Summary
Aquí se presenta una plataforma microscópica multifoto para imágenes de superficie ocular de ratón en vivo. El ratón fluorescente transgénico permite la visualización de núcleos celulares, membranas celulares, fibras nerviosas y capilares dentro de la superficie ocular. Las señales no lineales de segunda generación armónica derivadas de estructuras de collagenounous proporcionan imágenes sin etiquetas para arquitecturas estromales.
Abstract
El análisis histológico convencional y los sistemas de cultivo celular son insuficientes para simular completamente la dinámica fisiológica y patológica in vivo. La microscopía multifototónica (MPM) se ha convertido en una de las modalidades de imagen más populares para el estudio biomédico a niveles celulares in vivo, las ventajas incluyen alta resolución, penetración profunda de tejido y fototoxicidad mínima. Hemos diseñado una plataforma de imágenes MPM con un soporte de ojo de ratón personalizado y una etapa estereotáctica para la imagen de la superficie ocular in vivo. El ratón reportero de proteínas fluorescentes duales permite la visualización de núcleos celulares, membranas celulares, fibras nerviosas y capilares dentro de la superficie ocular. Además de las señales de fluorescencia multifoto, la adquisición de la segunda generación armónica (SHG) permite simultáneamente la caracterización de la arquitectura estromal colagenosa. Esta plataforma se puede emplear para imágenes intravitales con posicionamiento preciso en toda la superficie ocular, incluyendo córnea y conjuntiva.
Introduction
Las estructuras de la superficie ocular, incluyendo la córnea y la conjuntiva, protegen otros tejidos oculares más profundos de alteraciones externas. La córnea, la parte frontal transparente del ojo, funciona tanto como una lente refractiva para dirigir la luz hacia el ojo y como una barrera protectora. El epitelio corneal es la capa más externa de la córnea y consiste en distintas capas de células superficiales, células de las alas y células basales. El estroma corneal se compone de lamelas de colágeno sofisticadamente empacadas incrustadas con queratocitos. El endotelio corneal, una sola capa de células hexagonales planas, tiene un papel importante en el mantenimiento de la transparencia de la córnea manteniendo el estroma corneal en un estado relativamente deshidratado a través de sus funciones de bombeo1. Limbus forma el borde entre la córnea y la conjuntiva, y es el reservorio de células madre epiteliales corneales2. La conjuntiva altamente vascularizada ayuda a lubricar los ojos produciendo moco y lágrimas3.
La dinámica celular de las estructuras de la superficie corneal se estudia convencionalmente mediante análisis histológicos o cultivo celular in vitro, que podría no simular adecuadamente la dinámica celular in vivo. Por lo tanto, un enfoque de imágenes en vivo no invasivo puede salvar tal brecha. Debido a sus ventajas, que incluyen alta resolución, fotodatajo mínimo y profundidad de imagen más profunda, MPM se ha convertido en una poderosa modalidad en diversas áreas de investigación biológica4,,5,,6,,7,,8. Para las imágenes corneales, MPM proporciona información celular a partir de autofluorescencia intrínseca derivada de la NAD(P)H intracelular. Las señales de segunda generación armónica (SHG) derivadas de las fibras de colágeno no centrosimétricas tipo I bajo escaneo láser de femtosegundo proporcionan estructuras estromales collagenosas sin procedimientos de tinción adicionales9. Anteriormente, nosotros y otros grupos hemos explotado MPM para la toma de imágenes de córneas animales y humanas9,,10,,11,,12,,13,,14,,15.
Líneas transgénicas de ratón que exhiben proteínas fluorescentes en poblaciones celulares específicas se han utilizado ampliamente para diversos estudios en biología celular, incluyendo el desarrollo, homeostasis de tejido, regeneración de tejidos, y carcinogénesis. Utilizamos cepas transgénicas de ratón etiquetadas con proteínas fluorescentes para la toma de imágenes in vivo de córneas9,10, folículos pilosos10 y epidermis10 por MPM. La tensión fluorescente doble con membrana celular etiquetada con tdTomato y núcleo celular etiquetado con EGFP se cría a partir de dos cepas de ratón: R26R-GR (B6;129-Gt (ROSA)26Sortm1Ytchn/J, #021847)16 y mT-mG (Gt(ROSA26)ACTB-tdTomato-EG,#007676)17. La línea de ratón transgénico R26R-GR contiene construcciones de reportero de proteínas fluorescentes duales, incluyendo un gen de fusión H2B-EGFP y un gen de fusión de señal de anclaje mCherry-GPI, insertado en el locus Gt (ROSA)26Sor. La cepa transgénica mT-mG es un tdTomato dirigido a la membrana celular y ratones Cre-reporter fluorescentes EGFP. Antes de la recombinación de Cre, la proteína de membrana celular con expresión de fluorescencia tdTomato está ampliamente presente en varias células. Esta cepa de ratón transgénica nos permite visualizar núcleos-EGFP y membrana con tdTomato sin excitación Cre. Dos hembras (R26R-GR+/+) y un macho (mT-mG+/+) se criaron juntas para producir suficientes ratones para experimentos. Su descendencia con R26R-GR+/-;mT-mG+/- genotipo, una cepa de ratones fluorescentes duales, se utilizaron en este estudio. En comparación con una línea de ratón reportero fluorescente como se describió anteriormente9,10, esta tensión de ratón reportero fluorescente doble nos proporciona una adquisición de 50% menos de tiempo de imagen.
En este trabajo, describimos un protocolo técnico detallado para la toma de imágenes in vivo de la superficie ocular de una manera paso a paso utilizando nuestra plataforma de imágenes y ratones transgénicos fluorescentes duales.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con los procedimientos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso animal (IACUC) de la Universidad Nacional de Taiwán y el Hospital Chang Gung Memorial.
1. Configuración de microscopía multifoto, multifoto
- Construir un sistema basado en un microscopio vertical con inmersión en agua 20x 1.00 NA objetivo (Figura 1A).
- Utilice Ti: Láser de zafiro (con longitud de onda sintonizable) como fuente de excitación. Establezca la longitud de onda de salida láser en 880 nm para EGFP y 940 nm para tdTomato (Figura 1A).
- Incluya dos espejos dicroicos (495 nm y 580 nm) para la separación de SHG/EGFP y EGFP/tdTomato (Figura 1A). Separe espectralmente las señales SHG, EGFP y tdTomato mediante filtros de paso de banda 434/17nm, 510/84nm y 585/40nm(Figura 1A).
- Con el fin de optimizar la calidad de la imagen y evitar el fotoblanqueo y el daño tisular, ajuste la potencia del láser a unos 35 mW para la toma de imágenes de la córnea y 50 mW para el limbo. Mida la potencia del láser antes de que el láser pase el sistema óptico. La potencia exacta del láser en las muestras es de aproximadamente 8-9 mW. El diseño microscópico completo se muestra en la Figura 1A.
NOTA: El límite superior de la potencia del láser se establece en 70 mW para evitar el foto-blanqueo y el daño tisular.
2. Preparación animal para imágenes en vivo
- Use ratones de 8 a 12 semanas para el experimento. Inyecte por vía intramuscular 50-80 mg/kg de titamina HCl y zolazepam HCl para anestesia general. Compruebe la falta de respuesta al reflejo de abstinencia pellizcando un dedo del dedo delfín. Es importante una anestesia suficiente para permitir un control estable de la frecuencia respiratoria.
NOTA: Se recomienda a los ratones a la edad de 8 semanas o más porque sus globos oculares están maduros. - Coloque el ratón bajo anestesia en una etapa calentada e inserte la sonda de control de temperatura en el ano.
ADVERTENCIA: La sonda debe insertarse completamente en la cavidad anal sin exposición al aire, para evitar el sobrecalentamiento del calentador y la inducción del golpe de calor.
3. Retención ocular para imágenes en vivo de la superficie ocular
- Para la toma de imágenes en vivo de la superficie ocular, utilice el soporte de ratón estereotaxico diseñado a medida que consta de dos partes: un soporte para la cabeza para estabilizar la cabeza y un soporte para los ojos para retraer los párpados y exponer toda la superficie ocular (Figura 1B-D).
- Inserte las barras de los oídos en el carnoso auditivo externo y mantenga la fijación de tres puntos del soporte de la cabeza (Figura 1B,D).
- Aplicar tópicamente una solución de clorhidrato de oxicobucina al 0,4% en solución salina y dejarlo durante 3 minutos para anestesiar la superficie ocular.
- Asegúrese de que el globo ocular sobresalga mediante la retracción manual adecuada del párpado. De lo contrario, puede ocurrir isquemia y sangrado del globo ocular.
- Coloque cuidadosamente un lazo del tubo de polietileno del soporte ocular a lo largo del margen del párpado para exponer la superficie ocular. Estabilice el globo ocular con el soporte para los ojos compuesto por un fórceps Dumont No. 5 con sus puntas cubiertas con el lazo del tubo de polietileno(Figura 1C,D).
- Atornillar fórceps usando una perilla en fórceps distales del soporte del ojo para mantener el globo ocular estable (Figura 1D).
- Aplicar un gel para los ojos con el índice de refracción de 1.338 en la superficie corneal como medio de inmersión para mantener la humedad de la superficie ocular cada hora. Además, la aplicación regular del gel para los ojos cada hora evita nublarse en la córnea durante la toma de imágenes.
- Gire el globo ocular con el soporte que se bloqueó en la etapa motorizada paso a paso para obtener imágenes a través de toda la superficie corneal desde la córnea central hasta la región periférica(Figura 1C,D).
ADVERTENCIA: Tanto el exceso como las cantidades insuficientes de gel para los ojos pueden afectar la calidad de las imágenes durante la toma de imágenes. Por lo tanto, suplementar gel para los ojos cada hora para mantener la superficie húmeda regularmente es importante para la toma de imágenes.
4. Adquisición de imágenes en serie Z
NOTA: Establezca la primera y la última diapositiva de cada pila para reducir los artefactos de movimiento de caída.
- Antes de tomar las imágenes, imagine el campo de orientación con una fuente de luz de mercurio.
- Haga clic en el símbolo del software del microscopio para encender el software.
- Seleccione la ganancia de PMT adecuada y la ganancia digital para visualizar la estructura celular en la superficie ocular.
- Establezca la primera diapositiva y la última diapositiva para adquirir una pila.
- Introduzca valores numéricos para la resolución de la imagen y el paso z, por ejemplo, 512 x 512 y 1 m como paso z.
- Haga clic en el botón Inicio para recopilar imágenes de serie z.
- Adquiera imágenes en vivo dos veces en la misma área, primero a 880 nm de excitación para la recolección de señales SHG/EGFP y segundo en 940 nm de excitación para la recolección de señales EGFP/tdTomato.
NOTA: La combinación de dos pilas proporciona imágenes de 3 canales. La resolución de la imagen y el tamaño del formato de escaneado fueron de 512 x 512 píxeles y 157 m x157 m, respectivamente.
5. Procesamiento de imágenes y reconstrucción 3D
- Cargue las imágenes en serie z en el software Fiji18.
- Seleccione el plugin Median 3D filtro en Fiji para reducir los ruidos de fondo.
- Seleccione el filtro Máscara de desenfoque del paquete en Fiji para enfocar las imágenes.
- Haga clic en "Auto"en brillo/contraste para optimizar automáticamente la calidad de las imágenes.
- Guarde las imágenes como secuencias de imágenes para poder exportar las imágenes en serie z.
- Cargue imágenes en serie z en un software comercial (por ejemplo, Avizo lite) para la reconstrucción 3D mediante renderizado de volumen.
- En todas las imágenes MPM, presente las señales EGFP, tdTomato y SHG en color pseudo-verde, rojo y cian respectivamente.
- Capture imágenes de estructura 3D mediante la instantánea.
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Representative Results
Usando esta plataforma de imágenes en vivo, la superficie ocular del ratón se puede visualizar a niveles celulares. Para visualizar células individuales individuales en la superficie ocular, empleamos los ratones transgénicos fluorescentes duales con EGFP expresados en el núcleo y tdTomato expresados en la membrana celular. El estroma corneal rico en colágeno fue resaltado por señales SHG.
En el epitelio corneal, se visualizaron células superficiales, células de ala y células basales (Figura 2). En los ratones transgénicos fluorescentes duales, pudimos mapear células individuales desde la capa basal a las capas superficiales en el epitelio corneal y limbo (Figura 2). Se observaron las células superficiales hexagonales (punta de flecha blanca en la Figura 2). Tanto el tamaño nuclear como el espaciado internuclear desde la capa basal hacia las capas externas aumentaron en epitelio corneal (Figura 2). Las señales citoplasmáticas de fluorescencia tdTomato indicaban que el sistema vesicular intracelular rico en proteínas de membrana, incluido el aparato Golgi, retículo endoplasmático, estaban dispersos en las células del ala (Figura 2).
Dentro del estroma colágenoso, los queratocitos en forma de estelar fueron esbozados por la fluorescencia tdTomato dirigida a la membrana en ratones transgénicos fluorescentes duales (punta de flecha amarilla en la Figura 3 y la Figura 4). Los queratocitos incrustados en el estroma de colágeno estaban más sueltos espaciados que las células endoteliales. Además, los nervios ramificados delgados en el estroma corneal también se visualizaron mediante señales tdTomato dirigidas a membrana (punta de flecha blanca en la Figura 3). La monocapa de células endoteliales corneales mostró una forma hexagonal relativamente homogénea conectada en un patrón de panal (punta de flecha blanca en la Figura 4). El epitelio limbal consistía en 1–2 capas de células epiteliales (Figura 5). La cepa de ratón transgénica de reportero fluorescente doble también nos permitió imaginar los capilares dentro de la conjuntiva (Figura 6A). La arquitectura 3D de los capilares se reconstruyó delineando el endotelio vascular(Figura 6B,6C).
Figura 1: La configuración de MPM y el soporte giratorio del ratón.
(A) La configuración del MPM. (B) El diseño del soporte del ratón. El soporte del ratón consta de un soporte giratorio para la cabeza y un soporte para los ojos. (C) El diseño del portacuchillas del ratón. El portaves se retrae los párpados mediante un lazo de plástico para exponer la córnea y la conjuntiva. El soporte de la cabeza y el soporte para los ojos están atornillados juntos (B) en el escenario para permitir una rotación precisa y controlable y la imagen de la superficie ocular. (D) Fotografía del ratón vivo para imágenes corneales con soporte para los ojos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes en vivo del epitelio corneal en ratones transgénicos fluorescentes dobles.
El epitelio corneal se hizo una imagen capa por capa, para incluir células superficiales, células de alas y células basales. Las celdas superficiales se marcan con una punta de flecha blanca. Barra de escala a 50 m. (Z - profundidad de la superficie superior del epitelio (m)). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes en vivo del estroma corneal.
Dentro del estroma corneal, los queratocitos (cabeza de flecha amarilla) y las fibras nerviosas (punta de flecha blanca) estaban incrustados en el estroma colágeno (en color pseudo-azul). Barra de escala a 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imágenes en vivo del endotelio corneal en la córnea central.
Monocapa de células endoteliales corneales hexagonales (punta de flecha blanca). Barra de escala a 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Imágenes en vivo del epitelio limbo.
Las imágenes en vivo del epitelio limbal en ratones transgénicos fluorescentes duales mostraron núcleos vacuolados. Barra de escala a 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Imágenes en vivo y reconstrucción tridimensional de la red vascular en conjuntiva.
(A) Se visualizaron los capilares en estroma conjuntival. Barra de escala a 50 m. (B) Reconstrucción 3D de redes capilares realizadas utilizando un software comercial. Barra de escala a 50 m. (C,D) Las vistas 3D magnificadas de la imagen que se muestra en el panel B. Las células endoteliales vasculares fluorescentes delinearon los capilares (puntas de flecha blancas y amarillas). Barra de escala para el panel C a 6,26 m y para el panel D a 10 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Esta plataforma de imágenes MPM personalizada con un software de control se utilizó para la toma de imágenes intravitales de órganos epiteliales de ratón, incluyendo la piel10,el folículo piloso10 y la superficie ocular9,,10 (Figura 1A). El sistema personalizado se utilizó por su flexibilidad en el cambio de los componentes ópticos para varios experimentos, desde el comienzo de nuestro proyecto. Esta metodología de imagen es versátil para productos MPM comerciales. Este protocolo describe un método detallado para la toma de imágenes intravitales de la superficie ocular del ratón mediante la plataforma de imágenes MPM. Usando un soporte de ratón estereotaxico (Figura 1B), pudimos visualizar diferentes regiones a través de toda la superficie ocular. La capacidad de posicionamiento precisa permite supervisar los cambios dinámicos de celda temporal en una región especificada.
Aunque se han notificado varios estudios de imágenes MPM corneales murinas in vivo19,20,21,22, hay varias limitaciones técnicas que uno necesita superar para lograr imágenes continuas durante un largo período, por ejemplo, sosteniendo el globo ocular en una posición estable, disminuyendo los artefactos de movimiento durante la toma de imágenes y adquiriendo las imágenes durante un largo período sin fotoblancadas. En comparación con el ocular de plástico diseñado para la toma de imágenes corneales in vivo con acceso relativamente limitado a la superficie del ojo20,nuestro soporte para los ojos no sólo mantiene el globo ocular completamente expuesto, sino que también hace que toda la superficie ocular sea accesible a la lente objetivo(Figura 1C).
Aunque los tintes o sondas vitales se utilizan rutinariamente como reporteros fluorescentes para etiquetar las células20,21,22, la invasividad de la inyección de aguja puede interrumpir la dinámica celular natural de los órganos durante el estado homeostático fisiológico o el proceso de regeneración de tejidos. R26R-GR cepa de ratones transgénicos expresa proteína fluorescente verde estable y brillante en el núcleo celular y se ha utilizado para la visualización de la dinámica celular de los progenitores musculares en fibras fantasma23. mT-mG reportero línea de ratón transgénico se utilizó para analizar la diferenciación de las células epidérmicas inhomeostasis24. En comparación con una sola línea de ratón fluorescente transgénico reportero, esta cepa de ratón transgénica fluorescente dual redujo el tiempo de adquisición de la imagen a la mitad proporcionando simultáneamente la información de la estructura celular de los núcleos celulares y las membranas celulares. Al girar el soporte del ratón, se visualizaron núcleos planos de células endoteliales y sanguíneas dentro del lumen vascular utilizando tensión fluorescente dual del ratón (Figura 6). Por lo tanto, esta línea de ratón transgénico se puede utilizar para investigar la dinámica celular de los capilares en el futuro, que es la clave para la neovascularización corneal patológica. Además, esta plataforma de imágenes in vivo también se puede utilizar para explorar las respuestas inmunitarias en patologías corneales mediante el etiquetado fluorescente de diferentes células inmunitarias, como neutrófilos25,células langerhans26,células T reguladoras (Tregs)27 y células de mástil28.
En conclusión, demostramos una potente plataforma de imágenes MPM intravitales para el estudio de la superficie ocular del ratón. La combinación de escenario estereotaxico MPM en vivo y ratones transgénicos fluorescentes especiales permite la visualización en tiempo real de estructuras celulares y extracelulares distintas en la superficie ocular, incluyendo córnea, limbo y conjuntiva. Esta plataforma de imágenes intravital puede ayudar a explorar la dinámica celular de la superficie ocular y, con un mayor desarrollo, puede ser potencialmente utilizada para la detección de fármacos oftálmicos en el futuro.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros competidores.
Acknowledgments
Agradecemos el apoyo de las subvenciones del Ministerio de Ciencia y Tecnología, Taiwán (106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089, 108-2628-B-002-023, 108-2628-B-002-023), Hospital Universitario Nacional de Taiwán (NTUH108-T17) y Chang Gung Memorial Hospital, Taiwán (CMRPG3G1621, CMRPG3G1622, CMRPG3G1623).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AVIZO Lite software | Thermo Fisher Scientific | Version: 2019.3.0 | |
| Bandpass filters | Semrock | FF01-434/17 FF01-500/24 FF01-585/40 |
|
| Dichroic mirrors | Semrock | FF495-Di01-25x36 FF580-Di01-25x36 |
|
| Galvano | Thorlabs | GVS002 | |
| Jade BIO control software | SouthPort Corporation | Jade BIO | |
| Oxybuprocaine hydrochloride | Sigma | O0270000 | |
| PMT | Hamamatsu | H7422A-40 | |
| Polyesthylene Tube | BECTON DICKINSON | 427401 | |
| Stereotaxic mouse holder | Step Technology Co.,Ltd | 000111 | |
| Ti: Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai-Tai DeepSee | |
| Upright microscopy | Olympus | BX51WI | |
| Vidisic Gel | Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH | D13581 | |
| Zoletil | Virbac | VR-2831 |
References
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