Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Uma plataforma personalizada de microscopia multifotn para imagens ao vivo de córnea de rato e conjuntiva

doi: 10.3791/60944 Published: May 17, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Apresentada aqui é uma plataforma microscópica multifotípica para imagens de superfície ocular de rato vivo. O camundongo transgênico fluorescente permite a visualização de núcleos celulares, membranas celulares, fibras nervosas e capilares dentro da superfície ocular. Sinais de segunda geração harmônica não lineares derivados de estruturas colágenas fornecem imagens sem rótulos para arquiteturas estromais.

Abstract

A análise histológica convencional e os sistemas de cultura celular são insuficientes para simular completamente a dinâmica fisiológica e patológica in vivo. A microscopia multifotônica (MPM) tornou-se uma das modalidades de imagem mais populares para estudo biomédico em níveis celulares in vivo, as vantagens incluem alta resolução, penetração de tecido profundo e fototoxicidade mínima. Projetamos uma plataforma de imagem MPM com suporte para olhos de mouse personalizado e um estágio estereotaxico para imagem de superfície ocular in vivo. O rato repórter de proteína fluorescente dupla permite a visualização de núcleos celulares, membranas celulares, fibras nervosas e capilares dentro da superfície ocular. Além dos sinais de fluorescência multifotônica, a aquisição de segunda geração harmônica (SHG) permite simultaneamente a caracterização da arquitetura estromal colágena. Esta plataforma pode ser empregada para imagens intravitais com posicionamento preciso em toda a superfície ocular, incluindo córnea e conjuntiva.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

As estruturas superficiais oculares, incluindo a córnea e a conjuntiva, protegem outros tecidos oculares mais profundos de distúrbios externos. A córnea, a parte frontal transparente do olho, funciona tanto como uma lente refrativa para direcionar a luz para o olho quanto como uma barreira protetora. O epitélio corneo é a camada mais externa da córnea e consiste em camadas distintas de células superficiais, células de asa e células basais. O estroma corneal é composto de lamellae colagenosa sofisticadamente embalada embutida com ceratocitos. O endotélio corneo, uma única camada de células hexagonais planas, tem um papel importante na manutenção da transparência da córnea, mantendo o estroma córnea em um estado relativamente desidratado através de suas funções de bombeamento1. Limbus forma a borda entre a córnea e a conjuntiva, e é o reservatório de células-tronco epiteliais da córnea2. A conjuntiva altamente vascularizada ajuda a lubrificar os olhos produzindo muco e lágrimas3.

A dinâmica celular das estruturas da superfície córnea é convencionalmente estudada pela análise histológica ou pela cultura celular in vitro, o que pode não simular adequadamente a dinâmica celular in vivo. Uma abordagem de imagem ao vivo não invasiva pode, portanto, preencher tal lacuna. Devido às suas vantagens, que incluem alta resolução, fotodamagem mínima e profundidade de imagem mais profunda, o MPM tornou-se uma modalidade poderosa em diversas áreas de pesquisa biológica4,,5,,6,,7,,8. Para imagens córneas, o MPM fornece informações celulares da autofluorescência intrínseca derivada do NAD intracelular(P)H). Sinais de segunda geração harmônica (SHG) derivados das fibras de colágeno tipo I não centrosimétricas sob a varredura a laser femtosegundo fornecem estruturas estromais colágenos sem procedimentos adicionais de coloração9. Anteriormente, nós e outros grupos exploramos MPM para imagens de córneas animais e humanas9,,10,,11,12,,13,,14,,15.

Linhas de camundongos transgênicos que exibem proteínas fluorescentes em populações de células específicas têm sido amplamente utilizadas para vários estudos em biologia celular, incluindo desenvolvimento, homeostase tecidual, regeneração tecidual e carcinogênese. Foram utilizadas cepas de camundongos transgênicos rotuladas com proteínas fluorescentes para imagem in vivo de córneas9,,10, folículos capilares10 e epiderme10 por MPM. A cepa de camundongo fluorescente duplo com membrana celular rotulada com tdTomato e núcleo celular marcado com EGFP é criada a partir de duas cepas de camundongos: R26R-GR (B6;129-Gt (ROSA)26Sortm1Ytchn/J, #021847)16 e mT-mG (Gt(ROSA26)ACTB-tdTomato-EGFP, #007676)17. A linha de camundongos transgênicos R26R-GR contém uma dupla proteína fluorescente, incluindo um gene de fusão H2B-EGFP e um gene de fusão de sinal de âncora mCherry-GPI, inserido no lócus gt (ROSA)26Sor. A cepa transgênica mT-mG é um tdTomato de membrana celular e ratos cre-repórter fluorescentes EGFP. Antes da recombinação da Cre, a proteína da membrana celular com expressão de fluorescência tdTomato está amplamente presente em várias células. Esta cepa de camundongos transgênicos nos permite visualizar núcleos-EGFP e membrana com tdTomato sem excitação cre. Duas fêmeas (R26R-GR+/+) e um macho (mT-mG+/+) foram criadas juntas para produzir camundongos suficientes para experimentos. Sua prole com R26R-GR+/-;mT-mG+/- genótipo, uma cepa de camundongos fluorescentes duplos, foi utilizada neste estudo. Comparado com uma linha de mouse de repórter fluorescente como descrito anteriormente9,10, esta cepa de mouse repórter fluorescente duplo nos fornece uma redução de 50% do tempo de imagem.

Neste trabalho, descrevemos um protocolo técnico detalhado para imagens in vivo da superfície ocular de forma passo a passo usando nossa plataforma de imagem e camundongos transgênicos fluorescentes duplos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com os procedimentos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Nacional de Taiwan e do Chang Gung Memorial Hospital.

1. Configuração de microscopia multifotônica

  1. Construa um sistema baseado em um microscópio vertical com imersão de água 20x 1.00 NA objetivo(Figura 1A).
  2. Use Ti: Laser de safira (com comprimento de onda tunable) como fonte de excitação. Defina o comprimento de onda de saída a laser em 880 nm para EGFP e 940 nm para tdTomato(Figura 1A).
  3. Inclua dois espelhosdicróicos (495 nm e 580 nm) para a separação de SHG/EGFP e EGFP/tdTomato(Figura 1A). Separar espectralmente os sinais SHG, EGFP e tdTomato pelos filtros bandpass 434/17nm, 510/84nm e 585/40nm(Figura 1A).
  4. A fim de otimizar a qualidade da imagem e evitar fotobleaching e danos teciduais, definir a potência laser para cerca de 35 mW para imagem córnea e 50 mW para limbus. Meça a potência do laser antes que o laser passe pelo sistema óptico. A potência exata do laser nas amostras é de cerca de 8-9 mW. O design microscópico completo é mostrado na Figura 1A.
    NOTA: O limite superior da potência laser é definido para 70 mW para evitar o branqueamento fotográfico e danos nos tecidos.

2. Preparação animal para imagens ao vivo

  1. Use ratos de 8 a 12 semanas para o experimento. Injete intramuscularmente 50-80 mg/kg de tiletamina HCl e zolazepam HCl para anestesia geral. Verifique a falta de resposta ao reflexo de retirada beliscando um dedo do dedo do dedo. A anestesia suficiente é importante para permitir um monitoramento estável da taxa de respiração.
    NOTA: Camundongos com idade de 8 semanas ou mais são recomendados porque seus globos oculares estão amadurecidos.
  2. Coloque o mouse sob anestesia em um estágio aquecido e insira a sonda de monitoramento de temperatura no ânus.
    ATENÇÃO: A sonda deve ser totalmente inserida na cavidade anal sem exposição ao ar, para evitar o superaquecimento do aquecedor e a indução da insolação.

3. Ocular para imagem ao vivo da superfície ocular

  1. Para imagens ao vivo da superfície ocular, use o suporte de mouse estereotaxic projetado sob medida composto por duas partes: um suporte para cabeça para estabilizar a cabeça e um suporte ocular para retrair as pálpebras e expor toda a superfície ocular(Figura 1B-D).
  2. Insira as barras de ouvido no meatus auditivo externo e mantenha a fixação de três pontos do porta-cabeça(Figura 1B,D).
  3. Aplique topicamente uma solução de 0,4% de cloridrato de oxibuprocaína em soro fisiológico e deixe-o por 3 minutos para anestesiar a superfície ocular.
  4. Certifique-se de que o globo ocular está salientes por uma retração manual adequada das pálpebras. Caso contrário, a isquemia e o sangramento do globo ocular podem ocorrer.
  5. Coloque cuidadosamente um laço do tubo de polietileno do suporte ocular ao longo da margem das pálpebras para expor a superfície ocular. Estabilize o globo ocular com o suporte ocular composto por um fórceps No. 5 Dumont com suas pontas cobertas com o laço do tubo de polietileno(Figura 1C,D).
  6. Fórceps de parafuso usando um botão em fórceps destais do suporte ocular para manter o globo ocular estável(Figura 1D).
  7. Aplique um gel ocular com o índice refrativo de 1.338 na superfície da córnea como meio de imersão para manter a umidade da superfície ocular a cada hora. Além disso, a aplicação regular do gel ocular a cada hora evita nublar na córnea durante a imagem.
  8. Gire o globo ocular com o suporte que bloqueou o estágio motorizado do estepe para imagem em toda a superfície córnea central da córnea central até a região periférica(Figura 1C,D).
    ATENÇÃO: Tanto o excesso quanto as quantidades insuficientes de gel ocular podem afetar a qualidade das imagens durante a imagem. Portanto, complementar o gel ocular a cada hora para manter a superfície úmida regularmente é importante para a imagem.

4. Aquisição de imagem em série Z

NOTA: Defina o primeiro e o último slide em cada pilha para reduzir os artefatos de movimento de queda.

  1. Antes de tirar as imagens, imagem o campo de alvo com uma fonte de luz de mercúrio.
  2. Clique no símbolo do software de microscópio para ativar o software.
  3. Selecione o ganho pmt adequado e o ganho digital para visualizar a estrutura celular na superfície ocular.
  4. Defina o primeiro slide e o último slide para adquirir uma pilha.
  5. Digite valores numéricos para resolução de imagem e passo z, por exemplo, 512 x 512 e 1 μm como passo z.
  6. Clique no botão Iniciar para coletar imagens em série z.
  7. Adquira imagens ao vivo duas vezes na mesma área, primeiro com 880 nm de excitação para coleta de sinais SHG/EGFP e segundo em excitação de 940 nm para a coleta de sinais EGFP/tdTomato.
    NOTA: A combinação de duas pilhas fornece imagens de 3 canais. O tamanho da resolução da imagem e do formato de digitalização foram de 512 x 512 pixels e 157 μm x157 μm, respectivamente.

5. Processamento de imagem e reconstrução 3D

  1. Carregue as imagens em série Z no software Fiji18.
  2. Selecione o filtro 3D mediano do plugin em Fiji para reduzir os ruídos de fundo.
  3. Selecione o filtro Máscara de Embalagem Não-harp em Fiji para afiar as imagens.
  4. Clique em "Auto" em brilho/contraste para otimizar automaticamente a qualidade das imagens.
  5. Salve as imagens como sequências de imagens para poder exportar as imagens em série Z.
  6. Carregue imagens em série z em software comercial (por exemplo, Avizo lite) para reconstrução 3D usando renderização de volume.
  7. Em todas as imagens MPM, apresentam sinais EGFP, tdTomato e SHG nas cores pseudo-verde, vermelho e ciano, respectivamente.
  8. Capture imagens da estrutura 3D pelo instantâneo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Usando esta plataforma de imagem ao vivo, a superfície ocular do mouse pode ser visualizada em níveis celulares. Para visualizar células individuais únicas na superfície ocular, empregamos os camundongos transgênicos fluorescentes duplos com EGFP expressos no núcleo e tdTomato expressos na membrana celular. O estroma córnea rico em colágeno foi destacado por sinais shg.

No epitélio córnea, foram visualizadas células superficiais, células de asa e células basais (Figura 2). Nos camundongos transgênicos fluorescentes duplos, conseguimos mapear células únicas da camada basal para as camadas superficiais tanto no epitélio córnea quanto no epitélio limbal(Figura 2). As células superficiais hexagonais foram observadas (ponta de flecha branca na Figura 2). Tanto o tamanho nuclear quanto o espaçamento internuclear da camada basal em direção às camadas externas aumentaram no epitélio córnea(Figura 2). Os sinais citoplasmáticos da fluorescência tdTomato indicaram que o sistema vesicular intracelular rico em proteínas da membrana, incluindo o aparelho Golgi, órticulo endoplasmático, estava espalhado nas células das asas(Figura 2).

Dentro do estroma colágeno, os ceratocitos em forma de stellate foram delineados pela fluorescência tdTomato de meta de membrana em camundongos transgênicos fluorescentes duplos (ponta de flecha amarela na Figura 3 e Figura 4). Os ceratocitos embutidos no estroma colágeno eram mais espaçados do que as células endoteliais. Além disso, os nervos finos de ramificação no estroma córnea também foram visualizados por sinais tdTomato de direção de membrana (ponta de flecha branca na Figura 3). Monocamadas de células endoteliais córneas mostraram uma forma hexagonal relativamente homogênea conectada a um padrão de favo de mel (ponta de flecha branca na Figura 4). O epitélio limbal consistiu em 1-2 camadas de células epiteliais(Figura 5). A cepa de camundongo transgênico de repórter fluorescente dupla também nos permitiu imaginar os capilares dentro da conjuntiva (Figura 6A). A arquitetura 3D dos capilares foi reconstruída por delinear o endotélio vascular (Figura 6B,6C).

Figure 1
Figura 1: A configuração do MPM e do porta-mouse rotativo.
AAconfiguração do MPM. (B) O desenho do suporte do mouse. O suporte do mouse consiste em um suporte de cabeça rotativo e um suporte para os olhos. (C) O desenho do suporte do olho do mouse. O porta-olhos retrai pálpebras por um laço plástico para expor a córnea e a conjuntiva. O suporte da cabeça e o suporte dos olhos estão aparafusados (B) no palco para permitir uma rotação precisa e controlável e imagens da superfície ocular. (D) Fotografia de rato vivo para imagem corneal com suporte ocular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Imagem viva de epitélio córnea em camundongos transgênicos fluorescentes duplos.
O epitélio corneo foi imageado camada por camada, para incluir células superficiais, células de asa e células basais. Células superficiais são marcadas com uma ponta de flecha branca. Barra de escala = 50 μm. (Z = profundidade da superfície superior do epitélio (μm)). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Imagem ao vivo do estroma córnea.
Dentro do estroma córnea, os queratócitos (ponta de flecha amarela) e as fibras nervosas (ponta de flecha branca) foram incorporados no estroma colágeno (na cor pseudo-azul). Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Imagem viva de endotélio córnea na córnea central.
Monocamada de células endoteliais hexagonais da córnea (ponta de flecha branca). Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Imagem viva do epitélio limbal.
Imagens ao vivo do epitélio limbal em camundongos transgênicos fluorescentes duplos mostraram núcleos vacuolados. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Imagem viva e a reconstrução tridimensional da rede vascular em conjuntiva.
(A) Capilares em estroma conjuntivival foram visualizados. Barra de escala = 50 μm. (B) reconstrução 3D de redes capilares realizadas por meio de um software comercial. Barra de escala = 50 μm. (C,D) Visões 3D ampliadas da imagem mostrada no painel B. Células endoteliais vasculares fluorescentes delinearam os capilares (pontas de flecha branca e amarela). Barra de escala para painel C = 6,26 μm e para painel D = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Esta plataforma de imagem MPM personalizada com um software de controle foi usada para imagens intravitais de órgãos epiteliais de camundongos, incluindo pele10,folículo piloso10 e superfície ocular9,,10 (Figura 1A). O sistema personalizado foi usado por sua flexibilidade na alteração dos componentes ópticos para vários experimentos, desde o início do nosso projeto. Essa metodologia de imagem é versátil para produtos comerciais de MPM. Este protocolo descreve um método detalhado para imagens intravitais da superfície ocular do rato pela plataforma de imagem MPM. Usando um suporte de mouse estereotaxic(Figura 1B),pudemos visualizar diferentes regiões em toda a superfície ocular. O recurso de posicionamento preciso permite monitorar mudanças dinâmicas de células temporais em uma região especificada.

Embora vários estudos de imagem MM de córnea murina tenham sido relatados in vivo19,20,21,22, existem várias limitações técnicas que é preciso superar para alcançar imagens contínuas durante um longo período, por exemplo, segurando o globo ocular em uma posição estável, diminuindo artefatos de movimento durante a imagem e adquirindo as imagens por um longo período sem fotobleaching. Em comparação com a opala plástica projetada para imagens de córnea in vivo com acesso relativamente limitado à superfície ocular20,nosso suporte ocular não só mantém o globo ocular totalmente exposto, mas também torna toda a superfície ocular acessível à lente objetiva(Figura 1C).

Embora corantes vitais ou sondas sejam rotineiramente usados como repórteres fluorescentes para rotular células20,,21,22, a invasividade da injeção de agulha pode interromper a dinâmica celular natural dos órgãos durante o estado homeostático fisiológico ou processo de regeneração tecidual. A cepa de camundongos transgênicos R26R-GR expressa proteína fluorescente verde estável e brilhante no núcleo celular e tem sido usada para a visualização da dinâmica celular de progenitores musculares em fibras fantasmas23. mT-mG repórter linha de camundongos transgênicos foi utilizada para analisar a diferenciação de células epidérmicas inhomeostase24. Comparada com uma linha de camundongos transgênicos fluorescentes de um único repórter, esta cepa de camundongo transgênico fluorescente duplo reduziu o tempo de aquisição de imagem para metade, fornecendo simultaneamente informações da estrutura celular de núcleos celulares e membranas celulares. Ao girar o suporte do camundongo, núcleos planos de células endoteliais e sanguíneas foram visualizados dentro do lúmen vascular utilizando dupla cepa de camundongo transgênico fluorescente(Figura 6). Portanto, essa linha de camundongos transgênicos pode ser usada para investigar a dinâmica celular dos capilares no futuro, que é a chave para a neovascularização patológica da córnea. Além disso, essa plataforma de imagem in vivo também pode ser usada para explorar respostas imunes em patologias córneas por rotulagem fluorescente de diferentes células imunes, como neutrófilos25, células langerhans26,células T regulatórias (Tregs)27 e células de mastro28.

Em conclusão, demonstramos uma poderosa plataforma de imagem mpm intravital para estudo de superfície ocular do rato. A combinação de estágio estereotaxista MPM vivo e camundongos transgênicos fluorescentes especiais permite a visualização em tempo real de estruturas celulares e extracelulares distintas na superfície ocular, incluindo córnea, limbus e conjuntiva. Esta plataforma de imagem intravital pode ajudar a explorar a dinâmica celular da superfície ocular e, com mais desenvolvimento, pode ser potencialmente usada para a triagem de medicamentos oftálmicos no futuro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Agradecemos o apoio do Ministério da Ciência e Tecnologia, Taiwan (106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089, 108-2628-B-002-023, 108-2628-B-002-023), National Taiwan University Hospital (NTUH108-T17) e Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan (CMRPG3G1621, CMRPG3G1622, CMRPG3G1623).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AVIZO Lite software Thermo Fisher Scientific Version: 2019.3.0
Bandpass filters Semrock FF01-434/17
FF01-500/24
FF01-585/40
Dichroic mirrors Semrock FF495-Di01-25x36
FF580-Di01-25x36
Galvano Thorlabs GVS002
Jade BIO control software SouthPort Corporation Jade BIO
Oxybuprocaine hydrochloride Sigma O0270000
PMT Hamamatsu H7422A-40
Polyesthylene Tube BECTON DICKINSON 427401
Stereotaxic mouse holder Step Technology Co.,Ltd 000111
Ti: Sapphire laser Spectra-Physics Mai-Tai DeepSee
Upright microscopy Olympus BX51WI
Vidisic Gel Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH D13581
Zoletil Virbac VR-2831

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37, (3), 588-598 (2011).
  2. Van Buskirk, E. M. The anatomy of the limbus. Eye (London). 3, Pt 2 101-108 (1989).
  3. Hodges, R. R., Dartt, D. A. Tear film mucins: front line defenders of the ocular surface; comparison with airway and gastrointestinal tract mucins. Experimental Eye Research. 117, 62-78 (2013).
  4. Tan, H. Y., et al. Multiphoton fluorescence and second harmonic generation imaging of the structural alterations in keratoconus ex vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, (12), 5251-5259 (2006).
  5. Konig, K. Multiphoton microscopy in life sciences. Journal of Microscopy. 200, Pt 2 83-104 (2000).
  6. Rompolas, P., et al. Spatiotemporal coordination of stem cell commitment during epidermal homeostasis. Science. 352, (6292), 1471-1474 (2016).
  7. Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19, (2), 155-163 (2017).
  8. Xin, T., Gonzalez, D., Rompolas, P., Greco, V. Flexible fate determination ensures robust differentiation in the hair follicle. Nature Cell Biology. 20, (12), 1361-1369 (2018).
  9. Wu, Y. F., et al. Intravital multiphoton microscopic imaging platform for ocular surface imaging. Experimental Eye Research. 182, 194-201 (2019).
  10. Wu, Y. F., Tan, H. Y., Lin, S. J. Long-Term Intravital Imaging of the Cornea, Skin, and Hair Follicle by Multiphoton Microscope. Methods in Molecular Biology. (2019).
  11. Lo, W., et al. Fast Fourier transform-based analysis of second-harmonic generation image in keratoconic cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, (7), 3501-3507 (2012).
  12. Tan, H. Y., et al. Multiphoton fluorescence and second harmonic generation microscopy for imaging infectious keratitis. Journal of Biomedical Optics. 12, (2), 024013 (2007).
  13. Jester, J. V., et al. Four-dimensional multiphoton confocal microscopy: the new frontier in cellular imaging. Oculur Surface. 2, (1), 10-20 (2004).
  14. Morishige, N., et al. Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48, (3), 1087-1094 (2007).
  15. Hao, M., et al. In vivo non-linear optical (NLO) imaging in live rabbit eyes using the Heidelberg Two-Photon Laser Ophthalmoscope. Experimental Eye Research. 91, (2), 308-314 (2010).
  16. Chen, Y. T., et al. R26R-GR: a Cre-activable dual fluorescent protein reporter mouse. PLoS One. 7, (9), 46171 (2012).
  17. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, (9), 593-605 (2007).
  18. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  19. Masihzadeh, O., Lei, T. C., Ammar, D. A., Kahook, M. Y., Gibson, E. A. A multiphoton microscope platform for imaging the mouse eye. Molecular Vision. 18, 1840-1848 (2012).
  20. Zhang, H., et al. Two-photon imaging of the cornea visualized in the living mouse using vital dyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54, (10), 6526-6536 (2013).
  21. Lee, J. H., et al. Comparison of confocal microscopy and two-photon microscopy in mouse cornea in vivo. Experimental Eye Research. 132, 101-108 (2015).
  22. Ehmke, T., et al. In vivo nonlinear imaging of corneal structures with special focus on BALB/c and streptozotocin-diabetic Thy1-YFP mice. Experimental Eye Research. 146, 137-144 (2016).
  23. Webster, M. T., Manor, U., Lippincott-Schwartz, J., Fan, C. M. Intravital Imaging Reveals Ghost Fibers as Architectural Units Guiding Myogenic Progenitors during Regeneration. Cell Stem Cell. 18, (2), 243-252 (2016).
  24. Mesa, K. R., et al. Homeostatic Epidermal Stem Cell Self-Renewal Is Driven by Local Differentiation. Cell Stem Cell. 23, (5), 677-686 (2018).
  25. Goh, C. C., et al. Real-time imaging of dendritic cell responses to sterile tissue injury. Journal of Investigative Dermatology. 135, (4), 1181-1184 (2015).
  26. Kissenpfennig, A., et al. Dynamics and function of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic cells colonize lymph node areas distinct from slower migrating Langerhans cells. Immunity. 22, (5), 643-654 (2005).
  27. Chow, Z., Mueller, S. N., Deane, J. A., Hickey, M. J. Dermal regulatory T cells display distinct migratory behavior that is modulated during adaptive and innate inflammation. Journal of Immunology. 191, (6), 3049-3056 (2013).
  28. Dudeck, A., et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34, (6), 973-984 (2011).
Uma plataforma personalizada de microscopia multifotn para imagens ao vivo de córnea de rato e conjuntiva
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, Y. F., Ye, R. T., Pan, M. K., Lin, S. J., Tan, H. Y. A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva. J. Vis. Exp. (159), e60944, doi:10.3791/60944 (2020).More

Wu, Y. F., Ye, R. T., Pan, M. K., Lin, S. J., Tan, H. Y. A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva. J. Vis. Exp. (159), e60944, doi:10.3791/60944 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter