Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En tilpasset multiphoton mikroskopi plattform for live imaging av mus cornea og conjunctiva

Published: May 17, 2020 doi: 10.3791/60944
Automatic Translation
1, 1, 2,3, *1,3,4,5, *6,7
1Department of Biomedical Engineering, National Taiwan University, 2Institute of Pharmacology, College of Medicine, National Taiwan University, 3Molecular Imaging Center, National Taiwan University, 4Department of Dermatology, National Taiwan University Hospital, and College of Medicine, 5Research Center for Developmental Biology and Regenerative Medicine, National Taiwan University, 6Department of Ophthalmology, Chang Gung Memorial Hospital, 7College of Medicine, Chang Gung University
* These authors contributed equally

Summary

Presentert her er en multiphoton mikroskopisk plattform for levende mus okulær overflateavbildning. Fluorescerende transgen mus muliggjør visualisering av cellekjerner, cellemembraner, nervefibre og kapillærer innenfor den okulære overflaten. Ikke-lineære andre harmoniske generasjonssignaler avledet fra kollagenstrukturer gir etikettfri bildebehandling for stromal arkitekturer.

Abstract

Konvensjonell histologisk analyse og cellekultursystemer er utilstrekkelige til å simulere in vivo fysiologisk og patologisk dynamikk helt. Multiphoton mikroskopi (MPM) har blitt en av de mest populære bildemodaliteter for biomedisinsk studie på cellulære nivåer in vivo, fordeler inkluderer høy oppløsning, dyp vev penetrasjon og minimal fototoksisitet. Vi har designet en MPM bildeplattform med en tilpasset museøyeholder og et stereotoksisk stadium for avbildning av okulær overflate in vivo. Dual fluorescerende protein reporter mus muliggjør visualisering av cellekjerner, cellemembraner, nervefibre og kapillærer innenfor den okulære overflaten. I tillegg til multiphoton fluorescens signaler, anskaffe andre harmonisk generasjon (SHG) samtidig tillater karakterisering av kollagen stromal arkitektur. Denne plattformen kan brukes for intravital avbildning med nøyaktig posisjonering over hele okulær overflate, inkludert hornhinnen og conjunctiva.

Introduction

Okulære overflatestrukturer, inkludert hornhinnen og conjunctiva, beskytter andre dypere okulære vev mot ytre forstyrrelser. Hornhinnen, den gjennomsiktige fremre delen av øyet, fungerer både som en brytningslinse for å lede lys inn i øyet og som en beskyttende barriere. Hornhinnen epitel er det ytterste laget av hornhinnen og består av forskjellige lag av overfladiske celler, vingeceller og basalceller. Hornhinnen stroma består av sofistikert pakket kollagen lameller innebygd med keratocytter. Hornhinnen endotel, et enkelt lag med flate sekskantede celler, har en viktig rolle i å opprettholde gjennomsiktigheten av hornhinnen ved å holde hornhinnen stroma i en relativt dehydrert tilstand gjennom sine pumpefunksjoner1. Limbus danner grensen mellom hornhinnen og conjunctiva, og er reservoaret av hornhinne epitel stamceller2. Den svært vaskulariserte conjunctiva bidrar til å smøre øynene ved å produsere slim og tårer3.

Celledynamikken i hornhinnens overflatestrukturer studeres konvensjonelt av enten histologisk analyse eller in vitro cellekultur, som kanskje ikke simulerer in vivocelledynamikken tilstrekkelig. En ikke-invasiv levende bildetilnærming kan derfor bygge bro over slike gap. På grunn av fordelene, som inkluderer høy oppløsning, minimal fotodamage og dypere bildedybde, har MPM blitt en kraftig modalitet i ulike områder av biologiskforskning 4,,5,,6,,7,,8. For hornhinnens bildebehandling gir MPM cellulær informasjon fra iboende autofluorescence avledet fra intracellulær NAD(P)H. Andre harmoniske generasjon (SHG) signaler avledet fra ikke-centrosymmetrisk type I kollagen fibre under femtosecond laser skanning gir kollagen stromal strukturer uten ekstra farging prosedyrer9. Tidligere har vi og andre grupper utnyttet MPM for avbildning av dyr og menneskelige hornhinnen9,10,11,12,13,14,15.

Transgene muselinjer som viser fluorescerende proteiner i bestemte cellepopulasjoner har blitt mye brukt til ulike studier i cellebiologi, inkludert utvikling, vevshjemostase, vevregenerering og karsinogenese. Vi brukte transgene musestammer merket med fluorescerende proteiner for in vivo avbildning av hornhinnen9,,10,hårsekkene10 og epidermis10 av MPM. Den doble fluorescerende musstammen med cellemembran merket med tdTomato og cellekjerne merket med EGFP er avlet fra to musestammer: R26R-GR (B6;129-Gt (ROSA)26Sortm1Ytchn/J, #021847)16 og mT-mG (Gt(ROSA26)ACTB-tdTomato-EGFP, #007676)17. R26R-GR transgen muselinje inneholder en dobbel fluorescerende protein reporter konstruksjoner, inkludert en H2B-EGFP fusjon gen og mCherry-GPI anker signal fusjon genet, satt inn i Gt (ROSA) 26Sor locus. MT-mG transgen stamme er en celle membran-målrettet tdTomato og EGFP fluorescerende Cre-reporter mus. Før Cre rekombinasjon er cellemembranprotein med tdTomato fluorescensuttrykk allment tilstede i ulike celler. Denne transgene musestammen gjør det mulig for oss å visualisere kjerner-EGFP og membran med tdTomato uten Cre-eksitasjon. To hunner (R26R-GR+/+) og en hann (mT-mG+/+) transgen mus ble avlet sammen for å produsere tilstrekkelige mus til eksperimenter. Deres avkom med R26R-GR+/-;mT-mG+/- genotype, en dobbel fluorescerende musstamme, ble brukt i denne studien. Sammenlignet med en fluorescerende reporter muselinje som tidligerebeskrevet 9,10, gir denne doble fluorescerende reportermusstammen oss en 50% redusert erverving av bildetid.

I dette arbeidet beskriver vi en detaljert teknisk protokoll for in vivo-avbildning av den okulære overflaten på en trinnvis måte ved hjelp av vår bildeplattform og doble fluorescerende transgene mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med prosedyrer godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved National Taiwan University og Chang Gung Memorial Hospital.

1. Oppsett av multikopikopi med flere bilder

  1. Bygg et system basert på et oppreist mikroskop med vannsenking 20x 1,00 NA-mål (figur 1A).
  2. Bruk Ti: Sapphire laser (med tunable bølgelengde) som eksitasjonskilde. Sett laserutgangslengden på 880 nm for EGFP og 940 nm for tdTomato (figur 1A).
  3. Inkluder to dichroic speil (495 nm og 580 nm) for separasjon av SHG / EGFP og EGFP / tdTomato (Figur 1A). Separer SHG-signalene, EGFP og tdTomato etter bandpassfiltre 434/17nm, 510/84nm og 585/40nm (figur 1A).
  4. For å optimalisere bildekvaliteten og for å unngå fotobleaching og vevsskade, sett laserkraften til å være ca 35 mW for bilde hornhinnen og 50 mW for limbus. Mål lasereffekten før laseren passerer det optiske systemet. Den nøyaktige laserkraften på prøvene er ca 8-9 mW. Den komplette mikroskopiske designen er vist i figur 1A.
    MERK: Den øvre grensen for laserkraft er satt til 70 mW for å unngå fotobleking og vevsskade.

2. Dyreforberedelse for levende bildebehandling

  1. Bruk 8-12 uker gamle mus til eksperimentet. Injiser intramuskulært 50-80 mg/kg tiletamin HCl og zolazepam HCl for generell anestesi. Sjekk for mangel på respons på uttaksrefleks ved å klemme en tå. Tilstrekkelig bedøvelse er viktig for å tillate stabil pustefrekvensovervåking.
    MERK: Mus i en alder av 8 uker eller eldre anbefales fordi øyeeplene deres er modnet.
  2. Plasser musen under anestesi på et oppvarmet stadium og sett temperaturovervåkingsproben inn i anusen.
    FORSIKTIG: Sonden må settes helt inn i analhulen uten eksponering for luft, for å unngå overoppheting av varmeapparatet og induksjon av heteslag.

3. Øyeholder for levende avbildning av okulær overflate

  1. For levende avbildning av okulær overflate, bruk den spesialdesignede stereotaksiske museholderen bestående av to deler: en hodeholder for å stabilisere hodet og en øyeholder for å trekke tilbake øyelokkene og utsette hele okulær overflate (figur 1B-D).
  2. Sett ørestengene inn i den eksterne auditive meatus og opprettholde tre-punkts fiksering av hodeholderen (figur 1B, D).
  3. Bruk en løsning på 0,4% oksybuprokainhydroklorid i saltvann og la den stå i 3 min for å bedøve den okulære overflaten.
  4. Sørg for at øyeeplet stikker ut ved riktig manuell tilbaketrekking av øyelokket. Ellers kan iskemi og blødning i øyebollet forekomme.
  5. Plasser forsiktig en løkke av polyetylenrøret i øyeholderen langs øyelokkmarginen for å eksponere den okulære overflaten. Stabiliser øyeeplet med øyeholderen som består av en Nr. 5 Dumont tang med sine tips dekket med løkken av polyetylenrør (figur 1C, D).
  6. Skru tangen med en knott i distale tang i øyeholderen for å holde øyeeplet stabilt (figur 1D).
  7. Påfør en øyegel med den brytningsindeksen på 1,338 på hornhinnen som et nedsenkingsmedium for å opprettholde fuktigheten på den okulære overflaten hver time. I tillegg unngår regelmessig bruk av øyegelen hver time å sky i hornhinnen under avbildning.
  8. Roter øyeeplet med holderen som er låst på stepper-motorisert stadium for avbildning over hele hornhinnen overflaten fra den sentrale hornhinnen til periferområdet (figur 1C, D).
    FORSIKTIG: Både overskytende og utilstrekkelige mengder øyegel kan påvirke kvaliteten på bildene under bildebehandling. Derfor er supplerende øyegel hver time for å holde overflaten fuktig regelmessig viktig for avbildning.

4. Z-seriell bildeanskaffelse

MERK: Angi det første og siste lysbildet i hver stabel for å redusere objektene for fallbevegelse.

  1. Før du tar bildene, bilde målretting feltet med en kvikksølv lyskilde.
  2. Klikk på symbolet på mikroskopprogramvaren for å slå på programvaren.
  3. Velg riktig PMT-forsterkning og digital forsterkning for å visualisere cellulærstrukturen i den okulære overflaten.
  4. Angi det første lysbildet og det siste lysbildet for å hente en stabel.
  5. Angi numeriske verdier for bildeoppløsning og z-trinn, for eksempel 512 x 512 og 1 μm som z-trinn.
  6. Klikk på Start-knappen for å samle z-seriebilder.
  7. Hent levende bilder to ganger i samme område, først ved 880 nm eksitasjon for SHG / EGFP signaler samling og andre på 940 nm excitation for EGFP / tdTomato signaler samling.
    MERK: Kombinasjonen av to stabler gir 3 kanalbilder. Bildeoppløsningen og skanneformatstørrelsen var henholdsvis 512 x 512 piksler og 157 μm x157 μm.

5. Bildebehandling og 3D-rekonstruksjon

  1. Last z-seriebilder i Fiji programvare18.
  2. Velg plugin Median 3D-filteret i Fiji for å redusere bakgrunnslyder.
  3. Velg filteret Pakke uskarp maske på Fiji for å gjøre bildene skarpere.
  4. Klikk "Auto" i lysstyrke / kontrast for å optimalisere kvaliteten på bildene automatisk.
  5. Lagre bildene som bildesekvenser for å kunne eksportere z-seriebildene.
  6. Last z-seriebilder inn i kommersiell programvare (f.eks. Avizo lite) for 3D-rekonstruksjon ved hjelp av volumgjengivelse.
  7. I alle MPM-bilder, presentere EGFP, tdTomato, og SHG signaler i pseudo-grønn, rød, og cyan farge henholdsvis.
  8. Ta bilder av 3D-struktur ved øyeblikksbildet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjelp av denne levende bildeplattformen kan musens okulære overflate visualiseres på mobilnivå. For å visualisere individuelle enkeltceller i okulær overflate, brukte vi de doble fluorescerende transgene musene med EGFP uttrykt i kjernen og tdTomato uttrykt i cellemembranen. Kollagen-rik hornhinnen stroma ble fremhevet av SHG signaler.

I hornhinnenpitel ble overfladiske celler, vingeceller og basalceller (figur 2) visualisert. I de doble fluorescerende transgene musene kunne vi kartlegge enkeltceller fra basallaget til de overfladiske lagene i både hornhinnen og limbal epitel (figur 2). De sekskantede overfladiske cellene ble observert (hvitt pilspiss i figur 2). Både kjernefysisk størrelse og internukleær avstand fra basallaget mot de ytre lagene økte i hornhinnen epitel (figur 2). De cytoplasmatiske signalene fra tdTomato fluorescens indikerte at membranproteinrike intracellulære vesikulære systemet, inkludert Golgi-apparatet, endoplasmatisk retikuulum, ble spredt i vingecellene (figur 2).

Innenfor kollagenøs stroma ble de stellateformede keratocytene skissert av membran-målretting tdTomato fluorescens i to fluorescerende transgene mus (gult pilhode i figur 3 og figur 4). Keratocytter innebygd i kollagen stroma var mer løst fordelt enn endotelceller. I tillegg ble tynne forgreningsnerver i hornhinnen stroma også visualisert av membran-målretting tdTomato signaler (hvit pilspiss i figur 3). Monolayer av hornhinnen endotelceller viste en relativt homogen sekskantet form koblet til en honeycombed mønster (hvitt pilspiss i figur 4). Limbal epitel besto av 1-2 lag epitelceller (figur 5). Den doble fluorescerende reportertransgene musestammen gjorde det også mulig for oss å bilde kapillærene i conjunctiva (figur 6A). 3D-arkitektur av kapillærer ble rekonstruert ved å skissere vaskulær endotel (figur 6B,6C).

Figure 1
Figur 1: Oppsettet av MPM og roterende museholder.
(A) Oppsettet av MPM. (B)Utformingen av museholderen. Museholderen består av en roterende hodeholder og en øyeholder. (C)Utformingen av musen øyeholderen. Øyeholderen trekker øyelokkene tilbake med en plastsløyfe for å eksponere hornhinnen og conjunctiva. Hodeholderen og øyeholderen er skrudd sammen (B) på scenen for å tillate presis og kontrollerbar rotasjon og avbildning av okulær overflate. (D) Fotografi av levende mus for hornhinnen imaging med øyeholder. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Levende avbildning av hornhinneepitelet i to fluorescerende transgene mus.
Hornhinnen epitel ble avbildet lag for lag, for å inkludere overfladiske celler, vingeceller, og basalceller. Overfladiske celler er merket med et hvitt pilhode. Vektstangen = 50 μm. (Z = dybde fra den øverste overflaten av epitelet (μm)). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Levende bildebehandling av hornhinnen stroma.
Innenfor hornhinnen stroma, keratocytter (gul pilhode) og nervefibrene (hvit pilhode) ble innebygd i kollagen stroma (i pseudo-blå farge). Vektstangen = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Levende avbildning av hornhinnen endotel i sentral hornhinnen.
Monolayer av sekskantede hornhinnen endotelceller (hvitt pilhode). Vektstangen = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Levende avbildning av limbal epitel.
Levende bilder av limbal epitel i to fluorescerende transgene mus viste vacuolated kjerner. Vektstangen = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Levende bildebehandling og tredimensjonal rekonstruksjon av vaskulært nettverk i conjunctiva.
(A)Kapillærer i konjunktival stroma ble visualisert. Vektstangen = 50 μm. (B) 3D rekonstruksjon av kapillære nettverk utført ved hjelp av en kommersiell programvare. Vektstangen = 50 μm. (C, D) Forstørrede 3D-visninger av bildet vist i panel B. Fluorescerende vaskulære endotelceller skissert kapillærene (hvite og gule pilspisser). Vektstangen for panel C = 6,26 μm og for panel D = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne spesialbygde MPM-bildeplattformen med en kontrollprogramvare ble brukt til intravital avbildning av museepitelorganer, inkludert hud10,hårsekken10 og okulær overflate9,,10 (figur 1A). Det spesialbygde systemet ble brukt for sin fleksibilitet i å endre de optiske komponentene for ulike eksperimenter, siden begynnelsen av prosjektet vårt. Denne bildemetodikken er allsidig for kommersielle MPM-produkter. Denne protokollen beskriver en detaljert metode for intravital avbildning av musenokulær overflate av MPM bildeplattform. Ved hjelp av en stereotaksisk museholder (figur 1B)kunne vi visualisere forskjellige regioner over hele okulær overflate. Den nøyaktige posisjoneringsfunksjonen gjør det mulig å overvåke temporale celle dynamiske endringer i et angitt område.

Selv om flere studier av murine hornhinnen MPM imaging har blitt rapportert in vivo19,20,21,22, er det flere tekniske begrensninger som man må overvinne for å oppnå kontinuerlig avbildning over en lang periode, for eksempel holde øyeeplet i en stabil posisjon, redusere bevegelsesartefakter under bildebehandling og anskaffe bildene i lang tid uten fotobleaching. Sammenlignet med plast øyekopp designet for hornhinnen imaging in vivo med relativt begrenset tilgang til øyeoverflaten20, holder vår øyeholder ikke bare øyeeplet fullt eksponert, men gjør også hele okulær overflate tilgjengelig for objektivlinsen (figur 1C).

Selv om vitale fargestoffer eller sonder rutinemessig brukes som fluorescerende reportere for å merkeceller 20,21,22, kan invasiviteten av nåleinjeksjon forstyrre organenes naturlige celledynamikk under den fysiologiske homeostatiske tilstanden eller vevregenereringsprosessen. R26R-GR transgene mus stamme uttrykker stabil og lys grønn fluorescerende protein i cellekjernen og har blitt brukt til visualisering av celledynamikken til muskelstamfar i spøkelsesfibre23. mT-mG reporter transgen muselinje ble brukt til å analysere differensiering av epidermal celler inhomeostase24. Sammenlignet med en enkelt reporter fluorescerende transgen muselinje, reduserte denne doble fluorescerende transgene musestammen tidspunktet for bildeoppkjøp til halvparten ved samtidig å gi cellestrukturinformasjonen til både cellekjerner og cellemembraner. Ved å rotere museholderen ble flate kjerner av både endotel- og blodceller visualisert i vaskulære lumen ved hjelp av dobbel fluorescerende transgen musestamme (figur 6). Derfor kan denne transgene muselinjen brukes til å undersøke celledynamikken til kapillærer i fremtiden, som er nøkkelen til patologisk hornhinnenyvaskularisering. I tillegg kan denne in vivo bildeplattformen også brukes til å utforske immunresponser i hornhinnepatologier ved fluorescerende merking av forskjellige immunceller, for eksempel nøytrofiler25, langerhans celler26, regulatoriske T-celler (Tregs)27 og mastceller28.

Til slutt demonstrerte vi en kraftig intravital MPM-bildeplattform for musokulær overflatestudie. Kombinasjonen av live MPM stereotoksisk stadium og spesielle fluorescerende transgene mus muliggjør sanntidsvisualisering av distinkte cellulære og ekstracellulære strukturer i okulær overflate, inkludert hornhinnen, limbus og conjunctiva. Denne intravitale bildeplattformen kan bidra til å utforske celledynamikken til den okulære overflaten, og med videre utvikling kan den potensielt brukes til oftalmisk legemiddelscreening i fremtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi takker tilskuddsstøtten fra Kunnskapsdepartementet, Taiwan (106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089, 108-2628-B-002-023, 108-2628-B-002-023), National Taiwan University Hospital (NTUH108-T17) og Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan (CMRPG3G1621, CMRPG3G1622, CMRPG3G1623).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AVIZO Lite software Thermo Fisher Scientific Version: 2019.3.0
Bandpass filters Semrock FF01-434/17
FF01-500/24
FF01-585/40
Dichroic mirrors Semrock FF495-Di01-25x36
FF580-Di01-25x36
Galvano Thorlabs GVS002
Jade BIO control software SouthPort Corporation Jade BIO
Oxybuprocaine hydrochloride Sigma O0270000
PMT Hamamatsu H7422A-40
Polyesthylene Tube BECTON DICKINSON 427401
Stereotaxic mouse holder Step Technology Co.,Ltd 000111
Ti: Sapphire laser Spectra-Physics Mai-Tai DeepSee
Upright microscopy Olympus BX51WI
Vidisic Gel Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH D13581
Zoletil Virbac VR-2831

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  2. Van Buskirk, E. M. The anatomy of the limbus. Eye (London). 3, Pt 2 101-108 (1989).
  3. Hodges, R. R., Dartt, D. A. Tear film mucins: front line defenders of the ocular surface; comparison with airway and gastrointestinal tract mucins. Experimental Eye Research. 117, 62-78 (2013).
  4. Tan, H. Y., et al. Multiphoton fluorescence and second harmonic generation imaging of the structural alterations in keratoconus ex vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (12), 5251-5259 (2006).
  5. Konig, K. Multiphoton microscopy in life sciences. Journal of Microscopy. 200, Pt 2 83-104 (2000).
  6. Rompolas, P., et al. Spatiotemporal coordination of stem cell commitment during epidermal homeostasis. Science. 352 (6292), 1471-1474 (2016).
  7. Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).
  8. Xin, T., Gonzalez, D., Rompolas, P., Greco, V. Flexible fate determination ensures robust differentiation in the hair follicle. Nature Cell Biology. 20 (12), 1361-1369 (2018).
  9. Wu, Y. F., et al. Intravital multiphoton microscopic imaging platform for ocular surface imaging. Experimental Eye Research. 182, 194-201 (2019).
  10. Wu, Y. F., Tan, H. Y., Lin, S. J. Long-Term Intravital Imaging of the Cornea, Skin, and Hair Follicle by Multiphoton Microscope. Methods in Molecular Biology. , (2019).
  11. Lo, W., et al. Fast Fourier transform-based analysis of second-harmonic generation image in keratoconic cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3501-3507 (2012).
  12. Tan, H. Y., et al. Multiphoton fluorescence and second harmonic generation microscopy for imaging infectious keratitis. Journal of Biomedical Optics. 12 (2), 024013 (2007).
  13. Jester, J. V., et al. Four-dimensional multiphoton confocal microscopy: the new frontier in cellular imaging. Oculur Surface. 2 (1), 10-20 (2004).
  14. Morishige, N., et al. Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (3), 1087-1094 (2007).
  15. Hao, M., et al. In vivo non-linear optical (NLO) imaging in live rabbit eyes using the Heidelberg Two-Photon Laser Ophthalmoscope. Experimental Eye Research. 91 (2), 308-314 (2010).
  16. Chen, Y. T., et al. R26R-GR: a Cre-activable dual fluorescent protein reporter mouse. PLoS One. 7 (9), 46171 (2012).
  17. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  18. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  19. Masihzadeh, O., Lei, T. C., Ammar, D. A., Kahook, M. Y., Gibson, E. A. A multiphoton microscope platform for imaging the mouse eye. Molecular Vision. 18, 1840-1848 (2012).
  20. Zhang, H., et al. Two-photon imaging of the cornea visualized in the living mouse using vital dyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6526-6536 (2013).
  21. Lee, J. H., et al. Comparison of confocal microscopy and two-photon microscopy in mouse cornea in vivo. Experimental Eye Research. 132, 101-108 (2015).
  22. Ehmke, T., et al. In vivo nonlinear imaging of corneal structures with special focus on BALB/c and streptozotocin-diabetic Thy1-YFP mice. Experimental Eye Research. 146, 137-144 (2016).
  23. Webster, M. T., Manor, U., Lippincott-Schwartz, J., Fan, C. M. Intravital Imaging Reveals Ghost Fibers as Architectural Units Guiding Myogenic Progenitors during Regeneration. Cell Stem Cell. 18 (2), 243-252 (2016).
  24. Mesa, K. R., et al. Homeostatic Epidermal Stem Cell Self-Renewal Is Driven by Local Differentiation. Cell Stem Cell. 23 (5), 677-686 (2018).
  25. Goh, C. C., et al. Real-time imaging of dendritic cell responses to sterile tissue injury. Journal of Investigative Dermatology. 135 (4), 1181-1184 (2015).
  26. Kissenpfennig, A., et al. Dynamics and function of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic cells colonize lymph node areas distinct from slower migrating Langerhans cells. Immunity. 22 (5), 643-654 (2005).
  27. Chow, Z., Mueller, S. N., Deane, J. A., Hickey, M. J. Dermal regulatory T cells display distinct migratory behavior that is modulated during adaptive and innate inflammation. Journal of Immunology. 191 (6), 3049-3056 (2013).
  28. Dudeck, A., et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).

Tags

Bioengineering Utgave 159 hornhinnen conjunctiva okulær overflate multiphoton mikroskopi MPM intravital avbildning transgen mus
En tilpasset multiphoton mikroskopi plattform for live imaging av mus cornea og conjunctiva
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, Y. F., Ye, R. T., Pan, M. K.,… More

Wu, Y. F., Ye, R. T., Pan, M. K., Lin, S. J., Tan, H. Y. A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva. J. Vis. Exp. (159), e60944, doi:10.3791/60944 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter