Summary
Здесь мы описываем протокол для живой клеточной визуализации цитоскелета корковых микротрубочек на съемках апического меристема и отслеживаем его реакцию на изменения в физических силах.
Abstract
Понимание регуляции роста и морфогенеза на уровне клеток и тканей находится на переднем крае биологических исследований на протяжении многих десятилетий. Достижения в области молекулярных и визуальных технологий позволили нам получить представление о том, как биохимические сигналы влияют на морфогенетические события. Тем не менее, становится все более очевидным, что помимо биохимических сигналов, механические сигналы также влияют на некоторые аспекты роста клеток и тканей. Arabidopsis стрелять апический меристем (SAM) является куполообразной структуры, ответственной за генерацию всех надземных органов. Организация цитоскелета корковых микротрубочек, который опосредует апопластическое осаждение целлюлозы в клетках растений, пространственно отличается. Визуализация и количественная оценка моделей корковых микротрубочек необходимы для понимания биофизической природы клеток в SAM, так как целлюлоза является самым жестким компонентом стенки клеток растения. Стереотипная форма организации корковых микротрубочек также является следствием тканевых физических сил, существующих на SAM. Возмущение этих физических сил и последующий мониторинг организации корковых микротрубочек позволяет идентифицировать кандидатские белки, участвующие в посредничестве механо-восприятия и трансдукции. Здесь мы описываем протокол, который помогает исследовать такие процессы.
Introduction
Растительные клетки окружены внеклеточной матрицей полисахаридов и гликопротеинов, которая механически напоминает волокно усиленного композитного материала, способного динамически изменять своимеханические свойства 1. Рост растительных клеток обусловлен поглощением воды в клетку, что приводит к сопутствующего наращиванию напряженных сил на клеточной стенке. В ответ на такие силы, изменения в физическом состоянии клеточной стенки позволяет расширение клеток. Клетки с первичными стенками способны претерпевать быстрый рост по сравнению со вторичной клеточной стеной, содержащей клетки, главным образом из-за различий в химическом составе полисахаридов внутри. Первичные клетки стенки состоят из целлюлозы, гемичеллозы и пектина в дополнение к гликопротеинам, и отсутствие лигнина, компонент, который присутствует во вторичной клеточнойстенке 2. Целлюлоза, глюкозный полимер, связанный β-1,4 связей, является основным компонентом клеточных стенок. Он организован в фибрилляльные структуры, которые способны выдерживать высокие напряженные силы, опытные во время роста клеток3. Помимо выдержив напряженные силы, механическое усиление по преференциальному направлению приводит к тургорному расширению вдоль оси перпендикулярно чистой ориентации микрофилибры целлюлозы. На организацию целлюлозных микрофиллятов влияет кортикальный цитоскелет микротрубочек, так как они направляют направленное движение целлюлозно-синтезующих комплексов, расположенных на плазменноймембране 4. Таким образом, мониторинг организации корковых микротрубочек с использованием микротрубочек, связанных с белком или тубулином, слитым с флуоресцентной молекулой, служит прокси для наблюдения за чрезмерной структурой целлюлозы в клетках растений.
Узор коркового микротрубокона цитоскелет находится под контролем клеток и ткани морфологии производных механических сил. Кортикальная организация микротрубочек не имеет какой-либо преференциальной организации с течением времени в клетках, расположенных на вершине SAM, в то время как клетки на периферии и граница между SAM и возникающим органом имеют стабильный, высокоорганизованный надклеточный массив корковых микротрубочек5. Было разработано несколько подходов к физическому возмущению механического состояния клеток. Изменения осмотического статуса, а также лечение фармакологическими и энзиматических соединений, которые влияют на жесткость клеточной стенки может привести к последующим изменениям в напряженных сил, с которымисталкиваются клетки 6,7. Использование приспособлений, которые позволяют постепенное увеличение сжатых сил, с которыми сталкиваются ткани является еще одной альтернативой8. Было также показано, что применение центробежных сил влияет на механические силы без физического контакта с клетками9. Тем не менее, наиболее широко используемые средства изменения направленных сил в группе клеток воспользоваться тем, что все эпидермальные клетки находятся под напряжением и физической абляции клеток позволит устранить тургорное давление локально, а также нарушение клетки к клетке адгезии, тем самым изменяя напряженные силы, с которыми сталкиваются соседние клетки. Это выполняется либо путем ориентации мощных импульсных ультрафиолетовых лазеров или с помощью тонкой иглы.
Здесь мы подробно о процессе визуализации и оценки поведения корковых микротрубочек для механического возмущения на SAM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Рост растений
- Сеять семена арабидопсиса, выражают микротрубочки связывания домена сливается с зеленым флуоресцентным белком (MBD-GFP)10 на почве и держать в длинный день (16 ч день / 8 ч ночью), 20 градусов по Цельсию / 6 градусов по Цельсию условия в течение 1 недели для прорастания.
- После прорастания перенесите саженцы в новые горшки с достаточным пространством для роста, чтобы обеспечить устойчивый вегетативный рост. Держите растения в короткий день (8 ч днем / 16 ч ночью), 20 градусов по Цельсию / 16 градусов по Цельсию условиях в течение 3-5 недель.
- Передача растений на длинный день (16 ч день / 8 ч ночью), 20 градусов по Цельсию /16 градусов по Цельсию условия и держать до растений болт (2-3 недели). Дайте соцветию вырасти до 2-5 см в длину.
2. Средняя подготовка
- Приготовьте вскрытые блюда, заполнив небольшие блюда Петри (примерно 5,5 см в ширину, 1,5 см в глубину) примерно на половину их глубины с 2% агарозой. Вскрытые посуды также могут быть использованы для одной точки изображения времени.
- Подготовь средство роста.
- Приготовьте 50 мл раствора витамина в 1000x с 5 г мио-инозитола, 0,05 г никотиновой кислоты, 0,05 г гидрохлорида пиридоксина, 0,5 г гидрохлорида тиамина и 0,1 г глицина.
- Подготовка среды роста, состоящей из 1/2 Murashige и Skoog среднего, 1% сахарозы, 1,6% агара, 1x витаминов, рН 5,8. Автоклав и дайте ему остыть.
- На стерильной, чистой скамейке стерилизовать навесные пластиковые коробки (примерно 5,2 см х 5,2 см х 3 см) путем погружения в 70% этанола в течение 15 мин.
- На стерильной, чистой скамейке, как только среда находится в сносном тепле, добавить N6-бензиладенин в окончательной концентрации 200 нМ, и 1/1000 PPM (растительной консервантной смеси) и хорошо перемешать. Заполните стерильные коробки примерно до половины их глубины со средой.
3. Рассечение SAM
- Вырезать соцветия и удалить старые почки цветка с острыми типсами, пилинг цветы у основания peduncles, пока не трудно увидеть их невооруженным глазом.
- Создайте щель в агарозе в рассечении блюдо с типсами и посадить соцветие базы в толстый агар. Это дает хорошую твердую поддержку для дальнейшего тонкого вскрытия молодых цветов, чтобы разоблачить SAM.
- Удалите оставшиеся цветочные почки, толкая их вниз с типсами, начиная с старейших и последовательно прогрессирует на более молодых стадиях под рассекающим микроскопом, пока SAM не будет виден. SAM, как правило, подвергаются, когда старые цветы до стадии от 6 до 7 удаляются. После того, как SAM подвергается, избежать обезвоживания образца, быстро переходя к следующему шагу.
4. Передача и рост культурных САМ
- Завод свежевыпаренный образец, как подробно описано в разделе 1 в среде роста в прямоугольной пластиковой навесной культуры поле с SAM просто подвергаются над средней поверхности. Добавьте несколько капель стерильной деионизированной воды к краям культурных коробок и закройте крышку, чтобы поддерживать влажность внутри коробки. Убедитесь, что добавленная вода не покрывает SAM.
- Закройте крышку и оберните коробку микропорной лентой. Поместите коробку роста в длинные дневные или непрерывные дневные условия при 22 градусов по Цельсию и расти в течение 12-24 ч, чтобы SAM, чтобы оправиться от процедуры вскрытия и адаптироваться к культурным условиям.
5. Изображение SAM
- Заполните культурную коробку, содержащую SAM, стерильной деионизированной водой, чтобы покрыть образец. Проверьте под рассечением микроскопа и удалить любые пузырьки воздуха, силой распыления воды, направленной на образец с 1 мл пипетки.
- Поместите коробку культуры на вертикальной стадии конфокального микроскопа. Позаботьтесь о том, чтобы культурное поле не соехит с целями микроскопа. Используйте междугородную 40x или 60x воду окуная объектив численной диафрагмы 0.8-1 которая оптимальна для изображения без стекла крышки.
- Опустите цель в воду и проверьте наличие пузырьков воздуха, образовавав их на передней линзе цели. Удалите пузырьки, опустив сцену и аккуратно вытирая объектив оптической тканью и добавляя небольшое количество воды в переднюю линзу цели с пипеткой Pasteur перед погружением в воду.
- Используя фильтр GFP и модуль эпи-освещения конфокального микроскопа, отрегулируйте контроллер XY, чтобы найти образец. Регулируя положение глаз, поместите SAM непосредственно под источник света и сосредоточьтесь вдоль оси q до тех пор, пока вершина не будет расположена.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не смотрите прямо на ультрафиолетовый свет. - После того, как образец найден, осветите его с помощью лазера, способного захватывающих GFP (т.е. 488 нм или 496 нм лазерного источника). Отрегулируйте оптический зум микроскопа так, чтобы весь SAM и первая стадия цветочных имордий были в поле зрения. Дальнейшая регулировка мощности лазерного выхода и настройки усиления для обеспечения оптимального соотношения сигнала к шуму.
ПРИМЕЧАНИЕ: Высокая интенсивность лазера приведет к фото отбеливанию образца. Палитра недоэкспозиций и передержки помогает обеспечить лучшую корректировку этих параметров. - Дайте образцу успокоиться в течение 2-5 минут. Приобретайте конфокальные стеки образца с интервалом в 0,25 мкм-0,5 мкм с интервалом в 0,3 мкм. Убедитесь, что общее время изображения, необходимое для приобретения стеков для одного образца, не превышает 10 минут с момента погружения образца в воду до завершения приобретения.
- Немедленно удалите воду и перенесите культурную коробку обратно в камеру роста. Хранение образцов в течение длительного времени под водой будет влиять на осмотическое состояние клеток.
6. Микромеханическое возмущение SAM
- Настройка условий визуализации, описанных в разделе 5, и приобретение предабляционных стеков изображений организации корковых микротрубочек.
- Декант воды в культуре блюдо. Выполните абляцию чистой шприц-иглой (0,4 мм x 20 мм).
- Используя рассеченный микроскоп, тщательно держите иглу и медленно приближайтесь к SAM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дыхание проведения и обработки иглы с расслабленной хваткой помогает избежать встряхивания. - Кратко свяжитесь с куполом SAM кончиком иглы, чтобы подтвердить, что абляция сделана. Предпочтительно выполнять абляцию на периферии SAM, что позволяет визуализировать поведение и переход неорганизованных корковых микротрубочек в центральной области купола.
- Используя рассеченный микроскоп, тщательно держите иглу и медленно приближайтесь к SAM.
- Пополнить блюдо культуры стерильной деионизированной водой и добавить идиодид пропидия (10 мкг/мл). В дополнение к мониторингу сигнала корковой микротруболин GFP, визуализация йодида пропидия с помощью отдельного канала может четко маркировать области абляционных клеток. Иодид пропидия освещается с помощью 561 нм или любого другого подходящего лазера с выбросами, зарегистрированными между 600-650 нм.
- Приобретайте стеки изображений сразу после абляции (см. раздел 6) и повторяйте процесс приобретения каждые 2 ч в течение 6 ч. Верните блюдо культуры вместе с образцом в инкубационую камеру после каждой точки времени. Убедитесь, что есть немного воды осталось на культуре средств массовой информации и обернуть культуру блюдо с микропор ленты для предотвращения высыхания.
7. Визуализация данных и количественная оценка
- Создание поверхностных проекций с использованием свободно доступных программ, таких как MORPHOGRAPHX11, FIJI12, или макро SurfCut13.
- Выполните экстракцию кортикальной микротрубоковой анисотропии с помощью макроса FibrilTool14 на FIJI.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные протоколы использования программного обеспечения можно получить из соответствующих цитат.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показаны типичные проекционные изображения, полученные из линий MBD-GFP с ячейками в центре купола, содержащими дезорганизованные корковые микротрубочные микробубулы, и клетки на периферии, имеющие окружное распределение(рисунок 1A,B),в то время как клетки пограничного домена содержат корковые микротрубочные микробубулы, выровненные параллельно длинной оси клетки. Эти наблюдения показывают различия в пространственном распределении корковых микротрубочек в различных областях SAM. Промежуток времени изображения показали корковых микротрубочек выравнивание меняется от сильно неупорядоченные массива в более организованный массив в пределах 6 чабляции ( Рисунок 1C, D). Тенсоры, генерируемые с помощью FibrilTool, могут быть наложены на изображение корковых микротрубочек. Более длинный тенсор представлял собой более высокую степень анисотропии. Тенсоры также показали основную ось выравнивания корковых микротрубочек. Извлеченная информация может быть представлена путем заливки среднего анисотропии с течениемвремени (рисунок 1E)15. Размер выборки от четырех до пяти рекомендуется для лечения или генотипа, которые должны быть проверены. Результаты показали постепенное увеличение кортикальной микротрубоковой анисотропии в течение 6 ч и позволили сделать вывод, что модуляция механики SAM приводит к одновременным изменениям в организации корковых микротрубочек.
Рисунок 1: Пример результат корковой микротрубоковой анисотропии количественной оценки и механической абляции в Arabidopsis SAM. (A)Поверхностная проекция 35S: MBD-GFP SAM - стеки. (B)Нематические тенсоры красного цвета, показывающие кортикическую микротрубоконную анисотропию вручную сегментированных ячеек в центральном и пограничном домене. (C,D). Поверхностные проекции кортикальной микротрубоконной промежуток времени данных из абляционного эксперимента. (D) Увеличенные изображения из (C) показаны корковые микротрубочные перестройки вблизи места абляции (красная звездочка) накладывается с нематическим тенсор информации отдельных клеток. (E)Кортикальные микротрубочные анисотропии изменились после абляции от 0-6 ч, количественно из нематического тенсора помечены области в C с кругом, представляющим среднее значение и баров с указанием 95% доверия интервал. Масштаб баров 25 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Оценка событий механической трансдукции сигнала имеет решающее значение для выявления молекулярных регуляторов, участвующих в механо-восприятии и трансдукционных путях. В описанном здесь протоколе содержится количественное представление о таких событиях с помощью кортикальной микротрубоконной реакции в качестве считывания для такого процесса в САМ арабидопсиса. Описанная здесь процедура регулярно используется в нескольких исследованиях в различныхтипах тканей 16,17,18,19. Значительное увеличение анисотропии микротрубочек наблюдается в диапазоне 4 ч во всех типах тканей.
Наиболее важным шагом в протоколе является обеспечение того, чтобы изменения в микротрубочках не происходили из-за длительного погружения в воду, потому что вода самостоятельно приводит к повышению тургорного давления клеток. Таким образом, время визуализации должно быть сведено к минимуму. Это может поставить под угрозу разрешение изображения, но обеспечивает более точное считывание результатов возмущения. Вторым наиболее важным шагом является тщательное вскрытие SAM. Из-за своих очень малых размеров, он, скорее всего, будет поврежден во время процедуры. Органы становятся все труднее удалить, если peduncles старых органов не полностью удалены. Наконец, во время вскрытия образец не должен высыхать из-за длительного воздействия SAM. Это особенно распространено при обработке мутантных SAMs, которые трудно получить доступ или которые меньше, чем 50 мкм в диаметре. Частое применение капель воды на SAM между шагами вскрытия предотвратить эту проблему.
Ограничение этой процедуры заключается в том, что нет реального контроля над абляционной областью. Это проблема сравнения изменений, происходящих в различных условиях и генотипах. Поэтому для сравнения необходимо аналогичным образом использовать элементы управления, возмущенные САМ. Другой альтернативой является выполнение более контролируемой абляции с помощью импульсного ультрафиолетовоголазера 20. Кроме того, хотя абляция широко известна как создание изменений в механических свойствах, она также связана в определенной степени с ранами индуцированных ответов. По этой причине, другие подходы, такие как механическое сжатие и тургор-индуцированных возмущений должны быть выполненыдля подтверждения наблюдений 6,9.
Существенным преимуществом этого метода по сравнению с другими способами манипулирования механическими силами является то, что он использует очень основные инструменты, но обеспечивает надежное считывание микротрубочек ответ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Ни один.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FibrilTool | Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014 | ||
| FIJI | Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012 | ||
| glycine | Merck | 1.04201.1000 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | DM6000 CS | |
| MAP4-GFP | Marc, J. et al., Plant Cell 1998 | ||
| micropore tape | Leukopor | 02482-00 | |
| MorphographX | Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019 | ||
| myo-inositol | Sigma | I5125 | |
| N6-benzyladenine | Sigma | B3408 | |
| nicotinic acid | Sigma | N4126 | |
| plastic hinged box | Electron microscopy sciences | 64312 | |
| PPM (Plant Preservative Mixture) | Plant Cell Technology | PPM | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| pyridoxine hydrochloride | Sigma | P9755 | |
| SURFCUT | Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019 | ||
| thiamine hydrochloride | Sigma | T4625 |
References
- Cosgrove, D. J. Re-constructing our models of cellulose and primary cell wall assembly. Current Opinion in Plant Biology. 22, 122-131 (2014).
- McFarlane, H. E., Doring, A., Persson, S. The cell biology of cellulose synthesis. Annual Reviews in Plant Biology. 65, 69-94 (2014).
- Burgert, I. Exploring the micromechanical design of plant cell walls. American Journal of Botany. 93 (10), 1391-1401 (2006).
- Paredez, A. R., Somerville, C. R., Ehrhardt, D. W. Visualization of cellulose synthase demonstrates functional association with microtubules. Science. 312 (5779), 1491-1495 (2006).
- Barbier de Reuille, P., et al. MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D. Elife. 4, 05864 (2015).
- Kierzkowski, D., et al. Elastic domains regulate growth and organogenesis in the plant shoot apical meristem. Science. 335 (6072), 1096-1099 (2012).
- Heisler, M. G., et al. Alignment between PIN1 polarity and microtubule orientation in the shoot apical meristem reveals a tight coupling between morphogenesis and auxin transport. PLoS Biology. 8 (10), e1000516 (2010).
- Louveaux, M., Rochette, S., Beauzamy, L., Boudaoud, A., Hamant, O. The impact of mechanical compression on cortical microtubules in Arabidopsis: a quantitative pipeline. Plant Journal. 88 (2), 328-342 (2016).
- Nakayama, N., et al. Mechanical regulation of auxin-mediated growth. Current Biology. 22 (16), 1468-1476 (2012).
- Marc, J., et al. A GFP-MAP4 reporter gene for visualizing cortical microtubule rearrangements in living epidermal cells. Plant Cell. 10 (11), 1927-1940 (1998).
- Strauss, S., Sapala, A., Kierzkowski, D., Smith, R. S. Quantifying Plant Growth and Cell Proliferation with MorphoGraphX. Methods in Molecular Biology. 1992, 269-290 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Erguvan, O., Louveaux, M., Hamant, O., Verger, S. ImageJ SurfCut: a user-friendly pipeline for high-throughput extraction of cell contours from 3D image stacks. BMC Biology. 17 (1), 38 (2019).
- Boudaoud, A., et al. FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nature Protocols. 9 (2), 457-463 (2014).
- Sampathkumar, A., et al. Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth. Development. 146 (10), (2019).
- Hervieux, N., et al. A Mechanical Feedback Restricts Sepal Growth and Shape in Arabidopsis. Current Biology. 6 (8), P1019-P1028 (2016).
- Sampathkumar, A., et al. Subcellular and supracellular mechanical stress prescribes cytoskeleton behavior in Arabidopsis cotyledon pavement cells. Elife. 3, e01967 (2014).
- Sampathkumar, A., et al. Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth. Development. 146 (10), dev179036 (2019).
- Uyttewaal, M., et al. Mechanical stress acts via katanin to amplify differences in growth rate between adjacent cells in Arabidopsis. Cell. 149 (2), 439-451 (2012).
- Hamant, O., et al. Developmental patterning by mechanical signals in Arabidopsis. Science. 322 (5908), 1650-1655 (2008).
