Summary
Qui descriviamo un protocollo per l'imaging a cellule vive del citoscheletro microtubulo corticale al meristem apicale shoot e monitoriamo la sua risposta ai cambiamenti nelle forze fisiche.
Abstract
Comprendere la regolazione a livello cellulare e tissutale della crescita e della morfogenesi è stato in prima linea nella ricerca biologica per molti decenni. I progressi nelle tecnologie molecolari e di imaging ci hanno permesso di ottenere informazioni su come i segnali biochimici influenzano gli eventi morfogenetici. Tuttavia, è sempre più evidente che oltre ai segnali biochimici, gli spunti meccanici hanno anche un impatto su diversi aspetti della crescita cellulare e tissutale. Il meristem apicale a scatto arabidopsis (SAM) è una struttura a forma di cupola responsabile della generazione di tutti gli organi fuori terra. L'organizzazione del citoscheletro microtubulo corticale che media la deposizione di cellulosa apoplastica nelle cellule vegetali è spazialmente distinta. La visualizzazione e la valutazione quantitativa dei modelli di microtubuli corticali sono necessarie per comprendere la natura biofisica delle cellule nel MAS, poiché la cellulosa è il componente più rigido della parete cellulare della pianta. La forma stereotipata dell'organizzazione dei microtubuli corticali è anche una conseguenza delle forze fisiche a livello tissutale esistenti al SAM. La perturbazione di queste forze fisiche e il successivo monitoraggio dell'organizzazione dei microtubuli corticali consentono l'identificazione delle proteine candidate coinvolte nella mediazione della meccano-percezione e della trasduzione. Qui descriviamo un protocollo che aiuta a indagare tali processi.
Introduction
Le cellule vegetali sono circondate da una matrice extracellulare di polisaccaridi e glicoproteine che assomiglia meccanicamente a un materiale composito rinforzato con fibre in grado di cambiare dinamicamente le sue proprietàmeccaniche 1. La crescita delle cellule vegetali è guidata dall'assorbimento di acqua nella cellula, che si traduce in un accumulo concomitante di forze di trazione sulla parete cellulare. In risposta a tali forze, le modifiche allo stato fisico della parete cellulare consentono l'espansione cellulare. Le cellule con pareti primarie sono in grado di subire una rapida crescita rispetto alla parete cellulare secondaria contenente cellule principalmente a causa delle differenze nella composizione chimica dei polisaccaridi all'interno. Le cellule primarie della parete sono composte da cellulosa, emicellulosa e pectina oltre alle glicoproteine e mancano di lignina, un componente presente nella parete cellulare secondaria2. La cellulosa, un polimero del glucosio collegato tramite β-1,4 legami, è il componente principale delle pareti cellulari. È organizzato in strutture fibrillari in grado di resistere ad alte forze di trazione sperimentate durante la crescita cellulare3. Oltre a resistere alle forze di trazione, il rinforzo meccanico lungo una direzione preferenziale si traduce in un'espansione guidata dal turgore lungo un asse perpendicolare all'orientamento netto della microfibrillazione di cellulosa. L'organizzazione delle microfibriche di cellulosa è influenzata dal citoscheletro microtubulo corticale, in quanto guidano il movimento direzionale dei complessi sintetizzati alla cellulosa situati nella membranaplasmatica 4. Pertanto, il monitoraggio dell'organizzazione dei microtubuli corticali utilizzando una proteina associata a microtubuli o una tubulina fusa con una molecola fluorescente serve come proxy per l'osservazione di modelli sovrascritti di cellulosa nelle cellule vegetali.
La modelliatura del citoscheletro microtubulo corticale è sotto il controllo delle forze meccaniche derivate dalla morfologia cellulare e tissutale. L'organizzazione corticale dei microtubuli non ha alcuna organizzazione preferenziale nel tempo nelle cellule situate all'apice del MAS, mentre le cellule della periferia e il confine tra il SAM e l'organo emergente hanno una gamma supracellulare stabile e altamente organizzata di microtubuli corticali5. Sono stati sviluppati diversi approcci per perturbo fisicamente lo stato meccanico delle cellule. Modifiche allo stato osmotico, così come il trattamento con composti farmacologici ed enzimatici che influenzano la rigidità della parete cellulare possono comportare successivi cambiamenti nelle forze di trazione sperimentate dalla cellula6,7. L'uso di aggeggi che consentono il graduale aumento delle forze di compressione sperimentate dai tessuti è un'altraalternativa 8. L'applicazione di forze centrifughe ha anche dimostrato di influenzare le forze meccaniche senza alcun contatto fisico con le cellule9. Tuttavia, i mezzi più utilizzati per cambiare le forze direzionali in un gruppo di cellule sfruttano il fatto che tutte le cellule epidermiche sono sotto tensione e l'ablazione fisica delle cellule eliminerà la pressione del turgore localmente e interromperà l'adesione da cellula a cellula, modificando così le forze di trazione sperimentate dalle cellule vicine. Questo viene eseguito prendendo di mira un laser ultravioletto pulsato ad alta potenza o per mezzo di un ago fine.
Qui elaboriamo il processo di imaging e valutazione del comportamento corticale dei microtubuli per la perturbazione meccanica al SAM.
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Protocol
1. Crescita delle piante
- Seminare semi arabidopsis che esprimono il dominio legante del microtubulo fuso con proteine fluorescenti verdi (MBD-GFP)10 sul terreno e conservare in una lunga giornata (16 ore al giorno / 8 h notte), 20 ° C / 6 ° C condizioni per 1 settimana per la germinazione.
- Dopo la germinazione, trasferire le piantine in nuovi vasi con spazio di crescita sufficiente per consentire una robusta crescita vegetativa. Conservare le piante in breve giorno (8 ore al giorno /16 ore notturne), 20 °C/16 °C per 3-5 settimane.
- Trasferire gli impianti in una lunga giornata (16 ore al giorno /8 ore di notte), 20 °C/16 °C e conservare fino a quando le piante non si imbullonono (2-3 settimane). Lasciare crescere l'infiorescenza fino a 2-5 cm di lunghezza.
2. Preparazione media
- Preparare le sezionazioni riempiendo piccole piastre di Petri (larghe circa 5,5 cm, profonde 1,5 cm) a circa la metà della loro profondità con il 2% di agarosio. I piatti di sezionazione potrebbero anche essere utilizzati per l'imaging a punto singolo.
- Preparare il mezzo di crescita.
- Preparare 50 mL di una soluzione di stock vitaminico 1.000x con 5 g di mio-inositolo, 0,05 g di acido nicotinico, 0,05 g di cloridrato di piridossina, 0,5 g di cloridrato di tiammina e 0,1 g di glicina.
- Preparare il mezzo di crescita, composto da 1/2 Murashige e Skoog medium, 1% saccarosio, 1,6% agar, 1x vitamine, pH = 5,8. Autoclave e lasciare raffreddare.
- Su una panca sterile e pulita, sterilizzare scatole di plastica incernierate (circa 5,2 cm x 5,2 cm x 3 cm) immergendosi nel 70% di etanolo per 15 minuti.
- Su una panca sterile e pulita, una volta che il mezzo è al calore sopportabile, aggiungere N6-benziladenina a una concentrazione finale di 200 nM e 1/1.000 PPM (miscela conservante vegetale) e mescolare bene. Riempire le scatole sterili a circa la metà della loro profondità con il mezzo.
3. Dissezione del MAS
- Tagliare l'infiorescenza e rimuovere i boccioli di fiori più vecchi con pinze affilate sbucciando i fiori alla base dei peduncoli fino a quando non è difficile vederli ad occhio nudo.
- Creare una fessura nell'agarosio nel piatto di sezionamento con le forcep e piantare la base di infiorescenza nell'agar spesso. Questo dà un buon supporto solido per un'ulteriore dissezione fine dei fiori più giovani per esporre il MAS.
- Rimuovere i boccioli di fiori rimanenti spingendoli verso il basso con le forcep a partire dal più antico e avanzando sequenzialmente verso gli stadi più giovani sotto un microscopio sezionante fino a quando il MAS non è visibile. Il MAS è solitamente esposto quando i fiori più vecchi fino allo stadio da 6 a 7 vengono rimossi. Una volta esposto il MAS, evitare la disidratazione del campione spostandosi rapidamente al passaggio successivo.
4. Trasferimento e crescita di MAS coltivate
- Piantare il campione appena sezionato come descritto nella sezione 1 nel mezzo di crescita nella scatola rettangolare di coltura incernierata in plastica con il SAM appena esposto sopra la superficie media. Aggiungere alcune gocce di acqua deionizzata sterile ai bordi delle scatole di coltura e chiudere il coperchio per mantenere l'umidità all'interno della scatola. Assicurarsi che l'acqua aggiunta non copra il MAS.
- Chiudere il coperchio e avvolgere la scatola con nastro micropore. Posizionare la scatola di crescita in condizioni di lunga giornata o di giornata continua a 22 °C e crescere per 12-24 ore per consentire al SAM di riprendersi dalla procedura di dissezione e adattarsi alle condizioni di coltura.
5. Imaging del MAS
- Riempire la scatola di coltura contenente il MAS con acqua deionizzata sterile per coprire il campione. Controllare al microscopio di sezionazione e rimuovere eventuali bolle d'aria spruzzando forzatamente acqua diretta al campione con una pipetta da 1 mL.
- Posizionare la scatola delle impostazioni cultura su uno stadio di microscopio confocale verticale. Fare attenzione che la scatola delle impostazioni cultura non contatti gli obiettivi del microscopio. Utilizzare una lente di immersione dell'acqua a lunga distanza 40x o 60x di apertura numerica 0,8-1 ottimale per l'imaging senza vetro di copertura.
- Abbassare l'obiettivo nell'acqua e verificare la presenza di bolle d'aria formate sull'obiettivo anteriore dell'obiettivo. Rimuovere eventuali bolle abbassando lo stadio e pulendo delicatamente l'obiettivo con un tessuto ottico e aggiungendo una piccola quantità di acqua alla lente anteriore dell'obiettivo con una pipetta Pasteur prima della reimmersione nell'acqua.
- Utilizzando il filtro GFP e il modulo di epi-illuminazione del microscopio confocale, regolare il controller XY per localizzare il campione. Regolando la posizione dell'oculare, mettere il MAS direttamente sotto la sorgente luminosa e mettere a fuoco lungo l'asse Z fino a quando l'apice non si trova.
NOTA: Non guardare direttamente la luce ultravioletta. - Una volta trovato il campione, illuminarlo utilizzando un laser in grado di eccitanti GFP (cioè una sorgente laser a 488 nm o 496 nm). Regolare lo zoom ottico del microscopio in modo che l'intero SAM e il primordia floreale di fase 1 siano nel campo visivo. Regolare ulteriormente la potenza delle impostazioni di uscita e guadagno del laser per garantire un rapporto segnale-rumore ottimale.
NOTA: L'alta intensità del laser comporterà lo sbiancamento fotografico del campione. La tavolozza sottoesposizione e sovraesposizione contribuisce a garantire una migliore regolazione di queste impostazioni. - Lasciare depositare il campione per 2-5 minuti. Acquisire pile Z confocali del campione a intervalli di fette 0,25 μm-0,5 μm Z con una risoluzione di circa 0,3 μm di dimensione in pixel. Assicurarsi che il tempo totale di imaging richiesto per l'acquisizione di pile Z per un campione non superi i 10 minuti dal momento in cui il campione viene immerso in acqua fino al completamento dell'acquisizione.
- Rimuovere immediatamente l'acqua e trasferire la scatola di coltura nella camera di crescita. Mantenere i campioni a lungo sott'acqua influenzerà lo stato osmotico delle cellule.
6. Perturbazione micromeccanica del MAS
- Impostare le condizioni di imaging come descritto nella sezione 5 e acquisire pile di immagini di preablazione dell'organizzazione dei microtubuli corticali.
- Decantare l'acqua nel piatto della cultura. Eseguire l'ablazione con un ago pulito per siringhe (0,4 mm x 20 mm).
- Utilizzando un microscopio sezionato, tenere attentamente l'ago e avvicinarsi lentamente al MAS.
NOTA: Trattenere il respiro e maneggiare l'ago con una presa rilassata aiuta a evitare di tremare. - Contattare brevemente la cupola sam con la punta dell'ago per confermare che l'ablazione è fatta. Preferibilmente eseguire l'ablazione alla periferia del MAS, che consente la visualizzazione del comportamento e la transizione di microtubuli corticali non organizzati nella regione centrale della cupola.
- Utilizzando un microscopio sezionato, tenere attentamente l'ago e avvicinarsi lentamente al MAS.
- Riempire il piatto di coltura con acqua deionizzata sterile e aggiungere propidio idoduro (10 μg/ mL). Oltre a monitorare il segnale microtubulo corticale GFP, visualizzare lo ioduro di propidio usando un canale separato può segnare chiaramente le regioni di cellule ablate. Lo ioduro di propidio viene illuminato utilizzando il 561 nm o qualsiasi altro laser adatto con emissione registrata tra 600-650 nm.
- Acquisire pile di immagini subito dopo l'ablazione (vedere la sezione 6) e ripetere il processo di acquisizione ogni 2 ore per un periodo di 6 ore. Riportare il piatto di coltura insieme al campione nella camera di incubazione dopo ogni punto di tempo. Assicurarsi che sul supporto di coltura sia rimasta dell'acqua e avvolgere il piatto di coltura con nastro micropore per evitare l'essiccazione.
7. Visualizzazione e quantificazione dei dati
- Generare proiezioni di superficie utilizzando software liberamente disponibile come MORPHOGRAPHX11, FIJI12o macro SurfCut13.
- Eseguire l'estrazione di anisotropia microtubuli corticale utilizzando FibrilTool14 macro in FIJI.
NOTA: I protocolli dettagliati per l'uso del software possono essere ottenuti dalle rispettive citazioni.
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Representative Results
La figura 1 mostra le immagini di proiezione tipiche ottenute dalle linee MBD-GFP con celle al centro della cupola contenenti microtubuli corticali disorganizzati e celle alla periferia con distribuzione circonferenziale (Figura 1A,B), mentre le celle del dominio limite contengono microtubuli corticali allineati parallelamente all'asse lungo della cellula. Queste osservazioni mostrano differenze nella distribuzione spaziale dei microtubuli corticali nei diversi domini del MAS. L'imaging time lapse ha mostrato che l'allineamento corticale dei microtubuli è cambiato da un array altamente disordinato a un array più organizzato entro 6 h dall'ablazione (Figura 1C,D). I tensori generati utilizzando FibrilTool potrebbero essere sovrapposti all'immagine del microtubulo corticale. Un tensore più lungo rappresentava un più alto grado di anisotropia. I tensori mostravano anche il principale asse di allineamento dei microtubuli corticali. Le informazioni estratte possono essere rappresentate invadendo l'anisotropia media nel tempo (Figura 1E)15. Si raccomanda una dimensione del campione da quattro a cinque per trattamento o genotipo che deve essere testato. I risultati hanno mostrato un graduale aumento dell'anisotropia microtubuli corticale entro un periodo di 6 ore e ci hanno permesso di concludere che la modulazione alla meccanica del MAS si traduce in cambiamenti simultanei nell'organizzazione dei microtubuli corticali.
Figura 1: Esempio di risultato della quantificazione dell'anisotropia microtubuli corticale e dell'ablazione meccanica nel SAM arabidopsis. (A) Proiezione superficiale degli stack SAM Z 35S: MBD-GFP. (B) Tensori nematici in rosso che mostrano anisotropia microtubuli corticale di cellule segmentate manualmente nel dominio centrale e al contorno. (C,D). Le proiezioni superficiali dei dati di time lapse dei microtubuli corticali da un esperimento di ablazione. (D) Immagini ingrandite di (C) che mostrano un riallineamento corticale dei microtubuli vicino al sito di ablazione (asterisco rosso) sovrapposto con informazioni sul tensore nematico delle singole cellule. (E) L'anisotropia del microtubulo corticale è cambiata dopo ablazione da 0-6 h, quantificata dal tensore nematico etichettato regione in C con il cerchio che rappresenta il valore medio e le barre che indicano l'intervallo di confidenza del 95%. Barre di scala = 25 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La valutazione degli eventi di trasduzione meccanica del segnale è fondamentale per identificare i regolatori molecolari coinvolti nelle vie meccano-percezione e trasduzione. Il protocollo qui descritto fornisce una visione quantitativa di tali eventi utilizzando la risposta corticale dei microtubuli come lettura per tale processo nei MAS Arabidopsis. La procedura qui descritta viene regolarmente utilizzata in diversi studi in vari tipi ditessuti 16,17,18,19. Un aumento significativo dell'anisotropia dei microtubuli si osserva nell'intervallo di 4 ore in tutti i tipi di tessuto.
Il passo più critico del protocollo è garantire che le alterazioni dei microtubuli non si verifichino a causa della prolungata immersione nell'acqua, perché l'acqua da sola si traduce in un aumento della pressione del turgore delle cellule. Pertanto, il tempo di imaging dovrebbe essere ridotto al minimo. Ciò può compromettere la risoluzione dell'immagine, ma fornisce una lettura più accurata dei risultati della perturbazione. Il secondo passo più cruciale è un'attenta dissezione del MAS. A causa delle sue dimensioni molto piccole, è molto probabile che venga danneggiato durante la procedura. Gli organi diventano più difficili da rimuovere se i peduncoli degli organi più vecchi non vengono completamente rimossi. Infine, durante la dissezione il campione non deve asciugarsi a causa della prolungata esposizione all'aria del MAS. Ciò è particolarmente comune quando si maneggiano MAS mutanti di difficile accesso o di diametro inferiore a 50 μm. L'applicazione frequente di gocce d'acqua sul MAS tra le fasi di dissezione previeni questo problema.
Una limitazione di questa procedura è che non esiste un vero controllo sull'area ablata. Questo è un problema nel confrontare i cambiamenti che si verificano in diverse condizioni e genotipi. Pertanto, è necessario utilizzare i SAM di controllo perturbati in modo simile per il confronto. Un'altra alternativa è eseguire un'ablazione più controllata utilizzando un laser ultraviolettopulsato 20. Inoltre, mentre l'ablazione è ampiamente nota per creare cambiamenti nelle proprietà meccaniche, è anche associata in una certa misura alle risposte indotte dalla ferita. Per questo motivo, è necessario eseguire altri approcci, come la compressione meccanica e le perturbazioni indotte dal turgore per confermare leosservazioni 6,9.
Un vantaggio significativo di questo metodo rispetto ad altri modi di manipolare le forze meccaniche è che utilizza strumenti molto semplici ma fornisce una solida lettura della risposta dei microtubuli.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Nessuno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FibrilTool | Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014 | ||
| FIJI | Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012 | ||
| glycine | Merck | 1.04201.1000 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | DM6000 CS | |
| MAP4-GFP | Marc, J. et al., Plant Cell 1998 | ||
| micropore tape | Leukopor | 02482-00 | |
| MorphographX | Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019 | ||
| myo-inositol | Sigma | I5125 | |
| N6-benzyladenine | Sigma | B3408 | |
| nicotinic acid | Sigma | N4126 | |
| plastic hinged box | Electron microscopy sciences | 64312 | |
| PPM (Plant Preservative Mixture) | Plant Cell Technology | PPM | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| pyridoxine hydrochloride | Sigma | P9755 | |
| SURFCUT | Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019 | ||
| thiamine hydrochloride | Sigma | T4625 |
References
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