Summary
Her beskriver vi en protokol for levende celle billeddannelse af kortikale mikrotubule cytoskeleton på skyde apical meristem og overvåge dens reaktion på ændringer i fysiske kræfter.
Abstract
Forståelse celle-og vævsniveau regulering af vækst og morfogenese har været på forkant med biologisk forskning i mange årtier. Fremskridt inden for molekylær- og billeddannelsesteknologier gav os mulighed for at få indsigt i, hvordan biokemiske signaler påvirker morfogenetiske hændelser. Men det er mere og mere tydeligt, at bortset fra biokemiske signaler, mekaniske signaler også påvirke flere aspekter af celle og væv vækst. Den Arabidopsis skyde apisk meristem (SAM) er en kuppel-formet struktur ansvarlig for generation af alle overjordiske organer. Organiseringen af det kortikale mikrotubule cytoskeletton, der formidler apoplastisk celluloseaflejring i planteceller, er rumligt adskilt. Visualisering og kvantitativ vurdering af mønstre af kortikale mikrotubuli er nødvendige for at forstå den biofysiske karakter af celler på SAM, som cellulose er den stiveste komponent i plantecellevæggen. Den stereotype form for kortikal mikrotubule organisation er også en konsekvens af væv-dækkende fysiske kræfter, der findes på SAM. Forstyrrelsen af disse fysiske kræfter og efterfølgende overvågning af kortikale mikrotubule organisation giver mulighed for identifikation af kandidat proteiner involveret i mægle mechano-perception og transduktion. Her beskriver vi en protokol, der hjælper med at undersøge sådanne processer.
Introduction
Planteceller er omgivet af en ekstracellulær matrix af polysaccharider og glycoproteiner, der mekanisk ligner et fiberforstærket kompositmateriale, der dynamisk kan ændre dets mekaniske egenskaber1. Vækst i planteceller er drevet af optagelsen af vand i cellen, hvilket resulterer i en samtidig ophobning af trækkræfter på cellevæggen. Som reaktion på sådanne kræfter giver ændringer af cellevæggens fysiske tilstand mulighed for celleudvidelse. Celler med primære vægge er i stand til at gennemgå hurtig vækst i forhold til sekundære cellevæg, der indeholder celler, hovedsagelig på grund af forskelle i den kemiske sammensætning af polysacchariderne inden for. Primære vægceller er sammensat af cellulose, hemicellulose, og pektin ud over glycoproteiner, og mangler lignin, en komponent, der er til stede i den sekundære cellevæg2. Cellulose, en glukose polymer forbundet via β-1,4 obligationer, er den vigtigste del af cellevæggene. Det er organiseret i fibrillar strukturer, der er i stand til at modstå høje trækkræfter oplevet under cellevækst3. Ud over at modstå trækkræfter resulterer mekanisk forstærkning langs en præferenceretning i turgor-drevet ekspansion langs en aks vinkelret på netretningen af cellulosemikrofibril. Organiseringen af cellulose mikrofibrils er påvirket af kortikale mikrotubule cytoskelet, da de guider retningsbestemt bevægelse af cellulose-syntetiserende komplekser placeret på plasmamembranen4. Derfor, overvågning kortikale mikrotubule organisation ved hjælp af en microtubule-associeret protein eller tubulin fusioneret med en fluorescerende molekyle tjener som en proxy for observation af overliggende mønstre af cellulose i planteceller.
Mønstret af det kortikale mikrotubule cytoskeleti er under kontrol af celle- og vævsmorfologi afledte mekaniske kræfter. Kortikal mikrotubule organisation ikke har nogen præferenceorganisation over tid i celler placeret på toppen af SAM, mens celler i periferien og grænsen mellem SAM og det nye organ har en stabil, velorganiseret supracellular vifte af kortikale mikrotubuli5. Flere tilgange er blevet udviklet til fysisk forstyrre den mekaniske status af cellerne. Ændringer i osmotisk status samt behandling med farmakologiske og enzymatiske forbindelser, der påvirker cellevæggens stivhed, kan resultere i efterfølgende ændringer i trækkræfterne, som celle6,7oplever. Brugen af tingester, der giver mulighed for den gradvise stigning i trykkræfter opleves af væv er et andet alternativ8. Anvendelse af centrifugalkræfter har også vist sig at påvirke de mekaniske kræfter uden fysisk kontakt med cellerne9. Men de mest udbredte midler til at ændre retningsbestemte kræfter i en gruppe af celler drage fordel af det faktum, at alle epidermale celler er under spænding og fysisk ablation af celler vil fjerne turgor pres lokalt samt forstyrre celle-til-celle vedhæftning, og dermed ændre trækkræfter opleves af de omkringliggende celler. Dette udføres enten ved at målrette en høj-drevne pulserende ultraviolet laser eller ved hjælp af en fin nål.
Her uddyber vi processen med billeddannelse og vurdering af kortikal mikrotubule adfærd for mekanisk perturbation på SAM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plantevækst
- So Arabidopsis frø udtrykker mikrotubule bindende domæne fusioneret med grønne fluorescerende protein (MBD-GFP)10 på jorden og holde i lang dag (16 h dag / 8 h nat), 20 °C/6 °C betingelser for 1 uge for spiring.
- Efter spiring overføres planter til nye potter med tilstrækkelig vækstplads til at muliggøre robust vegetativ vækst. Hold planter på kort dag (8 timer dag /16 h nat), 20 °C/16 °C betingelser for 3-5 uger.
- Overfør planter til lang dag (16 timer dag /8 h nat), 20 °C/16 °C betingelser og holde indtil planter bolt (2-3 uger). Lad blomsterstanden vokse op til 2-5 cm lang.
2. Medium forberedelse
- Forbered dissekere retter ved at fylde små petriskåle (ca. 5,5 cm bred, 1,5 cm dyb) til ca. halvdelen af deres dybde med 2% opstod. Dissekerende retter kunne også bruges til enkelt tidspunkt punkt billeddannelse.
- Forbered vækstmediet.
- Der klargøres 50 ml 1.000x vitaminlageropløsning med 5 g myo-inositol, 0,05 g nikotinsyre, 0,05 g pyridoxinhydrorid, 0,5 g thiaminhydrorid og 0,1 g glycin.
- Forbered vækstmediet, der består af 1/2 Murashige og Skoog medium, 1% saccharose, 1,6% agar, 1x vitaminer, pH = 5,8. Autoklave og lad det køle af.
- På en steril, ren bænk steriliseres hængslede plastkasser (ca. 5,2 cm x 5,2 cm x 3 cm) ved nedsænkning i 70% ethanol i 15 min.
- På en steril, ren bænk, når mediet er på tålelig varme, tilsættes N6-benzyladenin til en endelig koncentration på 200 nM og 1/1.000 PPM (plantekonserveringsmiddelblanding) og bland godt. Fyld de sterile kasser til ca. halvdelen af deres dybde med mediet.
3. Dissektion af SAM
- Skær blomsterstanden og fjern de ældre blomsterknopper med skarpe snævlad ved at skrælle blomsterne i bunden af stilke, indtil det er svært at se dem med det blotte øje.
- Opret en slids i agarose i dissekere skålen med scet og plante blomsterstand base i den tykke agar. Dette giver god solid støtte til yderligere fin dissektion af yngre blomster til at afsløre SAM.
- Fjern de resterende blomsterknopper ved at skubbe dem ned med tangen, der starter med den ældste og sekventielt skrider til de yngre stadier under et dissekerende mikroskop, indtil SAM er synlig. SAM er normalt udsat, når ældre blomster op til fase 6 til 7 er fjernet. Når SAM er udsat, undgå dehydrering af prøven ved at flytte hurtigt til næste trin.
4. Overførsel og vækst af dyrkede SAM'er
- Plant den nydeknerede prøve som beskrevet i afsnit 1 i vækstmediet i den rektangulære plasthængslede kulturkasse med SAM lige eksponeret over mediumoverfladen. Tilsæt et par dråber sterilt deioniseret vand til kanterne af kulturkasserne og luk låget for at opretholde luftfugtigheden inde i kassen. Sørg for, at det tilsat vand ikke dækker SAM.
- Luk låget og pak æsken med mikroportape. Vækstboksen skal være i lange dage eller sammenhængende dagsforhold ved 22 °C og vokse i 12-24 timer, så SAM kan komme sig efter dissektionsproceduren og tilpasse sig dyringsbetingelserne.
5. Billeddannelse af SAM
- Fyld kulturboksen, der indeholder SAM med sterilt deioniseret vand, for at dække prøven. Kontroller under dissekerende mikroskop og fjern eventuelle luftbobler ved kraftigt at sprøjte vand rettet mod prøven med en 1 ml pipette.
- Placer kulturboksen på en opretstående konfokal mikroskopfase. Pas på, at kulturboksen ikke kommer i kontakt med mikroskopmålene. Brug en lang afstand 40x eller 60x vand dypning linse af numerisk blænde 0,8-1, der er optimal til billedbehandling uden et dækglas.
- Sænk målet i vandet og tjek for luftbobler dannet på målets forreste linse. Fjern eventuelle bobler ved at sænke scenen og forsigtigt tørre linsen med et optisk væv og tilføje en lille mængde vand til den forreste linse af målet med en Pasteur pipette før nedsænkning i vandet.
- Juster XY-controlleren ved hjælp af GFP-filteret og epibelysningsmodulet i konfokale mikroskop for at finde prøven. Justering af placeringen af okularer, sætte SAM direkte under lyskilden og fokusere langs Z aksen, indtil spidsen er placeret.
BEMÆRK: Kig ikke direkte på det ultraviolette lys. - Når prøven er fundet, belyses den ved hjælp af en laser, der kan være spændende GFP (dvs. en 488 nm eller 496 nm laserkilde). Juster mikroskopets optiske zoom, så hele SAM og fase 1 blomsterne er inden for synsfeltet. Yderligere justere styrken af laser output og få indstillinger for at sikre optimal signal-støj forhold.
BEMÆRK: Laserens høje intensitet vil resultere i fotoblegning af prøven. Under- og overeksponeringspaletten er med til at sikre en bedre justering af disse indstillinger. - Lad prøven falde til ro i 2-5 min. Der udtages konfokale Z-stakke af prøven med 0,25 μm-0,5 μm Z-skiveintervaller med en opløsning på ca. 0,3 μm pixelstørrelse. Sørg for, at den samlede billedbehandlingstid, der kræves for at erhverve Z-stakke for en prøve, ikke overstiger 10 min fra det tidspunkt, hvor prøven nedsænkes i vand, indtil erhvervelsen er afsluttet.
- Fjern straks vandet og overfør kulturboksen tilbage til vækstkammeret. Hvis prøverne opbevares i lang tid under vand, vil det påvirke cellernes osmotiske tilstand.
6. Mikromekanisk miksering af SAM
- Konfigurer billeddannelsesbetingelserne som beskrevet i afsnit 5, og hent forablationsbilledstakke i den kortikale mikrotubuleorganisation.
- Dekanter vandet i kulturskålen. Ablationen udføres med en ren sprøjtenål (0,4 mm x 20 mm).
- Ved hjælp af et dissekerende mikroskop skal du holde nålen forsigtigt og langsomt nærme dig SAM.
BEMÆRK: Åndegreb og håndtering af nålen med et afslappet greb hjælper med at undgå at ryste. - Kontakt kortvarigt SAM-kuplen med nålespidsen for at bekræfte, at ablationen er udført. Helst udføre ablation i periferien af SAM, som giver mulighed for visualisering af adfærd og overgang af uorganiserede kortikale mikrotubuli i den centrale region af kuplen.
- Ved hjælp af et dissekerende mikroskop skal du holde nålen forsigtigt og langsomt nærme dig SAM.
- Udfyld kulturskålen med sterilt deioniseret vand og tilsæt propidiumidodid (10 μg/ml). Ud over at overvåge GFP kortikale mikrotubule signal, visualisere propidium iodid ved hjælp af en separat kanal kan tydeligt markere regioner af ablated celler. Propidium iodid lyser ved hjælp af 561 nm eller enhver anden egnet laser med emission registreret mellem 600-650 nm.
- Anskaf billedstakke lige efter ablation (se afsnit 6), og gentag anskaffelsesprocessen hver 2 timer i en periode på 6 timer. Hæld kulturskålen tilbage sammen med prøven i inkubationskammeret efter hvert tidspunkt. Sørg for, at der er noget vand tilbage på kulturmediet og pak kulturskålen med mikroportape for at forhindre udsivning.
7. Datavisualisering og kvantificering
- Generer overfladeprojektioner ved hjælp af frit tilgængelig software som MORPHOGRAPHX11, FIJI12eller macro SurfCut13.
- Udfør udvinding af kortikale mikrotubule anisotropi ved hjælp af FibrilTool14 makro i FIJI.
BEMÆRK: Detaljerede protokoller for software brug kan fås ved henvendelser fra de respektive citater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser typiske projektionsbilleder fra MBD-GFP-linjer med celler i midten af kuplen, der indeholder uorganiserede kortikale mikrotubuli, og celler i periferien med en omkredsfordeling (Figur 1A,B), mens grænsedomænecellerne indeholder kortikale mikrotubuli, der er justeret parallelt med cellens lange akse. Disse observationer viser forskelle i den rumlige fordeling af kortikale mikrotubuli i sam'ens forskellige områder. Time lapse imaging viste kortikal mikrotubule tilpasning skifter fra en meget uorganiseret array til en mere organiseret array inden for 6 timer af ablation(Figur 1C, D). De tensors genereret ved hjælp af FibrilTool kunne overlejres på kortikale mikrotubule billede. En længere tensor repræsenterede en højere grad af anisotropi. Tensorerne viste også den vigtigste akse for tilpasning af de kortikale mikrotubuli. De udtrukne oplysninger kan repræsenteres ved at pottepot med tiden (figur 1E)15. En prøvestørrelse på fire til fem anbefales pr. behandling eller genotype, der skal testes. Resultaterne viste en gradvis stigning i kortikale mikrotubule anisotropi inden for en periode på 6 h og tillod os at konkludere, at graduering til mekanik af SAM resulterer i samtidige ændringer i kortikale mikrotubule organisation.
Figur 1: Eksempel resultat af kortikale mikrotubule anisotropi kvantificering og mekanisk ablation i Arabidopsis SAM. (A) Overfladeprojektion af 35S: MBD-GFP SAM Z stakke. (B) Nematic tensorer i rødt viser kortikale mikrotubule anisotropi af manuelt segmenterede celler i det centrale og grænse domæne. (C,D). Overfladeprojektioner af kortikale mikrotubule tidsforfaldsdata fra et ablationseksperiment. d) Forstørrede billeder fra (C) med kortikal mikrotubulejustering nær ablationsstedet (rød stjerne) overlejret med nematiske tensoroplysninger om de enkelte celler. (E) Kortikande mikrotubule anisotropi ændret efter ablation fra 0-6 h, kvantificeret fra det nematiske tieremærket område i C, hvor cirklen repræsenterer gennemsnitsværdien og stængerne med et konfidensinterval på 95 %. Skalabarer = 25 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vurderingen af mekaniske signaltransduktionshændelser er afgørende for at identificere molekylære regulatorer, der er involveret i mechano-perception og transduktionsveje. Den protokol, der er beskrevet her, giver et kvantitativt billede af sådanne hændelser ved at bruge det kortikale mikrotubulerespons som en udlæsning for en sådan proces i Arabidopsis SAM'er. Den her beskrevne fremgangsmåde anvendes rutinemæssigt i flere undersøgelser i forskellige vævstyper16,17,18,19. En betydelig stigning i mikrotubule anisotropi er observeret i intervallet 4 h i alle vævstyper.
Det mest kritiske trin i protokollen er at sikre, at ændringer i mikrotubuli ikke sker på grund af langvarig nedsænkning i vand, fordi vand i sig selv resulterer i en stigning i cellernes turgortryk. Derfor bør billedbehandlingstiden minimeres. Dette kan kompromittere billedopløsningen, men det giver en mere præcis udlæsning af forstyrrelsesresultaterne. Det næstmest afgørende skridt er omhyggelig dissektion af SAM. På grund af sin meget lille størrelse, er det meget sandsynligt, at blive beskadiget under proceduren. Organerne bliver vanskeligere at fjerne, hvis stilke af ældre organer ikke er helt fjernet. Endelig bør prøven under dissektionen ikke tørre ud på grund af langvarig lufteksponering af SAM. Dette er især almindeligt, når der håndteres mutante SAM'er, der er svære at få adgang til, eller som er mindre end 50 μm i diameter. Hyppig anvendelse af vanddråber på SAM mellem dissektionstrinne forhindrer dette problem.
En begrænsning af denne procedure er, at der ikke er nogen reel kontrol over det ablated område. Dette er et problem i sammenligning af ændringer, der forekommer under forskellige forhold og genotyper. Det er derfor nødvendigt at anvende kontrol-SAM'er, der er blevet forstyrret på samme måde, til sammenligning. Et andet alternativ er at udføre en mere kontrolleret ablation ved hjælp af en pulserende ultraviolet laser20. Desuden, mens ablation er almindeligt kendt for at skabe ændringer i mekaniske egenskaber, er det også forbundet til en vis grad med sår-induceret svar. Derfor skal der udføres andre fremgangsmåder, såsom mekanisk kompression og turgor-inducerede kræmteringer, for at bekræfteobservationerne 6,9.
En væsentlig fordel ved denne metode i forhold til andre måder at manipulere mekaniske kræfter er, at det bruger meget grundlæggende værktøjer endnu giver en robust udlæsning af microtubule respons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FibrilTool | Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014 | ||
| FIJI | Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012 | ||
| glycine | Merck | 1.04201.1000 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | DM6000 CS | |
| MAP4-GFP | Marc, J. et al., Plant Cell 1998 | ||
| micropore tape | Leukopor | 02482-00 | |
| MorphographX | Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019 | ||
| myo-inositol | Sigma | I5125 | |
| N6-benzyladenine | Sigma | B3408 | |
| nicotinic acid | Sigma | N4126 | |
| plastic hinged box | Electron microscopy sciences | 64312 | |
| PPM (Plant Preservative Mixture) | Plant Cell Technology | PPM | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| pyridoxine hydrochloride | Sigma | P9755 | |
| SURFCUT | Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019 | ||
| thiamine hydrochloride | Sigma | T4625 |
References
- Cosgrove, D. J. Re-constructing our models of cellulose and primary cell wall assembly. Current Opinion in Plant Biology. 22, 122-131 (2014).
- McFarlane, H. E., Doring, A., Persson, S. The cell biology of cellulose synthesis. Annual Reviews in Plant Biology. 65, 69-94 (2014).
- Burgert, I. Exploring the micromechanical design of plant cell walls. American Journal of Botany. 93 (10), 1391-1401 (2006).
- Paredez, A. R., Somerville, C. R., Ehrhardt, D. W. Visualization of cellulose synthase demonstrates functional association with microtubules. Science. 312 (5779), 1491-1495 (2006).
- Barbier de Reuille, P., et al. MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D. Elife. 4, 05864 (2015).
- Kierzkowski, D., et al. Elastic domains regulate growth and organogenesis in the plant shoot apical meristem. Science. 335 (6072), 1096-1099 (2012).
- Heisler, M. G., et al. Alignment between PIN1 polarity and microtubule orientation in the shoot apical meristem reveals a tight coupling between morphogenesis and auxin transport. PLoS Biology. 8 (10), e1000516 (2010).
- Louveaux, M., Rochette, S., Beauzamy, L., Boudaoud, A., Hamant, O. The impact of mechanical compression on cortical microtubules in Arabidopsis: a quantitative pipeline. Plant Journal. 88 (2), 328-342 (2016).
- Nakayama, N., et al. Mechanical regulation of auxin-mediated growth. Current Biology. 22 (16), 1468-1476 (2012).
- Marc, J., et al. A GFP-MAP4 reporter gene for visualizing cortical microtubule rearrangements in living epidermal cells. Plant Cell. 10 (11), 1927-1940 (1998).
- Strauss, S., Sapala, A., Kierzkowski, D., Smith, R. S. Quantifying Plant Growth and Cell Proliferation with MorphoGraphX. Methods in Molecular Biology. 1992, 269-290 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Erguvan, O., Louveaux, M., Hamant, O., Verger, S. ImageJ SurfCut: a user-friendly pipeline for high-throughput extraction of cell contours from 3D image stacks. BMC Biology. 17 (1), 38 (2019).
- Boudaoud, A., et al. FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nature Protocols. 9 (2), 457-463 (2014).
- Sampathkumar, A., et al. Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth. Development. 146 (10), (2019).
- Hervieux, N., et al. A Mechanical Feedback Restricts Sepal Growth and Shape in Arabidopsis. Current Biology. 6 (8), P1019-P1028 (2016).
- Sampathkumar, A., et al. Subcellular and supracellular mechanical stress prescribes cytoskeleton behavior in Arabidopsis cotyledon pavement cells. Elife. 3, e01967 (2014).
- Sampathkumar, A., et al. Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth. Development. 146 (10), dev179036 (2019).
- Uyttewaal, M., et al. Mechanical stress acts via katanin to amplify differences in growth rate between adjacent cells in Arabidopsis. Cell. 149 (2), 439-451 (2012).
- Hamant, O., et al. Developmental patterning by mechanical signals in Arabidopsis. Science. 322 (5908), 1650-1655 (2008).
