Summary
מוצג כאן פרוטוקול לזיהוי שדה של קמומילה מטריקריה באמצעות מערכת qPCR ניידת. פרוטוקול קל לביצוע זה אידיאלי כשיטה לאמת את זהותו של מין בוטני במקומות שבהם הגישה לציוד מעבדה ומומחיות מוגבלת, כגון חוות ומחסנים.
Abstract
בקרת איכות במוצרים בוטניים מתחילה באספקת חומרי הגלם. באופן מסורתי, זיהוי בוטני מתבצע באמצעות הערכה מורפולוגית ושיטות אנליטיות כימיות. עם זאת, חוסר הזמינות של בוטניקאים, במיוחד בשנים האחרונות, יחד עם הצורך לשפר את בקרת האיכות כדי להילחם בלחצים על שרשרת האספקה הביא על ידי הגדלת הביקוש הצרכני ושינויי האקלים, מחייב גישות חלופיות. מטרת הפרוטוקול היא להקל על זיהוי מינים בוטניים באמצעות מערכת qPCR ניידת בשטח או בכל הגדרה, שבה הגישה לציוד מעבדה ומומחיות מוגבלת. ה-DNA היעד מוגבר באמצעות qPCR מבוסס צבע, עם DNA מופק מחומרי עזר בוטניים המשמשים כשליטה חיובית. ה-DNA היעד מזוהה על ידי ההגדלה הספציפית שלה והתאים שיא ההתכה שלה נגד השליטה החיובית. תיאור מפורט של השלבים והפרמטרים, מאיסוף מדגם שדה מעשי, ועד לחילוץ DNA, הגבהה של PCR, ואחריו פרשנות נתונים, נכלל כדי להבטיח שהקוראים יוכלו לשכפל פרוטוקול זה. התוצאות הניבו יישור עם שיטות זיהוי בוטניות מסורתיות של המעבדה. הפרוטוקול קל לביצוע וחסכוני, ומאפשר בדיקות איכות על חומרי גלם קרוב ככל האפשר לנקודת המוצא של שרשרת האספקה.
Introduction
הנוהג של שימוש בצמחים כדי לשמור ולשפר את הבריאות שתחילתה אלפי שנים. בשל לחצים על שרשרת האספקה הביא הביקוש הצרכנימוגבר 1, שיטות קציר בר קיימא ושינויהאקלים 2, ניאוף בוטני הופך לדאגה גוברת בתעשיית מזוןותוסף תזונה 3. נוכחותם של מינים בוטניים לא מוצהרים או מזוהים שלא זוהו כהלכה עלולה להוביל ליעילות מופחתת, או אפילו לבעיות בטיחות. לדוגמה, קוהוש שחור (Actaea racemosa), המשמש לטיפול באי נוחות מחזורית, עשוי להיות מוחלף בזן אסייתי במחיר נמוך עם תמיכה מוגבלת בנתונים קליניים על יעילותו4. במקרה חמור יותר, החלפה של ניבים אריסטולוקיה עבור סטפניה terandra במחקר קליני לירידה במשקל באמצעות צמחי מרפא סיניים הוביל nephrotoxicity חמור ואי ספיקת כליות בחלק מהמשתתפים5,6. שני המינים השונים חלקו שם משותף סיני בשם "פאנג ג'י". מקרים אלה מדגישים את הצורך בפיקוח איכות מחמיר יותר, החלמזיהוי חומרי גלם 7, רצוי קרוב ככל האפשר לנקודת המוצא של שרשרת האספקה, כך שניתן להקצות משאבים ביעילות לחומר הזהות הנכונה.
ניתן להשתמש במספר גישות אורתוגונליות לזיהוי בוטני. באופן מסורתי, זיהוי בוטני מתבצע באמצעות הערכהמורפולוגית 8,9 ושיטות אנליטיותכימיות 10,11,12,13. זיהוי מורפולוגי מבוסס על הבדלים בתכונות מאקרוסקופיות ומיקרוסקופיות של חומרים צמחיים אם קיימים הבדלים(איור 1). עם זאת, היעדר תוכניות הכשרה לבוטניקה קלאסית בשנים האחרונות הביא למחסורב-14 מומחים- מה שהופך גישה זו לבלתי מעשית לבקרת איכות שגרתית. היישום שלה בחומרים בוטניים אבקה מוגבל גם. שיטות אנליטיות כימיות נמצאות בשימוש נרחב בתרופות ובמעבדות, אך אינן אידיאליות לבדיקות שטח בשל גודל המכשירים כגון כרומטוגרפיה של שכבה דקה (HPTLC), כרומטוגרפיה נוזלית בעלי ביצועים גבוהים (HPLC) וספקטרוסקופיה תהודה מגנטית גרעינית (NMR) (איור 2) ודרישות הסביבה. לאחרונה, שיטות גנומיות התגלו כטכניקה חלופית לאימות וזיהוי החלפה של מינים בוטניים והוכיחו את עצמם כיעילים ומדויקים. שיטות גנומיות מנצלות את הנאמנות הגבוהה ואת הספציפיות של מידעגנטי בחומרים צמחיים 15,16,17,,18,,19. כלי אבחון מולקולרי זמינים בצורה של מכשירים ניידים, ולעתים קרובות כוללים כלי פרשנות נתונים אוטומטיים המנמיך את המחסום לשימוש בטכנולוגיה, מה שהופךגישה זו אידיאליתלזיהוי שדה 20,21,22,23,24. לאחר ששיטת הניתוח המולקולרי תוכננהואושרה 25,26,27,זה יכול להתבצע על ידי כל אדם עם הכשרה ביולוגית מולקולרית בסיסית. בין הכלים הניידים השונים הזמינים, PCR בזמן אמת על רצפי DNA היא אחת הבחירות חסכוניות28. השילוב של מכשיר נייד, יחד עם ניתוח מולקולרי מותאם אישית ומאומת, מאפשר אימות של מינים ומרכיבים בוטניים מחוץ למעבדה, כגון בחוות ומחסני חומרים בוטניים, ומפחית את הזמן והעלויות הקשורות לשיטות מסורתיות.
מטרת פרוטוקול זה היא להציג שיטה לזיהוי בוטני במצבים שבהם הגישה לציוד מעבדה ומומחיות מוגבלת או אינה זמינה, באמצעות מערכת qPCR ניידת. השיטה מדגימה על שדה של קמומילה מטרטריה (איור 3A), הידוע בכינויו קמומיל גרמני, בשימוש נרחב עבור תכונות אנטי דלקתיות נוגדות חמצוןשלה 29. ניתן להתבלבל בין מינים קשורים בעלי מראה או ריח דומים, במיוחד מהגנים Chrysanthemum Chamaemelumצ'אמאמלום , טנצטוםוחרצית30,31,32. בין המינים הקשורים, Chamaemelum nobile, המכונה גם קמומיל רומי, הוא אחד מורגש עם רמות ייצור דומות במסחר (איור 3B). השיטה שהוכחה נועדה לא רק לזהות את המינים הבוטניים של המטרה M. chamomilla, אלא גם לזהות את קרוב המשפחה שלה, C. nobile, בהתבסס על ההגדלה הספציפית של רצפי DNA.
מאמר זה מסביר, בפירוט, כיצד לבצע זיהוי בוטני שדה של M. קמומילה באמצעות qPCR מבוסס צבע intercalating ולהמיס ניתוח עקומה במכשיר נייד. הפרוטוקול כולל איסוף של דגימות בוטניות מהשטח, חילוץ DNA באתר, והגדרה של תגובת PCR בזמן אמת. כדי להבטיח מסקנה תקפה, המטרה הבוטנית M. קמומילה ו- DNA גנומי C. נובלה שאינם היעד, מופק מראש מחומרי עזר בוטניים מוסמכים, משמשים כשליטה חיובית. את ספציפיותה של שיטה זו מדגימה על ידי ביצוע בדיקות זיהוי M. קמומילה ו- C. nobile בנפרד על דגימות ובקרות. שליטה שלילית שאינה תבנית משמשת כדי לא לכלול תוצאות חיוביות כוזבות הנגרמות על-ידי זיהום PCR.
Protocol
1. אוסף לדוגמה
- הגדר אזור בדיקה בשדה עם משטח שטוח ואופקי.
- זהה צמח מייצג המשקף את המאפיינים של רוב הצמחים בשדה פרח קמומיל (איור 4).
- בחר ראש פרח מהמפעל המייצג באמצעות כפפות סטריליות.
- מניחים את הדגימה בצינור אוסף של 2.0 מ"ל.
- חזור על שלבים 1.3 עד 1.4 ואספו עלון (באורך של כ-0.5-0.7 ס"מ) מאותו צמח.
הערה: M. קמומילה פרח ועלה הם קטנים מספיק כדי לשבת בתחתית צינור אוסף 2.0 מ"ל. עבור בוטניקה אחרת עם שטח פנים גדול יותר, אגרוף נייר או מספריים (שטיפה ב 70% אתנול לפני השימוש) יכול לשמש כדי לבודד דגימות רקמה לבדיקה. כאשר נדרשת דגימה מרובה, יש לשטוף את פונץ' הנייר או המספריים בין טיפול בדגימות שונות.
2. חילוץ דנ"א
- מחממים מראש את האינקובטור של האמבטיה היבשה ל-95 מעלות צלזיוס.
- לכל צינור אוסף, להוסיף 100 μL של פתרון החילוץ מתוך ערכת הפקת DNA צמח (המפורטים בטבלת חומרים). ליעילות חילוץ DNA טובה יותר, לטחון את דגימת הרקמה בתמיסת החילוץ באמצעות עלי רקמה.
- סגור את הצינור. ודא כי הרקמה הבוטנית מכוסה תמיסת החילוץ לאורך כל תהליך החילוץ.
- מניחים את צינורות האיסוף באינקובטור אמבטיה יבש שחומם מראש ותדגירה את צינורות האיסוף ב-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- לאחר 10 דקות, להוציא את הצינורות מהאינקובטור של האמבטיה היבשה.
- להוסיף 100 μL של פתרון דילול מאותה ערכת חילוץ DNA ולערבב את הפתרון על ידי pipetting למעלה ומטה מספר פעמים.
- חזור על אותו שלב עבור חילוץ עלון.
- לנער כדי לערבב את הפתרון עוד יותר. רקמת הצמח בדרך כלל לא נראה מושפל לאחר טיפול זה. הצבע הנוזלי עשוי להשתנות ולהיות מעונן.
הערה: ניתן לאחסן את הפתרון המדולל בטמפרטורת החדר במהלך הלילה אם לא ימשיך באופן מיידי. אין צורך להסיר את הפסולת התאית מרקמות הצמח לפני האחסון. הנוזל בצינורות מכיל את תבניות ה-DNA להגדלת PCR במורד הזרם.
3. הגדרת תגובת PCR
- קבע את תצורת תנאי התרמוצ'יקל של מכשיר qPCR בהתאם למפרטי היצרן. החל את פרופיל התרמוצ'יקלינג PCR המפורט ב (טבלה 1), המתחיל בשלב טמפרטורה קבוע עבור denaturation ראשוני, ואחריו 25 מחזורים של ההגבהה, ומסתיים בהשתוללות טמפרטורה כדי להשיג עקומת התכה ברזולוציה גבוהה.
- הפשרת qPCR מאסטר לערבב פריימרים(שולחן 2)בטמפרטורת החדר לפני השימוש.
- תכנן את התגובה שתוטען בכל באר: בארות המכילות שליטה חיובית עם מיני יעד, שליטה חיובית עם מינים שאינם יעד, דגימות, ושליטה שלילית(איור 5).
- בדוגמה זו, נעשה שימוש בעשר בארות – חמש למבחן זיהוי קמומיל גרמני וחמש הנותרות למבחן זיהוי קמומיל רומי. עבור כל סוג של בדיקת זיהוי מינים, באר אחת מכילה שליטה חיובית עם דנ"א המופק מהחומר המיועד למינים ממוקדים, באר אחת מכילה שליטה חיובית עם דנ"א המופק מהחומר הייחוס של מינים שאינם ממוקדים, שתי בארות מלאות בדגימות דנ"א של פרחים ועלים המופקות מהשדה, ובאר אחת מוקצית לבקרה שלילית. טבלה 3 מתארת כל סוג באר.
- הכן תגובת מאסטר-מיקס בהתאם למדריך עבור כל בדיקת זיהוי מינים בוטניים. תערובת אב לתגובה טיפוסית מכילה מיקס מאסטר QPCR אוניברסלי (2x), פריימרים ספציפיים למינים קדימה והפוך, ומים ללא גרעין. טבלה 4 מפרטת את הרכב מערכת התגובה.
הערה: אם לא להשתמש באופן מיידי, יש לאחסן את תערובת הבסיס לתגובת qPCR ב- +2°C עד +8°C במקרר קריר יותר או במקרר קטן. - מערבבים ביסודיות את תערובת האב של התגובה על-ידי התפתלות לפני השימוש.
- הנח את מחסנית qPCR עם הפנים כלפי פנים על משטח שטוח ויציב.
- טען 18 μL של תגובת אב-תמהיל שתצורתו נקבעה בשלב 3.4 לתוך בארות מחסנית בהתאם הבארים המוגדרים בשלב 3.3. להדגמה זו, להוסיף את התגובה מבחן קמומיל גרמנית תגובה מאסטר לערבב לתוך בארות מסומן עבור מבחן GC (GCT בארות 1, 3, 5, 7, 9) ואת התגובה בדיקת זיהוי קמומיל הרומית מאסטר-לערבב לתוך בארות מסומן עבור מבחן RC (RCT בארות 2, 4, 6, 8, 10) (ראה איור 5).
- להעביר 2 μL של DNA מדגם מן supernatant של צינורות מיצוי DNA ופקדים חיוביים DNA שחולצו מראש לתוך בארות מחסנית טעון מראש עם תערובת מאסטר qPCR. לאחר הוספת כל תבנית DNA לתערובת הראשי qPCR, בעדינות לערבב את הפתרון על ידי pipetting.
הערה: הימנע פסולת תאית צפה בעת העברת DNA מצינור החילוץ DNA. השתמש minicentrifuge כדי להפריד את הפסולת supernatant וסלולר, במידת הצורך. - אטמו בזהירות את המחסנית עם סרט דבק. טען את המחסנית על תא התרמוציקלינג וסגור אותה.
- הגדר את מכשיר qPCR לפעול.
Representative Results
על פי הפרוטוקול המתואר בסעיף 1, דנ"א בוטני מראש ועלה פרח חולצו לתוך supernatant לאחר דגירה חום של צינור האוסף ב 95 ° C במשך 10 דקות. במחקר הנוכחי, supernatant הראה צבע צהוב וירקרק עבור שני פרח ועלה, המציין כי מגוון רחב של תרכובות טבעיות שוחררו לתוך supernatant עם DNA בוטני (איור 6). למרות הגבירת PCR אמין הושג מאוחר יותר בשלושה רישיות עבור כל תבנית ה-DNA שחולצו שדה, הערכת איכות ה-DNA בוצעה במעבדה כהתייחסות. הריכוז של תמצית ה-DNA ראש פרח, נקבע על ידי פלואורומטריה, נע בין 3.69-5.36 ng/μL, בעוד הריכוז של תמצית DNA עלה נע בין 6.42-9.29 ng/μL. A260/ A280 ו A260/ A230 יחסי ספיגה של תמציות DNA פרח ועלה נמדדו על ידי ספקטרופוטומטריה. עם זאת, בשל החפיפה בין ה-DNA לבין ספקטרום ספיגת UV פיטוכימי, לא ניתן היה למדוד יחסים אלה (הנתונים לא מוצגים).
צביעת פלורסנט הדדית שימשה לניטור ההתעצמות של שברי מטרה בזמן אמת. מאז שני פריימרים ספציפיים M. קמומילה ו C. nobile היעד spacer פנימי מתעתק 2 (ITS2) אזור, אשר יש עשרות עד מאות עותקים בגנום הצמח, 25 מחזורי הגברה PCR מספיקים כדי ליצור מספיק מדלים לזיהוי של מיני קמומיל. באיור 7 , ערךCt עבור M. קמומילה שליטה חיובית במבחן זיהוי קמומילה M. היה פחות מ 25 (GCP_GCT), בעוד לאחר 25 מחזורי ההגדלה, הפלואורסצנציה של אותה שליטה במבחן זיהוי נוביל C. היה מתחת לסף הזיהוי (GCP_RCT). מצד שני, לאחר 25 מחזורים, הפלואורסצנציה עבור C. nobile שליטה חיובית במבחן זיהוי קמומילה M. היה מתחת לסף הזיהוי (RCP_GCT), בעוד ערך Ct עבור אותו בקרה במבחן זיהוי nobile C. היה פחות מ 25 (RCP_RCT). ההתגברות של פקדים חיוביים היעד ולא היעד בsays שלהם בהתאמה להדגים את הספציפיות של M. קמומילה זיהוי אסיי. עבור DNA מדגם, ראש פרח שדה ותמצית DNA עלה הניב ערכי Ct של 15.18 ו 19.41 ב M. בדיקת זיהוי קמומילה, בהתאמה (Sample1(פרח)_GCT ו Sample2(LEAF)_GCT). שתי הדגימות הללו לא הוגדלו במבחן זיהוי נוביל C. (Sample1(FLOWER)_RCT ו- Sample2(LEAF) _RCT). דפוסי ההגדלה של שתי הדגימות תוו לתבנית ההגדלה של מ. קמומילה שליטה חיובית. בקרות שליליות לא היו מוגברים הן M. קמומילה ו C. nobile בדיקות זיהוי (NC_GCT ו NC_RCT), למעט האפשרות של תוצאות חיוביות שגויות שנגרמו על ידי זיהום PCR. כדי לאשר עוד יותר את ההגברה הספציפית בפקדים ודגימות חיוביות, שברים של מוצר קצה PCR מכל באר נוהלו על 2% ג'ל agarose במעבדה(איור 8). עבור M. קמומילה זיהוי מבחן, שתי דגימות השדה הניבו amplicons פועל באותו מיקום כמו M. קמומילה שליטה חיובית עם גודל מוערך מעט מעל 100 bp (גודל תיאורטי 102 bp). עבור בדיקת זיהוי נוביל C. nobile, מינים שאינם יעד C. שליטה חיובית נוביל הניב להקה בין 50 ו 100 bp, התאמת הגודל התיאורטי של 65 bp. שאר הנתיבים לא הראו מוצר הגבירה ספציפי, שהיה בהסכמה עם היעדר אות פלורסנט עבור בארות אלה, כפי שנצפה בבדיקות שדה.
לאחר ההגדלה PCR, ניתוח עקומת התכה בוצע כדי להעריך את מאפייני הדיסוציאציה של DNA דו-גדילי (dsDNA) במהלך החימום. ככל שהטמפרטורה גברה במהלך המחזור האחרון לניתוח עקומת המסה, עליות בטמפרטורה גרמו לאפליקון הדו-גדילי להתנתק. צבע הפלורסנט intercalating שוחרר בהדרגה לתוך הפתרון, הפחתת עוצמת פלואורסצנטי(איור 9A). נקודת הגוון של העקומה הנגזרת הראשונה שימשה לקביעת טמפרטורת ההתכה (איור9B),התלויה בעיקר באורך שבר ה-DNA ובתוכן GC. שילוב ערך Ct עם טמפרטורת התכה יכול להגביר את הייחודיות של ניתוח qPCR. במחקר הנוכחי, שיא טמפרטורת ההתכה של M. קמומילה שליטה חיובית PCR amplicon התרחש ב 85.6 ° C (GCP_GCT) וזה היה שונה משיא טמפרטורת ההתכה של C. nobile שליטה חיובית PCR amplicon ב 79.1 ° C (RCP_RCT). amplicon PCR מראש פרח שדה ועלה הפיק פסגות טמפרטורה נמסה ב 85.2 ° C ו 84.8 ° C, בהתאמה (Sample1(פרח)_GCT ו Sample2(LEAF)_GCT). כדי להעריך את שינויי טמפרטורת ההתכה שנמדדו על ידי מערכת qPCR הניידת, נאספו נקודות נתונים נוספות כדי לאשר כי טמפרטורות המסה מדגם היו תמיד קרוב לטמפרטורת ההתכה שהתקבלה משליטה חיובית של M. קמומילה (בתוך 2 °C) והן היו רחוקות מטמפרטורת ההתכה של א amplicon שליטה חיובית של C. nobile (איור 10). פסגות טמפרטורה נמסות דווחו לעתים בארות אחרות. עם זאת, ערכי Ct שלהם לא היו פחות מ 25 ופסגות טמפרטורה נמסה לא היו קרוב M. קמומילה או C. שליטה חיובית nobile (יותר מ 2 ° C זה מזה).
לסיכום, ניתן לפרש את בדיקת זיהוי הקמומיה של שדה מ. בהתבסס על כללי החלטה המסוכמים בטבלה 5. עם כל הפקדים החיוביים הבדיקה חיובית עבור מינים בוטניים putative, שלילי עבור מינים אחרים, ובקרות שליליות בדיקות שליליות, שתי דגימות השדה נקבעו להכיל M. קמומילה אבל לא C. nobile. בנוסף, כדי ליישר את תוצאות בדיקות השדה עם טכניקות אנליטיות אחרות, מסקנות שדה אושרו עוד יותר על ידי שיטת ברקוד DNAשאומתה בעבר 25 (הנתונים לא הוצגו).
איור 1: זיהוי מורפולוגי של חומרים בוטניים. (א) היביסקוס רוזה-סיננסיס פרחים, שורשי כורכום longa, Malva סילבסטריס עלים, רוזמרינוס officinalis עלים, זרעי סאטיבום כוסינדרום, שורשי officinale Zingiber. (ב) פתיתי פטרוסלינום קריספם ואפיום קשקשים להבדיל. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: זיהוי כימי של חומרים בוטניים. (A)מכשיר HPTLC וכרומטוגרמה HPTLC מייצגת. (ב)מכשיר HPLC וכרומטוגרמה מייצגת של HPLC. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: בגרות קמומילה וצ'ממלום נוביל בתחום. (א) קמומילה מטריקריה, בעיבוד מוויקיפדיה תחת CC BY-SA 3.0, https://en.wikipedia.org/wiki/Matricaria_chamomilla#/media/File:Matricaria_February_2008-1.jpg. (ב) נוביל Chamaemelum, הותאם מתוך ויקיפדיה תחת CC BY-SA 3.0, https://en.wikipedia.org/wiki/Chamomile#/media/File:Chamaemelum_nobile_001.JPG. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: איסוף חלקי צמח קמומילה מהשדה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: פריסת בארות בדיקה בהדגמה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: תמצית דנ"א שדה בצינורות איסוף. רקמה בוטנית נשארת בצינור המקורי ומ מכוסה בתמצית DNA צהבהב. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 7: עלילת פלואורסצנס המציגה את ההצטברות של מוצרי PCR מעל 25 מחזורים של תרמוצ'יקלינג. M. קמומילה שליטה חיובית C. nobile שליטה חיובית להראות ערכי Ct פחות מ 25 ב M. קמומילה ו C. בדיקות זיהוי נוביל, בהתאמה. דגימות פרח השדה והעלים הוגדלו על ידי בדיקת זיהוי קמומילה עם ערכי Ct של 15.18 ו- 19.41. שאר הבארות לא היו מוגברות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 8: אלקטרופורזה ג'ל של מוצרי ההגדלה PCR שדה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 9: ניתוח טמפרטורת התכה. אותAהפלואורססנס בכל באר פוחת עם הטמפרטורה הגוברת. (ב)זהות מוצרי PCR אושרה על ידי שיא טמפרטורת ההתכה בניתוח עקומת התכה. דגימות פרחי השדה והעלים מראות פסגות ב-85.2°C ו-84.8°C. אלה קרובים לשיא המיוצר על ידי M. קמומילה שליטה חיובית. השליטה החיובית של C. nobile הניבה שיא של 79.1°C, שונה משלוש הדגימות האחרות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 10: שינוי שיא טמפרטורה נמס בין שליטה חיובית לדגימות שדה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
| הבמה | מחזור | טמפרטורה | זמן |
| טמפרטורה קבועה | 1 | 95 °C | ה-60 שנה |
| התהגבירות | 25 | 95 °C | ה-30 של ה-30 |
| 60 °C | ה-30 של ה-30 | ||
| עקומת התכה | 1 | 60 °C | רמפה 0.05 °C/s |
| 95 °C |
טבלה 1: תנאי תרמוצ'יקל qPCR עבור בדיקות זיהוי M. קמומילה ו- C. nobile.
| בדיקת מעבדה | שם פריימר | רצף 1.70-3' | מיקום | אזור | גודל אפליקון | |
| בגרות רקוטיטה | ת/ז3 (זל-3 | ת.ג.ב.ג.ג.י.ג.י.ג.י.ג.י.ג.י.ג.י | קדימה | ת.א.2 | 102 bp | |
| ת.ז. 4 | ת.א.ק.ג.ג.ב.ק. | הפוך | ||||
| נובילה של צ'ממלום | זלוטי 11 | טג'טג'קהג'טגגהאגקה | קדימה | ת.א.2 | 65 bp | |
| 12 זלוטי | תכליתה | הפוך | ||||
טבלה 2: זוגות פריימר לבדיקות זיהוי של מ. קמומילה ו-ג' נוביל.
| מיקום טוב | שם טוב | תיאור | |
| 1 | GC_PosCtrl_GC_Test | שליטה חיובית קמומיל גרמנית תחת בדיקת GC | |
| 2 | GC_PosCtrl_RC_Test | שליטה חיובית קמומיל גרמנית תחת בדיקת RC | |
| 3 | RC_PosCtrl_GC_Test | שליטה חיובית קמומיל רומי תחת בדיקת GC | |
| 4 | RC_PosCtrl_RC_Test | שליטה חיובית קמומיל רומי תחת בדיקת RC | |
| 5 | Field_Sample_GC_Test | מדגם של רקמת עלה תחת בדיקת GC | |
| 6 | Field_Sample_RC_Test | מדגם של רקמת עלה תחת בדיקת RC | |
| 7 | Field_Sample_GC_Test | מדגם של רקמת פרח תחת בדיקת GC | |
| 8 | Field_Sample_RC_Test | מדגם של רקמת פרח תחת בדיקת RC | |
| 9 | NegCtrl_GC_Test | מדגם בקרה שלילי תחת בדיקת GC | |
| 10 | NegCtrl_RC_Test | מדגם בקרה שלילי תחת בדיקת RC | |
טבלה 3: סוגים ותיאורים טובים עבור מ. קמומילה ובדיקות זיהוי נובילה C.
| מגיב | GC_Test | RC_Test |
| תערובת QPCR אוניברסלית* | 10 μL | 10 μL |
| פריימר ZL3 (10 μM) | 0.4 μL | נה |
| פריימר ZL4 (10 μM) | 0.4 μL | נה |
| פריימר ZL11 (10 μM) | נה | 0.4 μL |
| פריימר ZL12 (10 μM) | נה | 0.4 μL |
| H2O (ללא גרעין) | 7.2 μL | 7.2 μL |
| * מכיל התחלה חמה Taq DNA פולימראז | ||
טבלה 4: קומפוזיציה של מיקס מאסטר למ. קמומילה ובדיקות זיהוי נוביל.
| שם טוב | תוצאה צפויה | קריטריוני תוצאות חיוביות | קריטריוני תוצאות שליליות |
| זוהה / קיים | לא זוהה / נעדר | ||
| GC_PosCtrl_GC_Test | זוהה | Ct < 25 ו- 84 <= Tm <= 86 | - |
| GC_PosCtrl_RC_Test | לא זוהה | - | אין ערך Ct בתוך 25 מחזורים |
| RC_PosCtrl_GC_Test | לא זוהה | - | אין ערך Ct בתוך 25 מחזורים |
| RC_PosCtrl_RC_Test | זוהה | Ct < 25 ו- 79 <= Tm <= 81 | - |
| Field_Sample_Leaf_GC_Test | להציג | Ct < 25 ו- 84 <= Tm <= 86 | אין ערך Ct בתוך 25 מחזורים |
| Field_Sample_Leaf_RC_Test | נעדר | - | אין ערך Ct בתוך 25 מחזורים |
| Field_Sample_Flower_GC_Test | להציג | Ct < 25 ו- 84 <= Tm <= 86 | אין ערך Ct בתוך 25 מחזורים |
| Field_Sample_Flower_RC_Test | נעדר | - | אין ערך Ct בתוך 25 מחזורים |
| NegCtrl_GC_Test | לא זוהה | - | אין ערך Ct בתוך 25 מחזורים |
| NegCtrl_RC_Test | לא זוהה | - | אין ערך Ct בתוך 25 מחזורים |
טבלה 5: כללים לפרשנות תוצאת qPCR.
Discussion
העיצוב של פריימרים ובחירה בתבנית הם השלבים המכריעים בהשגת התעצמות QPCR יעילה וספציפית. לאחר זיהוי תבנית מתאימה, תוכנת עיצוב פריימר משמשת בדרך כלל לסיוע בבחירת פריימרים המבוססים על משתני עיצוב כגון אורך פריימר, טמפרטורת התכה ותוכן GC33,34. ניתן לבצע אופטימיזציה ואימות בתנאים הניסיוניים הצפויים של ה-assay כדי להבטיח ספציפיות, רגישות וחוסן של תגובת PCR35. עיצוב פריימר תת-אופטימלי עלול לגרום להיווצרות פריימר-דימר, שבה אינטראקציות פריימר מייצרות מוצרים לא ספציפיים36.
אין פקדי תבנית (NTC) המשמשים במחקר זה לבדוק הן זיהום DNA והן הנוכחות של dimers פריימר שיכול להשפיע על ההסתה. התוצאות לא הראו שום הגברה, אינדיקציה טובה כי גם זיהום DNA וגם dimers פריימר אינם דאגה. זיהום DNA ו dimers פריימר באים לידי ביטוי עקומות להמסה דרך אין פקדי תבנית, כמו פסגות נוספות בעקומות המסה של פקדים חיוביים. בדרך כלל, עקומת ההתכה של פקד חיובי צפויה להכיל שיא יחיד, אלא אם כן תת-תח-תום-ים עשיר בתבנית גורמת להמסה לא אחידה. ניתן היה לחזות פסגות כפולות על ידי הדמיית אסה נמסה באמצעות תוכנת uMELT37. במחקר זה, תקן הזהב של הפעלת מוצר PCR על ג'ל agarose שימש כדי לאשר את הנוכחות של מוצר PCR היעד והיעדר זיהום ו dimers פריימר.
אתגר משמעותי בניתוח מולקולרי של חומר בוטני הוא השגת DNA באיכות טובה בעקבות תהליך הפקת ה-DNA הבוטני. חומרים בוטניים נסחרים ונצרכים עבור תרכובות כימיות פעילות הקשורות יתרונות בריאותיים. בתהליך של הפקת DNA, תרכובות כימיות אלה ישוחררו גם לתוך פתרון חילוץ ה-DNA, פוטנציאל גורם עיכוב PCR, ובכך לגרום לכשלים בהגדלה PCR. ערכות טיהור DNA צמח שונים באמצעות ממיסים אורגניים ועמודים פותחו כדי להסיר תרכובות כימיות נגזר בוטניים38. עם זאת, מכסה המנוע אדים וצנטריפוגה במהירות גבוהה הנדרשים כדי לסייע ערכות אלה אינם זמינים בתחום.
בפרוטוקול הנוכחי, שיטת החילוץ של ה-DNA פשוטה משתמשת ערכת הפקת DNA צמח מסחרי (ראה טבלת חומרים לפרטים). הייתה לו היכולת לנטרל חומרים מעכבים נפוצים לתוצאות לרבייה והפיק תוצאות עקביות עבור M. קמומילה ו C. nobile. שני M. קמומילה ו C. ראשי פרח נוביל ועלים הניבו amplicons PCR עם פסגות המסה ספציפיות, המציין כי הנוכחות של מעכבי PCR לא היה דאגה. עבור צמחים אחרים עם רמות גבוהות יותר של מעכבי PCR, הגביר את ה-DNA בחילוץ המקורי שלהם עשוי להיות פחות יעיל. כדי להפחית את העיכוב ולשפר את יעילות ההגדלה, עם גישה לצמח כולו, חלקים אחרים צמח עם תוכן פוליסכריד ופוליפנול נמוך יותר יכול לשמש גם למטרות זיהוי. אם יש גישה מוגבלת לחלקי צמחים שונים, עלים צעירים יותר או עלי כותרת הנקטעו מראשי פרחים, אשר בדרך כלל יש תוכן פנולינמוך יותר 39, עשוי להציע סיכוי טוב יותר להצלחה. מאז רצפי DNA עקביים על פני כל הצמח, כל חלק צמח עשוי לשמש כדי לאשר את זהות המין. אם ההגדלה PCR היא עדיין תת אופטימלית, תמצית ה-DNA המקורית יכולה להיות מדוללת עוד יותר לפני PCR, או פרוטוקולי טיהור מעבדה מתוחכמים יותר ניתן להשתמש.
אתגר נוסף לניתוח PCR הוא תוצאות חיוביות כוזבות הנגרמות על ידי זיהום DNA, אשר יכול להשפיע לרעה על פרשנות נתונים. הוא נשלט בדרך כלל על ידי משק בית פעיל, שימוש בציוד ייעודי והגבלת העבודה לאזורים ייעודיים. באמצעות qPCR, כל ניתוח PCR יכול להתבצע במערכת סגורה, אשר מפחית מאוד את הסיכוי של זיהום AMPLICON PCR בסביבה שאינה מבוקרת היטב. חוץ מזה, DNA סביבתי גם לא צריך להראות חיובי כוזב בשל הספציפיות של ההסתה, על פי מחקר אימותקודם 40.
יש מקום לשיפור. בפרוטוקול שהוצג כאן, הצבע ההכלאה שימש כדי להראות את ההגדלה של שבר היעד בזמן אמת. הייחודיות של השיטה מאושרת עוד יותר על ידי טמפרטורת ההתכה האופיינית, אשר נבדל בין M. קמומילה ו- C. מגרענים נוביל. לכן, התעתעת PCR מבוססת צבע יכולה לענות ביעילות על השאלה "מהו מין צמח זה?" בתחום. עם זאת, בנוסף לצורך בביצוע זיהוי בוטני על צמח יחיד המבודד מהשטח, בנסיבות רבות, אבקות בוטניות או תמציות במחסן ייהנו גם מהערכת זהות מהירה באתר. עבור חומרים מסוג זה, ייתכן שיהיה צורך לטפל בשאלות נוספות, כגון "מה יש בחומר זה?", "האם הוא מכיל את המינים הבוטניים שאני מחפש?", "האם הוא מכיל נואף שאני רוצה להימנע ממנו?", ו"האם הוא הוחלף לחלוטין או חלקית על ידי מינים בוטניים אחרים המזיקים?". במקום להשתמש בצבע intercalating, בדיקות qPCR שונות ניתן לתווך למקד amplicons מצמחים שונים במערכת תגובה אחת, תוך שמירה על ספציפיות גבוהה ויעילות של ההסמעה. פיתוח qPCR מבוסס בדיקה וניצול של מערכת qPCR ניידת המציעה זיהוי ערוצים מרובים יכול להרחיב עוד יותר את היישום של בדיקות שדה כאסאי מתאים למטרה להגדרת סביבה רחבה יותר, כגון מחסני חומרים בוטניים ומרכזי הפצה כדי לענות על שאלות מורכבות יותר. בנוסף, שימוש בבדיקות מרובות גם מאפשר למשתמש לכלול ההגדלה הפנימית בכל מערכת תגובה, כך שמידע נוסף יהיה זמין כאשר מעכבים PCR חשוד.
לפרוטוקול המוצג כאן יש את היתרונות הבאים בהשוואה לטכנולוגיות קיימות המשמשות לאותה מטרה. ראשית, עבור שיטות זיהוי מורפולוגיות וכימיות מסורתיות, ההליך ותוצאותיו צריכים להתנהל ולפרש על ידי מומחים. בדיקות זיהוי מבוססות qPCR יכולות לבוצעות על ידי אנשים עם הכשרה בסיסית בביולוגיה מולקולרית ולפרש באופן מתוקן יותר. שנית, בהשוואה לזיהוי מינים מבוססי QPCR והבידול המבוצעים בדרך כלל במעבדה, פרוטוקול זיהוי השדה באמצעות מכשיר נייד אינו דורש מכשירים בעלי טביעת רגל גדולה, כגון צנטריפוגה במהירות גבוהה, ציוד להערכת איכות ה-DNA, רוכב תרמי עם גלאי פלואורסץ ומחשב שבו פועלת תוכנה מיוחדת. לכן, זיהוי מינים מבוססי DNA יכול להתבצע בכל הגדרה ללא דיחוי. שלישית, חיפוש חומרים בוטניים הוא משימה הדורשת פעולה גלובלית. עם התקדמות בשירותי ענן ובינה מלאכותית, מכשיר נייד יכול לקבל שיטות שפותחו ואומתו על ידי מומחים במעבדה, להיות מופעל על ידי לא מומחים באזורים מרוחקים ולייצר אישורים אובייקטיביים צדדים שלישיים. לכן, אפשרות זו היא משכנעת יותר מאי פעם עם עבודה מרחוק הופך את המגמה.
לסיכום, הפרוטוקול כאן הדגים זיהוי שדה של M. קמומילה באמצעות מערכת qPCR ניידת. היישום המוצלח של טכניקה זו יפיק תוצאות מדויקות ביותר על זיהוי בוטני ויסייע ליצרנים וספקים בוטניים להעפיל לחומרים בוטניים בזמן וחסכוני.
Disclosures
אנו מאשרים כי Zhengxiu יאנג, ג'נג קוואן, טיפאני צ'ואה, ליאו לי, Yanjun ג'אנג, סילבה Babajanian, טרישה צ'ואה, פיטר צ'אנג, גארי סוונסון, Zhengfei Lu הם עובדים של הרבלייף הבינלאומי של אמריקה, Inc. אנו מאשרים כי פרנצ'סקו Buongiorno, איזבלה דלה Noce, לורנצו קולומבו הם עובדים של Hyris בע"מ המייצרת את מכשיר qPCR נייד המשמש במאמר זה.
Acknowledgments
אנו מודים לג'יימס שאן על מאמציו בהקלטת וידאו בשטח. אנו מודים לג'ון ביירון ומתיו סמראו על עבודתם בעריכת וידאו. אנו מודים לאנסן לואו, הארי דו ופרנק דנג על תמיכתם באיתור שדה המבחן. אנו מודים למריה רובינסקי על הערותיה החשובות על כל כתב היד. כל האנשים ההוכרים הם עובדים של הרבלייף הבינלאומי של אמריקה, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Battery | TNE | 78000mAh | Provide field power supply |
| bCUBE | HYRIS | bCUBE 2.0 | Portable qPCR instrument |
| Cartridges(16 Well) | HYRIS | NA | Consumables for bCUBE |
| Electric pipette | Eppendorf | NA | Handling liquid |
| Extract-N-AmpTM plant PCR kit | SIGMA | XNAP2-1KT | Plant DNA extraction kit |
| German chamomile (Matricaria chamomilla L) flower botanical reference materials | AHP | 2264 | Used as positive control |
| Mini dry bath | Yooning | MiniH-100L | For DNA extraction |
| Nuclease-free water | AMBION | AM9937 | qPCR reaction |
| Primer | Thermo Fisher Scientific | NA | qPCR reaction |
| Roman chamomile (Chamaemelum nobile) flower botancial reference materials | ChromaDex | ASB-00030806-005 | Used as positive control |
| Luna universal qPCR master mix | NEB | M3003L | qPCR reaction |
References
- Smith, T., Gillespie, M., Eckl, V., Knepper, J., Reynolds, C. Herbal supplement sales in US increase by 9.4% in 2018. HerbalGram. 123, 62-73 (2019).
- Israelsen, L. D. The challenge of regulation, globalization and climate change on botanicals and traditional medicines: respecting tradition while embracing change. Planta Medica. 74 (3), 36 (2008).
- Cardellina, J. H. Challenges and opportunities confronting the botanical dietary supplement industry. Journal of Natural Products. 65 (7), 1073-1084 (2002).
- Foster, S. Exploring the peripatetic maze of black cohosh adulteration: a review of the nomenclature, distribution, chemistry, market status, analytical methods and safety. HerbalGram. 98, 32-51 (2013).
- Vanherweghem, J. L. Misuse of herbal remedies: The case of an outbreak of terminal renal failure in Belgium (Chinese herbs nephropathy). The Journal of Alternative and Complementary Medicine. 4 (1), 9-13 (1998).
- Vanherweghem, J. L., et al. Rapidly progressive interstitial renal fibrosis in young women: association with slimming regimen including Chinese herbs. The Lancet. 341 (8842), 387-391 (1993).
- Khan, I. A., Smillie, T. Implementing a "quality by design" approach to assure the safety and integrity of botanical dietary supplements. Journal of Natural Products. 75 (9), 1665-1673 (2012).
- Applequist, W. The Identification of Medicinal Plants: A Handbook of the Morphology of Botanicals in Commerce. , Missouri Botanical Garden Press. (2006).
- Upton, R., Graff, A., Jolliffe, G., Länger, R., Williamson, E. American Herbal Pharmacopoeia: Botanical Pharmacognosy - Microscopic Characterization of Botanical Medicines. , CRC Press. (2016).
- Frommenwiler, D. A., et al. Comprehensive HPTLC fingerprinting for quality control of an herbal drug - the case of angelica gigas root. Planta Medica. 84 (6-7), 465-474 (2018).
- Heyman, H. M., Meyer, J. J. M. NMR-based metabolomics as a quality control tool for herbal products. South African Journal of Botany. 82, 21-32 (2012).
- Lazarowych, N. J., Pekos, P. Use of fingerprinting and marker compounds for identification and standardization of botanical drugs: strategies for applying pharmaceutical HPLC analysis to herbal products. Drug Information Journal. 32 (2), 497-512 (1998).
- Tankeu, S., et al. Hyperspectral imaging and support vector machine: a powerful combination to differentiate black cohosh (actaea racemosa) from other cohosh species. Planta Medica. 84 (6-7), 407-419 (2018).
- Rodman, J. E., Cody, J. H. The taxonomic impediment overcome: NSF's Partnerships for Enhancing Expertise in Taxonomy (PEET) as a model. Systematic Biology. 52 (3), 428-435 (2003).
- Chen, S., et al. A renaissance in herbal medicine identification: from morphology to DNA. Biotechnology Advances. 32 (7), 1237-1244 (2014).
- Li, X., et al. Plant DNA barcoding: from gene to genome. Biological Reviews. 90 (1), 157-166 (2015).
- Madesis, P., Ganopoulos, I., Sakaridis, I., Argiriou, A., Tsaftaris, A. Advances of DNA-based methods for tracing the botanical origin of food products. Food Research International. 60, 163-172 (2014).
- Newmaster, S. G., Ragupathy, S., Janovec, J. A botanical renaissance: state-of-the-art DNA bar coding facilitates an automated identification technology system for plants. International Journal of Computer Applications in Technology. 35 (1), 50-60 (2009).
- Parveen, I., Gafner, S., Techen, N., Murch, S. J., Khan, I. A. DNA barcoding for the identification of botanicals in herbal medicine and dietary supplements: strengths and limitations. Planta Medica. 82 (14), 1225-1235 (2016).
- Agrawal, N., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. A pocket-sized convective PCR thermocycler. Angewandte Chemie International Edition. 46 (23), 4316-4319 (2007).
- Almassian, D. R., Cockrell, L. M., Nelson, W. M. Portable nucleic acid thermocyclers. Chemical Society Reviews. 42 (22), 8769-8798 (2013).
- Benítez-Páez, A., Portune, K. J., Sanz, Y. Species-level resolution of 16S rRNA gene amplicons sequenced through the MinION portable nanopore sequencer. Gigascience. 5 (1), 4 (2016).
- Emanuel, P. A., et al. Detection of Francisella tularensis within infected mouse tissues by using a hand-held PCR thermocycler. Journal of Clinical Microbiology. 41 (2), 689-693 (2003).
- Quick, J., et al. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 530 (7589), 228 (2016).
- Lu, Z., et al. Single-laboratory validation of a two-tiered DNA barcoding method for raw botanical identification. Journal of AOAC International. 102 (5), 1435-1447 (2019).
- Sgamma, T., et al. DNA barcoding for industrial quality assurance. Planta Medica. 83 (14-15), 1117-1129 (2017).
- Wallinger, C., et al. Rapid plant identification using species-and group-specific primers targeting chloroplast DNA. PLoS One. 7 (1), 29473 (2012).
- Newmaster, S. G., et al. Recommendations for validation of real-time PCR methods for molecular diagnostic identification of botanicals. Journal of AOAC International. , (2019).
- Singh, O., Khanam, Z., Misra, N., Srivastava, M. K. Chamomile (Matricaria chamomilla L.): an overview. Pharmacognosy Reviews. 5 (9), 82 (2011).
- Mills, S. Y., Bone, K. The Essential Guide to Herbal Safety. Elsevier Health Sciences. , 325 (2004).
- Avula, B., et al. Quantitative determination of phenolic compounds by UHPLC-UV-MS and use of partial least-square discriminant analysis to differentiate chemo-types of Chamomile/Chrysanthemum flower heads. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 88, 278-288 (2014).
- Guzelmeric, E., Vovk, I., Yesilada, E. Development and validation of an HPTLC method for apigenin 7-O-glucoside in chamomile flowers and its application for fingerprint discrimination of chamomile-like materials. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 108-118 (2015).
- Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. General concepts for PCR primer design. Genome Research. 3 (3), 30-37 (1993).
- Untergasser, A., et al. Primer3Plus, an enhanced web interface to Primer3. Nucleic Acids Research. 35, Web Server issue 71-74 (2007).
- Bustin, S., Huggett, J. qPCR primer design revisited. Biomolecular Detection and Quantification. 14, 19-28 (2017).
- Brownie, J., et al. The elimination of primer-dimer accumulation in PCR. Nucleic Acids Research. 25 (16), 3235-3241 (1997).
- Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27 (7), Oxford, England. 1019-1020 (2011).
- Heikrujam, J., Kishor, R., Mazumder, P. B. The chemistry behind plant DNA isolation protocols. Biochemical Analysis Tools - Methods for Bio-Molecules Studies. , (2020).
- Blum-Silva, C. H., Chaves, V. C., Schenkel, E. P., Coelho, G. C., Reginatto, F. H. The influence of leaf age on methylxanthines, total phenolic content, and free radical scavenging capacity of Ilex paraguariensis aqueous extracts. Revista Brasileira de Farmacognosia. 25 (1), 1-6 (2015).
- Lu, Z., et al. Validation of a targeted PCR method for raw and processed botanical material identification: an example using matricaria chamomilla (chamomile). Journal of AOAC International. 102 (6), 1787-1797 (2019).
