Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

פלטפורמת מיקרוסקופי מרובה-פוטונים מותאמת אישית להדמיה חיה של קרנית עכבר ולחמית

doi: 10.3791/60944 Published: May 17, 2020
* These authors contributed equally

Summary

מוצג כאן היא פלטפורמה מיקרוסקופית multiphoton עבור הדמיית פני השטח עינית עכבר חי. עכבר טרנסגני פלורסנט מאפשר הדמיה של גרעין התא, קרום התא, סיבי עצב ונימים בתוך פני השטח עינית. אותות לא ליניאריים של הדור ההרמוני השני הנגזרים ממבנים קולגניים מספקים הדמיה ללא תוויות עבור ארכיטקטורות סטרומה.

Abstract

ניתוח היסטולוגי קונבנציונלי ומערכות תרבות תאים אינם מספיקים כדי לדמות בדינמיקה פיזיולוגית ופתולוגית vivo לחלוטין. Multiphoton מיקרוסקופית (MPM) הפך לאחד מנודות ההדמיה הפופולריות ביותר עבור מחקר ביו רפואי ברמות התא vivo, היתרונות כוללים רזולוציה גבוהה, חדירה לרקמות עמוקות וphototoxicity מינימלי. עיצבנו פלטפורמת הדמיה MPM עם מחזיק עיניים מותאם אישית של העכבר ושלב סטריאו-קסי להדמיית משטח עיני ב-vivo. עכבר כתב חלבון פלואורסצנטי כפול מאפשר הדמיה של גרעין התא, קרום התא, סיבי עצב, ונימים בתוך פני השטח עינית. בנוסף לאותות פלואורסצינליים מרובי פוטון, רכישת הדור ההרמוני השני (SHG) מאפשרת בו זמנית אפיון של ארכיטקטורת סטרומה קולגנית. פלטפורמה זו יכולה להיות מועסקת עבור הדמיה תוך-ויטלית עם מיקום מדויק על פני כל פני השטח עינית, כולל קרנית ולחמית.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מבני פני השטח עינית, כולל הקרנית והלחמית, להגן על רקמות עיניות עמוקות אחרות מפני הפרעות חיצוניות. הקרנית, החלק הקדמי השקוף של העין, מתפקדת הן כעדשה שבירה להכוונון האור לתוך העין והן כמחסום מגן. אפיתל הקרנית הוא השכבה החיצונית ביותר של הקרנית ומורכב שכבות נפרדות של תאים שטחיים, תאי כנף ותאי בסיס. הקרנית סטרומה מורכבת מלמלה קולגניים ארוזה ומתוחכמת המשובצת בקרטוציטים. אנדותל קרנית, שכבה אחת של תאים משושים שטוחים, יש תפקיד חשוב בשמירה על השקיפות של הקרנית על ידי שמירה על סטרומה הקרנית במצב מיובש יחסית באמצעות פונקציות השאיבהשלה 1. לימבוס יוצר את הגבול בין הקרנית ללחמית, והוא מאגר תאי גזע אפיתל קרנית2. הלחמית עם כלי הדם מסייעת לשמן את העיניים על ידי ייצור ריר ודמעות3.

דינמיקת התא של מבני פני הקרנית נחקרים באופן קונבנציונלי על ידי ניתוח היסטולוגי או בתרבות תא במבחנה, אשר לא יכול לדמות כראוי את הדינמיקה בתא vivo. גישה לא פולשנית של הדמיה חיה יכולה, לפיכך, לגשר על הפער. בשל יתרונותיו, הכוללים רזולוציה גבוהה, פוטו-חום מינימלי ועומק הדמיה עמוק יותר, MPM הפך לעוצמתיות רבה בתחומיםשונים של מחקר ביולוגי 4,5,,6,7,8. עבור הדמיית קרנית, MPM מספק מידע סלולרי משפעת אוטומטית פנימית הנגזרת מ- NAD(P)H התוך תאי. הדור ההרמוני השני (SHG) אותות נגזרים מסוג שאינו centrosymmetric אני סיבי קולגן תחת סריקת לייזר femtosecond מספק מבנים סטרומה קולגניים ללא הליכי כתמים נוספים9. בעבר, אנחנו וקבוצות אחרות ניצלנו MPM להדמיה של קרניות בעליחיים ואדם 9,,10,,11,,12,,13,,14,,15.

קווי עכבר טרנסגניים המציגים חלבוני פלורסנט באוכלוסיות תאים ספציפיים שימשו באופן נרחב עבור מחקרים שונים בביולוגיה של תאים, כולל פיתוח, הומוסטאזיס רקמה, התחדשות רקמות, קרצינוגנזה. השתמשנו זנים עכבר transgenic עם תווית עם חלבונים פלורסנט עבור הדמיית vivo שלקרניות 9,,10,זקיקישיער 10 ו אפידרמיס10 על ידי MPM. זן העכבר הפלואורסצנטי הכפול עם קרום התא המסומן ב- tdTomato וגרעין התא המתויג ב- EGFP גדל משני זנים של העכבר: R26R-GR (B6;129-Gt (ROSA )26סורtm1Ytchn/J, #021847)16 ו- mT-mG (GT(ROSA26)ACTB-tdTomato-EGFP, #007676)17. קו העכבר הטרנסגני R26R-GR מכיל מבנה כפול של כתב חלבון פלורסנט, כולל גן היתוך H2B-EGFP והגן היתוך אות עוגן mCherry-GPI, מוכנס לתוך Gt (ROSA)26Sor לוקוס. הזן הטרנסגני mT-mG הוא קרום תא ממוקד tdTomato ו EGFP פלורסנט Cre-כתב עכברים. לפני Recombination Cre, חלבון קרום התא עם ביטוי פלואורסץ tdTomato קיים באופן נרחב בתאים שונים. זן עכבר טרנסגני זה מאפשר לנו לדמיין גרעין-EGFP וממברנה עם tdTomato ללא עירור Cre. שתי נקבות (R26R-GR+/+) וזכר אחד (mT-mG+/+) חוברו יחד כדי לייצר עכברים מספיקים לניסויים. צאצאיהם עם R26R-GR+/-;mT-mG+/- גנוטיפ, זן עכברים פלורסנט כפול, שימשו במחקר זה. בהשוואה לקו עכבר אחד כתב פלורסנט כפי שתוארקודם לכן 9,10, זן עכבר פלורסנט כפול זה מספק לנו 50% רכישה מופחתת של זמן הדמיה.

בעבודה זו, אנו מתארים פרוטוקול טכני מפורט להדמיית vivo של פני השטח עינית באופן שלב אחר שלב באמצעות פלטפורמת ההדמיה שלנו ועכברים טרנסגניים פלואורסצנטי כפול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם לנהלים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) של אוניברסיטת טייוואן הלאומית ו בית החולים צ'אנג גאנג ממוריאל.

1. הגדרת מיקרוסקופים מולטיפוטונים

  1. לבנות מערכת המבוססת על מיקרוסקופ זקוף עם טבילה מים 20x 1.00 NA המטרה (איור 1A).
  2. השתמש Ti: לייזר ספיר (עם אורך גל tunable) כמקור העירור. הגדר את אורך הגל של פלט הלייזר ב- 880 nm עבור EGFP ו- 940 נה"מ עבור tdTomato (איור 1A).
  3. כלול שתי מראות דיקרויות (495 נק' ו- 580 נה"מ) להפרדה בין SHG/EGFP ו- EGFP/tdTomato(איור 1A). ספקטרלי להפריד את אותות SHG, EGFP ו tdTomato על ידי מסנני bandpass 434/17nm, 510/84nm ו 585/40nm (איור 1A).
  4. על מנת לייעל את איכות התמונה ולהימנע מצילום ונזק לרקמות, להגדיר את כוח הלייזר להיות על 35 mW עבור הקרנית הדמיה ו 50 mW עבור לימבוס. למדוד את כוח הלייזר לפני הלייזר עובר את המערכת האופטית. כוח הלייזר המדויק על דגימות הוא על 8-9 mW. העיצוב המיקרוסקופי המלא מוצג באות 1A.
    הערה: הגבול העליון של כוח לייזר מוגדר 70 mW כדי למנוע הלבנת תמונה ונזק לרקמות.

2. הכנת בעלי חיים להדמיה חיה

  1. השתמש בעכברים בני 8-12 שבועות לניסוי. תוך שרירי להזריק 50-80 מ"ג/ק"ג של אריחים HCl ו HCl zolazepam להרדמה כללית. בדוק אם חוסר תגובה רפלקס נסיגה על ידי צביטת בהון. חינוי מספיק חשוב כדי לאפשר ניטור קצב נשימה יציב.
    הערה: עכברים בגיל 8 שבועות ומעלה מומלצים מכיוון שהעין שלהם התבגרה.
  2. מניחים את העכבר תחת הרדמה על במה מחוממת והכניסו את הגשוש לניטור טמפרטורה לפי הטבעת.
    התראה: יש להכניס את הגשוש במלואו לחלל האנאלי ללא חשיפה לאוויר, כדי להימנע מהתחממות יתר של התנור והשראה של מכת חום.

3. מחזיק עין להדמיה חיה של פני עינית

  1. להדמיה חיה של פני השטח העיניים, השתמשו במחזיק העכבר הסטריאו-מסה מותאם אישית המורכב משני חלקים: מחזיק ראש כדי לייצב את הראש ומחזיק עיניים כדי למשוך את העפעפיים ולחשוף את כל משטח העינית(איור 1B-D).
  2. הכנס את אטמי האוזן לתוך המיטוס השמיעתי החיצוני ולשמור על קיבעון של שלוש נקודות של בעל הראש (איור 1ב', ד).
  3. Topically להחיל פתרון של 0.4% אוקסיבופרוקאין הידרוכלוריד בתמיסת מלח ולהשאיר אותו במשך 3 דקות כדי להנימה את פני השטח עינית.
  4. ודא שגלגל העין בולט על ידי נסיגה ידנית נכונה של העפעפיים. אחרת, איסכמיה ודימום של גלגל העין יכול להתרחש.
  5. בזהירות למקם לולאה של צינור פוליאתילן של מחזיק עיניים לאורך שולי העפעף כדי לחשוף את פני השטח עינית. לייצב את גלגל העין עם מחזיק העין מורכב מ מקצות דומונט מס ' 5 עם קצותיה מכוסים בלולאה של צינור פוליאתילן (איור 1C,D).
  6. בורג מקצות באמצעות ידית במקציצות דיסטלי של מחזיק עיניים כדי לשמור על גלגל העין יציב(איור 1D).
  7. למרוח ג'ל עיניים עם אינדקס שבירה של 1.338 על פני השטח הקרנית כמדיום טבילה כדי לשמור על הלחות של פני השטח עינית בכל שעה. בנוסף, יישום קבוע של ג'ל העין בכל שעה להימנע מענן בקרנית במהלך ההדמיה.
  8. לסובב את גלגל העין עם המחזיק הנעול על השלב הממונע צעד להדמיה על פני פני הקרנית כולה מן הקרנית המרכזית לאזור ההיקפי(איור 1C,D).
    התראה: הן כמויות עודפות והן כמויות לא מספיקות של ג'ל עיניים יכול להשפיע על איכות התמונות במהלך ההדמיה. לכן, השלמת ג'ל עיניים כל שעה כדי לשמור על פני השטח לחים באופן קבוע חשוב להדמיה.

4. רכישת תמונה טורית Z

הערה: הגדר את השקופית הראשונה והאחרון בכל מחסנית כדי להפחית את חפצים תנועה שחרור.

  1. לפני צילום התמונות, צלם את שדה המטרה עם מקור אור כספית.
  2. לחץ על הסמל של תוכנת המיקרוסקופ כדי להפעיל את התוכנה.
  3. בחר רווח PMT נכון רווח דיגיטלי כדי לדמיין את המבנה התאי במשטח עינית.
  4. הגדר את השקופית הראשונה ואת השקופית האחרונה כדי להשיג מחסנית.
  5. הזן ערכים מספריים עבור רזולוציית תמונה ו- z-step, לדוגמה, 512 x 512 ו- μm אחד כ- z-step.
  6. לחץ על לחצן התחל כדי לאסוף תמונות z-serial.
  7. לרכוש תמונות חיות פעמיים באותו אזור, הראשון ב 880 נארם excitation עבור אוסף אותות SHG / EGFP והשני ב 940 צפון צפון מטרים עבור איסוף אותות EGFP / tdTomato.
    הערה: השילוב של שתי ערימות מספק 3 תמונות ערוצים. רזולוציית התמונה וגודל תבנית הסריקה היו 512 x 512 פיקסלים ו- 157 μm x157 μm, בהתאמה.

5. עיבוד תמונה ושחזור תלת-ממדי

  1. טען את התמונות z-serial לתוך תוכנתפיג'י 18.
  2. בחר את המסנן 3D חציון תוסף בפיג'י כדי להפחית את רעשי הרקע.
  3. בחר במסנן 'בטל ערפד מסיכה חבילה' בפיג'י כדי לחדד את התמונות.
  4. לחץעל" אוטומטי " בבהירות /ניגודיות כדי למטב באופן אוטומטי את איכות התמונות.
  5. שמור את התמונות כרצף תמונות כדי שתוכל לייצא את התמונות z-serial.
  6. טען תמונות z-serial לתוכנות מסחריות (לדוגמה, Avizo lite) לשחזור תלת-ממדי באמצעות עיבוד אמצעי אחסון.
  7. בכל תמונות MPM, הצג אותות EGFP, tdTomato ו- SHG בצבע פסאודו-ירוק, אדום וציאן בהתאמה.
  8. לכוד תמונות מבנה תלת-מית-די לפי התמונה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

באמצעות פלטפורמת הדמיה חיה זו, ניתן לדמיין את משטח עיני העכבר ברמות התא. כדי לדמיין תאים בודדים בודדים במשטח עינית, העסקנו את העכברים הטרנסגניים הפלואורסצנטיים הכפולים עם EGFP המבוטא בגרעין וב-tdTomato המתבטאים בממברנה התאית. סטרומה הקרנית העשירה קולגן היה מודגש על ידי אותות SHG.

באפיתל הקרנית, תאים שטחיים, תאי כנף ותאי בסיס(איור 2)היו חזותיים. בעכברים טרנסגניים פלואורסצנטיים כפולים, הצלחנו למפות תאים בודדים מהשכבה הבזלית לשכבות השטחיות הן בקרנית והן באפיתל לימבי(איור 2). התאים המשושה שטחיים נצפו (ראש חץ לבן באות 2). הן גודל גרעיני והן מרווח internuclear מהשכבה בסיס לכיוון השכבות החיצוניות גדל אפיתל קרנית(איור 2). האותות הציטופלסמיים של tdTomato פלואורסצנטיות הצביעו על כך שמערכת שלולית תאית עשירה בחלבון קרום, כולל מערכת Golgi, רטיקולום אנדופלסמי, היו מפוזרים בתאיהכנף (איור 2).

בתוך סטרומה קולגנית, keratocytes בצורת כוכבה תוארו על ידי קרום מיקוד tdTomato פלואורסצנטי בעכברים טרנסגניים פלואורסצנטי כפול (ראש חץ צהוב באות 3 ו איור 4). הקרטציטים המשובצים בקולגן סטרומה היו במטומטים יותר מאשר תאי אנדותל. בנוסף, עצבי הסתעפות דקים סטרומה הקרנית היו גם הדמיה על ידי קרום מיקוד tdTomato אותות (ראש חץ לבן באיור 3). חד שכבת תאי אנדותל הקרנית הראתה צורה משושה הומוגנית יחסית המחוברת לתבנית מרוקנת דבש (ראש חץ לבן באיור 4). האפיתל הלימבי כלל 1-2 שכבות של תאי אפיתל(איור 5). זן העכבר הטרנסגני של כתב הפלואורסצנט הכפול אפשר לנו גם למצוא את הנימים בתוך הלחמית (איור 6א). אדריכלות תלת-מית של נימים שוחזרה על ידי התוויה אנדותל כלי דם (איור 6B,6C).

Figure 1
איור 1: הגדרת MPM ומחזיק עכבר מסתובב.
(א)ההתקנה של ה- MPM. (ב)העיצוב של מחזיק העכבר. מחזיק העכבר מורכב ממחזיק ראש מסתובב ומחזיק עיניים. (ג)העיצוב של מחזיק עיני העכבר. מחזיק העיניים מושך עפעפיים על ידי לולאת פלסטיק כדי לחשוף את הקרנית ואת הלחמית. מחזיק הראש ומחזיק העיניים נדפקים יחד (ב) על הבמה כדי לאפשר סיבוב והדמיה מדויקים ותפוקתיים של משטח עיני. (ד)צילום של עכבר חי להדמיית קרנית עם מחזיק עיניים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: הדמיה חיה של אפיתל קרנית בעכברים טרנסגניים פלואורסצנטיים כפולים.
אפיתל הקרנית היה תמונה שכבה אחר שכבה, כדי לכלול תאים שטחיים, תאי כנף, ותאי בסיס. תאים שטחיים מסומנים בראש חץ לבן. סרגל קנה מידה = 50 μm. (Z = עומק מפני השטח העליון של אפיתל (μm)). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: הדמיה חיה של סטרומה הקרנית.
בתוך סטרומה הקרנית, keratocytes (ראש חץ צהוב) וסיבי העצב (ראש חץ לבן) היו מוטבעים סטרומה קולגנית (בצבע פסאודו כחול). סרגל קנה מידה = 50 μm. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: הדמיה חיה של אנדותל קרנית בקרנית המרכזית.
שכבת מונו-שכבה של תאי אנדותל הקרנית משושה (ראש חץ לבן). סרגל קנה מידה = 50 μm. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: הדמיה חיה של אפיתל לימב.
תמונות חיות של האפיתל הלימבי בעכברים טרנסגניים פלואורסצנטיים הראו גרעין פלואול. סרגל קנה מידה = 50 μm. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: הדמיה חיה ושחזור תלת מימדי של רשת כלי דם בלחמית.
נימיםבסטרומה הלחמית היו מדמיינת. סרגל קנה מידה = 50 μm. (ב)שחזור תלת-ממדי של רשתות ניחים המבוצעות באמצעות תוכנה מסחרית. סרגל קנה מידה = 50 μm. אני לאיודע מה לעשות. תצוגות תלת-מידות מוגדלות של התמונה המוצגת בלוח ב. תאי אנדותל כלי דם פלורסנט התווה את הנימים (ראשי חץ לבנים וצהובים). סרגל קנה מידה עבור לוח C = 6.26 μm עבור לוח D = 10 μm. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

פלטפורמת הדמיה MPM מותאמת אישית זו עם תוכנת בקרה שימשה להדמיה תוך-ויטלית של איברי אפיתל עכבר,כולל עור 10,זקיק שיער 10 ומשטחעינית 9,10 (איור 1A). המערכת הבנויה בהתאמה אישית שימשה לגמישותה בשינוי הרכיבים האופטיים לניסויים שונים, מאז תחילת הפרויקט. מתודולוגיית הדמיה זו היא רב-תכליתית עבור מוצרי MPM מסחריים. פרוטוקול זה מתאר שיטה מפורטת להדמיה תוך-ויטלית של משטח עיני העכבר על-ידי פלטפורמת הדמיה MPM. באמצעות מחזיק עכבר סטריאוטקסי(איור 1B),הצלחנו לדמיין אזורים שונים על פני כל פני השטח עינית. יכולת המיקום המדויקת מאפשרת לפקח על שינויים דינמיים של תאים זמניים באזור שצוין.

למרות מספר מחקרים של הדמיית MPM קרנית מורין דווחו vivo19,20,21,22 , יש כמה מגבלות טכניות אשר אחד צריך להתגבר כדי להשיג הדמיה רציפה על פני תקופה ארוכה למשל, מחזיק את גלגל העין בעמדה יציבה,הפחתת חפציתנועה במהלך הדמיה ורכישת התמונות לתקופה ארוכה ללא פוטו- בלי לצלם. בהשוואה לתפעת העין מפלסטיק המיועדת להדמיית קרנית ב-vivo עם גישה מוגבלת יחסית לפני השטחשל העין 20, מחזיק העיניים שלנו לא רק שומר על גלגל העין חשוף לחלוטין אלא גם הופך את כל פני השטח העיניים לנגישים לעדשההאובייקטיבית (איור 1C).

למרות צבעים חיוניים או בדיקות משמשים באופן שגרתי כתבים פלורסנט לתייג תאים20,21,22,הפולשניות של הזרקת מחט עלול לשבש את הדינמיקה הטבעית של תאים של איברים במהלך תהליך התחדשות הומאוסטטית פיזיולוגית או רקמות. R26R-GR עכברים טרנסגניים זן מבטא חלבון פלורסנט ירוק בהיר ויציב בגרעין התא שימש להדמיה של דינמיקת התא של אבותשרירים בסיבים רפאים 23. mT-mG כתב קו העכבר transgenic שימש כדי לנתח את ההבידול של תאים אפידרמיס inhomeostasis24. בהשוואה לקו עכבר טרנסגני פלואורסצנטי כתב יחיד, זן עכבר טרנסגני פלואורסצנטי כפול זה הפחית את זמן רכישת התמונה לחצי על ידי מתן מידע מבנה התא של גרעין התא וממברנות התא. על ידי סיבוב מחזיק העכבר, גרעין שטוח של אנדותל ותאי דם היו חזותיים בתוך לומן כלי הדם באמצעות זן עכבר טרנסגני פלורסנט כפול(איור 6). לכן, קו עכבר טרנסגני זה יכול לשמש כדי לחקור את הדינמיקה התא של נימים בעתיד, שהוא המפתח neovascularization קרנית פתולוגית. בנוסף, זה בפלטפורמת הדמיה vivo יכול לשמש גם כדי לחקור את התגובות החיסוניות פתולוגיות קרנית על ידי תיוג פלורסנט של תאים חיסונייםשונים, כגון נויטרופילים 25, langerhansתאים 26, תאי T רגולטוריים (Tregs)27 ותאי תורן 28.

לסיכום, הראינו פלטפורמת הדמיה רבת עוצמה של MPM תוך-ויטאל לחקר פני השטח של עינית העכבר. השילוב של במה סטריאוטקסית MPM חי ועכברים טרנסגניים פלואורסצנטיים מיוחדים מאפשר הדמיה בזמן אמת של מבנים תאיים וחוץ תאיים נפרדים על פני השטח עינית, כולל קרנית, לימבוס ולחמית. פלטפורמת הדמיה תוך-ויטאלית זו יכולה לעזור לחקור את דינמיקת התא של פני השטח העין, עם התפתחות נוספת, יכול לשמש פוטנציאלית לסינון תרופות אופטלמוס בעתיד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים לתמיכת המענק ממשרד המדע והטכנולוגיה, טייוואן (106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089, 108-2628-B-002-023, 108-2628-B-002-023), בית החולים הלאומי של אוניברסיטת טייוואן (NTUH108-T17) ובית החולים צ'אנג גאנג ממוריאל, טייוואן (CMRPG3G1621, CMRPG3G16222, CMRPGPG3G1623).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AVIZO Lite software Thermo Fisher Scientific Version: 2019.3.0
Bandpass filters Semrock FF01-434/17
FF01-500/24
FF01-585/40
Dichroic mirrors Semrock FF495-Di01-25x36
FF580-Di01-25x36
Galvano Thorlabs GVS002
Jade BIO control software SouthPort Corporation Jade BIO
Oxybuprocaine hydrochloride Sigma O0270000
PMT Hamamatsu H7422A-40
Polyesthylene Tube BECTON DICKINSON 427401
Stereotaxic mouse holder Step Technology Co.,Ltd 000111
Ti: Sapphire laser Spectra-Physics Mai-Tai DeepSee
Upright microscopy Olympus BX51WI
Vidisic Gel Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH D13581
Zoletil Virbac VR-2831

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37, (3), 588-598 (2011).
  2. Van Buskirk, E. M. The anatomy of the limbus. Eye (London). 3, Pt 2 101-108 (1989).
  3. Hodges, R. R., Dartt, D. A. Tear film mucins: front line defenders of the ocular surface; comparison with airway and gastrointestinal tract mucins. Experimental Eye Research. 117, 62-78 (2013).
  4. Tan, H. Y., et al. Multiphoton fluorescence and second harmonic generation imaging of the structural alterations in keratoconus ex vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, (12), 5251-5259 (2006).
  5. Konig, K. Multiphoton microscopy in life sciences. Journal of Microscopy. 200, Pt 2 83-104 (2000).
  6. Rompolas, P., et al. Spatiotemporal coordination of stem cell commitment during epidermal homeostasis. Science. 352, (6292), 1471-1474 (2016).
  7. Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19, (2), 155-163 (2017).
  8. Xin, T., Gonzalez, D., Rompolas, P., Greco, V. Flexible fate determination ensures robust differentiation in the hair follicle. Nature Cell Biology. 20, (12), 1361-1369 (2018).
  9. Wu, Y. F., et al. Intravital multiphoton microscopic imaging platform for ocular surface imaging. Experimental Eye Research. 182, 194-201 (2019).
  10. Wu, Y. F., Tan, H. Y., Lin, S. J. Long-Term Intravital Imaging of the Cornea, Skin, and Hair Follicle by Multiphoton Microscope. Methods in Molecular Biology. (2019).
  11. Lo, W., et al. Fast Fourier transform-based analysis of second-harmonic generation image in keratoconic cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, (7), 3501-3507 (2012).
  12. Tan, H. Y., et al. Multiphoton fluorescence and second harmonic generation microscopy for imaging infectious keratitis. Journal of Biomedical Optics. 12, (2), 024013 (2007).
  13. Jester, J. V., et al. Four-dimensional multiphoton confocal microscopy: the new frontier in cellular imaging. Oculur Surface. 2, (1), 10-20 (2004).
  14. Morishige, N., et al. Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48, (3), 1087-1094 (2007).
  15. Hao, M., et al. In vivo non-linear optical (NLO) imaging in live rabbit eyes using the Heidelberg Two-Photon Laser Ophthalmoscope. Experimental Eye Research. 91, (2), 308-314 (2010).
  16. Chen, Y. T., et al. R26R-GR: a Cre-activable dual fluorescent protein reporter mouse. PLoS One. 7, (9), 46171 (2012).
  17. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, (9), 593-605 (2007).
  18. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  19. Masihzadeh, O., Lei, T. C., Ammar, D. A., Kahook, M. Y., Gibson, E. A. A multiphoton microscope platform for imaging the mouse eye. Molecular Vision. 18, 1840-1848 (2012).
  20. Zhang, H., et al. Two-photon imaging of the cornea visualized in the living mouse using vital dyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54, (10), 6526-6536 (2013).
  21. Lee, J. H., et al. Comparison of confocal microscopy and two-photon microscopy in mouse cornea in vivo. Experimental Eye Research. 132, 101-108 (2015).
  22. Ehmke, T., et al. In vivo nonlinear imaging of corneal structures with special focus on BALB/c and streptozotocin-diabetic Thy1-YFP mice. Experimental Eye Research. 146, 137-144 (2016).
  23. Webster, M. T., Manor, U., Lippincott-Schwartz, J., Fan, C. M. Intravital Imaging Reveals Ghost Fibers as Architectural Units Guiding Myogenic Progenitors during Regeneration. Cell Stem Cell. 18, (2), 243-252 (2016).
  24. Mesa, K. R., et al. Homeostatic Epidermal Stem Cell Self-Renewal Is Driven by Local Differentiation. Cell Stem Cell. 23, (5), 677-686 (2018).
  25. Goh, C. C., et al. Real-time imaging of dendritic cell responses to sterile tissue injury. Journal of Investigative Dermatology. 135, (4), 1181-1184 (2015).
  26. Kissenpfennig, A., et al. Dynamics and function of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic cells colonize lymph node areas distinct from slower migrating Langerhans cells. Immunity. 22, (5), 643-654 (2005).
  27. Chow, Z., Mueller, S. N., Deane, J. A., Hickey, M. J. Dermal regulatory T cells display distinct migratory behavior that is modulated during adaptive and innate inflammation. Journal of Immunology. 191, (6), 3049-3056 (2013).
  28. Dudeck, A., et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34, (6), 973-984 (2011).
פלטפורמת מיקרוסקופי מרובה-פוטונים מותאמת אישית להדמיה חיה של קרנית עכבר ולחמית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, Y. F., Ye, R. T., Pan, M. K., Lin, S. J., Tan, H. Y. A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva. J. Vis. Exp. (159), e60944, doi:10.3791/60944 (2020).More

Wu, Y. F., Ye, R. T., Pan, M. K., Lin, S. J., Tan, H. Y. A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva. J. Vis. Exp. (159), e60944, doi:10.3791/60944 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter