Målet med detta arbete är att utveckla en metod för att reproducera kardiomyocyter från det vuxna hjärtat och mäta DNA-innehåll och kärnbildning.
Den vuxna däggdjur hjärtat är sammansatt av olika celltyper inklusive kardiomyocyter, endotelceller och fibroblaster. Eftersom det är svårt att tillförlitligt identifiera kärnor av kardiomyocyter på histologiska sektioner, många grupper är beroende av att isolera livskraftiga kardiomyocyter före fixering att utföra immunostaining. Dessa levande kardiomyocyte isolering tekniker kräver dock optimering för att maximera avkastningen, livskraft och kvalitet av proverna, med inneboende fluktuationer från prov till prov trots maximal optimering. Här rapporterar vi ett reproducerbart protokoll, som omfattar fixering före enzymatisk rötning av hjärtat, vilket leder till maximal avkastning samtidigt bevara in vivo morfologi av enskilda kardiomyocyter. Vi vidareutvecklade en automatiserad analysplattform för att fastställa antalet kärnor och DNA-innehåll per kärna för enskilda kardiomyocyter. Efter utsätta bröstet hålighet, var hjärtat greps i diastole genom perfusion med 60 mM KCl i PBS. Därefter var hjärtat fast i 4% paraformaldehyd (PFA) lösning, och sedan smälta med 60 mg/mL kollagenas lösning. Efter matsmältningar, celler var singularized av trituration, och kardiomyocyte fraktionen berikades via differential centrifugation. Isolerade kardiomyocyter var färgas för Troponin T och α-aktinin för att bedöma renhet av den erhållna befolkningen. Vidare utvecklade vi en bild analys plattform för att fastställa kardiomyocyte nucleation och ploidy status efter DAPI färgning. Bildbaserade ploidybedömningar ledde till konsekventa och reproducerbara resultat. Med detta protokoll är det således möjligt att bevara native morfologi av enskilda kardiomyocyter att tillåta immunocytokemi och DNA innehåll analys samtidigt uppnå maximal avkastning.
Hjärtsjukdom har varit den vanligaste dödsorsaken i majoriteten av västländerna i många decennier1,2. Även om många förbättringar i behandlingen av hjärt-kärlsjukdomar har förbättrat överlevnad, Det finns för närvarande inga behandlingar som kan ersätta förlorade kardiomyocyter. Därför studier relaterade till kardiomyocyte funktion, spridning, apoptos och hypertrofi har varit och fortsätter att vara en stor fokus för det vetenskapliga samfundet. Eftersom det vuxna däggdjurshjärtat har en mycket begränsad regenerativ kapacitet, med en uppskattad kardiomyocyte förnyelsefrekvens på mindre än 1% per år, är det av avgörande betydelse att tillförlitligt identifiera kardiomyocyte proliferativa händelser3,4. De flesta strategier som mäter proliferativa händelser förlitar sig antingen på färgning för införlivade DNA nukleotid analoger för att bedöma tidigare eller nuvarande spridning, eller fläck för nukleära markörer för aktiv spridning5. Det är särskilt viktigt att på ett tillförlitligt sätt identifiera kardiomycyt proliferativa händelser eftersom det totala antalet proliferativa kardiomyocyter är så låg3,6. Till exempel, baserat på en 1% förnyelsegrad av endogena kardiomyocyter per år, kan man räkna med att hitta mellan 25 och 50 kardiomyocyter vara proliferative vid en viss tidpunkt i den vuxna musen hjärta7,8. Eventuella felaktigheter i identifiering av kardiomyocytekärnor kan leda till falska positiva resultat. Därför är det kritiskt att på ett tillförlitligt sätt identifiera kardiomycytkärnor, som har visat sig svårt och opålitliga från histologiska avsnitt9. Identifiering av kardiomyocyter är mycket mer exakt från enstaka celler än från vävnad sektioner som det kan vara svårt att skilja kardiomyocyter från andra celltyper även när man använder markörer som α-aktinin, även om PCM1 kan vara en pålitlig markör för kardiomyocyter kärnor i histologiska avsnitt10.
Nuvarande protokoll är beroende av att isolera levande kardiomyocyter före fixering, som är känt för att orsaka dödsfall på minst 30% av kardiomyocyter, och kan leda till oavsiktligt urval av specifika populationer av kardiomyocyter11. Vidare, dessa protokoll är notoriskt svårt att optimera för att ge reproducerbara resultat. Även optimerad isolering tekniker kan normalt producera högst 65% levande, stavformade kardiomyocyter med varierande avkastning12.
För att övervinna dessa frågor utvecklade vi ett protokoll som gör det möjligt för forskare att isolera fasta kardiomyocyter. Eftersom proverna är fixerade före isolering maximeras utbytet, och in vivo-morfologin är välbevarad. Dessutom, med detta protokoll är det möjligt att isolera kardiomyocyter från kliniska prover, som typiskt sett fastställas omedelbart efter upphandling. Vidare, för att identifiera nygenererade kardiomyocyter, är det viktigt att mäta kärnbildning och ploidy status av enskilda kardiomyocyter, eftersom endast diploida kardiomyocyter antas typiskt vara nybildade. Flödescytometri kan inte skilja multinucleation från polyploidy och är ett relativt tids- och resurskrävande protokoll. Manuella skissering och mätning av kärnor inom bilder är mycket låg genomströmning och benägna att mänskliga partiskhet. Automatiserad kvantifiering av bilder av fasta, isolerade DAPI-färgade kardiomyocyter löser båda dessa problem. Imaging-baserad bestämning av kärnbildning och ploidyfördelningar kan erhållas med ett minimum av tid och reagenser med hjälp av basutrustning.
Eftersom kardiomyocyter inte kan upprätthållas i kultur, är det viktigt att isolera primära kardiomyocyter för att kunna studera deras arkitektur och funktion11. Därför har kardiomycytisolering tekniker använts i stor utsträckning i hjärtfältet. Om målet är att bestämma funktionella aspekter av kardiomyocyter, är det viktigt att isolera livskraftiga kardiomyocyter. Dessa levande kardiomyocyter kan också användas för att utföra immunfärgning på isolerade kardiomyocyter. Men optimera tekniken för att isolera levande kardiomyocyter är tekniskt utmanande, och även de bästa teknikerna vanligtvis bara avkastning 60-65% levande stavformade kardiomyocyter, och de återstående kardiomyocyter är alla balled upp och döende eller döda11,12. Här utvecklade vi en teknik som gör det möjligt för forskare att först fixa hjärtat, och sedan isolera kardiomyocyter effektivt. Detta nya protokoll möjliggör mycket högre avkastning av stavformade kardiomyocyter jämfört med tidigare publicerade protokoll. Vidare utvecklade vi en bildframställning analysplattform för att kategorisera kardiomyocyter automatiskt baserat på kärnbildning och ploidy. Med dessa nya metoder, grupper kan fläcka kardiomyocyter för olika proteiner, och studera kardiomyocyte ploidy och kärnbildning status som surrogat för regenerativ potential i hjärtat.
Det protokoll som beskrivs här är relativt okomplicerat, och kan utföras utan någon avancerad utrustning. Mängden kollagenas och inkubationstid för matsmältningen kan variera beroende på kollagenas partiet, och företaget som tillhandahåller det. Vi använde kollagenas typ 2, eftersom detta är mest används för att smälta hjärtat för att erhålla levande kardiomyocyter. Baserat på våra observationer, bestämde vi att natten inkubation med 60 mg/mL kollagenas typ 2 är optimal för nästan alla mus hjärtan oavsett nivån av fibros. Vi har aldrig haft en fråga om översmältning som intracellulära proteiner är fasta och inte lika tillgänglig som extracellulära kollagen. Men om hjärtat inte smälts ordentligt, mer kraftfull trituration kan behövas, vilket orsakar cellfragmentering på grund av skjuvning stress. Således är det avgörande att se till att hjärtat är smält ordentligt innan vi går vidare till trituration. Styvhet i hjärtat kan testas genom att klämma med tövövröp för att bedöma graden av matsmältningen. Efter inkubation med kollagenas, hjärtan bör vara mindre stel och lätt att riva isär. Andra typer av kollagenas kan också användas. En tidigare rapport använde en kombination av kollagenaser B och D14.
Vidare anser vi att detta protokoll kan användas för att bedöma det totala antalet kardiomyocyter i hjärtat15. Men om målet är att erhålla och kvantifiera alla kardiomyocyter från hjärtat, är det viktigt att inkubera hjärtan under längre tidsperioder i kollagenaslösningen (t.ex. 3-7 dagar), där kollagenaslösningen ska fyllas på en gång om dagen. Detta kommer att minimera inkonsekvenser i isolering effektivitet genom att eliminera effekten av graden av trituration på kardiomyocyte avkastning.
Användningen av DNA-innehåll för att mäta ploidy är inte ny, och har använts i flödescytometri i årtionden. Nyligen visade det sig att mikroskopi på liknande sätt kan användas för att uppskatta DNA-innehåll per kärna16. Här genomförde vi denna strategi för att mäta ploidy av kardiomyocyte kärnor, som ett surrogat för nybildade kardiomyocyter. Dogmen inom området hjärtregenerering är att endast mononukleerade, diploida kardiomyocyter kan genomgå cytokinesi och ge upphov till nya kardiomyocyter. Eftersom det är mycket utmanande att mäta nya kardiomyocyte bildas in vivo, isolera kardiomyocyter som har jagats efter administrering av en DNA-nukleotid analog och bestämma nivån av mononuklerad, har diploida kardiomyocyter använts som en approximation av förmågan hos hjärtat att generera nya kardiomyocyter17. Här ger vi ett makro för ImageJ som möjliggör enkel kvantifiering av kardiomyocyte ploidy. Åtminstone måste 500 kärnor mätas för att uppnå en exakt uppskattning av G1-toppens läge. Om man ser till att färgnings- och bildförhållandena är konsekventa över varje brunn i den avbildade plattan behöver endast 500 kärnor över hela provet avbildas, annars måste det finnas 500 kärnor per bildgrupp18,19. Begränsningar av imaging-baserad mätning av kärnbildning och ploidy inkluderar svårigheter att skilja kärnor från anhängare celler från faktiska kardiomyocyte kärnor, när du använder tvådimensionella bilder. Sådana anhängare celler kan resultera i överskattning av mängden flerkärniga celler och minska noggrannheten i mätningar av tetraploid kardiomyocyte kärnan befolkningen. En möjlig strategi för att lösa detta problem skulle vara att använda kardiomyocyte kärnmarkör PCM16,20. Vi har dock haft svårigheter att få tillförlitlig PCM1 färgning på korrekt fasta celler eller vävnader.
En annan potentiell begränsning är att vissa nukleära fläck bilder kan ha betydande bakgrund cytoplasmatisk färgning, förhindra korrekt thresholding med Fijis inbyggda metoder utan omfattande preprocessing. Dessutom minskar det oregelbundna bidraget från denna bakgrund fluorescens till ploidy uppskattningar deras noggrannhet. Dessutom, om cellerna inte är kvar i DNA-färgning lösning under tillräckligt lång tid, fluorescerande färgämnet kommer inte att binda till mättnad inom kärnorna och antagandet om ett linjärt samband mellan nukleär integrerad intensitet och DNA-innehåll kommer inte längre att vara korrekt.
Det bör noteras att programvaran inte kan segmentera kardiomycyt kluster och i stället tar bort dem från analys. Därför är det kritiskt viktigt att så kardiomyocyter vid en relativt låg densitet (t.ex. 1000 celler/cm2). Vidare kan programvaran inte skilja mellan två kardiomyocyter uppradade end-to-end och långa, singular kardiomyocyter. Dessa typer av kluster kan felaktigt blåsa multinucleation uppskattningar.
Även om den beskrivna metoden inte tillåter att erhålla livskraftiga kardiomyocyter och därmed inte kan användas för att mäta dynamiska cellulära processer, om målet är att utföra immunfärgning, anser vi att den beskrivna metoden är överlägsen befintliga protokoll med högre avkastning av kardiomyocyter och bättre kvalitet när det gäller morfologi och protein lokalisering. Slutligen skulle den beskrivna metoden kunna användas för att isolera kardiomyocyter från kliniska prover14,21. Vi tror att den beskrivna metodiken kan hjälpa olika forskare att få högkvalitativa kardiomyocyter och mäta kärnbildning och ploidy som surrogat för nya kardiomyocyter bildas.
The authors have nothing to disclose.
JHvB stöds av bidrag från NIH, Regenerative Medicine Minnesota, och en individuell Biomedical Research Award från The Hartwell Foundation.
96 wells plate for imaging | Corning | 3340 | We use these plates as they are suitable for imaging, although glass bottom plates would be better for confocal imaging |
Alpha actinin | Novus Biologicals | NBP1-32462 | This antibody is used as a marker of cardiomyocyte sarcomeres |
Blunt scissors | Fine Scissor Tools | 14072-10 | We prefer blunt scissors as the possibility of tearing heart tissue is lower when exposing the heart |
C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population |
CD-1 mice | Charles river | 22 | Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population |
Collagenase 2 | Worthington | LS004177 | For the purpose of this protocol, the batch to batch differences are minimal and don't affect overall yield and quality of the isolation |
Copper (II) sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 203165-10G | For edu staining |
Cy5 Picolyl Azide | Click Chemistry Tools | 1177-25 | Azide used for edu staining |
Cytation3 | BioTek | – | Used for automated imaging for DNA analysis |
DAPI | Life Technologies | D3571 | DAPI used for DNA staining. Stocks were dissolved in distilled water. |
donkey anti-mouse IgG-Alexa568 | Life Technologies | A10037 | Secondary antibody used to detect alpha actinin staining within cardiomyocytes |
Forceps | ROBOZ | RS-5137 | We use these curved, blunt forceps, although straight forceps could also be used |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144212 | To set pH of Tris-HCl buffer to pH 8.5 |
ImageJ | imagej.net/Fiji/Downloads | – | Used for analyzing images |
L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 255564-100G | For edu staining |
Needle for infusion | TERUMO | SV*23BLK | We use winged infusion sets throughout the protocol as it is easy to manipulate the position of the needle with these sets during injection |
Nikon A1R HD25 | Nikon | – | Used to take confocal images of alpha actinin staining |
Nylon mesh 200 micron | Elko filtering | 03-200/54 | Mesh used for filtering regular cardiomyocytes (not hypertrophied) |
Nylon mesh 400 micron | Elko filtering | 06-400/38 | Mesh used for filtering hypertrophied adult cardiomyocytes |
Phosphate Buffered Saline (1X) | Corning | 21-040-CV | This can also be prepared in the lab. Although sterility is important in this experiment, we think it is sufficient to prepare PBS and filtering it |
Potassium chloride, Granular | Mallinckrodt | 6858 | Granular potassium chloride was preffered by us as it forms less aggregates when stored in room temperature |
R | r-project.org | – | Used for data analysis of the measurements obtained from images |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | Used to buffer EdU staining reaction |