाओं26 या कृत्रिम सेल अनुसंधान21,एंजाइम एनकैप्सुलेशन, या दवा निर्माण के डिजाइन के लिए लागू किया जा सकता है। प्रस्तुत कार्यात्मक पीएमबीसी दवा वितरण के लिए आगे आशाजनक उम्मीदवार हैं, क्योंकि उनके भवन ब्लॉक इम्यूनोजेनिक28नहीं हैं, गतिशील संलयन व्यवहार प्रदर्शित करते हैं, और विविध कार्गो एनकैप्सुलेशन के लिए अनुमति देते हैं।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा करते हैं ।

Acknowledgments

लेखक वित्तीय सहायता के लिए BMBF और अनुसंधान सुविधा प्रदान करने के लिए जैविक प्रणाली विश्लेषण (ZBSA) के लिए केंद्र का शुक्रिया अदा करते हैं । हम प्लाज्मिड pEVOL-pAzF प्रदान करने के लिए पी जी शुल्ट्ज, टीएसआरआई, ला जोला, कैलिफोर्निया, संयुक्त राज्य अमेरिका के आभारी हैं। हम अल्बर्ट-लुडविग-यूनिवर्सिटी फ्रीबर्ग के सेंटर फॉर बायोलॉजिकल सिस्टम्स एनालिसिस (जेडबीएसए) में लाइफ इमेजिंग सेंटर (एलआईसी) के कर्मचारियों को उनके कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी संसाधनों के साथ मदद के लिए धन्यवाद देते हैं, और छवि रिकॉर्डिंग में उत्कृष्ट समर्थन करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 µm and 0.2 µm Steril Filter VWR
1,4-Dithiothreitol Merck
1-butanol. >99.5% p.a. Roth
2log DNA ladder NEB
2-Mercaptoethanol Roth
50 mL Falcon tubes VWR
79249 Alkyne Mega Stokes dye Sigma Aldrich
Acetic acid glacial VWR
Acetonitrile, anhydrous, 99.8% Sigma-Aldrich
Ampicillin sodium-salt, 99% Roth
BDP-FL-PEG4-DBCO Jena Bioscience
Biofuge Heraeus
Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm) Thermo Scientific
Brillant Blue G250 (Coomassie) Roth
BspQI NEB
Camera DS Qi1 Nikon
Centrifuge 5417r Eppendorf
Centrifuge 5810r Eppendorf
CF-400-Cu square mesh copper grid EMS
Chloramphenicol Roth
CompactStar CS 4 VWR
Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral Life Technologies
Digital sonifier Branson
Dimethylsulfoxide (DMSO) Applichem
Dnase I Applichem
EarI NEB
EcoRI-HF NEB
Environmental shaker incubator ES-20 Biosan
Ethanol absolute Roth
Ethidium bromide solution Roth
Filter supports Avanti
Glass plates Bio-Rad
Glycerol Proteomics Grade Amresco
Glycin Applichem
H4-Azido-Phe-OH Bachhem
Heat plate MR HeiTec Heidolph
HindIII NEB
HisTrap FF crude column GE Life Sciences Nickel column
Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a. Merck
Illuminator ix 20 INTAS
Illuminator LAS-4000 Fujifilm
Imidazole Merck
Immersions oil for microscopy Merck
Incubators shakers Unimax 1010 Heidolph
Inkubator 1000 Heidolph
IPTG, >99% Roth
Kanamycinsulfate Roth
L(+)-Arabinose Roth
Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE Sartorius
LB-Medium Roth
Lyophilizer Alpha 2-4 LSC Christ
Lysozyme, 20000 U/mg Roth
Microscope CM 100 Philips
Microscope Eclipse TS 100 Nikon
Microscopy cover glasses (15 x 15 mm) VWR
Microscopy slides VWR
Microwave Studio
Mini-Extruder Set Avanti Polar Lipids
NaCl, >99.5%, p.a. Roth
Natriumhydroxid pellets Roth
Ni-NTA Agarose, PerfectPro 5 Prime
Nucleopore Track-Etch Membrane Avanti
PH meter 766 calimatic Knick
Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF) Roth
Polypropylene Columns (1 mL) Qiagen
PowerPac basic BioRad
Propanol-2-ol Emplura
Protein ladder 10-250 kDa NEB
Recirculating cooler F12 Julabo
Reinforcement rings Herma
SacI HF NEB
SDS Pellets Roth
Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4 VWR
Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate VWR
T4 DNA Ligase NEB
TEMED Roth
TexasRed Dextran-Conjugate MolecularProbes
Thermomix comfort Eppendorf
THF, >99.5% p.a. Acros
Triton X 100 Roth
Trypton/Pepton from Casein Roth
Ultrasonic cleaner VWR
Urea p.a. Roth
Vacuum pump 2.5 Vacuubrand
XbaI NEB
XhoI NEB
ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V) Roth

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रसायन विज्ञान अंक १५८ इलास्टिन की तरह प्रोटीन प्रोटीन आधारित वेसिकल्स प्रोटीन फाइबर दवा वितरण प्रणाली आत्म विधानसभा प्रोटीन झिल्ली
परिभाषित सुप्रामॉलिक्यूलर संरचनाओं और विट्रो में कार्गो एनकैप्सुलेशन में एलेस्टिन की तरह प्रोटीन की विधानसभा का निर्देश दिया
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Schreiber, A., Stühn, L. G.,… More

Schreiber, A., Stühn, L. G., Geissinger, S. E., Huber, M. C., Schiller, S. M. Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro. J. Vis. Exp. (158), e60935, doi:10.3791/60935 (2020).

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