Summary
На стыке органических и aqueous растворителей, с учетом амфифилических эластиноподобных белков, собираемых в сложные надмолекулярные структуры, такие как пузырьки, волокна и коацерваты, вызванные экологическими параметрами. Описанные протоколы сборки дают Белковые Мембраны на основе Сравнения (PMBCs) с настраиваемыми свойствами, что позволяет инкапсуляции различных грузов.
Abstract
Специализированные белковые строительные блоки являются универсальными кандидатами для сборки надмолекулярных структур, таких как минимальные клетки, средства доставки лекарств и ферментные леса. Благодаря своей биосовместимости и тюнике на генетическом уровне, эластиновые белки (ELP) являются идеальными строительными блоками для биотехнологического и биомедицинского применения. Тем не менее, сборка протеиновых надмолекулярных структур с различными физиохимическими свойствами и хорошим инкапсуляционным потенциалом остается сложной задачей.
Здесь мы предоставляем два эффективных протокола для управляемой самосборки амфифилических ELPs в надмолекулярные белковые архитектуры, такие как сферические коакерваты, волокна и стабильные пузырьки. Представленные протоколы сборки генерируют белковые мембранные компоненты (PMBCs) на основе ELPs с адаптируемыми физикохимическими свойствами. PMBCs продемонстрировать фазовое поведение разделения и выявить метод зависимых мембранных синтеза и способны инкапсулировать химически разнообразные флуоресцентные молекулы груза. В результате PMBCs имеют высокий потенциал применения в качестве платформы разработки и доставки наркотиков, искусственных клеток, и разрозненные пространства реакции.
Introduction
Сборка надмолекулярных структур для биотехнологических применений становится все более важной1,,2,,3,,4,,5. Для сборки функциональных архитектур, таких как коацерваты, пузырьки и волокна с желаемыми физикохимическими свойствами, важно понимать и контролировать физико-химические и конформационные свойства компонентов. Благодаря молекулярной точности молекул, найденных в природе, строительные блоки для надмолекулярных структур все чаще основаны на липидах, нуклеиновых кислотах или белках. По сравнению с синтетическими полимерами, белковые строительные блоки позволяют точно контролировать возникающие надрамолекулярные структуры6 на генетическом уровне. Первичная аминокислота (аа) последовательность отдельных блоков здания протеина внутренне кодирует информацию для их потенциала агрегата от молекулярного до макроскопического уровня также, как трехмерная форма и физические свойства окончательной надмолекулярной структуры7.
Сообщаемые методы сборки различных надмолекулярных структур часто связаны с амфифильные белки, такие как чувствительные к температуре эластиновые белки (ELP)5,8,9, рекомбинантный олеозин10и искусственный белок амфифилов11. Методы срабатывания температуры привели к сборке мицеллей4,10,12Волокон13Листы14и везикулы9,15,16. Применяются методы, связанные с органическими растворителями, для формирования динамических белковых пузырьков8,11,14. До сих пор применяемые протоколы для формирования везикулчастой часто не имеют контроля сборки над сборками размером с микрометр16,17или имеют ограниченный урожай сборки5. Кроме того, некоторые сообщили ELP на основе пузырьков имеют нарушения инкапсуляции потенциал12или ограниченная стабильность с течением времени9. Устранение этих недостатков, представленные протоколы позволяют самосборку микрометра и субмикрометрового размера надмолекулярных структур с различными физиохимическими свойствами, хорошим потенциалом инкапсуляции и длительной стабильностью. Специализированные амфифилические ELPs собираются в надмолекулярные структуры, охватывающие диапазон от сферических коацерватов и высоко упорядоченных витой волокна пучки униламеллярных пузырьков в зависимости от прикладного протокола и связанных с ними условий окружающей среды. Большие везикулярные белковые мембранные сосульки (PMBC) выявляют все основные фенотипы, такие как мембранное слияние и поведение фазового разделения, аналогичное липосомам. PMBCs эффективно инкапсулировать химически разнообразные флуоресцентные молекулы груза, которые могут контролироваться с помощью простой эпифлюоресценции микроскопии. Повторяющиеся области ELP, используемые в данном исследовании, являются привлекательными строительными блоками для супрамолекулярных архитектур на основе белка18. ELP pentapeptide repeat unit (VPGVG), как известно, переносит различные аа, кроме пролина на четвертой позиции (valine, V), сохраняя при этом свои структурные и функциональные свойства19. Конструкция амфифильных ELPs, содержащая отличительные гидрофильные и гидрофобные домены, была реализована путем вставки остатков гостя aa (X) в повтор ЕС VPGXG с ярко выраженной гидрофобичностью, полярностью и зарядом20. Амфифильные области ELP, где оснащены гидрофобных фенилаланин (F) или изолейцин (I), в то время как гидрофильный домен содержал заряженную глутаминовую кислоту (E) или аргинин (R) в качестве остатков гостя. Список подходящих амфифилических конструкций ELP и соответствующих последовательностей aa можно найти в дополнительной информации и ссылках8,21. Все строительные блоки, где оснащены либо небольшими флуоресцентными красителями или флуоресцентными белками для визуализации с помощью флуоресценции микроскопии. mEGFP и другие флуоресцентные белки были N-терминально слиты с гидрофильных доменов амфифилов ELP. Органические красители были спряжены с помощью медь-свободного штамма способствовали алкин-азид цикловуда (SPAAC) в совместное переводно введены неестественные аминокислоты (UAA). Сотрансляционная инкорпорация UAApara-азидофенилаланин (pAzF)22позволяет N-терминал модификации гидрофильных домен ELP. Таким образом, зеленый флуоресцентный краситель BDP-FL-PEG4-DBCO (BDP) или любой небольшой флуоресцентной молекулы с напряженной циклоктин может быть использован в качестве флуоресцентного зонда. Успешное включение UAA pAzF и циклоaddition красителя через SPAAC может быть легко подтверждено с помощью LC-MS/MS благодаря эффективной ионизации соответствующих триптических пептидов8. Этот небольшой органический краситель был применен для расширения выбора растворителя для протоколов сборки, так как флуоресцентные белки несовместимы с большинством органических растворителей. Ниже описаны два наиболее эффективных протокола сборки надмолекулярных структур, разработанных в нашей лаборатории. Метод отеков THF совместим только с органическим красителем модифицированных амфифилических ELP. В отличие от этого, метод экструзии 1-бутанол (BuOH) совместим со многими белками, как флуоресцентный зонд, например, mEGFP, так как описанный метод полностью сохраняет флуоресценцию этих белков синтеза. Кроме того, инкапсуляция малых молекул и везикулярное поведение синтеза лучше всего работает, используя метод экструзии BuOH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Проектирование и клонирование амфифильных эластиноподобных белков (ELPs)
- Клон и дизайн конструкций, как описано в другом месте8,20. Плазмиды доступны по запросу.
2. Выражение белка, очищение и приготовление
- Выражение F20E20-mEGFP и F20E20-mCherry
- Прививать основную культуру выражения от ночной предкультуры до OD600 из 0,3. Инкубировать при 37 градусах Цельсия, 200 об/мин в стерильной среде LB 400 мл, дополненной присваиваемыми антибиотиками в 2 л колбе.
- Подготовьте акционерное решение IPTG (1 M) для индукции культуры экспрессии в ультрачистой воде.
- При достижения OD600 0.5-0.8 добавьте IPTG к культуре выражения к конечной концентрации 1 мМ и снижайте температуру инкубации до 20 градусов по Цельсию. Разрешить выражение при 20 градусах по Цельсию в течение примерно 20 ч при 200 об/мин.
- Выражение амфифилического ELP, содержащего UAA pAzF
- Прививать основную культуру выражения от ночной E. coli pre-culture, содержащей две плазмиды pEVOL pAzF и, например, pET28-NMBL-(TAG)R40F20-его до OD600 0.3 (см. дополнительную информацию для аминокислотных последовательностей). Инкубировать при 37 градусах Цельсия, 200 об/мин в стерильной среде LB 400 мл, дополненной канамицином и хлорамфениколом в 2 л колбе.
- Приготовьте 100 мМ пасетного раствора в ультрачистой воде. Для 10 мл бульонного раствора ПАЗФ, весят 206,2 мг ПАЗИ и повторно применяем его в 8 мл ультрачистой воды. Чтобы растворить pAzF поднять рН раствора с 3 M NaOH и тщательно перемешать. При растворении ПАУЗ внимательно опустите рН до 10,5 и добавьте ультрачистую воду до конечного объема в 10 мл. Используйте стерильный фильтр (0,22 мкм) и подайте раствор в 2 мл реакционных труб.
- Приготовьте 1 M штуч-раствор IPTG в ультрачистой воде и 20% растворе арабинозы в ультрачистой воде.
- При достижения OD600 0.5-0.8 добавьте pAzF к культуре выражения к окончательной концентрации 2 мМ. Инкубировать культуру в течение 10 мин, 37 КВ, 200 об/мин, чтобы обеспечить поглощение ПАЗФ.
- Индуцировать экспрессию целевого белка и экспрессию необходимого синтеза tRNA/t-RNA при одновременном добавлении IPTG (1 мМ) и арабинозы (2%) и снизить температуру инкубации до 20 градусов по Цельсию.
- Разрешить выражение при 20 градусах по Цельсию в течение примерно 20 ч при 200 об/мин. Культура выражения урожая при центрифугации при 4 градусах по Цельсию, 4000 х г,40 мин.
- Лиза и очистки белка
- Отстегивайте пеллеты E. coli в буфере излисебя (10 мл на литр культуры; 50 мМ Tris-HCl pH 8, 500 мМ NaCl, 4 M мочевины, 0,25% Triton X-100), содержащие лисозим (0,1 мг/мл) и PMSF (0,1 мл мл). Инкубировать в течение 30 минут на льду и заморозить и оттаивать два раза после этого, погрузив образец в жидкий азот.
- Сонифицировать подвеску (30%, 15 раз, 30 с: 10 с перерывом) и очистить лизат через центрифугацию (4 кв.к., 10 000 х г в течение 40 мин).
- Очистите белок с помощью хроматографии сродства (например, на колонке никеля 1 мл с помощью системы FPLC, подключенной к сбору фракций; см. Таблица материалов). Вылейте белок с элюционным буфером (50 мм Tris-HCl, 500 мМ NaCl, 4 M мочевины, 250-500 мм имидазола) и хранить при 4 градусах Цельсия до дальнейшей обработки.
- Проанализируйте эффективность очистки с помощью SDS-PAGE.
3. Краситель-модификация ELPs через SPAAC
- Грубо оцените концентрацию раствора ELP. Поглощение280 для оценки концентрации не является ценным, так как последовательность pAzF-R40F20 не хватает аминокислот, поглощающих в УФ-диапазоне. Таким образом, ранее лиофилизированный и взвешенный амфифил ELP может быть использован в качестве эталона для сравнения полосы SDS PAGE. Путем сравнения суммированных серых значений intesity sDS PAGE полос из ELP решений с известными концентрациями и ваш образец грубой концентрации образца может быть оценена.
- Добавьте 1 зллю флуоресцентного красителя BDP-FL-PEG4-DBCO (10 мМ конечной концентрации; 20 мкм конечной концентрации) до 500 л л раствора ELP (20 мкм). Инкубировать реакцию около 10 ч при 15 градусах Цельсия, в то время как встряхивая и защищены от света.
- Для дальнейшего использования диализировать реакцию, чтобы удалить чрезмерное BDP.
- Равновесие диализа мембраны (например, 12 kDa отсечения) в ультрачистой воде в течение 10 мин. Вырезать диализм мембраны в правильный размер, который будет помещен на верхней части открытия реакции трубки, содержащей нажал ELP раствор. Чтобы исправить диализную мембрану в отверстие, поместите крышку реакционной трубки с пробитым ядром на отверстие, тем самым закрыв трубку.
- Поместите реакционную трубку вверх дном в выбранный буфер. Обмен буфера (2-5 L) дважды после диализа, по крайней мере 3 ч каждый раз. Удалите любые пузырьки воздуха, оказавшись между мембраной диализа и буфером, чтобы обеспечить успешный диализ.
4. Протокол отеков THF
- Диализ однородный раствор ELP против фосфата или трис-буфера (10 мМ) со стабильным рН 7,5 для удаления солей и оставшихся соединений из его тега очистки.
- Приготовьте лиофилизатор и охладите до стартовой температуры для замораживания сушки.
- Aliquot диализированный белковый раствор в 1,5 мл реакционных трубок (50-500 л на трубку) и шоковый замораживание жидкого азота. Чтобы избежать нежелательного смешивания различных белковых растворов во время замораживания сушки, шапки с небольшим отверстием можно положить поверх реакционной трубки, чтобы запечатать его частично.
- Возьмите замороженные образцы белка из жидкого азота и сразу же поместите их в лиофилизатор, чтобы начать замораживание сушки. Замораживание сушки завершается, когда образец полностью сухой (примерно 24-48 ч). Впоследствии проветривайте лиофилизированные амфифилические ЭЛП с сухим N2,затем сразу же закрывают крышки реакционной трубки, чтобы избежать контакта с влагой воздуха.
- Добавьте чистый THF в лиофилизированные образцы (ELP, 5-10 мкм) и поместите раствор в водяной ванне соникатор, содержащий ледяную воду в течение 15 минут, чтобы обеспечить отек ELP в THF.
- Разогреть термоциклопер до 30-60 градусов по Цельсию для образования везикул или до 90 градусов по Цельсию для образования волокна и подготовить новые реакционные трубки, содержащие либо ультрачистую воду или буфер (50 мм2PO4/Na2HPO4, 50 мМ NaCl, рН 5-13). Сферические коакерваты собираются преимущественно при 20 градусах по Цельсию в пределах рН 9-13. Формирование Vesicle благоприятствует при 50-60 градусах Цельсия между рН 7 и 9. Образование волокна предварительно индуцированно над 60 c между pH 5 и 12.
- После звукового шага поместите раствор ELP/THF, а также подготовленный ультрачистый раствор воды или буфера в термоциклер и нагрейте до нужной температуры в течение 5 мин. При достигаете температуры разогретый раствор ELP/THF должен быть тщательно стратифицирован поверх разогретой ультрачистой воды или буферного раствора. Должно быть видно четкое разделение двух этапов с определенным интерфейсом.
- Поместите смесь в термоцикл снова и инкубировать в течение 20 минут, чтобы обеспечить везикул или волокна формирования на интерфейсе. После этого дайте образцам остыть до комнатной температуры в течение 10 минут до анализа с помощью флуоресценции или диализа.
- Диализный раствор, содержащий надмолекулярные структуры против ультрачистой воды или буфера (50 мм2PO4/Na2HPO4,50 мМ NaCl, рН 7-10).
5. Протокол экструзии BuOH
- Подготовьте раствор ELP 1-50 мм в ультрачистой воде или буфере (50 мм ПБ рН 7,5, 100 мм NaCl, может содержать до 4 М мочевины). Концентрация амфифилических ELP F20R20-mEGFP и раствора F20R20-mCherry можно определить с помощью коэффициентов вымирания моляров (F20R20-mEGFP A280 - 22015 M-1 см-1 и F20R20-mCherry A280 - 34380 M-1 см-1sequencea)
- Добавьте 10%-20% (v/v) 1-бутанол и сразу же смешайте раствор, прокладывая трубку вверх и вниз или рисуя его через шприц несколько раз. Можно нанести общий пипетку калибра 100 л или шприц Hamilton, оснащенный иглой 0,25 х 25 мм. Мутность раствора во время смешивания должна увеличиваться, что указывает на образование везикулы. 1-октанол 5%-15% (v/v) также может быть использован для везикулы экструзии вместо 1-бутанола.
- Для достижения узкого распределения размеров, выдавливать пузырьки с помощью мини-экструдера через мембрану с размером поры 1 мкм при комнатной температуре. Размер мембраны, используемый для экструзии, определяет верхний размер отсечения пузырьков.
- Диализ пузырьков, как описано выше (шаг 3.3), чтобы удалить остаточный 1-бутанол.
6. Инкапсуляция красителя с протоколом экструзии BuOH
- Смешайте примерно 40 мл ELP раствор в 10 мм Tris-HCl, рН 8 с 1 L Dextran Texas Red (0,0025 мг/мл конечной концентрации).
- Добавьте в раствор 10 кЛ BuOH и выдавливайте 5-10 раз через шприц, оснащенный иглой 0,25 х 25 мм.
7. Анализ надмолекулярных структур с использованием флуоресценции микроскопии
- Поместите подкрепление кольцо на стеклянную горку и твердо прижмите клей стороны к стеклу.
- Добавьте 5 зл и пилули образца на внутреннюю часть арматурного кольца и поместите крышку скольжения сверху.
- Печать образца с лаком для ногтей по краям крышки скольжения, чтобы избежать испарения образца во время анализа.
- Провести флуоресценцию микроскопии, как ранее описано8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Разработка протокола для производства везикул
На рисунке 1 описаны два различных метода подготовки везикля. Метод отеков THF на левой стороне состоит из трех последовательных шагов и приводит к различным надмолекулярным сборкам ELP в зависимости от температуры. На изображении эпифлюоресценции на рисунке 1А показаны пузырьки, собранные из BDP-R20F20, и фибрилюлевые структуры, собранные из BDP-R40F20. Метод BuOH, иллюстрированный на правой стороне исключительн водит к образованию пузырьков ELP, принося около 2 заказа величины больше пузырьков сравненных к методу отекth THF. Схематическая иллюстрация показывает процесс подготовки пузырьков BuOH. Для препаратов везикулы на рисунке 1B BDP-R40F20 смешивали с 10-15% (v/v) BuOH и пузырьки были подготовлены через экструзию смеси.
Руководство надмолекулярной самосборкой в различные структуры
На рисунке 2 показаны схематические иллюстрации и эпифлюоресценции изображения различных надмолекулярных структур, собранных из BDP-R40F20 через протокол ОТек THF. В этом случае для различных протоколов сборки использовался лиофилизированный BDP-R40F20. рН буфера и температура процесса сборки были скорректированы с учетом формы либо коакерватов, фибриллов или пузырьков. Коакерваты, изображенные на рисунке 2А, имеют диаметр 1-2 мкм и были собраны из BDP-R40F20 при 20 градусах Цельсия и рН 13. Корректировка температуры сборки до 90 градусов по Цельсию приводит к образованию нановолоконных пучков(рисунок 2В)при рН 4-13, протестированных с BDP-R40F20. Стабильные пузырьки могут быть собраны из ELP при температуре 50 градусов по Цельсию и рН 7(рисунок 2C). Небольшие ошибки на одном из важнейших этапов протокола сборки могут привести к образованию агрегатов, изображенных на рисунке 2D.
Инкапсуляция различных грузов
На рисунке 3 показана инкапсуляция различных грузов в везикуловый просвет везиклов, собранных из F20R20-mEGFP с помощью метода экструзии BuOH. Для инкапсуляции положительно заряженного красителя Atto Rho13 на рисунке 3A,краситель был смешан с вакусовым раствором ELP перед добавлением (15% v/v) BuOH и экструзии шприца смеси. Конфокальные микроскопические изображения показывают пузырьки, образованные из F20R20-mEGFP в зеленом канале, красный краситель AttoRho13 в красном канале и в результате слияние канала показывает успешную инкапсуляцию внутри везикальной просвет.
Полисахарид Dextran Red 3000 был успешно инкапсулирован с помощью метода экструзии BuOH, как описано выше. Изображения, записанные в зеленом канале, изображают пузырьки, образованные из F20R20-mEGFP, в то время как красный канал показывает полисахаридный груз. Слияние зеленого и красного изображения на рисунке 3B подтверждают успешную инкапсуляцию Dextran Red 3000 в просвете везикула.
Совместимость компонента membrane и разделение фаз смешанных пузырьков BuOH до/после экструзии
На рисунке 4 показано фазовое разделение и слияние амфифилов ELP при смешивании отдельных строительных блоков PMBC по сравнению со собранными популяциями PMBC. Смешивание амфифилических строительных блоков ELP (F20R20-mEGFP и F20R20-mCherry) перед сборкой PMBC приводит к однородно распределенным молекулам в пределах собранной мембраны PMBC. Однородное распределение флюорофоров и связанных с ними амфифилов ELP проявляется при слиянии красного и зеленого канала соответствующих флуоресценции изображений. Путем смешивания везикулных популяций, собранных либо из F20R20-mEGFP или F20R20-mCherry четко видны мембранные участки красного или зеленого флуоресценции очевидны сразу после смешивания. Это указывает на то, что события синтеза PMBC по-разному помечены PMBCs происходят и что эти сплавляющие мембраны и их составляющие остаются фазой разделены, по крайней мере 20 минут. Аналогичное фазовое поведение известно из липидных плотов, в липидных мембранах23.
Рисунок 1: Иллюстрация метода отеков THF и метода экструзии BuOH для управляемой самосборки амфифилических ELPs в надмолекулярные структуры, такие как пузырьки или волокна. Схематический рабочий процесс и репрезентативные эпифлюоресценции изображения (A) метод отекTH с BDP-R20F20 и BDP-R40F20 в результате различных надмолекулярных структур в зависимости от температуры и рН и (B) метод экструзии BuOH исключительно чего везикулы от BDP-R40F20 (шкала no 2m). Эта цифра была изменена от Schreiber et al. 20198. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Применяя метод отеков THF BDP-R40F20 самосборки в различных надмолекулярных структур. Экологические условия, применяемые при составлении протокола сборки (например, температура или рН), определяют преобладают надмолекулярные структуры, сформированные. Представитель надмолекулярных структур в соответствующих условиях во время сборки были проверены с помощью эпифлюоресценции микроскопии и варьируются от (A) коацерватов и (B) фибриллов (C) стабильные пузырьки. (D) Сбой в сборке определенных структур во время протокола отеков THF приводит к образованию неспецифических агрегатов (шкала бар 2 мкм). Эта цифра была изменена с8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Различные грузы могут быть инкапсулированы в пузырьках ELP с помощью метода экструзии BuOH. (A) показывает репрезентативные конфокальные изображения пузырьков F20R20-mEGFP с инкапсулированным положительно заряженным краситель AttoRho13 и (B) инкапсуляцией полисахарида dextran красного (шкала бар 5 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Совместимость компонентов мембраны и слияние везикуловых мембран, собранных из F20R20 с помощью метода экструзии BuOH. ()Смешивание флуоресцентных F20R20-mEGFP и F20R20-mCherry белкового раствора до шприцев-экструзии приводит к мембранам PMBC с однородными распределенными амфифильные белки, видимые в зеленом канале (левое изображение), красный канал (среднее изображение) и слитый канал (правое изображение). (B) PMBCs собраны из F20R20-mEGFP или F20R20-mCherry и смешанные впоследствии через экструзию шприца привести к разделенным ELP амфифил патчи в мембранах PMBC. Разделенные амфифилы ELP внутри мембраны видны после слияния PMBC в течение по крайней мере 20 мин в зеленом канале (левое изображение), красном канале (среднее изображение) и объединенном канале (правое изображение). Шкала баров соответствует 5 мкм. Эта цифра была изменена от Schreiber et al. 20198. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Неисправность при следовании описанным протоколам для сборки определенных надмолекулярных структур в основном приводит либо к образованию неспецифических агрегатов(рисунок 2,IV), либо к однородно распределенным ЭЛП-амфифилам. Критические шаги протокола рассматриваются ниже:
Для высокой экспрессии амфифилового ELP оптимальна относительно низкая температура 20 градусов по Цельсию. Для успешного очищения на основе сродства амфифильных ELP концентрация мочевины 4 М в буфере лизиса была доказана, чтобы наилучшим образом успокоить амфифилический ELP и увеличить урожайность белка в растворимых фракции растворителя. Если более низкие концентрации мочевины в буфере лисиса желательны, сродство очистки должны быть проверены на отдельные конструкции. 2 M мочевины работал также для некоторых конструкций, особенно для тех, где Его тег был слиты с гидрофильной области и, следовательно, все еще в состоянии связать с мислины. Дополнительный шаг очищения после Его тег очистки через размер исключения хроматографии может увеличить выход везикул, а также.
В случае применения протокола THF-отек, амфифилический ELP должен быть помечен флуоресцентным органическим красителем для визуализации. Важно отметить, что маркировка BDP амфифильных ELP (см. дополнительную информацию для аминокислотных последовательностей, содержащих UAA pAzF) через SPAAC является отсутствие каких-либо редуктора, таких как TCEP, DTT, ни й-меркаптанол во всех буферах очистки. Это необходимо, чтобы избежать хорошо сообщили азид к amine сокращения ПАЗФ до реакции SPAAC24.
Точная реакция стоихиометрии красителя на амфифилический ELP (например, pAzF-R40F20) не имеет решающего значения, поскольку не обязательно маркировать каждую молекулу ELP для простой визуализации везикула с помощью эпифлюоресцентной микроскопии. Таким образом, корреляция эталонной полосы геля SDS и соответствующего взвешенного лиофилизированного образца необходима только один раз для каждой белковой конструкции. Однако, если близко к 100% урожайности маркировки желательно соотношение 1:1 эквиваленты красителя к молекулам ELP достаточно. Очень похожие амфифилические ELPs были проанализированы в нашей лаборатории, чтобы быть полностью помечены на эквимолярное добавление BDP (данные еще не опубликованы).
Для препарата везикулы с использованием метода отекTH, наиболее важными шагами являются отек лиофилизированной амфифилической ELP и последующее стратификации этого решения на вершине водной фазы буфера. Поэтому свежеифилизированный амфифилический ЭЛП должен быть максимально ангиолирующим, что может быть достигнуто путем вентиляции лиофилизатора сухим азотным газом и немедленного закрытия крышек реакционной трубки. При наличии, перегородка герметичность сухой THF должны быть использованы для повышения выходной, но THF p.a. (Зgt;99.5%) без перегородки работает, а также. Стратификация шаг на отек амфифилических ELP в сухом THF должны быть выполнены очень тщательно. Успешное расслоение двух контролируемых температурой решений приводит к четко видимой фазе границы между органической и вавной фазой. Первоначальный шаг стратификации должен проводиться медленно, даже если повышенные температуры приводят к термической индуцированной смешивания этих фаз. Появление мутности раствора обусловлено легким рассеянием образовавшихся пузырьков, волокон или коацерватов. В контрольных образцах не хватает белка, никакой мутности не появляется, хотя небольшие по размеру структуры (до 200 нм) сообщается для THF водная интерфейс25. Шаг стратификации THF является наиболее критическим и неудачным шагом протокола отеков. После инкубационного шага надмолекулярные структуры можно диализировать против буфера или ультрачистой воды. Предпочтительно же водное решение должно быть использовано, который был применен для первоначальной сборки для того, чтобы сохранить осмоляритность и предотвратить отек или сокращение собранных пузырьков. После диализа, пузырьки, волокна и коакерваты, как правило, стабильны, по крайней мере одну неделю. В зависимости от параметров окружающей среды во время сборки часто небольшая доля других надмолекулярных структур, кроме основной структуры, присутствуют при применении метода отеков THF8. Описанный метод THF увеличивает выход везикулсборки на один порядок величины, в то время как экструзия BuOH повышает урожайность на три порядка величины по сравнению с нашим ранее опубликованным методом in vitro5.
Метод экструзии BuOH применяется для получения исключительно стабильных везикулярных структур с высокой воспроизводимостью, обходя волокна и сферические коакерваты. Этот метод менее подвержен ошибкам и совместим с флуоресцентными белками. Поэтому f20R20-mEGFP или F20R20-mCherry могут быть применены, а также BDP-R40F20 или BDP-E20F20. Единственным важным шагом является быстрое смешивание раствора водного белка после добавления 10%-20% v/v BuOH. Концентрация F20R20-mEGFP или F20R20-mCherry должна состочиться в районе 1-15 км. Применяя метод экструзии BuOH, пузырьки могут быть собраны в ультрачистую воду или буфер, содержащий до 5 M NaCl или 4 M мочевины и рН в диапазоне от 5 до 8. Экструдированные PMBCs в 20% v/v BuOH могут храниться не менее 6 месяцев при 4 градусах Цельсия, сохраняя при этом свою везикулярную структуру. Чтобы сузить распределение размера везикулы, они могут быть экструдированы с помощью мини-экструдера через мембрану размером 0,2-1 мкм поры. Это поры экструзии может быть сделано непосредственно после BuOH дополнение к амфифильной ELP или после везикул сборки. Если PMBCs слишком концентрированы для визуализации, собранные пузырьки в BuOH могут быть разбавлены путем быстрого смешивания с использованием водиного буфера, содержащего 10%-20% v/v BuOH.
Основным ограничением метода экструзии BuOH является то, что диализ PMBC против водной буферов часто приводит к плохой выходу везикулы. Кроме того, наличие остаточного BuOH в мембранном пространстве не может быть исключено, так как простые жирные кислоты смогли включить в мембрану PMBC21. Таким образом, мембраны PMBC могут быть в некоторой степени состоят из белка и альканола moieties.
Инкапсуляция химически разнообразных молекул груза лучше всего работает с помощью метода экструзии BuOH. Кроме того, DMSO в качестве растворителя для запаса раствор красителя, который будет захвачен увеличивает эффективность инкапсуляции красителя. Для тонкого груза, который будет инкапсулирован, 5%-10% v/v 1-октанол может быть использован для сборки PMBC и было доказано, чтобы быть лучше совместимы, по сравнению с BuOH, с функциональными инкапсулированных ферментов, таких как ДНК-лигаза или TEV протеазы21,26. Однако, из-за более короткой длины цепи n-бутанола его можно диализировать против водного буфера в отличие от 1-октанола, который не способен проникать в прикладной диализ-мембрану. Другим ограничением метода является то, что прикладные температуры и значения рН, необходимые для контроля желаемого образования надструктуры, могут влиять на активность ферментов. В будущей работе следует установить очистку сродства или исключения размера, чтобы отделить неинкапсулированные и инкапсулированные молекулы без ухудшения целостности везикуловых мембран.
В отличие от методов регидратации пленки16,17 описанных в этом протоколах позволяют сборку пузырьков размеров более 600 нм. Это позволяет контролировать события синтеза в реальном времени с помощью простой эпифлюоресценционной микроскопии и наблюдения разделения мембранной фазы8. По сравнению с температурой, вызванной везикулярной сборкой амфифильных ELP9, описанные здесь протоколы дают PMBC с длительной стабильностью времени до 6 месяцев. Однако главным недостатком является потребность в органическом растворителе для формирования структуры. Несмотря на то, что BuOH полностью сохраняет целостность и функцию флуоресцентных белков27 (данные не показаны), активность инкапсулированных ферментов может быть ограничена остаточным органическим растворителем и должна быть проверена индивидуально. Тем не менее, каталитические реакции с участием ДНК-лигазы, TEV-протеазы и липасы были успешно проведены в светящемся пространстве пузырьков, собранных 1-октанол или BuOH экструзии26,21. Кроме того, даже если диализ THF после сборки очень беспроблемный и везикул целостность сохраняется, удаление BuOH часто приводит к потере целостности везикулы из-за неизвестных причин.
Описанные протоколы позволяют исследователям собирать микрометр и субмикрометровые надмолекулярные структуры с различными физикохимическими свойствами, хорошими свойствами инкапсуляции и долгой стабильностью времени. Эти надмолекулярные структуры могут быть применены для разработки минимальных клеток26 или искусственных исследований клеток21, инкапсуляции ферментов, или формулировки препарата. Представленные функциональные PMBCs являются еще одним перспективным кандидатом на доставку лекарств, так как их строительные блоки не являются иммуногенными28, демонстрируют динамическое поведение синтеза, и позволяют разнообразную инкапсуляцию грузов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих финансовых интересах.
Acknowledgments
Авторы благодарят BMBF за финансовую поддержку и Центр биологического анализа систем (ЗБСА) за предоставление научно-исследовательского центра. Мы благодарны. Г. Шульцу, TSRI, La Jolla, California, США за предоставление плазмида pEVOL-pAzF. Мы благодарим сотрудников Центра визуализации жизни (LIC) в Центре биологического анализа систем (ЗБСА) Альберта-Людвига-Университета Фрайбурга за помощь в их конфокальной микроскопии ресурсов, а также отличную поддержку в записи изображений.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 µm and 0.2 µm Steril Filter | VWR | ||
| 1,4-Dithiothreitol | Merck | ||
| 1-butanol. >99.5% p.a. | Roth | ||
| 2log DNA ladder | NEB | ||
| 2-Mercaptoethanol | Roth | ||
| 50 mL Falcon tubes | VWR | ||
| 79249 Alkyne Mega Stokes dye | Sigma Aldrich | ||
| Acetic acid glacial | VWR | ||
| Acetonitrile, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | ||
| Ampicillin sodium-salt, 99% | Roth | ||
| BDP-FL-PEG4-DBCO | Jena Bioscience | ||
| Biofuge | Heraeus | ||
| Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm) | Thermo Scientific | ||
| Brillant Blue G250 (Coomassie) | Roth | ||
| BspQI | NEB | ||
| Camera DS Qi1 | Nikon | ||
| Centrifuge 5417r | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5810r | Eppendorf | ||
| CF-400-Cu square mesh copper grid | EMS | ||
| Chloramphenicol | Roth | ||
| CompactStar CS 4 | VWR | ||
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral | Life Technologies | ||
| Digital sonifier | Branson | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Applichem | ||
| Dnase I | Applichem | ||
| EarI | NEB | ||
| EcoRI-HF | NEB | ||
| Environmental shaker incubator ES-20 | Biosan | ||
| Ethanol absolute | Roth | ||
| Ethidium bromide solution | Roth | ||
| Filter supports | Avanti | ||
| Glass plates | Bio-Rad | ||
| Glycerol Proteomics Grade | Amresco | ||
| Glycin | Applichem | ||
| H4-Azido-Phe-OH | Bachhem | ||
| Heat plate MR HeiTec | Heidolph | ||
| HindIII | NEB | ||
| HisTrap FF crude column | GE Life Sciences | Nickel column | |
| Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a. | Merck | ||
| Illuminator ix 20 | INTAS | ||
| Illuminator LAS-4000 | Fujifilm | ||
| Imidazole | Merck | ||
| Immersions oil for microscopy | Merck | ||
| Incubators shakers Unimax 1010 | Heidolph | ||
| Inkubator 1000 | Heidolph | ||
| IPTG, >99% | Roth | ||
| Kanamycinsulfate | Roth | ||
| L(+)-Arabinose | Roth | ||
| Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE | Sartorius | ||
| LB-Medium | Roth | ||
| Lyophilizer Alpha 2-4 LSC | Christ | ||
| Lysozyme, 20000 U/mg | Roth | ||
| Microscope CM 100 | Philips | ||
| Microscope Eclipse TS 100 | Nikon | ||
| Microscopy cover glasses (15 x 15 mm) | VWR | ||
| Microscopy slides | VWR | ||
| Microwave | Studio | ||
| Mini-Extruder Set | Avanti Polar Lipids | ||
| NaCl, >99.5%, p.a. | Roth | ||
| Natriumhydroxid pellets | Roth | ||
| Ni-NTA Agarose, PerfectPro | 5 Prime | ||
| Nucleopore Track-Etch Membrane | Avanti | ||
| PH meter 766 calimatic | Knick | ||
| Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF) | Roth | ||
| Polypropylene Columns (1 mL) | Qiagen | ||
| PowerPac basic | BioRad | ||
| Propanol-2-ol | Emplura | ||
| Protein ladder 10-250 kDa | NEB | ||
| Recirculating cooler F12 | Julabo | ||
| Reinforcement rings | Herma | ||
| SacI HF | NEB | ||
| SDS Pellets | Roth | ||
| Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4 | VWR | ||
| Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate | VWR | ||
| T4 DNA Ligase | NEB | ||
| TEMED | Roth | ||
| TexasRed Dextran-Conjugate | MolecularProbes | ||
| Thermomix comfort | Eppendorf | ||
| THF, >99.5% p.a. | Acros | ||
| Triton X 100 | Roth | ||
| Trypton/Pepton from Casein | Roth | ||
| Ultrasonic cleaner | VWR | ||
| Urea p.a. | Roth | ||
| Vacuum pump 2.5 | Vacuubrand | ||
| XbaI | NEB | ||
| XhoI | NEB | ||
| ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V) | Roth |
References
- Elzoghby, A. O., Samy, W. M., Elgindy, N. A. Protein-based nanocarriers as promising drug and gene delivery systems. Journal of Controlled Release. 161 (1), 38-49 (2012).
- Jang, Y., Champion, J. A. Self-Assembled Materials Made from Functional Recombinant Proteins. Accounts of Chemical Research. 49 (10), 2188-2198 (2016).
- Timmermans, S. B. P. E., van Hest, J. C. M. Self-assembled nanoreactors based on peptides and proteins. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 35, 26-35 (2018).
- Dreher, M. R., et al. Temperature Triggered Self-Assembly of Polypeptides into Multivalent Spherical Micelles. Journal of the American Chemical Society. 130 (2), 687-694 (2008).
- Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).
- Matsuurua, K. Rational design of self-assembled proteins and peptides for nano- and micro-sized architectures. RSC Advances. 4 (6), 2942-2953 (2013).
- Rocklin, G. J., et al. Global analysis of protein folding using massively parallel design, synthesis, and testing. Science. 357 (6347), 168-175 (2017).
- Schreiber, A., Stühn, L. G., Huber, M. C., Geissinger, S. E., Rao, A., Schiller, S. M. Self-Assembly Toolbox of Tailored Supramolecular Architectures Based on an Amphiphilic Protein Library. Small. 15 (30), 1900163 (2019).
- Jang, Y., Hsieh, M. -C., Dautel, D., Guo, S., Grover, M. A., Champion, J. A. Understanding the Coacervate-to-Vesicle Transition of Globular Fusion Proteins to Engineer Protein Vesicle Size and Membrane Heterogeneity. Biomacromolecules. 20 (9), 3494-3503 (2019).
- Vargo, K. B., Sood, N., Moeller, T. D., Heiney, P. A., Hammer, D. A. Spherical micelles assembled from variants of recombinant oleosin. Langmuir: the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (38), 11292-11300 (2014).
- Bellomo, E. G., Wyrsta, M. D., Pakstis, L., Pochan, D. J., Deming, T. J. Stimuli-responsive polypeptide vesicles by conformation-specific assembly. Nature Materials. 3 (4), 244-248 (2004).
- Martín, L., Castro, E., Ribeiro, A., Alonso, M., Rodríguez-Cabello, J. C. Temperature-Triggered Self-Assembly of Elastin-Like Block Co-Recombinamers:The Controlled Formation of Micelles and Vesicles in an Aqueous Medium. Biomacromolecules. 13 (2), 293-298 (2012).
- Li, Y., Rodriguez-Cabello, J. C., Aparicio, C. Intrafibrillar Mineralization of Self-Assembled Elastin-Like Recombinamer Fibrils. ACS Applied Materials & Interfaces. , (2017).
- Vargo, K. B., Parthasarathy, R., Hammer, D. A. Self-assembly of tunable protein suprastructures from recombinant oleosin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (29), 11657-11662 (2012).
- Park, W. M., Champion, J. A. Thermally Triggered Self-Assembly of Folded Proteins into Vesicles. Journal of the American Chemical Society. 136 (52), 17906-17909 (2014).
- Vogele, K., et al. Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments. Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).
- Vogele, K., et al. In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth. Journal of Visualized Experiments. (148), e59831 (2019).
- Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2015).
- Urry, D. W., et al. Elastin: a representative ideal protein elastomer. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).
- Huber, M. C., Schreiber, A., Wild, W., Benz, K., Schiller, S. M. Introducing a combinatorial DNA-toolbox platform constituting defined protein-based biohybrid-materials. Biomaterials. 35 (31), 8767-8779 (2014).
- Schreiber, A., Huber, M. C., Schiller, S. M. Prebiotic Protocell Model Based on Dynamic Protein Membranes Accommodating Anabolic Reactions. Langmuir. 35 (29), 9593-9610 (2019).
- Chin, J. W., Santoro, S. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. Addition of p-Azido-l-phenylalanine to the Genetic Code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
- Sonnino, S., Prinetti, A. Membrane domains and the "lipid raft" concept. Current Medicinal Chemistry. 20 (1), 4-21 (2013).
- Bräse, S., Gil, C., Knepper, K., Zimmermann, V. Organische Azide - explodierende Vielfalt bei einer einzigartigen Substanzklasse. Angewandte Chemie. 117 (33), 5320-5374 (2005).
- Li, Z., et al. Large-Scale Structures in Tetrahydrofuran–Water Mixture with a Trace Amount of Antioxidant Butylhydroxytoluene (BHT). The Journal of Physical Chemistry B. 115 (24), 7887-7895 (2011).
- Huber, M. C., Schreiber, A., Schiller, S. M. Minimalist Protocell Design: A Molecular System Based Solely on Proteins that Form Dynamic Vesicular Membranes Embedding Enzymatic Functions. ChemBioChem. 20 (20), 2618-2632 (2019).
- Raghunathan, G., et al. A comparative study on the stability and structure of two different green fluorescent proteins in organic co-solvent systems. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 18 (2), 342-349 (2013).
- Sallach, R. E., et al. Long-term biostability of self-assembling protein polymers in the absence of covalent crosslinking. Biomaterials. 31 (4), 779-791 (2010).
