Summary
L'obiettivo di questo lavoro è quello di sviluppare un metodo per isolare in modo riproducibile i cardiomiociti dal cuore adulto e misurare il contenuto di DNA e la nucleazione.
Abstract
Il cuore dei mammiferi adulti è composto da vari tipi di cellule tra cui cardiomiociti, cellule endoteliali e fibroblasti. Poiché è difficile identificare in modo affidabile i nuclei dei cardiomiociti sulle sezioni istologiche, molti gruppi si affidano all'isolamento dei cardiomiociti vitali prima della fissazione per eseguire l'immunostaining. Tuttavia, queste tecniche di isolamento cardiomiocito vivo richiedono ottimizzazione per massimizzare la resa, la vitalità e la qualità dei campioni, con fluttuazioni intrinseche da campione a campione nonostante la massima ottimizzazione. Qui, abbiamo segnalare un protocollo riproducibile, che coinvolge la fissazione prima della digestione ezimatica del cuore, che porta alla massima resa pur preservando la morfologia in vivo dei cardiomiociti individuali. Abbiamo inoltre sviluppato una piattaforma di analisi automatizzata per determinare il numero di nuclei e il contenuto di DNA per nucleo per i singoli cardiomiociti. Dopo aver esposto la cavità toracica, il cuore è stato arrestato in diastole per perfusione con 60 mM KCl in PBS. Successivamente, il cuore è stato fissato in soluzione di paraformaldeide (PFA) del 4%, e poi digerito con una soluzione di collagenasi da 60 mg/mL. Dopo la digestione, le cellule sono state singolarizzate dalla triturazione e la frazione cardiomiocita è stata arricchita tramite centrifugazione differenziale. I cardiomiociti isolati sono stati macchiati per Troponin T α-actinin per valutare la purezza della popolazione ottenuta. Inoltre, abbiamo sviluppato una piattaforma di analisi delle immagini per determinare la nucleazione cardiomiocita e lo stato di ploiy dopo la colorazione DAPI. Le valutazioni dello ploiy basate sull'immagine hanno portato a risultati coerenti e riproducibili. Così, con questo protocollo, è possibile preservare la morfologia nativa dei singoli cardiomiociti per consentire l'immunocitochimica e l'analisi del contenuto del DNA raggiungendo al contempo la massima resa.
Introduction
Le malattie cardiache sono state la principale causa di morte nella maggior parte dei paesi occidentali per moltidecenni 1,2. Anche se molti miglioramenti nel trattamento delle malattie cardiovascolari hanno migliorato la sopravvivenza, attualmente non ci sono trattamenti che possono sostituire i cardiomiociti persi. Pertanto, gli studi relativi alla funzione cardiomiocata, proliferazione, apoptosi e ipertrofia sono stati e continuano ad essere un obiettivo principale della comunità scientifica. Poiché il cuore dei mammiferi adulti ha una capacità rigenerativa molto limitata, con un tasso di rinnovo stimato dei cardiomiocisti inferiore all'1%all'anno,è fondamentale identificare in modo affidabile gli eventi prolifertivi cardiomiocato3,4 . La maggior parte delle strategie che misurano gli eventi proliferistivi si basano sia sulla colorazione per gli analoghi nucleotidi di DNA incorporati per valutare la proliferazione precedente o corrente, sia sulla macchia per i marcatori nucleari della proliferazione attiva5. È particolarmente importante identificare in modo affidabile gli eventi prolifertivi cardiomiociti poiché il numero complessivo di cardiomiociti proliferitivi è così basso3,6. Ad esempio, sulla base di un tasso di rinnovo dell'1% di cardiomiociti endogeni all'anno, ci si può aspettare di trovare tra 25 e 50 cardiomiociti per essere proliferative in qualsiasi momento nel cuore del topoadulto 7,8. Eventuali imprecisioni nell'identificazione dei nuclei di cardiomiocite potrebbero portare a risultati falsi positivi. Pertanto, è fondamentale identificare in modo affidabile i nuclei cardiomiocati, che si sono dimostrati difficili e inaffidabili dalle sezioni istologiche9. L'identificazione dei cardiomiociti è molto più accurata dalle singole cellule che dalle sezioni di tessuto in quanto potrebbe essere difficile distinguere i cardiomiociti da altri tipi di cellule anche quando si utilizzano marcatori come α-actinin, anche se PCM1 potrebbe essere un marcatore affidabile di nuclei cardiomiociti nelle sezioni istologiche10.
I protocolli attuali si basano sull'isolamento dei cardiomiociti vivi prima della fissazione, che è noto per causare la morte di almeno il 30% dei cardiomiociti, e potrebbe portare a selezione involontaria di popolazioni specifiche di cardiomiociti11. Inoltre, questi protocolli sono notoriamente difficili da ottimizzare per fornire risultati riproducibili. Anche le tecniche di isolamento ottimizzate possono in genere produrre non più del 65% di cardiomiociti vivi a forma di asta con rese variabili12.
Per superare questi problemi, abbiamo sviluppato un protocollo che consente ai ricercatori di isolare cardiomiociti fissi. Poiché i campioni sono fissati prima dell'isolamento, la resa viene massimizzata e la morfologia in vivo è ben conservata. Inoltre, con questo protocollo è possibile isolare i cardiomiociti da campioni clinici, che sono in genere fissati immediatamente dopo l'approvvigionamento. Inoltre, per identificare i cardiomiociti appena generati, è importante misurare lo stato di nucleazione e ploiato dei singoli cardiomiociti, poiché solo i cardiomiociti diploidi sono tipicamente considerati di nuova formazione. La citometria del flusso non è in grado di distinguere la multinucleazione dalla poliploizia ed è un protocollo relativamente dissidrica e di risorse. La struttura manuale e la misurazione dei nuclei all'interno delle immagini sono molto poco elaborate e soggette a pregiudizi umani. La quantificazione automatizzata delle immagini di cardiomiociti fissi e isolati macchiati da DAPI risolve entrambi questi problemi. La determinazione basata sull'imaging delle distribuzioni di nucleazione e ploiy può essere ottenuta con un minimo di tempo e reagenti utilizzando attrezzature di base.
Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti conformemente alle linee guida del National Institutes of Health e approvati dalla University of Minnesota Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Preparazione delle soluzioni e delle attrezzature chirurgiche
- Prima dell'isolamento, sterilizzare l'apparecchiatura chirurgica utilizzando la soluzione di etanolo al 70%.
- Aggiungere 2,24 g di KCl alla soluzione di salina tamponata al fosfato (PBS) da 500 mL per ottenere una concentrazione finale di 60 mM. Conservare la soluzione KCl-PBS a temperatura ambiente. Utilizzare 3 mL di soluzione KCl-PBS per mouse.
- Diluire la soluzione di paraformaldeide (PFA) del 32% con PBS in per ottenere una concentrazione finale del 4% di PFA. Preparare 10 mL del 4% di PFA in PBS per mouse. La soluzione PFA diluita può essere conservata a 4 gradi centigradi per 2-3 settimane in un contenitore di vetro.
NOTA: la soluzione PFA preparata al 4% può essere conservata a -20 gradi centigradi per periodi di tempo più lunghi. - Preparare 1 mL di soluzione di collagenasi per topo aggiungendo 60 mg di collagenasi, digitare 2 per 1 mL di PBS.
2. Perfusione e fissazione del cuore
- Anestesizzare l'animale utilizzando 2-5% isoflurane con una velocità di flusso di ossigeno di 1 L/min. Confermare l'anestesia confermando la mancanza di movimento e la minore velocità respiratoria.
NOTA: L'iniezione di epatina (100-500 U/kg) prima dell'eutanasia può aumentare la qualità e la resa delle cellule prevenendo i coaguli di sangue, consentendo così una perfusione più efficiente del cuore con fissativo. - Eutanasia dell'animale secondo le metodologie approvate.
NOTA: Abbiamo seguito le linee guida dell'American Veterinary Medical Association per l'eutanasia degli animali e abbiamo ottenuto l'approvazione locale della IACUC per l'eutanasia. - Posizionare l'animale eutanasia in posizione supina, e nastro adesivo verso il basso gli arti estesi.
- Tagliare il petto per esporre il cuore utilizzando forbici smussate. Tagliare l'aorta discendente e la vena caval inferiore.
- Perfuse il cuore iniettando 3 mL di soluzione KCl-PBS attraverso il ventricolo sinistro con una velocità di 3 mL/min utilizzando una pompa peristaltica attaccata a un set di infusione con un ago farfalla 23 G (26 G per i neonati). Assicurarsi di non perforare attraverso il setto.
NOTA: In alternativa, utilizzare un ago attaccato a una siringa per iniettare soluzioni. - Perfuse il cuore iniettando 10 mL di 4% soluzione PFA per 10 min utilizzando una pompa peristaltica ad una velocità di 1 mL/ min.
- Rimuovere tutto il cuore con le forbici. Dopo aver rimosso il cuore, è possibile isolare una regione specifica del cuore increde. Posizionare il cuore, o un segmento di esso in un tubo microcentrifrifuge da 1,5 mL contenente 1 mL di soluzione PFA del 4%. Incubare il cuore su rocker a temperatura ambiente con velocità a dondolo tra 20-30 rpm per 1 h.
3. Isolamento dei cardiomiociti fissi
- Mettere il cuore in un piatto Petri contenente soluzione PBS. Spremere il cuore per sbarazzarsi di qualsiasi PFA rimanente in ventricoli, e lavare in PBS.
- Mettere il cuore fisso in un nuovo tubo microcentrifuge da 1,5 mL contenente soluzione di collagenasi (60 mg/mL). Posizionare il tubo sul rocker (20-30 rpm) a 37 gradi centigradi per l'incubazione notturna.
NOTA: Estendere il tempo di incubazione fino a 1 settimana e ricostituire la soluzione di collagenasi ogni due giorni per ridurre la possibile variazione di resa se si prevede che i cuori siano fibrotici, che potrebbero richiedere più tempo di digestione del collagene per digerire il collagene extracellulare. - Mettere la soluzione di collagenasi e il cuore in un piatto Petri da 35 mm. Dissociare il cuore in pezzi da 1 mm utilizzando le forbici o le forbici.
- Utilizzare una pipetta di trasferimento per triturare ulteriormente il tessuto dissociato per 2 min. Se le particelle di tessuto rimangono ancora nel piatto, utilizzare una pipetta di trasferimento con apertura più stretta e continuare la triturazione. Continuare fino a quando la maggior parte del tessuto è ripartito.
NOTA: Oltre la triturazione provoca la rottura dei singoli cardiomiociti. Assicurarsi di non sopra triturare controllando regolarmente al microscopio. - Posizionare una rete di nylon da 200-600 m sopra l'apertura del tubo di centrifuga da 15 mL.
NOTA: Per i cardiomiociti ipertrofati, si consiglia di utilizzare una rete di nylon da 400 m invece di 200 m. - Aggiungere 5 mL di PBS al piatto Petri contenente cellule dissociate e filtrare la soluzione attraverso la rete di nylon, comprese le particelle di tessuto. Lavare la maglia di nylon passando ulteriori 4 mL PBS.
- Centrifugare la soluzione filtrata a 10-100 x g per 1 min.
NOTA: la centrifugazione 100 x g non produrrà una popolazione di cardiomiocazione pura al 100%, e alcune cellule non cardiomiocato saranno probabilmente incluse. - Scartare il supernatant a meno che non si vuole macchiare / valutare le cellule cardiache non cardiomiociti pure. Rispendere il pellet in PBS da 10 mL prima della colorazione.
4. Cardiomiociti di colorazione
- Raccogliere le cellule per centrifugazione a 100 x g per 1 min e aggiungere 5 mL di soluzione di permeabilizzazione (ad esempio, 0,5% Triton X-100 in PBS). Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente su rocker.
NOTA: Per i punti 4.1, 4.2 e 4.4 utilizzare tubi centrifuga da 15 mL in quanto è più facile rimuovere il supernatant senza disturbare il pellet cellulare rispetto ai tubi microcentrifuge da 1,5 mL. - Raccogliere le cellule per centrifugazione a 100 x g per 1 min, aggiungere 5 mL di buffer di blocco (ad esempio, 3% di albume di siero bovino [BSA] in PBS) e incubare per 30 min a temperatura ambiente su un rocker.
- Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 100 x g per 1 min e aggiungere 1 mL di soluzione anticorpo primaria (in PBS) con il rapporto di diluizione appropriato. Trasferire la soluzione in un tubo di microcentrifuge da 1,5 mL e incubare cardiomiociti in soluzione di anticorpi primari in condizioni ottimizzate (ad esempio, 4 gradi centigradi durante la notte).
- Trasferire i cardiomiociti con soluzione anticorpo primaria in un tubo di centrifuga di 15 mL e aggiungere 9 mL di PBS. Incubare i cardiomiociti per 10 minuti a temperatura ambiente su un rocker.
- Raccogliere le cellule per centrifugazione a 100 x g per 1 min e aggiungere 10 mL di PBS. Incubare i cardiomiociti per 10 minuti a temperatura ambiente su un rocker. Ripetere questo passaggio ancora una volta.
- Raccogliere le cellule per centrifugazione a 100 x g per 1 min e aggiungere la soluzione anticorpo secondaria contenente DAPI. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente su un rocker, seguito da ripetere il passo 4.5 due volte per lavare i cardiomiociti.
- Posizionare le cellule su copertine o piastre compatibili con il microscopio e procedere con l'imaging.
NOTA: le immagini incluse nel manoscritto sono state scattate con obiettivi 10x e 40x. I laser utilizzati sono stati: 405 nm per DAPI, 561 nm per Alpha actinin e 640 nm per Edu.
5. Installazione del software di imaging
NOTA: seguire questi passaggi utilizzando Il file supplementare 1-SoftwareScreenshots.pdf.
- Scarica la distribuzione Fiji di ImageJ.
- Aprire Fiji. Fare clic su Aiuto > Aggiorna... > Gestisci siti di aggiornamento. Controllare i siti di aggiornamento "IJPB-plugins" e "Biomedgroup" per scaricare i plugin dipendenze Ellipse Split e Morpholibj.
- Fare clic su Chiudi. Figi dovrebbe iniziare a scaricare le dipendenze. Al termine, riavviare Fiji.
- Scaricare Rstudio e aprirlo.
- Copiare install.packages(c("ggplot2", "autothresholdr", "dplyr", "purrr", "jsonlite", "shiny")) nella riga di comando della console R e premere il tasto Invio. Digitare "y" in risposta a tutte le richieste di installazione di tutte le dipendenze R (Schermata 1 in File supplementare 1).
6. Quantificazione dell'immagine
- Aprire Fiji e trascinare "AnalyzeNucleation.py" (fornito come file di codice supplementare) nella barra di stato di Fiji. Si aprirà una finestra di modifica dello script. Fare clic su Esegui nell'angolo inferiore sinistro per iniziare (Schermata 2 in File supplementare 1).
- Verrà visualizzata una finestra di dialogo(File supplementare 1: Schermata 3), in cui viene chiesto il percorso della directory dei dati di output. Tutti i dati di analisi, le cifre e altri dati utilizzati da questo software verranno memorizzati in questa cartella. Verrà visualizzata un'altra finestra di dialogo più grande, che visualizza tutte le impostazioni di analisi delle immagini (File supplementare 1: Schermata 4).
- Selezionare la posizione della directory contenente le immagini da analizzare.
- Immettere il formato del nome file dell'immagine utilizzando le espressioni regolari. Immettere il formato del nome file dell'immagine, che indica quali parti del nome file corrispondono a riga, colonna, canale e (facoltativamente) sito tra parentesi graffe, utilizzando espressioni regolari. Non inserire spazi all'interno delle parentesi graffe. Racchiudere le parti variabili del formato del nome file tra parentesi graffe. Il modo in cui i file vengono salvati dipende dal software di imaging, e questo passaggio recupererà le informazioni rilevanti dal nome del file dell'immagine.
NOTA: ad esempio, la stringa di formato
r" Piastra 1-(? P[A-a-z])(? P [0-9]-)-(? P [A-a-z].tif"
descrive un nome file che inizia con "Plate 1-", seguito da una o più lettere alfabetiche che indicano la riga, seguita da una o più cifre che indicano la colonna, seguita da "-", seguita da una o più lettere che indicano il canale, seguito da ".tif". Le lettere all'interno delle parentesi angolari come "<>" sono nomi di variabili e vengono copiate automaticamente nei dati quando vengono raccolte. Uno dei nomi di variabile deve essere "" - Indicare il nome dei canali in cui la macchia nucleare è visibile e dove sono visibili i cardiomiociti. Questi nomi devono essere esattamente come sono nella parte corrispondente alla variabile "
" nei nomi dei nomi di file delle espressioni regolari. - Indicare come raggruppare le immagini utilizzando nomi di variabili delimitati da virgole. Tutte le immagini all'interno di un determinato gruppo verranno aperte e analizzate in un unico batch. Ad esempio, se le immagini sono suddivise in set per ogni pozzo e c'è un pozzo per ogni combinazione univoca di riga e colonna, scrivere "riga, colonna" in questo campo.
NOTA: queste variabili di raggruppamento devono essere un sottoinsieme delle variabili utilizzate nella stringa di formato. Non utilizzare "canale" come variabile di raggruppamento, questo separerà le immagini del canale corrispondenti l'una dall'altra. - Indicare se le immagini sono cucite insieme in un'unica immagine di pozzo o sono separate per ogni sito. Nel primo caso, il sito non deve essere indicato nella stringa di formato del nome file.
- Scegliere il metodo di soglia da utilizzare per separare i nuclei dallo sfondo. Tutti i metodi di soglia standard delle Fiji sono disponibili. Testare diversi metodi di soglia per determinare quale funziona meglio per il set di immagini. In questo esempio, scegliere il metodo Otsu.
- Indicare se la soglia deve essere ricalcolata o meno per ogni immagine del sito o se deve essere utilizzata la stessa soglia per ogni immagine del gruppo. Indicare se le immagini cardiomiocizzate sono di colore luminoso o utilizzare un marcatore fluorescente.
- Indicare il metodo di soglia cardiomiocato. Se nel passaggio precedente è stato scelto brightfield, questo metodo di soglia verrà applicato alle immagini di campo luminoso filtrate perimetrali. Indicare se la soglia deve essere ricalcolata o meno per ogni immagine del sito o se deve essere utilizzata la stessa soglia per ogni immagine del gruppo.
- Indicare il numero di righe di immagini del sito che coprono ogni pozzo. Indicare il numero di colonne di immagini del sito che coprono ogni pozzo. Indicare l'area minima dei nuclei in pixel. Utilizzare una dimensione minima generosamente bassa, nella fase di analisi verrà calcolata una soglia più alta e più precisa. Indicare l'area minima dei cardiomiociti.
- Dopo aver scelto le impostazioni desiderate, fare clic su OK.
- Immagini simili a quelle presenti in Figura 3 e Figura 4 verrà visualizzato sullo schermo, che mostra le diverse fasi della pipeline di analisi. Esaminare queste immagini per assicurarsi che la soglia e la segmentazione si verifichino correttamente.
- La cartella dei risultati selezionata dovrebbe ora essere riempita con i dati di analisi (File supplementare 1: Schermata 5). I file diversi dai dati di analisi possono essere salvati in modo sicuro in questa cartella, purché i loro nomi non inizino con "cm_", "nuclei_" o "nucleilink_".
7. Analisi dei dati
NOTA: i file csv prodotti possono essere analizzati manualmente. Ogni sottoinsieme di immagini analizzate produce una tripletta di file csv denominati "nuclei(metadata).csv", "nucleilink(metadata).csv" e "cardiomyocytes(metadata),csv", dove (metadati) viene sostituito con una sequenza di coppie nome-valore nel formato "_(name)-(value)", dove (nome) e (valore) sono sequenze di caratteri alfanumerici derivati da stringhe corrispondenti nell'espressione regolare specificata in precedenza. (Ad esempio, se la riga e la colonna sono state indicate nei nomi di file, saranno presenti stringhe come "_row"F" e "_column-8". La colonna più a sinistra senza nome di ogni file nuclei e nucleilink è un numero ID nucleo. La colonna "Min" del file nucleilink è l'ID del cardiomiocato che conteneva detto nucleo interamente o 0 in caso contrario. La colonna "Max" dei nuclei è l'ID del cardiomiocito più alto che conteneva detto nucleo in parte, o 0 in caso contrario. La colonna "Mean" del file cardiomiociti è il numero id cardiomiociti.
- Aprire "AnalyzeMultinucleatedServer.R" in Rstudio (fornito come file di codice supplementare).
- All'inizio di questo file è presente una variabile denominata "folderName". Accanto ad esso è un percorso di file. In qui digitare il percorso della cartella dei dati di output selezionata nell'ultimo passaggio, senza la barra finale ( File 1: ).
- Nell'angolo superiore sinistro della finestra di modifica dello script dovrebbe essere presente una freccia verde con l'etichetta Esegui app. Fare clic su questa freccia. Il caricamento dei dati e l'app potrebbero richiedere del tempo.
- Inizialmente, saranno visibili tre grafici di gating, uno per indicare la soglia minima valida dell'area nucleare, uno per indicare la soglia minima valida di intensità media nucleare e uno per indicare il diametro minimo valido per i cardiomiociti. Utilizzare i dispositivi di scorrimento per impostare queste soglie (File supplementare 1: Schermata 7).
NOTA: In ciascuno di questi grafici dovrebbe essere presente un grande picco ampio corrispondente a nuclei o cardiomiociti validi, affiancato da ampie code che rappresentano detriti o cardiomiociti segmentati errati. Utilizzare le soglie per tagliare una coda di ciascuno dei picchi off. - Scorrere verso il basso. Fare clic sul pulsante Applica soglie selezionate (in fondo al file supplementare 1: Schermata 7).
- Fare clic sul pulsante Distribuzione intensità di stampa. In questo modo verrà eseguito il rendering della distribuzione dell'intensità nucleare dell'intero campione e di sottotrame separate per ogni variabile di raggruppamento.
NOTA: ad esempio, se le variabili di raggruppamentoe sono state immesse nell'espressione regolare nella finestra di dialogo Figi, i grafici che indicano la distribuzione dell'intensità per riga e per colonna verranno visualizzati qui ( File 1: Schermata 8 ). Se le condizioni di illuminazione e colorazione erano costanti nelle diverse parti del campione, queste trame dovrebbero mostrare chiaramente due picchi di intensità, un dimmer, uno più alto per i nuclei diploidi e uno più luminoso e più corto per i nuclei tetraploidi. - La variazione intracampione comporterà che questo modello non sia visibile nel grafico di un intero campione e che vi sia una grande varietà nella posizione dei picchi diploidi e tetraploidi per riga, colonna o altra variabile di raggruppamento. In quest'ultimo caso, scorrere verso il basso selezionare la casella di controllo Normalizza separatamente per gruppo per tenere conto di questa variazione ( File supplementare1: Screenshot 9).
- Fare clic sul pulsante Calcola Ploidy (File supplementare 1: Screenshot 9). Fare clic sul pulsante Stampa distribuzione ploidy stimata. I grafici appariranno nelle finestre vuote a destra. Nel grafico di esempio intero normalizzato, il modello a due picchi dovrebbe essere visibile se non lo era prima.
- Selezionare le soglie per isolare i picchi diploidi e tetraploidi l'uno dall'altro e dagli outlier utilizzando i cursori (File supplementare 1: Schermata 9). Scorrere verso il basso. Fare clic sul pulsante Calcola Ploidy e Nucleation (Supplementary File 1: Screenshot 10).
- Fare clic sul pulsante Stampa e salva nella cartella dei risultati. Il grafico salvato nella cartella dei risultati selezionata verrà visualizzato anche in questa finestra interattiva (File supplementare 1: Screenshot 10).
Representative Results
I cardiomiociti sono stati isolati secondo il protocollo sopra descritto. Utilizzando questo metodo, in genere si ottengono cardiomiociti singolari uniformemente che sono relativamente puri senza contaminare le cellule non cardiomiociti (Figura 1A). I cardiomiociti sono facilmente identificabili sotto la microscopia a campo luminoso a causa delle loro dimensioni caratteristiche e della biriferingenza. Questa tecnica è facile da implementare e fornisce risultati coerenti da diversi isolazioni con rendimenti e qualità di cardiomioc primiti comparabili (Figura 1B). I cardiomiociti isolati possono essere conservati a 4 gradi centigradi per diverse settimane prima di un ulteriore utilizzo.
I cardiomiociti che sono stati isolati secondo il protocollo di cui sopra possono essere utilizzati per varie applicazioni a valle, come la misurazione delle dimensioni dei cardiomiociti, lo ploiato cardiomiocite e l'immunocitochimica. Come risultato rappresentativo, mostriamo che i cardiomiociti isolati secondo questo protocollo possono essere macchiati utilizzando anticorpi e azidi fluocromatici per la chimica dei clic per rilevare la localizzazione di proteine specifiche o per rilevare rispettivamente la replicazione del DNA cardiomiocito. Ad esempio, abbiamo colorato i cardiomiociti con anticorpi che riconoscono α-actinin per mostrare il caratteristico modello di colorazione z-line dei sarcomere (Figura 2A). In un esperimento separato, abbiamo somministrato l'analogico di timidina 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ai topi prima di isolare i cardiomiociti fissi. Dopo l'isolamento cardiomiocito, abbiamo macchiato per edU incorporato utilizzando i protocolli standard13, e siamo stati in grado di rilevare cardiomiociti che avevano subito S fase in cardiomiociti mononucleati, binucleati e trinucleati (Figura 2B).
Per espandere ulteriormente l'utilità del metodo di isolamento, abbiamo sviluppato una pipeline che permette la quantificazione dello ploiato cardiomiocite basato sulla colorazione integrata del DNA. Per essere in grado di misurare lo stato di ploiy di cellule o nuclei, avevamo bisogno di segmentare nuclei e cardiomiociti. La figura 3 mostra una rappresentazione della strategia utilizzata per identificare i singoli nuclei. In primo luogo, l'immagine originale dell'immagine macchiata (Figura 3A) è soglieta in base all'intensità (Figura 3B). Qui, abbiamo usato DAPI per macchiare il DNA, ma qualsiasi altro colorante nucleare che mostra una correlazione lineare con il contenuto di DNA avrebbe funzionato. Il programma consente di scegliere uno qualsiasi dei metodi di soglia di intensità delle Fiji, ma in questo esempio è stato utilizzato il metodo di Otsu. Vengono escluse le maschere nucleari che toccano il bordo dell'immagine o sono più piccole della soglia minima di area pixel specificata. Quindi, le ellissi sono adatte alle maschere nucleari, segmentando i singoli nuclei. Figura 3C mostra queste ellissi sovrapposte sull'immagine originale. Successivamente, i fori vengono riempiti nelle maschere e i pixel dell'immagine vengono quindi partizionati in territori in base all'ellisse a cui sono più prossimali (Figura 3D). I confini di questi territori vengono quindi utilizzati per tracciare linee attraverso ammassi nucleari, terminando il processo di segmentazione nucleare (Figura 3E).
Il passo successivo prevede il rilevamento di cardiomiociti. Per le immagini di cardiomiocate che si ottengono sulla base di cellule macchiate fluorescenti (Figura 4A), il processo è molto simile a quello per i nuclei. L'immagine viene soglieta in base a un valore di intensità calcolato dal metodo di soglia selezionato, in questo caso il metodo del triangolo. Le maschere cardiomiociti identificate che toccano il contorno dell'immagine o sono al di sotto di una certa dimensione sono escluse e i fori vengono riempiti nelle maschere per fornire cardiomiociti adeguatamente segmentati (Figura 4B). Poiché i cardiomiociti hanno una forma più irregolare rispetto ai nuclei, non viene effettuato alcun tentativo di segmentare i cluster di cardiomiociti. Al contrario, questi cluster sono esclusi in base al loro alto diametro minimo di Feret durante la fase di analisi. La segmentazione da immagini di campi luminosi procede in modo leggermente diverso. In primo luogo, l'immagine del campo luminoso originale (Figura 4C) viene elaborata con un filtro bordo Sobel. Questo filtro calcola il valore assoluto della sfumatura di ogni pixel all'interno dell'immagine. I pixel nelle aree con modifiche rapide ricevono valori elevati e i pixel nelle aree smussati dell'immagine ricevono valori bassi. Questa immagine filtrata per bordi viene quindi soglieta dall'intensità, utilizzando il metodo Triangle, con conseguente cardiomiociti mascherati (Figura 4D). Queste maschere altamente irregolari vengono quindi levigate e collegate tra loro tramite chiusura morfologica utilizzando un cerchio con un raggio di 2 pixel, che riempie tutte le aree bianche dell'immagine in cui il cerchio non può adattarsi senza sovrapporre una regione nera (Figura 4E). Infine, i fori nelle maschere vengono riempiti, le regioni che toccano il bordo vengono escluse e le piccole particelle vengono rimosse, terminando il processo di segmentazione cardiomiocato (Figura 4F).
Utilizzando la strategia di segmentazione delineata, possiamo quindi determinare lo stato di nucleazione dei singoli cardiomiociti. Utilizzando questo approccio, abbiamo determinato lo stato di nucleazione dei cardiomiociti isolati dai cuori dei topi CD-1 outbred nei primi time-point postnatali. I cuori dei topi neonati (primo giorno di vita) hanno mostrato che la maggior parte dei cardiomiociti a quel punto sono mononucleati(Figura 5: neonatale). Questa alta frequenza di cardiomiociti mononucleati è molto più bassa nei topi giovani (2 settimane), dove i cardiomiociti mononucleati costituiscono circa il 25% della popolazione cardiomiocata totale(Figura 5: giovanile). Infine, possiamo misurare lo stato di ploizza dei singoli nuclei all'interno dei cardiomiociti e determinare se sono diploidi o tetraploidi. Questi risultati mostrano una maggiore frequenza di nuclei tetraploidi nei topi adolescenti (Figura 6).
Figura 1: Efficienza dell'isolamento cardiomiocato dopo la fissazione. (A) Immagine rappresentativa di cardiomiociti isolati macchiati con DAPI per mostrare i nuclei. (DAPI (blu), Campo luminoso (grigio)) (B) Rendimento di cardiomiociti isolati da topi diversi a 3 mesi di età. Barre di scala : 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immunocitochimica dei cardiomiociti isolati. (A) Immagine rappresentativa di cardiomiociti macchiati per α-actinin (α-actinin (rosso) e DAPI (blu)). (B) Cardiomiociti macchiati per EdU incorporato (rosso) e DAPI (blu). Vengono mostrati cardiomiociti rappresentativi mononucleati (a sinistra), binucleati (al centro) e trinucleati (a destra) ed EdU positivi. Barre di scala : 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Strategia per la segmentazione nucleare. (A) Immagine del canale DAPI originale. (B) Immagine con soglia (in questo esempio è stato utilizzato il metodo Otsu). (C) Maschere identificate dalle immagini con soglia sovrapposte sull'immagine macchiata DAPI originale. (D) Tassellatura Voronoi basata su maschere nucleari. (E) Nuclei segmentati finali, con cluster divisi evidenziati. Barre di scala : 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Strategia per la segmentazione dei cardiomiocti. (A) Immagine originale fluorescente Troponin I macchiato di cardiomiocate. (B) Immagine con soglia triangolare, dopo aver riempito i fori ed escludendo gli oggetti piccoli e quelli che toccano il bordo. (C) Immagine cardiomiocite originale (D) Immagine cardiomiocata filtrata e triangolata (E) Immagine filtrata per bordi dopo la chiusura morfologica con un raggio di due pixel ( F )Stessaimmagine dopo aver riempito i fori ed escludendo gli oggetti piccoli e quelli che toccano il bordo. Barre di scala : 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Classificazione dei cardiomiociti in base al numero di nuclei. I cuori neonatali (di 1 giorno) contengono più cardiomiociti mononucleati rispetto ai cuori giovani (14 giorni fa). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Distribuzione del contenuto di DNA cardiomiocato per nucleo. Nei neonati (a sinistra), il 13,5% dei nuclei CM mononucleati sono tetraploidi e l'11,9% dei nuclei CM binucleati sono tetraploidi. Nei giovani (a destra), il 33,9% dei nuclei CM mononucleati sono tetraploidi e il 31,2% dei nuclei CM binucleati sono tetraploidi. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File supplementare 1: Schermate software. Si prega di fare clic qui per visualizzare questo file (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
File supplementare 2: AnalyzeNucleation.py. Si prega di fare clic qui per visualizzare questo file (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
File supplementare 3: AnalyzeMultinucleatedServer.R. Si prega di fare clic qui per visualizzare questo file (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
Discussion
Poiché i cardiomiociti non possono essere mantenuti in coltura, è importante isolare i cardiomiociti primari per poter studiare la loro architettura e la funzione11. Quindi, le tecniche di isolamento cardiomiocato sono state ampiamente utilizzate in campo cardiaco. Se l'obiettivo è quello di determinare gli aspetti funzionali dei cardiomiociti, è importante isolare i cardiomiociti vitali. Questi cardiomiociti vivi possono essere utilizzati anche per eseguire l'immunostaining su cardiomiociti isolati. Tuttavia, ottimizzare la tecnica di isolare i cardiomiociti vivi è tecnicamente impegnativo, e anche le migliori tecniche in genere producono solo cardiomiociti a forma di asta dal vivo, e i cardiomiociti rimanenti sono tutti a palla e morentio morti 11,12. Qui, abbiamo sviluppato una tecnica che permetterà ai ricercatori di riparare prima il cuore e quindi isolare i cardiomiociti in modo efficiente. Questo nuovo protocollo consente rese molto più elevate di cardiomiociti a forma di asta rispetto ai protocolli pubblicati in precedenza. Inoltre, abbiamo sviluppato una piattaforma di analisi dell'imaging per classificare automaticamente i cardiomiociti in base alla nucleazione e alla ploizia. Con queste nuove metodologie, i gruppi possono macchiare i cardiomiociti per diverse proteine e studiare lo stato di ploizia e nucleazione come surrogati per il potenziale rigenerativo del cuore.
Il protocollo qui descritto è relativamente semplice e può essere eseguito senza alcuna apparecchiatura avanzata. La quantità di collagenasi e il tempo di incubazione per la digestione può variare a seconda del lotto di collagenasi e della società che lo fornisce. Abbiamo usato collagenasi tipo 2, dal momento che questo è più ampiamente utilizzato per digerire il cuore per ottenere cardiomiociti vivi. Sulla base delle nostre osservazioni, abbiamo determinato che l'incubazione durante la notte con 60 mg/mL collagenasi tipo 2 è ottimale per quasi tutti i cuori di topo indipendentemente dal livello di fibrosi. Non abbiamo mai avuto un problema di overdigestion in quanto le proteine intracellulari sono fisse e non accessibili come il collagene extracellulare. Tuttavia, se il cuore non viene digerito correttamente, potrebbe essere necessaria una triturazione più vigorosa, che causa la frammentazione cellulare a causa dello stress di taglio. Pertanto, è fondamentale assicurarsi che il cuore sia digerito correttamente prima di passare alla triturazione. La rigidità del cuore può essere testata stringendo con le forcecce per valutare il grado di digestione. Dopo l'incubazione con collagenasi, i cuori dovrebbero essere meno rigidi e facili da strappare. Possono essere utilizzati anche altri tipi di collagenasi. Un rapporto precedente utilizzato una combinazione di collagenasi B e D14.
Inoltre, riteniamo che questo protocollo possa essere utilizzato per valutare il numero complessivo di cardiomiociti nel cuore15. Tuttavia, se l'obiettivo è quello di ottenere e quantificare tutti i cardiomiociti dal cuore, è importante incubare i cuori per lunghi periodi di tempo nella soluzione collagenase (ad esempio, 3-7 giorni), dove la soluzione di collagenasi deve essere rifornita una volta al giorno. Ciò ridurrà al minimo le incoerenze nell'efficienza dell'isolamento eliminando l'impatto del grado di triturazione sulla resa cardiomiocite.
L'uso del contenuto di DNA per misurare lo stratagemma non è nuovo ed è stato utilizzato nella citometria di flusso per decenni. Recentemente, è stato dimostrato che la microscopia può essere utilizzata allo stesso modo per stimare il contenuto di DNA per nucleo16. Qui, abbiamo implementato questa strategia per misurare lo ploidy dei nuclei cardiomiociti, come surrogato per i cardiomiociti di nuova formazione. Il dogma nel campo della rigenerazione cardiaca è che solo i cardiomiociti mononucleati e diploidi possono sottoporsi a citocinesi e dare origine a nuovi cardiomiociti. Dal momento che è molto difficile misurare la formazione di nuovi cardiomiociti in vivo, isolando i cardiomiociti che sono stati inseguiti dopo la somministrazione di un nucleotide di DNA analogico e determinando il livello di cardiomiociti mononucleati e diploidi è stato utilizzato come approssimazione della capacità del cuore di generare nuovi cardiomiociti17. Qui, forniamo una macro per ImageJ che consente una facile quantificazione dello ploiy cardiomiocite. Come minimo, 500 nuclei devono essere misurati per ottenere una stima accurata della posizione del picco del G1. Se si fa attenzione a garantire che le condizioni di colorazione e imaging siano coerenti in ogni pozzo della lastra con immagine, solo 500 nuclei nell'intero campione devono essere immaginati, altrimenti devono essere presenti 500 nuclei per gruppo di immagini18,19. Le limitazioni della misurazione basata sull'imaging della nucleazione e dello ploiy includono difficoltà a distinguere i nuclei dalle cellule aderenti dai nuclei cardiomiocati effettivi, quando si utilizzano immagini bidimensionali. Tali cellule aderenti potrebbero comportare una sopravvalutazione della quantità di cellule multinucleate e diminuire la precisione delle misurazioni della popolazione del nucleo di cardiomiocito tetraploide. Una possibile strategia per risolvere questo problema sarebbe quella di utilizzare il marcatore nucleare cardiomiocato PCM16,20. Tuttavia, abbiamo avuto difficoltà a ottenere una colorazione affidabile PCM1 su cellule o tessuti correttamente fissati.
Un'altra potenziale limitazione è che alcune immagini di macchie nucleari potrebbero avere una significativa colorazione citoplasmica di sfondo, impedendo una corretta soglia utilizzando i metodi costruiti da Fiji senza un'estesa pre-elaborazione. Inoltre, il contributo irregolare di questa fluorescenza di fondo nelle stime di ploiato ne riduce la precisione. Inoltre, se le cellule non vengono lasciate nella soluzione di colorazione del DNA per un tempo sufficiente, il colorante fluorescente non si legherà alla saturazione all'interno dei nuclei e l'ipotesi di una relazione lineare tra intensità integrata nucleare e contenuto di DNA non sarà più accurata.
Va notato che il software non può segmentare cluster cardiomiocate e invece li rimuove dall'analisi. Pertanto, è di fondamentale importanza seminare cardiomiociti a densità relativamente bassa (ad esempio, 1000 cellule/cm2). Inoltre, il software non è in grado di distinguere tra due cardiomiociti allineati end-to-end e lunghi, singolari cardiomiociti. Questi tipi di cluster potrebbero erroneamente gonfiare le stime multinucleazione.
Anche se il metodo descritto non consente di ottenere cardiomiociti vitali e quindi non può essere utilizzato per misurare i processi cellulari dinamici, se l'obiettivo è quello di eseguire l'immunostaining, crediamo che il metodo descritto sia superiore ai protocolli esistenti con rese più elevate di cardiomiociti e una migliore qualità in termini di morfologia e localizzazione delle proteine. Infine, il metodo descritto potrebbe essere utilizzato per isolare i cardiomiociti dai campioni clinici14,21. Crediamo che la metodologia descritta possa aiutare diversi ricercatori a ottenere cardiomiociti di alta qualità e misurare la nucleazione e lo ploiato come surrogati per la formazione di nuovi cardiomiociti.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
JHvB è supportato da sovvenzioni del NIH, Regenerative Medicine Minnesota, e da un premio individuale di ricerca biomedica della Hartwell Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 wells plate for imaging | Corning | 3340 | We use these plates as they are suitable for imaging, although glass bottom plates would be better for confocal imaging |
| Alpha actinin | Novus Biologicals | NBP1-32462 | This antibody is used as a marker of cardiomyocyte sarcomeres |
| Blunt scissors | Fine Scissor Tools | 14072-10 | We prefer blunt scissors as the possibility of tearing heart tissue is lower when exposing the heart |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population |
| CD-1 mice | Charles river | 22 | Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population |
| Collagenase 2 | Worthington | LS004177 | For the purpose of this protocol, the batch to batch differences are minimal and don't affect overall yield and quality of the isolation |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 203165-10G | For edu staining |
| Cy5 Picolyl Azide | Click Chemistry Tools | 1177-25 | Azide used for edu staining |
| Cytation3 | BioTek | - | Used for automated imaging for DNA analysis |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | DAPI used for DNA staining. Stocks were dissolved in distilled water. |
| donkey anti-mouse IgG-Alexa568 | Life Technologies | A10037 | Secondary antibody used to detect alpha actinin staining within cardiomyocytes |
| Forceps | ROBOZ | RS-5137 | We use these curved, blunt forceps, although straight forceps could also be used |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144212 | To set pH of Tris-HCl buffer to pH 8.5 |
| ImageJ | imagej.net/Fiji/Downloads | - | Used for analyzing images |
| L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 255564-100G | For edu staining |
| Needle for infusion | TERUMO | SV*23BLK | We use winged infusion sets throughout the protocol as it is easy to manipulate the position of the needle with these sets during injection |
| Nikon A1R HD25 | Nikon | - | Used to take confocal images of alpha actinin staining |
| Nylon mesh 200 micron | Elko filtering | 03-200/54 | Mesh used for filtering regular cardiomyocytes (not hypertrophied) |
| Nylon mesh 400 micron | Elko filtering | 06-400/38 | Mesh used for filtering hypertrophied adult cardiomyocytes |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | Corning | 21-040-CV | This can also be prepared in the lab. Although sterility is important in this experiment, we think it is sufficient to prepare PBS and filtering it |
| Potassium chloride, Granular | Mallinckrodt | 6858 | Granular potassium chloride was preffered by us as it forms less aggregates when stored in room temperature |
| R | r-project.org | - | Used for data analysis of the measurements obtained from images |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | Used to buffer EdU staining reaction |
References
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135 (10), e146 (2017).
- Heidenreich, P. A., et al. Forecasting the future of cardiovascular disease in the United States: a policy statement from the American Heart Association. Circulation. 123 (8), 933-944 (2011).
- Eschenhagen, T., et al. Cardiomyocyte Regeneration: A Consensus Statement. Circulation. 136 (7), 680-686 (2017).
- Tzahor, E., Poss, K. D. Cardiac regeneration strategies: Staying young at heart. Science. 356 (6342), 1035-1039 (2017).
- Bergmann, O., et al. Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart. Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).
- Richardson, G. D. Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
- Ang, K. L., et al. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 298 (6), C1603-C1609 (2010).
- Bergmann, O., et al. Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover. Experimental Cell Research. 317 (2), 188-194 (2011).
- O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Shaklee, J., et al. Development of a Click-Chemistry Reagent Compatible with Mass Cytometry. Scientific Reports. 8 (1), 6657 (2018).
- Mollova, M., et al. Cardiomyocyte proliferation contributes to heart growth in young humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1446-1451 (2013).
- Naqvi, N., et al. A proliferative burst during preadolescence establishes the final cardiomyocyte number. Cell. 157 (4), 795-807 (2014).
- Roukos, V., Pegoraro, G., Voss, T. C., Misteli, T. Cell cycle staging of individual cells by fluorescence microscopy. Nature Protocols. 10 (2), 334-348 (2015).
- Patterson, M., et al. Frequency of mononuclear diploid cardiomyocytes underlies natural variation in heart regeneration. Nature Genetics. 49 (9), 1346-1353 (2017).
- Gomes, C. J., Harman, M. W., Centuori, S. M., Wolgemuth, C. W., Martinez, J. D. Measuring DNA content in live cells by fluorescence microscopy. Cell Division. 13, 6 (2018).
- Woo, L. A., et al. High-content phenotypic assay for proliferation of human iPSC-derived cardiomyocytes identifies L-type calcium channels as targets. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 127, 204-214 (2018).
- Morikawa, Y., Heallen, T., Leach, J., Xiao, Y., Martin, J. F. Dystrophin-glycoprotein complex sequesters Yap to inhibit cardiomyocyte proliferation. Nature. 547 (7662), 227-231 (2017).
- Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
