Summary
Målet med detta arbete är att utveckla en metod för att reproducera kardiomyocyter från det vuxna hjärtat och mäta DNA-innehåll och kärnbildning.
Abstract
Den vuxna däggdjur hjärtat är sammansatt av olika celltyper inklusive kardiomyocyter, endotelceller och fibroblaster. Eftersom det är svårt att tillförlitligt identifiera kärnor av kardiomyocyter på histologiska sektioner, många grupper är beroende av att isolera livskraftiga kardiomyocyter före fixering att utföra immunostaining. Dessa levande kardiomyocyte isolering tekniker kräver dock optimering för att maximera avkastningen, livskraft och kvalitet av proverna, med inneboende fluktuationer från prov till prov trots maximal optimering. Här rapporterar vi ett reproducerbart protokoll, som omfattar fixering före enzymatisk rötning av hjärtat, vilket leder till maximal avkastning samtidigt bevara in vivo morfologi av enskilda kardiomyocyter. Vi vidareutvecklade en automatiserad analysplattform för att fastställa antalet kärnor och DNA-innehåll per kärna för enskilda kardiomyocyter. Efter utsätta bröstet hålighet, var hjärtat greps i diastole genom perfusion med 60 mM KCl i PBS. Därefter var hjärtat fast i 4% paraformaldehyd (PFA) lösning, och sedan smälta med 60 mg/mL kollagenas lösning. Efter matsmältningar, celler var singularized av trituration, och kardiomyocyte fraktionen berikades via differential centrifugation. Isolerade kardiomyocyter var färgas för Troponin T och α-aktinin för att bedöma renhet av den erhållna befolkningen. Vidare utvecklade vi en bild analys plattform för att fastställa kardiomyocyte nucleation och ploidy status efter DAPI färgning. Bildbaserade ploidybedömningar ledde till konsekventa och reproducerbara resultat. Med detta protokoll är det således möjligt att bevara native morfologi av enskilda kardiomyocyter att tillåta immunocytokemi och DNA innehåll analys samtidigt uppnå maximal avkastning.
Introduction
Hjärtsjukdom har varit den vanligaste dödsorsaken i majoriteten av västländerna i många decennier1,2. Även om många förbättringar i behandlingen av hjärt-kärlsjukdomar har förbättrat överlevnad, Det finns för närvarande inga behandlingar som kan ersätta förlorade kardiomyocyter. Därför studier relaterade till kardiomyocyte funktion, spridning, apoptos och hypertrofi har varit och fortsätter att vara en stor fokus för det vetenskapliga samfundet. Eftersom det vuxna däggdjurshjärtat har en mycket begränsad regenerativ kapacitet, med en uppskattad kardiomyocyte förnyelsefrekvens på mindre än 1% per år, är det av avgörande betydelse att tillförlitligt identifiera kardiomyocyte proliferativa händelser3,4. De flesta strategier som mäter proliferativa händelser förlitar sig antingen på färgning för införlivade DNA nukleotid analoger för att bedöma tidigare eller nuvarande spridning, eller fläck för nukleära markörer för aktiv spridning5. Det är särskilt viktigt att på ett tillförlitligt sätt identifiera kardiomycyt proliferativa händelser eftersom det totala antalet proliferativa kardiomyocyter är så låg3,6. Till exempel, baserat på en 1% förnyelsegrad av endogena kardiomyocyter per år, kan man räkna med att hitta mellan 25 och 50 kardiomyocyter vara proliferative vid en viss tidpunkt i den vuxna musen hjärta7,8. Eventuella felaktigheter i identifiering av kardiomyocytekärnor kan leda till falska positiva resultat. Därför är det kritiskt att på ett tillförlitligt sätt identifiera kardiomycytkärnor, som har visat sig svårt och opålitliga från histologiska avsnitt9. Identifiering av kardiomyocyter är mycket mer exakt från enstaka celler än från vävnad sektioner som det kan vara svårt att skilja kardiomyocyter från andra celltyper även när man använder markörer som α-aktinin, även om PCM1 kan vara en pålitlig markör för kardiomyocyter kärnor i histologiska avsnitt10.
Nuvarande protokoll är beroende av att isolera levande kardiomyocyter före fixering, som är känt för att orsaka dödsfall på minst 30% av kardiomyocyter, och kan leda till oavsiktligt urval av specifika populationer av kardiomyocyter11. Vidare, dessa protokoll är notoriskt svårt att optimera för att ge reproducerbara resultat. Även optimerad isolering tekniker kan normalt producera högst 65% levande, stavformade kardiomyocyter med varierande avkastning12.
För att övervinna dessa frågor utvecklade vi ett protokoll som gör det möjligt för forskare att isolera fasta kardiomyocyter. Eftersom proverna är fixerade före isolering maximeras utbytet, och in vivo-morfologin är välbevarad. Dessutom, med detta protokoll är det möjligt att isolera kardiomyocyter från kliniska prover, som typiskt sett fastställas omedelbart efter upphandling. Vidare, för att identifiera nygenererade kardiomyocyter, är det viktigt att mäta kärnbildning och ploidy status av enskilda kardiomyocyter, eftersom endast diploida kardiomyocyter antas typiskt vara nybildade. Flödescytometri kan inte skilja multinucleation från polyploidy och är ett relativt tids- och resurskrävande protokoll. Manuella skissering och mätning av kärnor inom bilder är mycket låg genomströmning och benägna att mänskliga partiskhet. Automatiserad kvantifiering av bilder av fasta, isolerade DAPI-färgade kardiomyocyter löser båda dessa problem. Imaging-baserad bestämning av kärnbildning och ploidyfördelningar kan erhållas med ett minimum av tid och reagenser med hjälp av basutrustning.
Protocol
Alla djurförsök utfördes överensstämmer National Institutes of Health riktlinjer och godkänts av University of Minnesota Institutionella Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Beredning av lösningarna och den kirurgiska utrustningen
- Före isoleringen, sterilisera den kirurgiska utrustningen genom att använda 70% etanollösning.
- Tillsätt 2,24 g KCl till 500 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att få en slutkoncentration på 60 mM. Förvara KCl-PBS-lösning i rumstemperatur. Använd 3 mL KCl-PBS-lösning per mus.
- Späd 32% paraformaldehyd (PFA) lösning med PBS till att erhålla slutlig koncentration av 4% PFA. Förbered 10 mL på 4 % PFA i PBS per mus. Utspädd PFA-lösning kan förvaras vid 4 °C i 2-3 veckor i en glasbehållare.
OBS: Förberedd 4% PFA-lösning kan förvaras vid -20 °C under längre tidsperioder. - Förbered 1 mL kollagenaslösning per mus genom att tillsätta 60 mg kollagenas, typ 2 per 1 mL PBS.
2. Perfusion och fixering av hjärtat
- Bedöva djuret genom att använda 2-5% isofluran med en syreflödeshastighet på 1 L/min. Bekräfta anestesin genom att bekräfta bristande rörelse och lägre andningsfrekvens.
OBS: Injicera heparin (100-500 U/kg) före dödshjälp kan öka cellkvaliteten och utbytet genom att förebygga blodproppar och därigenom möjliggöra effektivare perfusion av hjärtat med fixativt. - Avliva djuret enligt godkända metoder.
OBS: Vi följde American Veterinary Medical Association riktlinjer för dödshjälp av djur, och fått lokala IACUC godkännande för dödshjälp. - Placera avlivade djuret i ryggläge, och tejpa ner förlängda lemmar.
- Skär genom bröstet för att exponera hjärtat med hjälp av trubbig-end sax. Skär fallande aorta och sämre kaval ven.
- Genomsyra hjärtat genom att injicera 3 mL KCl-PBS-lösning genom den vänstra ventrikeln med en flödeshastighet på 3 mL/min med hjälp av en peristaltisk pump som är fäst vid ett infusionsset med en 23 G fjärilsnål (26 G för nyfödda). Se till att inte tränga igenom septum.
OBS: Använd alternativt en nål som är fäst vid en spruta för att injicera lösningar. - Genomsyra hjärtat genom att injicera 10 mL av 4% PFA lösning i 10 min med hjälp av en peristaltisk pump med en hastighet av 1 mL/min.
- Ta bort hela hjärtat med hjälp av sax. Efter att ha avlägsnat hjärtat är det möjligt att isolera en specifik region i hjärtat genom att incising. Placera hjärtat, eller ett segment av det i ett 1,5 mL mikrocentrifugrör som innehåller 1 mL av 4% PFA-lösning. Inkubera hjärtat på vipp i rumstemperatur med gunghastighet mellan 20-30 rpm i 1 h.
3. Isolering av fasta kardiomyocyter
- Placera hjärtat i en petriskål som innehåller PBS-lösning. Pressa hjärtat för att bli av med alla PFA kvar i ventriklar, och tvätta i PBS.
- Sätt det fasta hjärtat i ett nytt 1,5 mL mikrocentrifugrör som innehåller kollagenaslösning (60 mg/mL). Placera röret på vipp (20-30 rpm) vid 37 °C för inkubering över natten.
OBS: Förläng inkubationstiden upp till 1 vecka och fyll på kollagenaslösningen varannan dag för att minska den möjliga variationen i utbyte om hjärtan förväntas vara fibrotiska, vilket kan kräva längre tid av kollagenas matsmältningen att smälta extracellulärt kollagen. - Lägg kollagenaslösning och hjärtat i en 35 mm Petriskål. Separera hjärtat i 1 mm bitar genom att använda tlyktor eller sax.
- Använd en överföringspipett för att ytterligare triturtera den dissocierade vävnaden i 2 min. Om vävnadspartiklar fortfarande finns kvar i skålen, använd en överföringspipett med smalare öppning och fortsätt trituration. Fortsätt tills majoriteten av vävnaden bryts ned.
OBS: Över trituration orsakar enskilda kardiomyocyter att bryta. Se till att inte över triturate genom att kontrollera regelbundet under ett mikroskop. - Placera ett 200-600 μm nylonnät över öppning av 15 mL centrifugrör.
OBS: För hypertrophied kardiomyocyter, rekommenderas att använda 400 μm nylon mesh i stället för 200 μm. - Tillsätt 5 mL PBS till petriskålen som innehåller dissocierade celler och filtrera lösningen genom nylonnät, inklusive vävnadspartiklar. Tvätta nylonnätet genom att passera ytterligare 4 mL PBS.
- Centrifugera den filtrerade lösningen vid 10-100 x g i 1 min.
OBS: 100 x g centrifugeringen kommer inte att ge 100% ren kardiomyocyte population, och vissa icke-kardiomyocyteceller kommer sannolikt att ingå. - Kassera supernatant om man inte vill fläcka / utvärdera icke-kardiomyocyter hjärtceller också. Resuspend pelleten i 10 mL PBS före färgning.
4. Färgning kardiomyocyter
- Samla cellerna genom centrifugering vid 100 x g i 1 min och tillsätt 5 mL permeabiliseringslösning (t.ex. 0,5% Triton X-100 i PBS). Inkubera i 20 min i rumstemperatur på vips.
OBS: För steg 4.1, 4.2 och 4.4 använd 15 mL centrifugrör eftersom det är lättare att ta bort supernatanten utan att störa cellpelletsen jämfört med 1,5 mL mikrocentrifugrör. - Samla cellerna genom centrifugation vid 100 x g i 1 min, tillsätt 5 mL blockerande buffert (t.ex. 3% bovint serumalbumin [BSA] i PBS) och inkubera i 30 min vid rumstemperatur på en vipp.
- Samla in cellerna genom centrifugering vid 100 x g i 1 min och tillsätt 1 mL primär antikroppslösning (i PBS) med lämpligt utspädningsförhållande. Överför lösningen till 1,5 mL mikrocentrifugrör och inkubera kardiomyocyter i primär antikroppslösning under optimerade förhållanden (t.ex. 4 °C över natten).
- Överför kardiomyocyter med primär antikroppslösning till ett 15 mL centrifugrör och tillsätt 9 mL PBS. Inkubera kardiomyocyterna i 10 min vid rumstemperatur på en vipp.
- Samla cellerna genom centrifugeringen vid 100 x g i 1 min och tillsätt 10 mL PBS. Inkubera kardiomyocyterna i 10 min vid rumstemperatur på en vipp. Upprepa det här steget en gång till.
- Samla in cellerna genom centrifugering vid 100 x g i 1 min och tillsätt den sekundära antikroppslösningen som innehåller DAPI. Inkubera i 30 min vid rumstemperatur på en vips, följt av upprepande steg 4,5 två gånger för att tvätta kardiomyocyter.
- Placera cellerna antingen på täcken eller mikroskopkompatibla plattor och fortsätt med avbildning.
OBS: Bilder som ingår i manuskriptet togs med 10x och 40x mål. Lasrar som användes var: 405 nm för DAPI, 561 nm för Alpha aktinin och 640 nm för Edu.
5. Programvara för bildåtergivning av installationsprogram
OBS: Följ tillsammans med dessa steg med hjälp av Tilläggsfil 1-SoftwareScreenshots.pdf.
- Ladda ner Fiji distributionen av ImageJ.
- Öppna Fiji. Klicka på Hjälp > Uppdatera... > Hantera uppdateringswebbplatser. Kontrollera "IJPB-plugins" och "Biomedgroup" uppdateringswebbplatser för att ladda ner beroenden plugins Ellipse Split och Morpholibj.
- Klicka på Stäng. Fiji bör börja ladda ner beroendena. Starta om Fiji när du är klar.
- Ladda ner Rstudio och öppna den.
- Kopiera install.packages(c("ggplot2", "autothresholdr", "dplyr", "purrr", "jsonlite", "shiny")) in i R-konsolens kommandorad och tryck på Enter-tangenten. Skriv "y" som svar på alla uppmaningar att installera alla R-beroenden (Skärmdump 1 i Tilläggsfil 1).
6. Bildkvantifiering
- Öppna Fiji och dra "AnalyzeNucleation.py" (levereras som en kompletterande kodfil) till Fijis statusfält. Då öppnas ett skriptredigeringsfönster. Klicka på Kör i det nedre vänstra hörnet för att börja den (Skärmbild 2 i Tilläggsfil 1).
- En dialogruta kommer att dyka upp (Tilläggsfil 1: Skärmdump 3), där man ber om platsen för utdatakatalogen. Alla analysdata, siffror och andra data som används av denna programvara kommer att lagras i den här mappen. En annan, större dialogruta kommer att dyka upp, visar alla inställningar bildanalys (Tilläggsfil 1: Skärmdump 4).
- Välj plats för katalog som innehåller bilder som ska analyseras.
- Ange formatet för bildfilnamn med hjälp av reguljära uttryck. Ange formatet för bildfilnamn, som anger vilka delar av filnamnet som motsvarar rad-, kolumn-, kanal- och (valfritt) plats inom klammerparenteser, med hjälp av reguljära uttryck. Lägg inte utrymmen inom tandställningen. Surroundvariabeldelar av filnamnsformatet i klammerparenteser {}. Sättet som filer sparas på beror på bildhanteringsprogrammet, och det här steget kommer att hämta relevant information från bildfilnamnet.
OBS: Till exempel formatsträngen
r" Tallrik 1-(? P[A-Za-z]+)(? P [0-9]+)-(? P [A-Za-z]+).tif"
beskriver ett filnamn som börjar med "Plate 1-", som följs av en eller flera alfabetiska bokstäver som anger raden, som följs av en eller flera siffror som anger kolumnen, som följs av "-", som följs av en eller flera bokstäver som anger kanalen, som följs av ".tif". Bokstäverna inuti vinkelparenteserna som "<>" är variabelnamn och kopieras automatiskt in i data när de samlas in. Ett av variabelnamnen måste vara "" - Ange namnet på kanaler där kärnfläcken är synlig och var kardiomyocyterna är synliga. Dessa namn måste vara exakt som de är i den del som matchas av variabeln "
" i filnamnen för reguljärt uttryck. - Ange hur bilderna ska grupperas med hjälp av kommaavgränsade variabelnamn. Alla avbildningarna inom en viss grupp kommer att öppnas och analyseras i en sats. Till exempel, om bilderna är uppdelade i uppsättningar för varje brunn, och det finns en brunn för varje unik kombination av rad och kolumn, sedan skriva "rad, kolumn" i det här fältet.
OBS: Dessa grupperingsvariabler måste vara en delmängd av de variabler som används i formatsträngen. Använd inte "kanal" som en grupperingsvariabel, detta kommer att skilja motsvarande kanalbilder från varandra. - Ange om bilder är ihopsydda i en brunnsbild eller är separata för varje webbplats. I det tidigare fallet ska platsen inte anges i filnamnsformatsträngen.
- Välj vilken tröskelmetod som ska användas för att separera kärnor från bakgrunden. Alla Fijis standardtröskmetoder finns tillgängliga. Testa olika tröskelmetoder för att avgöra vilka som fungerar bäst för bilduppsättningen. I det här exemplet väljer du Otsu-metoden.
- Ange om tröskelvärdet ska beräknas om för varje webbplatsavbildning eller om samma tröskelvärde ska användas för varje bild i gruppen. Ange om kardiomycytbilderna är ljustfält eller använder en fluorescerande markör.
- Ange kardiomyocytens tröskelmetod. Om Brightfield valdes i föregående steg kommer den här tröskelmetoden att tillämpas på kant-filtrerade brightfield-bilder. Ange om tröskelvärdet ska beräknas om för varje webbplatsavbildning eller om samma tröskelvärde ska användas för varje bild i gruppen.
- Ange antalet rader med webbplatsbilder som täcker varje brunn. Ange antalet kolumner med webbplatsbilder som täcker varje brunn. Ange minimiarean för atomkärnor i bildpunkter. Använd en generöst låg minsta storlek, en högre och mer exakt tröskel kommer att beräknas i analyssteget. Ange minimiareal av kardiomyocyter.
- Efter att ha valt önskade inställningar klicka på OK.
- Bilder som liknar de som finns i figur 3 och figur 4 kommer att visas på skärmen, som visar de olika stegen i analyspipelinen. Inspektera dessa bilder för att säkerställa att tröskelvärden och segmentering sker på rätt sätt.
- Den valda resultatmappen ska nu fyllas med analysdata (Tilläggsfil 1: Skärmbild 5). Andra filer än analysdata kan säkert sparas i den här mappen så länge deras namn inte börjar med "cm_", "nuclei_", eller "nucleilink_".
7. Dataanalys
OBS: De csv-filer som produceras kan analyseras manuellt. Varje analyserad bilddeluppsättning producerar en triplett av csv-filer med namnet "atomkärnor(metadata).csv", "nucleilink(metadata).csv", och "kardiomyocyter(metadata),csv", där (metadata) ersätts med en sekvens av namn-värde-par av formuläret "_(name)=(värde)", där (namn) och (värde) är sekvenser av alfanumeriska tecken som härletts från strängar som matchas i det reguljära uttrycket som ges tidigare. (Till exempel om rad och kolumn angavs i filnamnen sedan strängar som "_row = F" och "_column = 8" kommer att vara närvarande). Den namnlösa kolumnen längst till vänster i varje nuclei- och nucleilink-fil är ett nucleus-ID-nummer. Den "Min" kolumnen i kärnannlänk filen är id av kardiomyocyte som innehöll nämnda kärnan helt eller 0 på annat sätt. Den "Max" kolumn av kärnorna är ID för den högst numrerade kardiomyocyte som innehöll nämnda kärna delvis, eller 0 på annat sätt. Den "Mean" kolumnen i kardiomyocyter filen är kardiomyocyter id nummer.
- Öppna "AnalyseraMultinucleatedServer.R" i Rstudio (tillhandahålls som kompletterande kodfil).
- Överst i den här filen finns en variabel med namnet "folderName". Bredvid den finns en filsökväg. Här inne skriver du sökvägen till den utdatamapp som valts i det sista steget, utan det slutliga snedstrecket (Tilläggsfil 1: Skärmbild 6).
- I det övre vänstra hörnet av skriptredigeringsfönstret bör det finnas en grön pil med etiketten Kör app. Klicka på den här pilen. Det kan ta lite tid innan data laddas och för appen att dyka upp.
- Inledningsvis kommer tre gating grafer vara synliga, en för att ange den lägsta giltiga kärnområdeströskeln, en för att ange den lägsta giltiga nukleära medelintensitetströskeln, och en för att ange den högsta giltiga minimi-ferets diameter för kardiomyocyter. Använd skjutreglagen för att ställa in dessa tröskelvärden( Tilläggsfil 1: Skärmbild 7).
OBS: I var och en av dessa grafer, en stor, bred topp som motsvarar giltiga kärnor eller kardiomyocyter bör vara närvarande, flankerad av breda svansar som representerar skräp eller felaktiga segmenterade kardiomyocyter. Använd trösklarna för att skära en svans av var och en av topparna av. - Bläddra nedåt. Klicka på knappen Verkställ valda tröskelvärden (längst ned i Tilläggsfil 1: Skärmdump 7).
- Klicka på knappen Tomt intensitetsfördelning. Detta kommer att göra tomt av kärnintensitetsfördelningen för både hela urvalet och separata delplots för varje gruppvariabel.
OBS: Till exempel omoch grupperingsvariabler skrevs in i det reguljära uttrycket i Fiji-dialogen, kommer tomter som anger intensitetsfördelningen per rad och efter kolumn att visas här (Tilläggsfil 1: Skärmdump 8). Om belysning och färgning villkor var konstant över de olika delarna av provet, bör dessa tomter alla tydligt visa två intensitetstoppar, en dimmer, högre en för diploida kärnor och en ljusare, kortare för tetraploid kärnor. - Intrasample variation kommer att resultera i detta mönster inte är synlig i hela-prov tomt och det finns stor variation i placeringen av diploid och tetraploid toppar efter rad, kolumn, eller annan gruppering variabel. I det senare fallet, bläddra ner kontrollera kryssrutan Normalisera Separat efter grupp för att redovisa denna variation (Tilläggsfil 1: Skärmdump 9).
- Klicka på knappen Beräkna Ploidy (Tilläggsfil 1: Skärmdump 9). Klicka på knappen Plot Beräknad Ploidy Fördelning. Grafer kommer att visas i de tomma fönstren till höger. I den normaliserade hela provgrafen bör tvåtoppmönstret vara synligt om det inte var tidigare.
- Välj tröskelvärden för att isolera diploida och tetraploidatopparna från både varandra och extremvärden med hjälp av skjutreglagen (Tilläggsfil 1: Skärmbild 9). Bläddra nedåt. Klicka på knappen Beräkna Ploidy and Nucleation (Supplementary File 1: Skärmdump 10).
- Klicka på knappen Plot och Spara in resultatmapp. Den tomt som sparats in i den valda resultatmappen kommer också att visas i detta interaktiva fönster (Tilläggsfil 1: Skärmbild 10).
Representative Results
Kardiomyocyter isolerades enligt det protokoll som beskrivs ovan. Med denna metod får vi typiskt enhetligt singulariserade kardiomyocyter som är relativt rena utan att förorena icke-kardiomyocyteceller (Figur 1A). Kardiomyocyter är lätt identifieras under ljusa fältet mikroskopi på grund av deras karakteristiska storlek och birefringence. Denna teknik är enkel att genomföra och ger konsekventa resultat från olika isoleringar med jämförbara kardiomyocyte avkastning och kvalitet (Figur 1B). Isolerade kardiomyocyter kan förvaras vid 4 °C i flera veckor före vidare användning.
Kardiomyocyter som var isolerade enligt ovanstående protokoll kan användas för olika nedströms applikationer, såsom mätning kardiomyocyte storlek, kardiomyocyte ploidy och immunocytokemi. Som ett representativt resultat visar vi att kardiomyocyter isolerade enligt detta protokoll kan färgas med hjälp av antikroppar och fluorokrom-konjugerade azider för klickkemi för att upptäcka lokalisering av specifika proteiner eller för att upptäcka kardiomyocyte DNA-replikering, respektive. Till exempel, vi färgade kardiomyocyter med antikroppar som erkänner α-aktinin för att visa den karakteristiska z-line färgning mönster av sarkomer (Figur 2A). I ett separat experiment administrerade vi den tymidin analoga 5-Ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) till möss innan du isolerar fasta kardiomyocyter. Efter kardiomyocyte isolering, vi färgas för införlivade EdU med hjälp av standardprotokoll13, och kunde upptäcka kardiomyocyter som hade genomgått S fas i antingen mononukleerad, binucleated och trinucleated kardiomyocyter (Figur 2B).
För att ytterligare utöka nyttan av isoleringsmetoden utvecklade vi en pipeline som möjliggör kvantifiering av kardiomyocyteploidy baserat på integrerad DNA-färgning. För att kunna mäta ploidy status av celler eller kärnor, vi behövde segment kärnor och kardiomyocyter. Figur 3 visar en representation av den strategi vi använde för att identifiera enskilda kärnor. Först är den ursprungliga bilden DNA-infärgad bild (Bild 3A) tröskelad baserat på intensitet (Bild 3B). Här använde vi DAPI för att färga för DNA, men alla andra nukleära färgämnen som visar en linjär korrelation med DNA-innehåll skulle fungera. Programmet gör det möjligt för någon av Fijis intensitet thresholding metoder som skall väljas, men i detta exempel Otsu metod användes. Kärnmasker som vidrör bildens kant eller som är mindre än den angivna lägsta tröskelvärdet för pixelområdet är undantagna. Sedan är ellipser passar till kärnmaskerna, segmentera enskilda kärnor. Bild 3C visar dessa ellipser överlagrad på originalbilden. Därefter fylls hål i maskerna, och bildens pixlar är sedan indelat i territorier baserat på vilka ellips de är mest proximala till (Bild 3D). Gränserna för dessa territorier används sedan för att dra linjer genom kärnkluster, efterbehandling av kärnsegmenteringsprocessen (Figur 3E).
Nästa steg innebär detektion av kardiomyocyter. För kardiomyocytebilder som erhålls baserat på fluorescerande färgade celler (Figur 4A) är processen mycket lik den för kärnor. Bilden är tröskelad baserat på ett intensitetsvärde som beräknas med den valda tröskelmetoden, i detta fall triangeln metoden. Identifierade kardiomycytmasker som vidrör bildens gräns eller som ligger under en viss storlek är uteslutna och hål fylls i maskerna för att ge korrekt segmenterade kardiomyocyter (Figur 4B). Eftersom kardiomyocyter har en mer oregelbunden form än kärnor, görs inga försök att segmentera kardiomyocyter kluster. Istället utesluts dessa kluster baserat på deras höga minimi-Ferets diameter under analyssteget. Segmentering från ljusa fältbilder fortsätter något annorlunda. Först bearbetas den ursprungliga ljusafältbilden ( Bild 4C) med ett Sobel-kantfilter. Det här filtret beräknar det absoluta värdet för övertoningen för varje pixel inom bilden. Pixlar i regioner med snabba ändringar får höga värden och pixlar i jämna regioner i bilden får låga värden. Denna kant-filtrerade bilden är sedan tröskelav intensitet, med hjälp av Triangle metoden, vilket resulterar i maskerade kardiomyocyter (Figur 4D). Dessa mycket oregelbundna masker jämnas sedan ut och kopplas ihop via morfologisk stängning med hjälp av en cirkel med en radie på 2 pixlar, som fyller i alla vita regioner i bilden där cirkeln inte kan få plats utan att överlappa en svart region (Bild 4E). Slutligen är hål i maskerna fyllda, regioner som rör vid gränsen är uteslutna, och små partiklar avlägsnas, efterbehandling kardiomyocyte segmenteringsprocessen (Figur 4F).
Med hjälp av den skisserade segmenteringsstrategin kan vi sedan bestämma kärnbildningsstatus för enskilda kardiomyocyter. Med hjälp av denna metod bestämde vi kärnbildning status cardiomyocytes isolerade från hjärtan outbred CD-1 möss vid tidiga postnatala tid-punkter. Hjärtan av nyfödda möss (första dagen i livet) visade att majoriteten av kardiomyocyter vid den punkten är mononukleerade (Figur 5: neonatal). Denna höga frekvens av mononucleerade kardiomyocyter är mycket lägre hos juvenila möss (2 veckor gamla), där mononuklerad kardiomyocyter utgör cirka 25% av den totala kardiomyocytepopulationen (Figur 5: juvenil). Slutligen kan vi mäta ploidy status enskilda kärnor inom kardiomyocyter, och avgöra om de är diploida eller tetraploida. Dessa resultat visar högre frekvens av tetraploida kärnor hos ungdomars möss (Figur 6).
Bild 1: Effektivitet av kardiomyocyteisolering efter fixering. (A) Representativ bild av isolerade kardiomyocyter färgas med DAPI att visa atomkärnor. (DAPI (blå), Brightfield (grå)) (B) Utbyte av kardiomyocyter isolerade från olika möss vid 3 månaders ålder. Skala barer = 50 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Immuncytokemi av isolerade kardiomyocyter. (A) Representativ bild av kardiomyocyter färgas för α-aktinin (α-aktinin (röd) och DAPI (blå)). (B) Kardiomyocyter färgas för införlivade EdU (röd) och DAPI (blå). Representativa kardiomyocyter som är mononukleerade (vänster), binucleated (mitten) och trinucleated (höger) och EdU positiva visas. Skala barer = 50 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Diagram 3: Strategi för kärnsegmentering. (A) Original DAPI-kanalbild. (B) Thresholded image (i detta exempel användes Otsus metod). (C) Masker som identifierades från de tröskelvärde bilderna överlagrad på den ursprungliga DAPI färgas bilden. (D) Voronoi tessellation baserad på nukleära masker. (E) Slutliga segmenterade kärnor, med split kluster markeras. Skala barer = 100 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Strategi för kardiomyocyte segmentering. (A) Original fluorescerande Troponin jag färgade kardiomyocyte bild. (B) Triangel-tröskelad bild, efter fyllning av hål och exklusive små föremål och de som vidrör gränsen. (C) Original ljusa fält kardiomyocyte bild (D) Kant-filtrerad och triangel-thresholded kardiomyocyte bild (E) Kant-filtrerad bild efter morfologisk stängning med en radie av två pixlar (F) Samma bild efter fyllning av hål och exklusive små objekt och de som vidrör gränsen. Skala barer = 100 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: Klassificering av kardiomyocyter baserat på antal kärnor. Neonatal hjärtan (1 dag gammal) innehåller mer mononucleated kardiomyocyter än juvenil hjärtan (14 dagar gammal). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 6: Fördelning av kardiomyocytets DNA-innehåll per kärna. Hos nyfödda (vänster) är 13,5 % av mononuklerade CM-kärnor tetraploida och 11,9 % av binucleerade CM-kärnor är tetraploida. Hos ungfisk (höger) är 33,9 % av mononuklerade CM-kärnor tetraploida och 31,2 % av binucleerade CM-kärnor är tetraploida. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Kompletterande fil 1: Programvara Skärmdumpar. Vänligen klicka här för att se denna fil (Högerklicka för att ladda ner).
Kompletterande Fil 2: AnalyzeNucleation.py. Vänligen klicka här för att se denna fil (Högerklicka för att ladda ner).
Kompletterande fil 3: AnalyseraMultinucleatedServer.R. Vänligen klicka här för att se denna fil (Högerklicka för att ladda ner).
Discussion
Eftersom kardiomyocyter inte kan upprätthållas i kultur, är det viktigt att isolera primära kardiomyocyter för att kunna studera deras arkitektur och funktion11. Därför har kardiomycytisolering tekniker använts i stor utsträckning i hjärtfältet. Om målet är att bestämma funktionella aspekter av kardiomyocyter, är det viktigt att isolera livskraftiga kardiomyocyter. Dessa levande kardiomyocyter kan också användas för att utföra immunfärgning på isolerade kardiomyocyter. Men optimera tekniken för att isolera levande kardiomyocyter är tekniskt utmanande, och även de bästa teknikerna vanligtvis bara avkastning 60-65% levande stavformade kardiomyocyter, och de återstående kardiomyocyter är alla balled upp och döende eller döda11,12. Här utvecklade vi en teknik som gör det möjligt för forskare att först fixa hjärtat, och sedan isolera kardiomyocyter effektivt. Detta nya protokoll möjliggör mycket högre avkastning av stavformade kardiomyocyter jämfört med tidigare publicerade protokoll. Vidare utvecklade vi en bildframställning analysplattform för att kategorisera kardiomyocyter automatiskt baserat på kärnbildning och ploidy. Med dessa nya metoder, grupper kan fläcka kardiomyocyter för olika proteiner, och studera kardiomyocyte ploidy och kärnbildning status som surrogat för regenerativ potential i hjärtat.
Det protokoll som beskrivs här är relativt okomplicerat, och kan utföras utan någon avancerad utrustning. Mängden kollagenas och inkubationstid för matsmältningen kan variera beroende på kollagenas partiet, och företaget som tillhandahåller det. Vi använde kollagenas typ 2, eftersom detta är mest används för att smälta hjärtat för att erhålla levande kardiomyocyter. Baserat på våra observationer, bestämde vi att natten inkubation med 60 mg/mL kollagenas typ 2 är optimal för nästan alla mus hjärtan oavsett nivån av fibros. Vi har aldrig haft en fråga om översmältning som intracellulära proteiner är fasta och inte lika tillgänglig som extracellulära kollagen. Men om hjärtat inte smälts ordentligt, mer kraftfull trituration kan behövas, vilket orsakar cellfragmentering på grund av skjuvning stress. Således är det avgörande att se till att hjärtat är smält ordentligt innan vi går vidare till trituration. Styvhet i hjärtat kan testas genom att klämma med tövövröp för att bedöma graden av matsmältningen. Efter inkubation med kollagenas, hjärtan bör vara mindre stel och lätt att riva isär. Andra typer av kollagenas kan också användas. En tidigare rapport använde en kombination av kollagenaser B och D14.
Vidare anser vi att detta protokoll kan användas för att bedöma det totala antalet kardiomyocyter i hjärtat15. Men om målet är att erhålla och kvantifiera alla kardiomyocyter från hjärtat, är det viktigt att inkubera hjärtan under längre tidsperioder i kollagenaslösningen (t.ex. 3-7 dagar), där kollagenaslösningen ska fyllas på en gång om dagen. Detta kommer att minimera inkonsekvenser i isolering effektivitet genom att eliminera effekten av graden av trituration på kardiomyocyte avkastning.
Användningen av DNA-innehåll för att mäta ploidy är inte ny, och har använts i flödescytometri i årtionden. Nyligen visade det sig att mikroskopi på liknande sätt kan användas för att uppskatta DNA-innehåll per kärna16. Här genomförde vi denna strategi för att mäta ploidy av kardiomyocyte kärnor, som ett surrogat för nybildade kardiomyocyter. Dogmen inom området hjärtregenerering är att endast mononukleerade, diploida kardiomyocyter kan genomgå cytokinesi och ge upphov till nya kardiomyocyter. Eftersom det är mycket utmanande att mäta nya kardiomyocyte bildas in vivo, isolera kardiomyocyter som har jagats efter administrering av en DNA-nukleotid analog och bestämma nivån av mononuklerad, har diploida kardiomyocyter använts som en approximation av förmågan hos hjärtat att generera nya kardiomyocyter17. Här ger vi ett makro för ImageJ som möjliggör enkel kvantifiering av kardiomyocyte ploidy. Åtminstone måste 500 kärnor mätas för att uppnå en exakt uppskattning av G1-toppens läge. Om man ser till att färgnings- och bildförhållandena är konsekventa över varje brunn i den avbildade plattan behöver endast 500 kärnor över hela provet avbildas, annars måste det finnas 500 kärnor per bildgrupp18,19. Begränsningar av imaging-baserad mätning av kärnbildning och ploidy inkluderar svårigheter att skilja kärnor från anhängare celler från faktiska kardiomyocyte kärnor, när du använder tvådimensionella bilder. Sådana anhängare celler kan resultera i överskattning av mängden flerkärniga celler och minska noggrannheten i mätningar av tetraploid kardiomyocyte kärnan befolkningen. En möjlig strategi för att lösa detta problem skulle vara att använda kardiomyocyte kärnmarkör PCM16,20. Vi har dock haft svårigheter att få tillförlitlig PCM1 färgning på korrekt fasta celler eller vävnader.
En annan potentiell begränsning är att vissa nukleära fläck bilder kan ha betydande bakgrund cytoplasmatisk färgning, förhindra korrekt thresholding med Fijis inbyggda metoder utan omfattande preprocessing. Dessutom minskar det oregelbundna bidraget från denna bakgrund fluorescens till ploidy uppskattningar deras noggrannhet. Dessutom, om cellerna inte är kvar i DNA-färgning lösning under tillräckligt lång tid, fluorescerande färgämnet kommer inte att binda till mättnad inom kärnorna och antagandet om ett linjärt samband mellan nukleär integrerad intensitet och DNA-innehåll kommer inte längre att vara korrekt.
Det bör noteras att programvaran inte kan segmentera kardiomycyt kluster och i stället tar bort dem från analys. Därför är det kritiskt viktigt att så kardiomyocyter vid en relativt låg densitet (t.ex. 1000 celler/cm2). Vidare kan programvaran inte skilja mellan två kardiomyocyter uppradade end-to-end och långa, singular kardiomyocyter. Dessa typer av kluster kan felaktigt blåsa multinucleation uppskattningar.
Även om den beskrivna metoden inte tillåter att erhålla livskraftiga kardiomyocyter och därmed inte kan användas för att mäta dynamiska cellulära processer, om målet är att utföra immunfärgning, anser vi att den beskrivna metoden är överlägsen befintliga protokoll med högre avkastning av kardiomyocyter och bättre kvalitet när det gäller morfologi och protein lokalisering. Slutligen skulle den beskrivna metoden kunna användas för att isolera kardiomyocyter från kliniska prover14,21. Vi tror att den beskrivna metodiken kan hjälpa olika forskare att få högkvalitativa kardiomyocyter och mäta kärnbildning och ploidy som surrogat för nya kardiomyocyter bildas.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
JHvB stöds av bidrag från NIH, Regenerative Medicine Minnesota, och en individuell Biomedical Research Award från The Hartwell Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 wells plate for imaging | Corning | 3340 | We use these plates as they are suitable for imaging, although glass bottom plates would be better for confocal imaging |
| Alpha actinin | Novus Biologicals | NBP1-32462 | This antibody is used as a marker of cardiomyocyte sarcomeres |
| Blunt scissors | Fine Scissor Tools | 14072-10 | We prefer blunt scissors as the possibility of tearing heart tissue is lower when exposing the heart |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population |
| CD-1 mice | Charles river | 22 | Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population |
| Collagenase 2 | Worthington | LS004177 | For the purpose of this protocol, the batch to batch differences are minimal and don't affect overall yield and quality of the isolation |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 203165-10G | For edu staining |
| Cy5 Picolyl Azide | Click Chemistry Tools | 1177-25 | Azide used for edu staining |
| Cytation3 | BioTek | - | Used for automated imaging for DNA analysis |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | DAPI used for DNA staining. Stocks were dissolved in distilled water. |
| donkey anti-mouse IgG-Alexa568 | Life Technologies | A10037 | Secondary antibody used to detect alpha actinin staining within cardiomyocytes |
| Forceps | ROBOZ | RS-5137 | We use these curved, blunt forceps, although straight forceps could also be used |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144212 | To set pH of Tris-HCl buffer to pH 8.5 |
| ImageJ | imagej.net/Fiji/Downloads | - | Used for analyzing images |
| L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 255564-100G | For edu staining |
| Needle for infusion | TERUMO | SV*23BLK | We use winged infusion sets throughout the protocol as it is easy to manipulate the position of the needle with these sets during injection |
| Nikon A1R HD25 | Nikon | - | Used to take confocal images of alpha actinin staining |
| Nylon mesh 200 micron | Elko filtering | 03-200/54 | Mesh used for filtering regular cardiomyocytes (not hypertrophied) |
| Nylon mesh 400 micron | Elko filtering | 06-400/38 | Mesh used for filtering hypertrophied adult cardiomyocytes |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | Corning | 21-040-CV | This can also be prepared in the lab. Although sterility is important in this experiment, we think it is sufficient to prepare PBS and filtering it |
| Potassium chloride, Granular | Mallinckrodt | 6858 | Granular potassium chloride was preffered by us as it forms less aggregates when stored in room temperature |
| R | r-project.org | - | Used for data analysis of the measurements obtained from images |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | Used to buffer EdU staining reaction |
References
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135 (10), e146 (2017).
- Heidenreich, P. A., et al. Forecasting the future of cardiovascular disease in the United States: a policy statement from the American Heart Association. Circulation. 123 (8), 933-944 (2011).
- Eschenhagen, T., et al. Cardiomyocyte Regeneration: A Consensus Statement. Circulation. 136 (7), 680-686 (2017).
- Tzahor, E., Poss, K. D. Cardiac regeneration strategies: Staying young at heart. Science. 356 (6342), 1035-1039 (2017).
- Bergmann, O., et al. Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart. Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).
- Richardson, G. D. Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
- Ang, K. L., et al. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 298 (6), C1603-C1609 (2010).
- Bergmann, O., et al. Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover. Experimental Cell Research. 317 (2), 188-194 (2011).
- O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Shaklee, J., et al. Development of a Click-Chemistry Reagent Compatible with Mass Cytometry. Scientific Reports. 8 (1), 6657 (2018).
- Mollova, M., et al. Cardiomyocyte proliferation contributes to heart growth in young humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1446-1451 (2013).
- Naqvi, N., et al. A proliferative burst during preadolescence establishes the final cardiomyocyte number. Cell. 157 (4), 795-807 (2014).
- Roukos, V., Pegoraro, G., Voss, T. C., Misteli, T. Cell cycle staging of individual cells by fluorescence microscopy. Nature Protocols. 10 (2), 334-348 (2015).
- Patterson, M., et al. Frequency of mononuclear diploid cardiomyocytes underlies natural variation in heart regeneration. Nature Genetics. 49 (9), 1346-1353 (2017).
- Gomes, C. J., Harman, M. W., Centuori, S. M., Wolgemuth, C. W., Martinez, J. D. Measuring DNA content in live cells by fluorescence microscopy. Cell Division. 13, 6 (2018).
- Woo, L. A., et al. High-content phenotypic assay for proliferation of human iPSC-derived cardiomyocytes identifies L-type calcium channels as targets. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 127, 204-214 (2018).
- Morikawa, Y., Heallen, T., Leach, J., Xiao, Y., Martin, J. F. Dystrophin-glycoprotein complex sequesters Yap to inhibit cardiomyocyte proliferation. Nature. 547 (7662), 227-231 (2017).
- Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
