Summary
Her beskriver vi en protokoll for levende celleavbildning av det kortikale mikrotubulicycyskeletonen ved skyteapokaell meristem og overvåking av responsen på endringer i fysiske krefter.
Abstract
Forstå celle og vev nivå regulering av vekst og morfogenese har vært i forkant av biologisk forskning i mange tiår. Fremskritt innen molekylære og bildeteknologier gjorde det mulig for oss å få innsikt i hvordan biokjemiske signaler påvirker morfogenetiske hendelser. Det er imidlertid stadig tydeligere at bortsett fra biokjemiske signaler, påvirker mekaniske signaler også flere aspekter av celle- og vevsvekst. Arabidopsis skyte apical meristem (SAM) er en kuppelformet struktur ansvarlig for generering av alle overjordiske organer. Organiseringen av det kortikale mikrotubulicytskeletonet som formidler apoplastisk cellulosedeponering i planteceller er romlig distinkt. Visualisering og kvantitativ vurdering av mønstre av kortikale mikrotubuli er nødvendig for å forstå cellenes biofysiske natur ved SAM, da cellulose er den kvelende komponenten i plantecelleveggen. Den stereotypiske formen for kortikale mikrotubuli organisasjon er også en konsekvens av vev-wide fysiske krefter som finnes på SAM. Perturbasjon av disse fysiske kreftene og påfølgende overvåking av kortikale mikrotubuli organisasjon gjør det mulig for identifisering av kandidatproteiner involvert i å megle mekano-persepsjon og transduksjon. Her beskriver vi en protokoll som bidrar til å undersøke slike prosesser.
Introduction
Planteceller er omgitt av en ekstracellulær matrise av polysakkarider og glykoproteiner som mekanisk ligner et fiberforsterket komposittmateriale som er i stand til å dynamisk endre sine mekaniskeegenskaper 1. Vekst i planteceller er drevet av opptaket av vann inn i cellen, noe som resulterer i en samtidig oppbygging av strekkkrefter på celleveggen. Som svar på slike krefter tillater endringer i celleveggens fysiske tilstand celleutvidelse. Celler med primærvegger er i stand til å gjennomgå rask vekst sammenlignet med sekundærcellevegg som inneholder celler, hovedsakelig på grunn av forskjeller i polysakkarides kjemiske sammensetning innenfor. Primære veggceller består av cellulose, hemicellulose og pektin i tillegg til glykoproteiner, og mangler lignin, en komponent som er tilstede i den sekundære celleveggen2. Cellulose, en glukosepolymer knyttet β-1,4 bind, er den viktigste komponenten i celleveggene. Det er organisert i fibrillar strukturer som er i stand til å motstå høye strekkkrefter opplevd under cellevekst3. I tillegg til å motstå strekkfasthet, resulterer mekanisk forsterkning langs en fortrinnsrett retning i turgordrevet ekspansjon langs en akse vinkelrett på nettorienteringen til cellulosemikrofibril. Organiseringen av cellulosemikrofibrillene påvirkes av det kortikale mikrotubulicycytskeleton, da de styrer retningsbevegelsen til cellulosesyntetiserende komplekser som ligger ved plasmamembranen4. Derfor, overvåking kortikale mikrotubuli organisasjon ved hjelp av en mikrotubbul-assosiert protein eller tubulin smeltet med et fluorescerende molekyl fungerer som en proxy for observasjon av overlying mønstre av cellulose i planteceller.
Mønsteret av kortikale mikrotubuli cytoskeleton er under kontroll av celle- og vevmorfologi avledet mekaniske krefter. Kortikal mikrotubuli organisasjon har ingen fortrinnsrett organisasjon over tid i celler som ligger på toppen av SAM, mens celler i periferien og grensen mellom SAM og det nye organet har en stabil, svært organisert supracellular utvalg av kortikale mikrotubuli5. Flere tilnærminger er utviklet for å fysisk perturb den mekaniske statusen til cellene. Endringer i osmotisk status, samt behandling med farmakologiske og enzymatiske forbindelser som påvirker stivheten i celleveggen, kan føre til påfølgende endringer i strekkkreftene som oppleves av cellen6,7. Bruken av innretninger som tillater gradvis økning i kompresjonskrefter opplevd av vev er et annet alternativ8. Bruk av sentrifugalkrefter har også vist seg å påvirke de mekaniske kreftene uten fysisk kontakt med cellene9. Imidlertid utnytter de mest brukte måtene å endre retningskrefter i en gruppe celler seg av det faktum at alle epidermale celler er under spenning og fysisk ablasjon av celler, eliminere turgortrykk lokalt, samt forstyrre celle-til-celle-vedheft, og dermed endre strekkkreftene oppleves av de nærliggende cellene. Dette utføres enten ved å målrette en kraftig pulserende ultrafiolett laser eller ved hjelp av en fin nål.
Her utdyper vi prosessen med avbildning og vurdering av kortikal mikrotubuli atferd for mekanisk perturbasjon ved SAM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plantevekst
- Så Arabidopsis frø uttrykker mikrotubuli bindende domene smeltet sammen med grønt fluorescerende protein (MBD-GFP)10 på jord og holde i lang dag (16 timer dag / 8 h natt), 20 ° C / 6 ° C forhold i 1 uke for spiring.
- Etter spiring, overføre frøplanter til nye potter med tilstrekkelig vekst plass for å tillate robust vegetativ vekst. Oppbevar planter på kort dag (8 timer dag /16 timer natt), 20 °C/16 °C i 3-5 uker.
- Overfør planter til lang dag (16 timer dag / 8 h natt), 20 ° C / 16 ° C forhold og hold til plantene bolt (2-3 uker). La blomsterstanden vokse opp til 2-5 cm lang.
2. Middels forberedelse
- Forbered dissekeringsrettene ved å fylle små Petri-retter (ca. 5,5 cm brede, 1,5 cm dype) til omtrent halvparten av dybden med 2% oppsto. Dissekeringsrettene kan også brukes til engangspunktavbildning.
- Forbered vekstmediet.
- Forbered 50 ml av en 1000x vitaminlagerløsning med 5 g myo-inositol, 0,05 g nikotinsyre, 0,05 g pyridoksinhydroklorid, 0,5 g tiaminhydroklorid og 0,1 g g glycin.
- Forbered vekstmediet, bestående av 1/2 Murashige og Skoog medium, 1% sukrose, 1,6% agar, 1x vitaminer, pH = 5,8. Autoklav og la den avkjøles.
- På en steril, ren benk, steriliser hengslede plastbokser (ca. 5,2 cm x 5,2 cm x 3 cm) ved å senke i 70% etanol i 15 min.
- På en steril, ren benk, når mediet er på utholdelig varme, tilsett N6-benzyladenine til en endelig konsentrasjon på 200 nM, og 1/1000 PPM (plantekonserveringsmiddelblanding) og bland godt. Fyll de sterile boksene til omtrent halvparten av dybden med mediet.
3. Disseksjon av SAM
- Klipp blomsterstanden og fjern de eldre blomsterknoppene med skarpe tang ved å peeling blomstene ved foten av peduncles til det er vanskelig å se dem med det blotte øye.
- Lag en spalte i agarose i disseksjonsfatet med tang og plant blomsterstanden inn i den tykke agaren. Dette gir god solid støtte for ytterligere fin disseksjon av yngre blomster for å avsløre SAM.
- Fjern de gjenværende blomsterknoppene ved å skyve dem ned med tangene som starter med den eldste og sekvensielt utvikler seg til de yngre stadiene under et dissekerende mikroskop til SAM er synlig. SAM er vanligvis utsatt når eldre blomster opp til trinn 6 til 7 fjernes. Når SAM er utsatt, unngå dehydrering av prøven ved å bevege seg raskt til neste trinn.
4. Overføring og vekst av kultiverte SAMs
- Plant den nydesiterte prøven som beskrevet i avsnitt 1 inn i vekstmediet i den rektangulære plasthengslede kulturboksen med SAM like utsatt over den mellomstore overflaten. Tilsett noen dråper sterilt deionisert vann til kantene på kulturboksene og lukk lokket for å opprettholde fuktigheten inne i boksen. Kontroller at det ekstra vannet ikke dekker SAM.
- Lukk lokket og pakk boksen med mikroporetape. Plasser vekstboksen på lang dag eller kontinuerlig dag forhold ved 22 ° C og vokse i 12-24 h slik at SAM å gjenopprette fra disseksjon prosedyren og tilpasse seg kulturforholdene.
5. Bildebehandling av SAM
- Fyll kulturboksen som inneholder SAM med sterilt deionisert vann for å dekke prøven. Kontroller under disseksjonsmikroskopet og fjern eventuelle luftbobler ved kraftig sprøyting av vann rettet mot prøven med en 1 ml pipette.
- Plasser kulturboksen på et oppreist konfokalt mikroskopstadium. Vær forsiktig med at kulturboksen ikke kontakter mikroskopmålene. Bruk en langdistanse 40x eller 60x vanndyppinglinse av numerisk blenderåpning 0,8-1 som er optimal for bildebehandling uten dekkglass.
- Senk målet ned i vannet og se etter luftbobler dannet på målets frontlinse. Fjern eventuelle bobler ved å senke scenen og forsiktig tørke linsen med et optisk vev og tilsett en liten mengde vann til forsiden av objektivet med en Pasteur pipette før reimmersion i vannet.
- Bruk GFP-filteret og epibelysningsmodulen til det konokale mikroskopet til å justere XY-kontrolleren for å finne prøven. Justere plasseringen av okulære, sette SAM direkte under lyskilden og fokuser langs Z-aksen til toppunktet er plassert.
MERK: Ikke se direkte på ultrafiolett lys. - Når prøven er funnet, belyse den ved hjelp av en laser som er i stand til spennende GFP (det vil si en 488 nm eller 496 nm laserkilde). Juster den optiske zoomen på mikroskopet slik at hele SAM og trinn 1 floral primordia er i synsfeltet. Juster laserutgangens kraft ytterligere for å sikre optimalt signal-til-støy-forhold.
MERK: Laserens høye intensitet vil resultere i bleking av prøven. Under- og overeksponeringspaletten bidrar til å sikre bedre justering av disse innstillingene. - La prøven slå seg ned i 2-5 min. Skaff deg konokkale Z-stabler av prøven ved 0,25 μm-0,5 μm Z-skiveintervaller med en oppløsning på ca. 0,3 μm pikselstørrelse. Kontroller at den totale bildetiden som kreves for å anskaffe Z-stabler for en prøve, ikke overstiger 10 minutter fra tidspunktet prøven er nedsenket i vann til oppkjøpet er fullført.
- Fjern umiddelbart vannet og overfør kulturboksen tilbake til vekstkammeret. Holde prøvene i lang tid under vann vil påvirke den osmotiske statusen til cellene.
6. Mikromekanisk perturbasjon av SAM
- Konfigurer bildeforholdene som beskrevet i avsnitt 5, og hent forhåndsavbildningsbildestabler i den kortikale mikrotubuliorganisasjonen.
- Dekanter vannet i kulturretten. Utfør ablasjonen med en ren sprøytenål (0,4 mm x 20 mm).
- Bruk et dissekerende mikroskop, hold forsiktig nålen og sakte nærmer SAM.
MERK: Pusten holder og håndterer nålen med et avslappet grep bidrar til å unngå risting. - Kontakt kort SAM-kuppelen med nålespissen for å bekrefte at ablasjonen er ferdig. Fortrinnsvis utføre ablasjonen i periferien av SAM, noe som tillater visualisering av atferd og overgang av uorganiserte kortikale mikrotubuli i den sentrale regionen av kuppelen.
- Bruk et dissekerende mikroskop, hold forsiktig nålen og sakte nærmer SAM.
- Fyll kulturfatet på med sterilt deionisert vann og tilsett propidiumjodid (10 μg/ml). I tillegg til å overvåke GFP kortikale mikrotubuli signal, visualisere propidiumjodid ved hjelp av en egen kanal kan tydelig markere områder av ablated celler. Propidiumjodid er opplyst ved hjelp av 561 nm eller annen egnet laser med utslipp registrert mellom 600-650 nm.
- Hent bildestabler rett etter ablasjon (se avsnitt 6) og gjenta anskaffelsesprosessen hver 2. Returner kulturretten sammen med prøven inn i inkubasjonskammeret etter hvert gangpunkt. Sørg for at det er litt vann igjen på kulturmediene og pakk kulturfatet med mikroporetape for å forhindre utvasking.
7. Datavisualisering og kvantifisering
- Generer overflateprojeksjoner ved hjelp av fritt tilgjengelig programvare som MORPHOGRAPHX11,FIJI12eller makro SurfCut13.
- Utfør ekstraksjon av kortikale mikrotubuli anisotropi ved hjelp av FibrilTool14 makro i FIJI.
MERK: Detaljerte protokoller for programvarebruk kan fås fra de respektive sitatene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser typiske projeksjonsbilder hentet fra MBD-GFP-linjer med celler i midten av kuppelen som inneholder uorganiserte kortikale mikrotubuli, og celler i periferien har en omkretsfordeling (figur 1A,B), mens grensedomenecellene inneholder kortikale mikrotubuli justert parallelt med cellens lange akse. Disse observasjonene viser forskjeller i romlig fordeling av kortikale mikrotubuli i de forskjellige domenene til SAM. Tidsforløp av bildebehandling viste kortikale mikrotubuli justering endring fra en svært uorden array til en mer organisert array innen 6 timer etter ablasjon (Figur 1C, D). Tensorene som genereres ved hjelp av FibrilTool, kan legges over på det kortikale mikrotubulibildet. En lengre tensor representerte en høyere grad av anisotropi. Tensorene viste også den viktigste aksen for justering av kortikale mikrotubuli. Den utpakkede informasjonen kan representeres ved å potte gjennomsnittlig anisotropi over tid (figur 1E)15. En prøvestørrelse på fire til fem anbefales per behandling eller genotype som må testes. Resultatene viste en gradvis økning i kortikal mikrotubuli anisotropi innen en periode på 6 timer og tillot oss å konkludere med at modulering til mekanikken i SAM resulterer i samtidige endringer i kortikal mikrotubuli organisasjon.
Figur 1: Eksempel på kortikale mikrotubuli anisotropi kvantifisering og mekanisk ablasjon i Arabidopsis SAM. (A)Overflateprojeksjon av 35S: MBD-GFP SAM Z stabler. (B) Nematiske tensorer i rødt viser kortikale mikrotubuli anisotropi av manuelt segmenterte celler i det sentrale og grensedomenet. (C, D). Overflateprojeksjoner av kortikale mikrotubbule tid forfalle data fra et ablasjonseksperiment. (D) Forstørrede bilder fra (C) som viser kortikal mikrotubulijustering nær ablasjonsstedet (rød stjerne) overlaid med nematisk tensorinformasjon for individuelle celler. (E) Kortikal mikrotubuli anisotropi endret etter ablasjon fra 0-6 h, kvantifisert fra den nematiske tensor merket regionen i C med sirkelen som representerer gjennomsnittsverdien og stolpene som indikerer 95% konfidensintervall. Skala barer = 25 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vurderingen av mekaniske signaltransduksjonshendelser er avgjørende for å identifisere molekylære regulatorer som er involvert i mekano-persepsjons- og transduksjonsbanene. Protokollen som er beskrevet her gir et kvantitativt syn på slike hendelser ved å bruke den kortikale mikrotubuliresponsen som en avlesning for en slik prosess i Arabidopsis SAMs. Prosedyren beskrevet her brukes rutinemessig i flere studier i ulike vevstyper16,17,18,19. En betydelig økning i mikrotubuli anisotropi observeres i området 4 timer i alle vevstyper.
Det mest kritiske trinnet i protokollen er å sikre at endringer i mikrotubuli ikke oppstår på grunn av langvarig nedsenkninger i vann, fordi vann på egen hånd resulterer i en økning av cellenes turgortrykk. Derfor bør bildetiden minimeres. Dette kan kompromittere bildeoppløsningen, men det gir en mer nøyaktig avlesning av perturbasjonsresultatene. Det nest mest avgjørende trinnet er forsiktig disseksjon av SAM. På grunn av sin svært lille størrelse, er det svært sannsynlig å bli skadet under prosedyren. Organene blir vanskeligere å fjerne hvis peduncles av eldre organer ikke er helt fjernet. Til slutt, under disseksjon bør prøven ikke få lov til å tørke ut på grunn av langvarig lufteksponering av SAM. Dette er spesielt vanlig ved håndtering av muterte SAMer som er vanskelige å få tilgang til, eller som er mindre enn 50 μm i diameter. Hyppig bruk av vanndråper på SAM mellom disseksjonstrinnene forhindrer dette problemet.
En begrensning av denne prosedyren er at det ikke er noen reell kontroll over det ablerte området. Dette er et problem i å sammenligne endringer som skjer under forskjellige forhold og genotyper. Derfor er det nødvendig å bruke kontroll SAMs perturbed på en lignende måte for sammenligning. Et annet alternativ er å utføre en mer kontrollert ablasjon ved hjelp av en pulserende ultrafiolett laser20. I tillegg, mens ablasjon er viden kjent for å skape endringer i mekaniske egenskaper, er det også forbundet i en viss grad med sårinduserte responser. Av denne grunn må andre tilnærminger, for eksempel mekanisk kompresjon og turgor-induserte perturbasjoner, utføres for å bekrefteobservasjonene 6,9.
En betydelig fordel med denne metoden sammenlignet med andre måter å manipulere mekaniske krefter er at den bruker svært grunnleggende verktøy, men gir en robust avlesning av mikrotubulirespons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FibrilTool | Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014 | ||
| FIJI | Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012 | ||
| glycine | Merck | 1.04201.1000 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | DM6000 CS | |
| MAP4-GFP | Marc, J. et al., Plant Cell 1998 | ||
| micropore tape | Leukopor | 02482-00 | |
| MorphographX | Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019 | ||
| myo-inositol | Sigma | I5125 | |
| N6-benzyladenine | Sigma | B3408 | |
| nicotinic acid | Sigma | N4126 | |
| plastic hinged box | Electron microscopy sciences | 64312 | |
| PPM (Plant Preservative Mixture) | Plant Cell Technology | PPM | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| pyridoxine hydrochloride | Sigma | P9755 | |
| SURFCUT | Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019 | ||
| thiamine hydrochloride | Sigma | T4625 |
References
- Cosgrove, D. J. Re-constructing our models of cellulose and primary cell wall assembly. Current Opinion in Plant Biology. 22, 122-131 (2014).
- McFarlane, H. E., Doring, A., Persson, S. The cell biology of cellulose synthesis. Annual Reviews in Plant Biology. 65, 69-94 (2014).
- Burgert, I. Exploring the micromechanical design of plant cell walls. American Journal of Botany. 93 (10), 1391-1401 (2006).
- Paredez, A. R., Somerville, C. R., Ehrhardt, D. W. Visualization of cellulose synthase demonstrates functional association with microtubules. Science. 312 (5779), 1491-1495 (2006).
- Barbier de Reuille, P., et al. MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D. Elife. 4, 05864 (2015).
- Kierzkowski, D., et al. Elastic domains regulate growth and organogenesis in the plant shoot apical meristem. Science. 335 (6072), 1096-1099 (2012).
- Heisler, M. G., et al. Alignment between PIN1 polarity and microtubule orientation in the shoot apical meristem reveals a tight coupling between morphogenesis and auxin transport. PLoS Biology. 8 (10), e1000516 (2010).
- Louveaux, M., Rochette, S., Beauzamy, L., Boudaoud, A., Hamant, O. The impact of mechanical compression on cortical microtubules in Arabidopsis: a quantitative pipeline. Plant Journal. 88 (2), 328-342 (2016).
- Nakayama, N., et al. Mechanical regulation of auxin-mediated growth. Current Biology. 22 (16), 1468-1476 (2012).
- Marc, J., et al. A GFP-MAP4 reporter gene for visualizing cortical microtubule rearrangements in living epidermal cells. Plant Cell. 10 (11), 1927-1940 (1998).
- Strauss, S., Sapala, A., Kierzkowski, D., Smith, R. S. Quantifying Plant Growth and Cell Proliferation with MorphoGraphX. Methods in Molecular Biology. 1992, 269-290 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Erguvan, O., Louveaux, M., Hamant, O., Verger, S. ImageJ SurfCut: a user-friendly pipeline for high-throughput extraction of cell contours from 3D image stacks. BMC Biology. 17 (1), 38 (2019).
- Boudaoud, A., et al. FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nature Protocols. 9 (2), 457-463 (2014).
- Sampathkumar, A., et al. Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth. Development. 146 (10), (2019).
- Hervieux, N., et al. A Mechanical Feedback Restricts Sepal Growth and Shape in Arabidopsis. Current Biology. 6 (8), P1019-P1028 (2016).
- Sampathkumar, A., et al. Subcellular and supracellular mechanical stress prescribes cytoskeleton behavior in Arabidopsis cotyledon pavement cells. Elife. 3, e01967 (2014).
- Sampathkumar, A., et al. Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth. Development. 146 (10), dev179036 (2019).
- Uyttewaal, M., et al. Mechanical stress acts via katanin to amplify differences in growth rate between adjacent cells in Arabidopsis. Cell. 149 (2), 439-451 (2012).
- Hamant, O., et al. Developmental patterning by mechanical signals in Arabidopsis. Science. 322 (5908), 1650-1655 (2008).
