Summary
유기 및 수성 용매의 계면에서 맞춤형 양피 성 엘라스틴과 같은 단백질은 환경 매개 변수에 의해 유발되는 소포, 섬유 및 응고체와 같은 복잡한 상분자 구조로 조립됩니다. 설명된 조립 프로토콜은 튜닝 가능한 특성을 가진 단백질 멤브레인 기반 구획(PMBC)을 생성하여 다양한 화물을 캡슐화할 수 있도록 합니다.
Abstract
맞춤형 단백질성 빌딩 블록은 최소 세포, 약물 전달 차량 및 효소 스캐폴드와 같은 포부 분자 구조의 조립을 위한 다목적 후보입니다. 유전적 수준에서의 생체 적합성 및 튜닝성으로 인해 엘라스틴과 같은 단백질(ELP)은 생명 공학 및 생물 의학 응용 분야에 이상적인 구성 요소입니다. 그럼에도 불구하고, 뚜렷한 물리화학적 특성과 양호한 캡슐화 잠재력을 가진 단백질 기반의 상분자 구조의 조립은 여전히 도전적이다.
여기에서 우리는 구형 응고체, 섬유 및 안정한 소포와 같은 초분자 단백질 아키텍처로 양과성 ELP의 유도자가 조립을 위한 2개의 효율적인 프로토콜을 제공합니다. 제시된 조립 프로토콜은 적응형 물리화학적 특성을 가진 ELP를 기반으로 단백질 멤브레인 기반 구획(PMBC)을 생성합니다. PMBC는 위상 분리 거동을 시연하고 방법 의존적 멤브레인 융합을 드러내며 화학적으로 다양한 형광화물 분자를 캡슐화할 수 있습니다. 생성된 PMBC는 약물 제형 및 전달 플랫폼, 인공 세포 및 구획화된 반응 공간으로서 높은 적용 잠재력을 가지고 있다.
Introduction
생명 공학 응용 프로그램에 대한 상분 분자 구조의 조립은 점점 더 중요해지고있다1,,2,,3,,4,,5. 원하는 물리 화학적 특성을 가진 코서바트, 소포 및 섬유와 같은 기능적 아키텍처의 조립을 위해 구성 요소의 물리 화학적 및 형태적 특성을 이해하고 제어하는 것이 중요합니다. 자연에서 발견되는 분자의 분자 정밀도로 인해, 상분 분자 구조에 대한 빌딩 블록은 점점 지질, 핵산 또는 단백질에 기초하고 있습니다. 합성 폴리머에 비해, 단백질 구성 요소는 유전 수준에서 응급 최후의 분자 구조6에 대한 정확한 제어를 할 수 있습니다. 개별 단백질 빌딩 블록의 1차 아미노산(aa) 서열은 최종 초분자구조의3차원 형상 및 물성뿐만 아니라 거시적 수준까지의 분자로부터 그들의 조립 전위성에 대한 정보를 본질적으로 인코딩한다.
다른 상분 분자 구조의 조립을위한보고 된 방법은 종종 온도에 민감한 엘라스틴과 같은 단백질 (ELP)과 같은 양과 성 단백질을 포함5,8,9, 재조합 올레오신10및 인공 단백질 양서류11. 온도 트리거 방법은 미셀의 조립을 주도하고있다4,10,12섬유13시트14및 소포9,15,16. 유기 용매와 관련된 방법은 동적 단백질 기반 소포의 형성을 위해 적용되었습니다.8,11,14. 지금까지 소포 형성을 위한 응용 프로토콜은 마이크로미터 크기의 어셈블리에 대한 조립 제어가 부족한 경우가 많습니다.16,17또는 조립 수율이 제한되어 있습니다.5. 또한, 일부 보고 ELP 기반 소포 는 캡슐화 잠재력을 손상12또는 시간이 지남에 따라 제한된 안정성9. 이러한 단점을 해결하는 제시된 프로토콜은 뚜렷한 물리화학적 특성, 양호한 캡슐화 잠재력 및 장시간 안정성을 갖춘 마이크로미터 및 서브 마이크로미터 크기의 초분자 구조의 자체 조립을 가능하게 합니다. 맞춤형 양서류 ELP는 구형 응고체와 고도로 주문된 꼬인 섬유 번들에서 적용된 프로토콜 및 관련 환경 조건에 따라 unilamellar 소포에 이르기까지 다양한 범위의 상분자 구조로 조립됩니다. 큰 수피 단백질 막 기지를 둔 구획 (PMBC)는 리포좀과 유사한 막 융합 및 상 분리 행동과 같은 모든 주요 표현형을 밝힙니다. PMBC는 간단한 epifluorescence 현미경 검사법을 사용하여 모니터링할 수 있는 화학적으로 다양한 형광화물 분자를 효율적으로 캡슐화합니다. 이 연구에서 사용되는 반복적 인 ELP 도메인은 단백질 기반의 초분자 아키텍처를위한 매력적인 빌딩 블록입니다.18. ELP 펜타펩타이드 반복 유닛(VPGVG)은 구조적 및 기능적 특성을 유지하면서 네 번째 위치(발린, V)에서 프롤린 외에 다른 aa를 견딜 수 있는 것으로 알려져 있습니다.19. 특유의 친수성 및 소수성 도메인을 포함하는 양과성 ELP의 설계는 뚜렷한 소수성, 극성 및 전하를 가진 VPGXG 반복에 aa 게스트 잔류물 (X)을 삽입함으로써 실현되었습니다.20. 친수성 도메인이 충전된 글루탐산(E) 또는 아르기닌(R)을 게스트 잔류물로 함유하는 동안 소수성 페닐알라닌(F) 또는 이솔루신(I)을 구비한 양과성 ELP 도메인. 적격 한 양과 성 ELP 구문 및 해당 aa 시퀀스의 목록은 보충 정보 및 참조에서 찾을 수 있습니다.8,21. 형광 현미경 검사법을 통해 시각화를 위한 작은 형광 염료 또는 형광 단백질을 갖춘 모든 빌딩 블록. mEGFP 및 기타 형광 단백질은 ELP 양서류의 친수성 도메인에 N-말단 융합되었다. 유기 염료는 구리가 없는 균주를 통해 공액화되었고 알키네-아지드 사이클로아더(SPAAC)를 동시 도입된 부자연 아미노산(UAA)으로 촉진시켰다. UAA의 공동 번역 편입para-아지도페닐알라닌 (파즈프)22친수성 ELP 도메인의 N 말단 수정을 허용합니다. 이에 녹색 형광염료 BDP-FL-PEG4-DBCO(BDP) 또는 변형된 사이클로크틴을 가진 임의의 작은 형광 분자는 형광 프로브로서 사용될 수 있다. UAA pAzF의 성공적인 통합과 SPAAC를 통한 염료의 사이클로추가는 해당 트립틱 펩타이드의 효율적인 이온화로 인해 LC-MS/MS를 통해 쉽게 확인할 수 있습니다.8. 이 작은 유기 염료는 형광 단백질이 대부분의 유기 용매와 호환되지 않으므로 조립 프로토콜에 대한 용매 선택을 넓히기 위해 적용되었습니다. 실험실에서 개발된 상분자 구조에 대한 가장 효율적인 조립 프로토콜 2개는 아래에 설명되어 있습니다. THF 팽윤 방법은 유기 염료 변형 양과성 ELP와만 호환됩니다. 대조적으로, 1-부탄올(BuOH) 압출 방법은 형광 프로브와 같은 많은 단백질과 호환되며, 예를 들어 mEGFP, 기재된 방법은 이들 융합 단백질의 형광을 완전히 보존하기 때문이다. 또한, 소분자 및 수혈융합 거동을 캡슐화하는 것은 BuOH 압출 방법을 채택함으로써 가장 잘 작동한다.
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Protocol
1. 양과성 엘라스틴과 같은 단백질의 설계 및 복제 (ELP)
- 다른 곳에서 설명한 대로 구성을 복제하고디자인합니다 8,,20. 플라스미드는 요청 시 이용 가능합니다.
2. 단백질 발현, 정제 및 준비
- F20E20-mEGFP 및 F20E20-mCherry의 표현
- 하룻밤 사전 배양에서 0.3의 OD600까지 메인 발현 배양액을 접종합니다. 37°C에서 배양, 멸균 된 400 mL LB 배지에서 2 L 플라스크에서 적절한 항생제로 보충.
- 초순수에서 발현 배양의 유도를 위한 IPTG 스톡 솔루션(1M)을 준비한다.
- OD600 0.5-0.8에 도달하면 발현 배양에 IPTG를 추가하여 최종 농도인 1 mM을 추가하고 인큐베이션 온도를 20°C로 줄입니다. 200 rpm에서 약 20 시간 동안 20 °C에서 발현을 허용하십시오.
- UAA pAzF를 포함하는 양과성 ELP의 발현
- 2개의 플라스미드 pEVOL pAzF 및 예를 들어 pET28-NMBL-(TAG)를 포함하는 하룻밤 대장균 사전 배양으로부터 의 주요 발현 배양으로부터 의 OD600에 0.3의 그의 접종(아미노산 서열에 대한 보충 정보 참조). 37°C에서 배양하고, 2L 플라스크에 카나마이신과 클로람페니콜을 보충한 멸균 400 mL LB 배지에서 200 rpm을 배양하였다.
- 초순수에 100 mMM pAzF 스톡 솔루션을 준비하십시오. 10 mL의 pAzF 스톡 솔루션의 경우 206.2 mg의 pAzF를 측정하고 8 mL의 초순수로 다시 일시 중단하십시오. pAzF를 용해시키기 위해 용액의 pH를 3 M NaOH로 올리고 격렬하게 혼합한다. pAzF가 용해되면 pH를 10.5로 조심스럽게 낮추고 최종 부피 인 10 mL에 초순수를 추가하십시오. 멸균 필터(0.22 μm)를 사용하고 2 mL 반응 튜브에서 용액을 알리쿼트합니다.
- 초순수에 1M IPTG 스톡 솔루션과 초순수에 20% 아라비노스 스톡 솔루션을 준비합니다.
- OD600 0.5-0.8에 도달하면, 2 mM의 최종 농도에 발현 배양에 pAzF를 추가한다. pAzF 섭취를 허용하도록 10분, 37°C, 200 rpm동안 배양배양한다.
- IPTG (1 mM) 및 아라비노스 (2%)의 동시 첨가를 통해 필요한 tRNA /t-RNA 합성물의 표적 단백질 발현 및 발현 유도 인큐베이션 온도를 20°C로 낮추십시오.
- 200 rpm에서 약 20 시간 동안 20 °C에서 발현을 허용하십시오. 4°C, 4000 x g,40분에서 원심분리에 의한 수확 발현 배양.
- 세포 용해 및 단백질 정제
- 리소자임(0.1 mg/mL) 및 PMSF(0.1 mg/mL)를 함유하는 용해 완충액(배양 리터당 10 mL, 50 mM Tris-HCl pH 8, 500 mM NaCl, 4 M urea, 0.25% 트리톤 X-100)에서 대장균 펠릿을 재중단시켰다. 얼음에 30 분 동안 배양하고 액체 질소에 샘플을 침수하여 나중에 두 번 동결 및 해동.
- 현탁액을 초음파 처리 (30%, 15 회, 30 초 : 10 초 휴식)를 원심 분리를 통해 용해 (4 °C, 40 분 동안 10,000 x g)를 제거하십시오.
- 친화성 크로마토그래피를 사용하여 단백질을 정화합니다(예를 들어 분획 수집기에 연결된 FPLC 시스템을 사용하여 1 mL 니켈 컬럼에서; 재료 표참조). 용출 완충제 (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 4 M 우레아, 250-500 mM 이미다졸)로 단백질을 용출하고 추가 처리 될 때까지 4 °C에서 보관하십시오.
- SDS-PAGE를 통해 정제 효율을 분석합니다.
3. SPAAC를 통한 ELP의 염료 수정
- ELP 용액의 농도를 대략 추정합니다. pAzF-R40F20 서열은 UV 범위에서 흡수되는 아미노산이 결여되어 있기 때문에 농도 평가를 위한280 흡수는 가치가 없다. 따라서, 이전에 는 동약 및 가중 ELP 양피필SSS PAGE 대역 비교를 위한 참고자료로 사용될 수 있다. ELP 솔루션에서 SDS PAGE 대역의 합산된 회색 값 의 영성을 비교하여 알려진 농도와 시료의 대략적인 농도를 추정할 수 있습니다.
- 형광 염료 BDP-FL-PEG4-DBCO (10 mM 스톡 솔루션; 20 μM 최종 농도)를 ELP 용액 의 500 μL (~20 μM)에 추가합니다. 15°C에서 약 10시간 동안 반응을 배양하면서, 흔들면서 빛으로부터 보호하였다.
- 추가 사용에 대 한, 과도 한 BDP를 제거 하는 반응을 투석.
- 10 분 동안 초순수에서 투석 막 (예 : 12 kDa 컷오프)을 평형화. 투석 막을 올바른 크기로 잘라 클릭 한 ELP 용액을 함유한 반응 튜브의 개구부 위에 놓습니다. 개구부에서 투석 막을 고정하려면 개구부에 코어를 펀칭하여 반응 튜브 뚜껑을 놓아 튜브를 닫습니다.
- 반응 튜브를 선택한 버퍼에 거꾸로 놓습니다. 투석 후 버퍼(2-5L)를 매번 적어도 3시간 동안 교환합니다. 투석 막과 완충제 사이에 갇힌 기포를 제거하여 성공적인 투석을 보장합니다.
4. THF 붓기 프로토콜
- 투석 균질 ELP 용액은 안정된 pH 7.5를 가진 인산염 또는 트리스 완충액(10 mM)에 대하여 그의 태그 정제로부터 염 및 잔여 화합물을 제거한다.
- 동결 건조를 위해 동결 건조를 시작하고 온도로 식히십시오.
- 1.5 mL 반응 튜브 (튜브 당 50-500 μL)에서 투석 단백질 용액을 알리쿼트하고 액체 질소에서 충격 동결. 동결 건조 중에 다른 단백질 용액의 원치 않는 혼합을 방지하기 위해, 작은 구멍이있는 캡을 반응 튜브 위에 올려 부분적으로 밀봉 할 수 있습니다.
- 액체 질소에서 냉동 된 단백질 샘플을 가지고 즉시 동결 건조를 시작하기 위해 동결 필로에 배치합니다. 시료가 완전히 건조되면 동결 건조가 완료됩니다 (약 24-48 시간). 그 후, 건조 N2와공기 애호가 ELPs를 환기, 다음 즉시 공기 수분과의 접촉을 피하기 위해 반응 튜브 뚜껑을 닫습니다.
- 용약 샘플 (ELP, 5-10 μM)에 순수한 THF를 추가하고 THF에서 ELP의 팽윤을 허용하기 위해 얼음 물이 함유 된 수조 초음파 처리기에 용액을 15 분 동안 놓습니다.
- 소포 형성을 위해 30-60 °C또는 섬유 형성을 위해 최대 90 °C까지 열열 처리하고 초순수 또는 완충액을 포함하는 새로운 반응 튜브를 준비합니다 (50 mM NaH2PO4/ Na2HPO4,50 mM NaCl, pH 5-13). 구형 응고체는 pH 9-13 내에서 20°C에서 주로 조립됩니다. 소포 형성은 pH 7과 9 사이의 50-60°C에서 선호된다. 섬유 형성은 pH 5 와 12 사이에서 60°C 이상으로 미리 유도된다.
- 초음파 처리 단계 후 ELP /THF 용액과 준비된 초순수 또는 완충액을 열순환기에서 넣고 원하는 온도까지 5 분 동안 가열하십시오. 온도에 도달하면 예열 된 ELP / THF 용액은 예열 된 초순수 또는 완충액 위에 신중하게 계층화해야합니다. 고유한 인터페이스를 가진 두 단계의 명확한 분리가 표시되어야 합니다.
- 혼합물을 다시 열사이클러에 넣고 20 분 동안 배양하여 계면에서 소포 또는 섬유 형성을 허용합니다. 그 후, 형광 현미경 또는 투석을 통해 분석하기 전에 샘플을 실온으로 10 분 동안 식힙니다.
- 초순수 또는 완충액에 대한 초분자 구조를 함유하는 투석액(50 mM NaH2PO4/Na2HPO4,50 mM NaCl, pH 7-10).
5. BuOH 압출 프로토콜
- 초순수 또는 완충액(50 mM pb pH 7.5, 100 mM NaCl, 최대 4M 우레아을 함유할 수 있음)에서 1-50 μM ELP 용액을 준비한다. 양과성 ELP F20R20-mEGFP 및 F20R20-mCherry 용액의 농도는 어금니 소멸 계수(F20R20-mEGFP A280= 22015 M-1 cm-1 및 F20R20-mCherry A280= 34380M-1)를 사용하여 결정될 수 있다.-1
- 10%-20%(v/v) 1-부타놀을 추가하고 즉시 파이펫팅또는 주사기를 여러 번 통해 그려서 용액을 혼합합니다. 0.25 x 25mm 바늘이 장착된 일반적인 100 μL 파이펫 또는 해밀턴 주사기를 적용할 수 있습니다. 혼합 중 용액의 탁도가 증가하여 소포 형성을 나타냅니다. 1-옥탄놀 5%-15% (v/v) 또한 1-부탄올 대신 소포 압출에 사용할 수 있습니다.
- 좁은 크기 분포를 달성하기 위해, 실온에서 1 μm의 기공 크기의 멤브레인을 통해 미니 압출기를 사용하여 소포를 압출한다. 압출에 사용되는 멤브레인 크기는 소포의 상부 크기 컷오프를 결정합니다.
- 상기와 같이 소포를 투석(단계 3.3)하여 잔류 1-부탄올을 제거한다.
6. BuOH 압출 프로토콜로 염료 캡슐화
- 약 40 μL ELP 용액을 10 mM Tris-HCl, pH 8과 1 μL Dextran 텍사스 레드 (0.0025 mg/mL 최종 농도)로 혼합합니다.
- 용액에 BuOH 10 μL을 추가하고 0.25 x 25mm 바늘이 장착 된 주사기를 통해 5-10 회 돌출시하십시오.
7. 형광 현미경을 이용한 초분자 구조 분석
- 유리 슬라이드에 보강 링을 놓고 접착제 면을 유리에 단단히 누릅니다.
- 철근 링 안쪽에 시료 5 μL을 추가하고 커버 슬립을 위에 놓습니다.
- 분석 중에 샘플이 증발하지 않도록 커버 슬립 가장자리에 매니큐어로 시료를 밀봉합니다.
- 앞서 설명한 대로 형광 현미경 검사법을 수행8.
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Representative Results
소포 생산을 위한 프로토콜 개발
그림 1은 두 가지 다른 소포 준비 방법을 간략하게 설명합니다. 좌측의 THF 팽윤 방법은 3개의 연속적인 단계로 구성되며 온도에 따라 ELP의 상이한 상이한 분자 어셈블리를 초래한다. 그림 1A 에피오레스내시크 현미경 이미지는 BDP-R20F20에서 조립된 소포와 BDP-R40F20에서 조립된 섬유소 구조를 보여줍니다. 오른쪽에 예시된 BuOH 방법은 ELP 소포의 형성을 독점적으로 유도하여 THF 팽윤 방법에 비해 약 2배의 더 많은 소포를 산출합니다. 도식 그림은 BuOH 소포의 준비 과정을 보여줍니다. 도 1B BDP-R40F20에서 소포 제제를 위해 10-15% (v/v) BuOH및 소포를 혼합하여 혼합물의 압출을 통해 제조하였다.
상분자 자가 조립을 다른 구조로 유도
도 2는 THF 팽윤 프로토콜을 통해 BDP-R40F20으로부터 조립된 상이한 상이한 상이한 분자 구조의 개략적 그림 및 에피플루엔션 이미지를 나타낸다. 이 경우 동색화된 BDP-R40F20은 상이한 어셈블리 프로토콜을 위해 사용되었다. 버퍼의 pH와 조립 공정의 온도는 응고체, 섬유소 또는 소포를 형성하도록 조정되었다. 도 2A에 도시된 응고체는 직경이 1-2 μm이고 20°C 및 pH 13에서 BDP-R40F20으로부터 조립되었다. 조립 온도를 90°C로 조정하면 BDP-R40F20으로 테스트한 pH 4-13에서 나노섬유 번들(그림2B)이형성됩니다. 안정소포는 50°C 및 pH 7의 온도에서 ELP로부터 조립될 수있었다(도 2C). 어셈블리 프로토콜의 중요한 단계 중 하나에서 작은 실수는 그림 2D에묘사 된 집계의 형성으로 이어질 수 있습니다.
다른 화물의 캡슐화
도 3은 BuOH 압출 방법을 통해 F20R20-mEGFP로부터 조립된 소포의 소포 루멘내로 상이한 화물의 캡슐화를 나타낸다. 도 3A에서양전하 염료 아토 Rho13의 캡슐화를 위해, 염료는 혼합물의 부OH 및 주사기 압출의 첨가 전에 수성 ELP 용액과 혼합하였다. 공초점 현미경 이미지는 녹색 채널에서 F20R20-mEGFP로부터 형성된 소포를 보여주고, 적색 염료 AttoRho13은 적색 채널및 생성된 병합 채널에서 소포 루멘 내부의 성공적인 캡슐화를 나타낸다.
상기 다당류 Dextran Red 3000은 전술한 바와 같은 BuOH 압출 방법을 사용하여 성공적으로 캡슐화되었다. 녹색 채널에 기록된 이미지는 F20R20-mEGFP로 형성된 소포를 묘사하고 빨간색 채널은 다당류 화물을 나타낸다. 도 3B에서 병합된 녹색 및 적색 이미지는 소포 루멘에 성공적인 Dextran Red 3000 캡슐화를 확인한다.
압출 전후 혼합 BuOH 소포의 멤브레인 성분 호환성 및 상 분리
도 4는 조립된 PMBC 집단대 단일 PMBC 빌딩 블록의 혼합 시 ELP 양서류의 위상 분리 및 융합 거동을 나타낸다. PMBC 조립 전에 양과성 ELP 빌딩 블록(F20R20-mEGFP 및 F20R20-mCherry)을 혼합하면 조립된 PMBC 멤브레인 내에서 균질하게 분포된 분자를 유도합니다. 형광단 및 관련 ELP 양피의 균질분포는 각각의 형광 이미지의 적색 및 녹색 채널을 병합할 때 분명하다. F20R20-mEGFP 또는 F20R20-m체리에서 조립된 소포 집단을 혼합함으로써 적색 또는 녹색 형광의 명확하게 보이는 막 패치는 혼합 직후에 분명하게 드러난다. 이것은 다르게 표지된 PMBC의 PMBC 융합 사건이 생기고 이 융합 막 및 그들의 성분이 적어도 20 분 동안 분리된 위상을 유지한다는 것을 나타냅니다. 유사한 단계 행동은 지질 뗏목에서 알려져 있다, 지질 막 내에서23.
도 1: 소포 또는 섬유와 같은 상분체 구조로 양과성 엘프의 유도자가 조립을 위한 THF 팽윤 방법 및 BuOH 압출 방법의 예시. BDP-R20F20 및 BDP-R40F20을 이용한 THF 팽윤 법의 회로도 워크플로우 및 대표적인 에피플루네시 이미지는 온도 및 pH에 따라 상이한 상이한 상이한 분자 구조를 초래하고(B)BDP-R40F20(scale bar 2μm)에서 소포를 독점적으로 산출하는 BuOH 압출 방법.A 이 수치는 슈라이버 외 20198에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: THF 팽윤 방법을 적용함으로써 BDP-R40F20은 상이한 상이한 분자 구조로 자체 조립된다. 조립 프로토콜(예: 온도 또는 pH) 동안 적용되는 환경 조건은 형성된 우세한 상분분자 구조를 결정한다. 조립 동안 각각의 조건에서 대표적인 초분자 구조는 epifluoresccccopy를 통해 모니터링되었고 (A) 코열화 및 (B) 섬유소에서 (C) 안정소포까지 의 범위. (d) THF 팽윤 프로토콜 동안 정의된 구조물의 조립실패는 비특이적 응집체의 형성을 이끈다(스케일 바 2 μm). 이 그림은8에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: BuOH 압출 방법을 사용하여 ELP 소포 내에서 상이한 화물을 캡슐화할 수 있다. (a)F20R20-mEGFP 소포의 대표적인 공초점 이미지를 캡슐화된 양전하 염료 AttoRho13 및(B)다당류 덱스트란 레드(스케일 바 5 μm)의 캡슐화를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: BuOH 압출 방법을 통해 F20R20에서 조립된 소포 막의 멤브레인 성분 호환성 및 융합 거동. (a)형광 F20R20-mEGFP 및 F20R20-mCherry 단백질 용액을 주사기 압출 전에 혼합하면 녹색 채널(왼쪽 이미지), 적색 채널(가운데 이미지) 및 병합 채널(오른쪽 이미지)에서 동질적으로 분포된 양과성 단백질을 가진 PMBC 멤브레인이 이어집니다. (B)PMBC는 F20R20-mEGFP 또는 F20R20-mCherry로부터 조립되고 연속하여 주사기 압출을 통해 혼합되어 PMBC 멤브레인 내에서 분리된 ELP 양서류 패치로 이어진다. 멤브레인 내의 분리된 ELP 양서류는 PMBC 융합 후 녹색 채널(왼쪽 이미지), 적색 채널(가운데 이미지), 및 병합된 채널(오른쪽 이미지)에서 20분 이상 동안 볼 수 있다. 배율 막대는 5 μm에 해당합니다. 이 수치는 슈라이버 외 20198에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
정의된 상분자 구조의 조립을 위한 기재된 프로토콜을 따르는 동안 결함은 주로 비특이적 응집체의형성(도 2,IV) 또는 균질적으로 분포된 ELP-양서류에 이르게 한다. 프로토콜의 중요한 단계는 다음과 같습니다.
양서류 ELP의 높은 발현 수율을 위해 20°C의 비교적 낮은 온도가 최적입니다. 양과성 ELP의 성공적인 친화도 기반 정제를 위해 용해 완충액에서 4M의 우레아 농도는 양과성 ELP를 가장 잘 용해시키고 수용성 용출 분획에서 단백질 수율을 증가시키는 것으로 입증되었다. 용해 완충액에 있는 더 낮은 우레아 사격이 요구되는 경우에, 친화성 정제는 개별 구조물을 위해 시험되어야 합니다. 2 M 우레아는 특히 His-tag가 친수성 도메인에 융합되어 수지를 결합 할 수있는 일부 구조에 대해서도 잘 작동했습니다. 크기 배제 크로마토그래피를 통한 그의 태그 정제 후 추가적인 정제 단계는 소포 수율을 증가시킬 수 있다.
THF 팽윤 프로토콜을 적용하는 경우에, 양과성 ELP는 시각화를 위한 형광 유기 염료로 표지될 필요가 있습니다. SPAAC를 통한 양피ELP의 BDP 라벨링(UAA pAzF를 함유하는 아미노산 서열에 대한 보충 정보 참조)에 대해 중요한 것은 모든 정제 완충제에서 TCEP, DTT 또는 β-메르카페탄올과 같은 임의의 환원제의 부재이다. 이는 SPAAC반응(24)에앞서 pAzF의 아민 감소에 대해 잘 보고된 아지드를 피하기 위해 필요하다.
양과성 ELP (예를 들어 pAzF-R40F20)에 염료의 정확한 반응 stoichiometry는 상피 현미경 검사법을 통해 간단한 소포 시각화를 위한 모든 단 하나 ELP 분자를 레이블을 붙일 필요가 없기 때문에 중요하지 않습니다. 따라서, 기준 SDS 겔 밴드와 상응하는 가중 된 용이성 샘플의 상관관계는 각 단백질 구성에 대해 한 번만 필요합니다. 그러나, 100% 라벨링 수율이 요구되는 경우 ELP 분자에 1:1 등가물 염료의 비로 충분하다. 매우 유사한 양수 ELP는 BDP (아직 게시되지 않은 데이터)의 등구 첨가에 완전히 표지될 수 있도록 실험실에서 분석되었습니다.
THF 팽윤 방법을 사용하여 소포 준비를 위해, 가장 중요한 단계는 수성 완충단계 의 위에 이 해결책의 동포화된 양과성 ELP의 팽윤 및 후속 계층화입니다. 따라서, 신선하게 동포화된 양민ELP는 가능한 한 무수화되어야 하며, 이는 건조질소 가스를 가진 호우건조증제의 환기및 반응튜브 뚜껑의 즉각적인 폐쇄에 의해 달성될 수 있다. 가능한 경우, 중격 밀봉 건조 THF는 소포 수율을 높이기 위해 사용되어야하지만, THF p.a. (>99.5%) 중격없이뿐만 아니라 작동합니다. 건조 THF에서 양과 성 ELP를 팽창시 계층화 단계는 매우 신중하게 실행되어야한다. 두 온도 제어 솔루션의 성공적인 계층화는 유기 상과 수성 상 사이의 명확하게 보이는 위상 경계로 이어집니다. 온도가 상승하여 이러한 단계의 열 유도 혼합으로 이어지더라도 초기 계층화 단계는 천천히 진행되어야 합니다. 용액의 출현 탁도는 형성 된 소포, 섬유 또는 응고물의 광 산란에 기인한다. 단백질이 결여된 대조군 샘플에서는 THF 수계25에대해 작은 크기 구조(최대 200 nm)가 보고되었지만 탁도가 나타나지 않는다. THF 계층화 단계는 팽윤 프로토콜의 가장 중요하고 실패하기 쉬운 단계입니다. 배양 단계 후 초분자 구조는 완충제 또는 초순수에 대해 투석될 수 있다. 삼투압을 유지하고 조립된 소포의 팽윤 또는 수축을 방지하기 위해 초기 조립에 적용된 동일한 수성 용액을 우선적으로 사용해야 합니다. 투석 후, 소포, 섬유 및 응고체는 일반적으로 적어도 1 주일 동안 안정적입니다. 조립 시 환경 적 매개 변수에 따라 THF 팽윤 방법이 적용되는 경우 주요 구조 외에 다른 극분자 구조의 작은 비율이 종종 존재한다8. 기재된 THF 방법은 소포 어셈블리 수율을 1배 크기로 증가시키고 BuOH 압출은 이전에 발표된 시험관 내 방법5에비해 3배의 크기의 수율을 향상시킨다.
BuOH 압출 방법은 높은 재현성, 섬유 및 구형 응고를 우회하여 독점적으로 안정적인 수식 구조를 얻기 위해 적용됩니다. 이 방법은 오류가 발생하기 쉽고 형광 단백질과 호환됩니다. 따라서 F20R20-mEGFP 또는 F20R20-mCherry는 BDP-R40F20 또는 BDP-E20F20뿐만 아니라 적용될 수 있다. 유일한 중요한 단계는 10%-20% v/v BuOH를 첨가한 후 수성 단백질 용액을 빠르게 혼합하는 것입니다. F20R20-mEGFP 또는 F20R20-m체리 농도는 약 1-15 μM이어야 합니다. BuOH 압출 방법을 적용함으로써 소포는 5 M NaCl 또는 4 M 요소 및 5~ 8에 이르는 pH를 함유하는 초순수 또는 완충액으로 조립될 수 있다. 20% v/v BuOH의 압출 PMBC는 4°C에서 최소 6개월 동안 보관할 수 있으며, 수체 구조를 보존할 수 있습니다. 소포 크기 분포를 좁히기 위해 0.2-1 μm 크기의 멤브레인을 통해 미니 압출기를 사용하여 압출 할 수 있습니다. 이러한 기공 압출은 양서류 ELP에 BuOH 첨가 후 또는 소포 조립 후 직접 수행될 수 있다. PMBC가 이미징에 너무 집중되어 있는 경우, BuOH의 조립된 소포는 10%-20% v/v BuOH를 함유하는 수성 버퍼를 사용하여 신속한 혼합을 통해 희석될 수 있습니다.
BuOH 압출 방법의 주요 제한은 수성 버퍼에 대한 PMBC 투석이 종종 빈약한 소포 수율을 초래한다는 것입니다. 또한, 단순 지방산이 PMBC멤브레인(21)에통합될 수 있었기 때문에 막 공간 내의 잔류 부OH의 존재는 배제될 수 없다. 따라서, PMBC 막은 어느 정도 단백질 및 알카놀 모이티로 구성될 수 있다.
화학적으로 다양한 화물 분자의 캡슐화는 BuOH 압출 방법을 사용하여 가장 잘 작동합니다. 또한, DMSO는 포획되는 염료의 스톡 용액에 대한 용매로서 염료 캡슐화 효율을 증가시킨다. 캡슐화될 섬세한 화물의 경우, 5%-10% v/v 1-옥탄올은 PMBC 조립에 사용될 수 있으며, 부OH와 비교할 때 DNA-리가제 또는 TEV 프로테아제21,,26과같은 기능적 캡슐화 효소와 함께 더 나은 호환이 입증되었다. 그러나, n-부탄올의 짧은 사슬 길이로 인해 적용된 투석 막에 침투할 수 없는 1-옥탄올과 는 대조적으로 수성 완충제에 대해 투석될 수 있다. 또 다른 방법의 한계는 원하는 수위 구조 형성을 제어하는 데 필요한 적용된 온도 및 pH 값이 효소 활성에 영향을 미칠 수 있다는 것이다. 향후 작업에서, 친화도 정제 또는 크기 배제 정제는 소포 막 무결성을 저하하지 않고 캡슐화되지 않은 분자 대 캡슐화되지 않은 분자를 분리하도록 확립되어야 한다.
필름 재수화방법(16,,17)과는 대조적으로 본원에 기재된 프로토콜은 600 nm보다 큰 소포 크기의 조립을 가능하게 한다. 이를 통해 간단한 epifluoresccccccci검사법 및 막상 분리의 관찰을 통해 실시간 융합 사건을 모니터링할 수있다 8. 여기에 설명된 프로토콜은 양서류 ELP9의 온도 트리거 된 vesicular 조립에 비해 최대 6 개월의 장시간 안정성을 가진 PMBC를 산출합니다. 그러나, 주요 단점은 구조 형성을 위한 유기 용매의 필요성이다. BuOH는 형광 단백질27 (데이터가 표시되지 않음)의 무결성과 기능을 완전히 보존하더라도 캡슐화 된 효소의 활성은 잔류 유기 용매에 의해 제한 될 수 있으며 개별적으로 테스트해야합니다. 그러나, DNA-리가제, TEV-프로테아제 및 리파아제와 관련된 촉매 반응은 소포의 발광 공간 내에서 성공적으로 수행되었으며, 1-옥탄놀 또는 부오압출(26,,21)에의해 조립되었다. 또한, 조립 후 THF 투석은 매우 문제가 되지 않고 소포 무결성이 보존되더라도 BuOH 제거는 알 수없는 이유로 인해 소포 무결성을 잃는 경우가 많습니다.
설명된 프로토콜을 통해 연구원은 뚜렷한 물리 화학적 특성, 양호한 캡슐화 특성 및 장시간 안정성을 갖춘 마이크로미터 및 서브 마이크로미터 크기의 초분자 구조를 조립할 수 있습니다. 이러한 상분자 구조는 최소세포(26) 또는 인공 세포연구(21)또는 효소 캡슐화, 또는 약물 제형의 설계에 적용될 수 있다. 제시된 기능성 PMBC는 그들의 빌딩 블록이 면역원성28이아니기 때문에 약물 전달을 위한 추가 유망한 후보물, 동적 융합 행동을 전시하고, 다양한 화물 캡슐화를 허용합니다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 재정 지원을 위한 BMBF및 생물학 시스템 분석 센터 (ZBSA)를 위한 연구 시설을 제공하기위한 감사합니다. 우리는 P. G. 슐츠, TSRI, 라 호야, 캘리포니아, 플라스미드 pEVOL-pAzF를 제공에 감사드립니다. 우리는 알버트 루드비히스 대학 프라이부르크의 생물 학적 시스템 분석 센터 (ZBSA)의 생명 이미징 센터 (LIC)의 직원에게 공초점 현미경 자원에 대한 도움과 이미지 기록에 대한 탁월한 지원에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 µm and 0.2 µm Steril Filter | VWR | ||
| 1,4-Dithiothreitol | Merck | ||
| 1-butanol. >99.5% p.a. | Roth | ||
| 2log DNA ladder | NEB | ||
| 2-Mercaptoethanol | Roth | ||
| 50 mL Falcon tubes | VWR | ||
| 79249 Alkyne Mega Stokes dye | Sigma Aldrich | ||
| Acetic acid glacial | VWR | ||
| Acetonitrile, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | ||
| Ampicillin sodium-salt, 99% | Roth | ||
| BDP-FL-PEG4-DBCO | Jena Bioscience | ||
| Biofuge | Heraeus | ||
| Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm) | Thermo Scientific | ||
| Brillant Blue G250 (Coomassie) | Roth | ||
| BspQI | NEB | ||
| Camera DS Qi1 | Nikon | ||
| Centrifuge 5417r | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5810r | Eppendorf | ||
| CF-400-Cu square mesh copper grid | EMS | ||
| Chloramphenicol | Roth | ||
| CompactStar CS 4 | VWR | ||
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral | Life Technologies | ||
| Digital sonifier | Branson | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Applichem | ||
| Dnase I | Applichem | ||
| EarI | NEB | ||
| EcoRI-HF | NEB | ||
| Environmental shaker incubator ES-20 | Biosan | ||
| Ethanol absolute | Roth | ||
| Ethidium bromide solution | Roth | ||
| Filter supports | Avanti | ||
| Glass plates | Bio-Rad | ||
| Glycerol Proteomics Grade | Amresco | ||
| Glycin | Applichem | ||
| H4-Azido-Phe-OH | Bachhem | ||
| Heat plate MR HeiTec | Heidolph | ||
| HindIII | NEB | ||
| HisTrap FF crude column | GE Life Sciences | Nickel column | |
| Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a. | Merck | ||
| Illuminator ix 20 | INTAS | ||
| Illuminator LAS-4000 | Fujifilm | ||
| Imidazole | Merck | ||
| Immersions oil for microscopy | Merck | ||
| Incubators shakers Unimax 1010 | Heidolph | ||
| Inkubator 1000 | Heidolph | ||
| IPTG, >99% | Roth | ||
| Kanamycinsulfate | Roth | ||
| L(+)-Arabinose | Roth | ||
| Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE | Sartorius | ||
| LB-Medium | Roth | ||
| Lyophilizer Alpha 2-4 LSC | Christ | ||
| Lysozyme, 20000 U/mg | Roth | ||
| Microscope CM 100 | Philips | ||
| Microscope Eclipse TS 100 | Nikon | ||
| Microscopy cover glasses (15 x 15 mm) | VWR | ||
| Microscopy slides | VWR | ||
| Microwave | Studio | ||
| Mini-Extruder Set | Avanti Polar Lipids | ||
| NaCl, >99.5%, p.a. | Roth | ||
| Natriumhydroxid pellets | Roth | ||
| Ni-NTA Agarose, PerfectPro | 5 Prime | ||
| Nucleopore Track-Etch Membrane | Avanti | ||
| PH meter 766 calimatic | Knick | ||
| Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF) | Roth | ||
| Polypropylene Columns (1 mL) | Qiagen | ||
| PowerPac basic | BioRad | ||
| Propanol-2-ol | Emplura | ||
| Protein ladder 10-250 kDa | NEB | ||
| Recirculating cooler F12 | Julabo | ||
| Reinforcement rings | Herma | ||
| SacI HF | NEB | ||
| SDS Pellets | Roth | ||
| Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4 | VWR | ||
| Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate | VWR | ||
| T4 DNA Ligase | NEB | ||
| TEMED | Roth | ||
| TexasRed Dextran-Conjugate | MolecularProbes | ||
| Thermomix comfort | Eppendorf | ||
| THF, >99.5% p.a. | Acros | ||
| Triton X 100 | Roth | ||
| Trypton/Pepton from Casein | Roth | ||
| Ultrasonic cleaner | VWR | ||
| Urea p.a. | Roth | ||
| Vacuum pump 2.5 | Vacuubrand | ||
| XbaI | NEB | ||
| XhoI | NEB | ||
| ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V) | Roth |
References
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