Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

En anpassad Multiphoton Mikroskopi plattform för Live Imaging av Mus Hornhinna och Bindhinna

doi: 10.3791/60944 Published: May 17, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Presenteras här är en multiphoton mikroskopisk plattform för levande mus okulär yta imaging. Fluorescerande transgen mus möjliggör visualisering av cellkärnor, cellmembran, nervfibrer och kapillärer inom den okulära ytan. Icke-linjära andra harmoniska generationen signaler som härrör från kollagenous strukturer ger etikett-fri bildbehandling för stromal arkitekturer.

Abstract

Konventionella histologiska analys och cellodling system är otillräckliga för att simulera in vivo fysiologiska och patologiska dynamik helt. Multiphoton mikroskopi (MPM) har blivit en av de mest populära bildframställning modaliteter för biomedicinsk studie på cellulära nivåer in vivo, fördelar inkluderar hög upplösning, djup vävnad penetration och minimal fototoxicitet. Vi har utformat en MPM imaging plattform med en anpassad mus öga hållare och en stereotaxic skede för bildbehandling okulär yta in vivo. Dual fluorescerande protein reporter mus möjliggör visualisering av cellkärnor, cellmembran, nervfibrer, och kapillärer inom okulär yta. Förutom multifoton fluorescens signaler, förvärva andra harmoniska generationen (SHG) samtidigt möjliggör karakterisering av kollagenös stromal arkitektur. Denna plattform kan användas för intravital avbildning med noggrann positionering över hela okulär yta, inklusive hornhinna och bindhinna.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De okulär ytstrukturer, inklusive hornhinnan och bindhinnan, skyddar andra djupare okulär vävnader från yttre störningar. Hornhinnan, den genomskinliga främre delen av ögat, fungerar både som en brytningslins för att rikta ljus in i ögat och som en skyddande barriär. Hornhinnans epitel är det yttersta lagret av hornhinnan och består av distinkta lager av ytliga celler, vingceller och basala celler. Hornhinnans stroma består av sofistikerat packade kollagenhlamlas inbäddade med keratocyter. Hornhinnans endotel, ett enda lager av platta sexkantiga celler, har en viktig roll i att upprätthålla insynen i hornhinnan genom att hålla hornhinnans stroma i ett relativt uttorkad stat genom sin pumpfunktioner1. Limbus bildar gränsen mellan hornhinnan och bindhinnan, och är reservoaren av hornhinnans epitelceller2. Den starkt vascularized bindhinna hjälper till att smörja ögonen genom att producera slem och tårar3.

Celldynamiken i hornhinnans ytstrukturer studeras konventionellt genom antingen histologisk analys eller in vitro-cellkultur, som kanske inte på ett tillfredsställande sätt simulerar in vivo-celldynamiken. En icke-invasiv levande bildbehandling strategi kan därför överbrygga en sådan klyfta. På grund av dess fördelar, som inkluderar hög upplösning, minimal fotoskador och djupare bildframställning djup, MPM har blivit en kraftfull modalitet i olika områden av biologisk forskning4,5,6,7,8. För hornhinnans bildbehandling, MPM ger cellulär information från inneboende autofluorescens som härrör från den intracellulära NAD(P)H. Andra harmoniska generationens (SHG) signaler som härrör från den icke-centrosymmetriska typ I kollagen fibrer under femtosecond laserscanning ger kollagen stromal strukturer utan ytterligare färgning förfaranden9. Tidigare har vi och andra grupper utnyttjat MPM för bildframställning av djur- och människoklinner9,10,11,12,13,14,15.

Transgena muslinjer som uppvisar fluorescerande proteiner i specifika cellpopulationer har använts i stor utsträckning för olika studier inom cellbiologi, inklusive utveckling, vävnadshomeostas, vävnadsregenerering och carcinogenes. Vi använde transgen mus stammar märkta med fluorescerande proteiner för in vivo bildframställning av hornhinnor9,10, hårsäckar10 och epidermis10 av MPM. Den dubbla fluorescerande musstammen med cellmembranet märkt med tdTomato och cellkärna märkta med EGFP är uppfödd från två musstammar: R26R-GR (B6;129-Gt (ROSA)26Sortm1Ytchn/J, #021847)16 och mT-mG (Gt(ROSA26)ACTB-tdTomato-EGFP, #007676)17. R26R-GR transgen mus linje innehåller en dubbel fluorescerande protein reporter konstruktioner, inklusive en H2B-EGFP fusion gen och mCherry-GPI ankare signal fusion gen, införas i Gt (ROSA)26Sor locus. Den transgena stammen mT-mG är en cellmembran-riktad tdTomato och EGFP fluorescerande Cre-reporter möss. Före Cre rekombination är cellmembranprotein med tdTomato fluorescensuttryck allmänt närvarande i olika celler. Denna transgena musstam gör det möjligt för oss att visualisera atomkärnor-EGFP och membran med tdTomato utan Cre-excitation. Två honor (R26R-GR+/+) och en hane (mT-mG+/+) var transgen mus uppfödda tillsammans för att producera tillräckliga möss för experiment. Deras avkomma med R26R-GR+/-;mT-mG+/- genotyp, en dubbel fluorescerande möss stam, användes i denna studie. Jämfört med en fluorescerande reporter muslinje som tidigare beskrivits9,10, denna dubbla fluorescerande reporter mus stam ger oss en 50% minskad förvärvning av bildtagning tid.

I detta arbete beskriver vi ett detaljerat tekniskt protokoll för in vivo-avbildning av okulär ytan i ett steg-för-steg-sätt med hjälp av vår bildframställning plattform och dubbla fluorescerande transgena möss.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alla djurförsök utfördes i enlighet med förfaranden som godkänts av den institutionella Animal Care and Use Committee (IACUC) vid National Taiwan University och Chang Gung Memorial Hospital.

1. Multiphoton mikroskopi setup

  1. Bygg ett system som bygger på ett upprätt mikroskop med vatten nedsänkning 20x 1,00 NA mål (Figur 1A).
  2. Använd Ti: Sapphire laser (med avstämbar våglängd) som excitation källa. Ställ in laserutgångsvåglängden vid 880 nm för EGFP och 940 nm för tdTomato (Bild 1A).
  3. Inkludera två dichroic speglar (495 nm och 580 nm) för separation av SHG/EGFP och EGFP/tdTomato (Bild 1A). Spektralt separera SHG-signalerna, EGFP och tdTomato genom bandpassfilter 434/17nm, 510/84nm och 585/40nm (Figur 1A).
  4. För att optimera bildkvaliteten och för att undvika fotobleaching och vävnadsskador, ställ in lasereffekten till ca 35 mW för bildande hornhinna och 50 mW för limbus. Mät lasereffekten innan lasern passerar det optiska systemet. Den exakta lasereffekten på prover är ca 8-9 mW. Den kompletta mikroskopiska designen visas i figur 1A.
    OBS: Den övre gränsen för lasereffekt är inställd på 70 mW för att undvika fotoblekning och vävnadsskador.

2. Djurförberedelse för live-avbildning

  1. Använd 8-12 veckor gamla möss för experimentet. Injicera intramuskulärt 50-80 mg/kg tiletamin HCl och zolazepam HCl för narkos. Kontrollera om det saknas svar på abstinensreflex genom att nypa en tå. Tillräcklig anesthetisering är viktigt för att möjliggöra stabil andningshastighet övervakning.
    OBS: Möss vid 8 veckors ålder eller högre rekommenderas eftersom deras ögonglober mognas.
  2. Placera musen under anestesi på en uppvärmd scen och sätt in temperaturövervakningssonden i anusen.
    FÖRSIKTIGHET: Sonden måste föras in helt i analhålan utan att utsättas för luften, för att undvika överhettning av värmaren och induktion av värmeslag.

3. Ögonhållning för livebildning av okulär yta

  1. För live avbildning av den okulära ytan, använd den specialdesignade stereotaxiska mushållaren bestående av två delar: en huvudhållare för att stabilisera huvudet och en ögonhållare för att dra tillbaka ögonlocken och exponera hela okulär yta (Figur 1B-D).
  2. Sätt i öronstänger i den externa hörselköttsusen och bibehåll huvudhållarens trepunktsfixering (Figur 1B,D).
  3. Lokalt tillämpa en lösning av 0,4% oxybuprokain hydroklorid i saltlösning och lämna den i 3 min för att bedöva den okulär yta.
  4. Se till att ögongloben sticker ut av korrekt manuell ögonlocksretraktion. Annars kan ischemi och blödningar i ögongloben uppstå.
  5. Placera försiktigt en slinga av ögonhållarens polyetylenrör längs ögonlocksmarginalen för att exponera den okulära ytan. Stabilisera ögongloben med ögonhållaren som består av en Nr 5 Dumont-tcuds med dess spetsar täckta med slingan av polyetylenrör (Figur 1C,D).
  6. Skruvtstlysnare med hjälp av en knopp i distala kraftkn i ögonhållare för att hålla ögongloben stabil (Bild 1D).
  7. Applicera en ögongel med brytningsindexet 1,338 på hornhinnans yta som ett nedsänkningsmedium för att upprätthålla fukten i den okulärliga ytan varje timme. Dessutom regelbundet tillämpning av ögat gel varje timme undvika grumliga i hornhinnan under bildbehandling.
  8. Rotera ögongloben med hållaren som låste på stegmotoriserade scenen för avbildning över hela hornhinnans yta från den centrala hornhinnan till den perifera regionen (Figur 1C,D).
    VAR FÖRSIKTIG: Både över- och otillräcklig mängd ögongel kan påverka kvaliteten på bilderna under bildtagningen. Därför är komplettera ögat gel varje timme för att hålla ytan fuktig regelbundet viktigt för bildbehandling.

4. Z-seriebild förvärv

OBS: Ställ in den första och sista bilden i varje stapel för att minska den släppa rörelse artefakter.

  1. Innan du tar bilderna, bild inriktningsfältet med en kvicksilver ljuskälla.
  2. Klicka på symbolen för mikroskopprogramvaran för att slå på programvaran.
  3. Välj korrekt PMT-förstärkning och digital förstärkning för att visualisera den cellulära strukturen i den okulära ytan.
  4. Ställ in den första bilden och den sista bilden för att skaffa en stapel.
  5. Ange numeriska värden för bildupplösning och z-steg, t.ex.
  6. Klicka på Start-knappen för att samla in z-seriebilder.
  7. Förvärva levande bilder två gånger i samma område, först vid 880 nm excitation för SHG / EGFP signaler insamling och andra på 940 nm excitation för EGFP / tdTomato signaler insamling.
    OBS: Kombinationen av två stackar ger 3 kanaler bilder. Bildupplösningen och scanformatstorleken var 512 x 512 pixlar respektive 157 μm x157 μm.

5. Bildbehandling och 3D-rekonstruktion

  1. Ladda z-seriebilderna i Fijis programvara18.
  2. Välj plugin Median 3D-filtret i Fiji för att minska bakgrundsljud.
  3. Välj filtret Paket oskarp mask i Fiji för att skärpa bilderna.
  4. Klicka på" Auto" i ljusstyrka/kontrast för att automatiskt optimera kvaliteten på bilderna.
  5. Spara bilderna som bildsekvenser för att kunna exportera z-seriebilderna.
  6. Ladda z-seriebilder i kommersiell programvara (t.ex. Avizo lite) för 3D-rekonstruktion med hjälp av volymåtergivning.
  7. I alla MPM-bilder presenterar du EGFP-, tdTomato- och SHG-signaler i pseudogrön, röd respektive cyanfärg.
  8. Fånga 3D-struktur bilder av ögonblicksbilden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Med hjälp av denna live imaging plattform, musen okulär yta kan visualiseras på cellulära nivåer. För att visualisera enskilda enstaka celler i okulär yta, vi anställda de dubbla fluorescerande transgena möss med EGFP uttryckt i kärnan och tdTomato uttryckt i cellmembranet. Den kollagen-rika hornhinnan stroma belystes av SHG signaler.

I hornhinneepitelet visualiserades ytliga celler, vingceller och basala celler ( figur2). I de dubbla fluorescerande transgena mössen kunde vi kartlägga enstaka celler från det basala lagret till de ytliga lagren i både hornhinnans och limbal epitel (Figur 2). De sexkantiga ytliga cellerna observerades (vit pilspets i figur 2). Både kärnstorlek och internukleära avstånd från det basala skiktet mot de yttre skikten ökade i hornhinnans epitel (Figur 2). De cytoplasmatiska signalerna av tdTomat fluorescens indikerade att det membranproteinrika intracellulära veskulära systemet, inklusive Golgiapparaten, endoplasmatiskt reticulum, var utspridda i vingcellerna (Figur 2).

Inom kollagens stroma, de stellate-formade keratocyter beskrevs av membran-inriktning tdTomat fluorescens i dubbla fluorescerande transgena möss (gul pilspets i figur 3 och figur 4). De keratocytes inbäddade i kollagen stroma var mer löst fördelade än endotelceller. Dessutom var tunna förgrening nerver i hornhinnan stroma också visualiseras genom membran-inriktning tdTomato signaler (vit pilspets i figur 3). Monolayer av hornhinnans endotelceller visade en relativt homogen sexkantig form ansluten till ett honeycombed mönster (vit pilspets i figur 4). Det limbala epitelet bestod av 1–2 skikt epitelceller (Figur 5). Den dubbla fluorescerande reporter transgen mus stam också möjligt för oss att bilden kapillärerna inom bindhinna (Figur 6A). 3D arkitektur av kapillärer rekonstruerades genom att skissera vaskulär endothelium (Figur 6B,6C).

Figure 1
Bild 1: Uppställningen av MPM och roterande mushållare.
(A) Inställningen av MPM. (B) Mushållarens utformning. Mushållaren består av en roterande huvudhållare och en ögonhållare. (C) Musögonhållarens utformning. Ögonhållaren drar tillbaka ögonlocken genom en plastslinga för att exponera hornhinnan och bindhinnan. Huvudhållaren och ögonhållaren skruvas ihop (B) på scenen för att möjliggöra exakt och kontrollerbar rotation och bildframställning av okulär yta. (D) Fotografi av levande mus för hornhinnans bildbehandling med ögonhållare. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Liveavbildning av hornhinneepitelet i dubbla fluorescerande transgena möss.
Hornhinnans epitel var avbildad lager för lager, att inkludera ytliga celler, vinge celler och basala celler. Ytliga celler är markerade med en vit pilspets. Skala bar = 50 μm. (Z = djup från den översta ytan av epitel (μm)). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 3
Bild 3: Liveavbildning av hornhinnestredan.
Inom hornhinnans stroma, de keratocytes (gul pilspets) och nervfibrerna (vit pilspets) var inbäddade i kollagenous stroma (i pseudo-blå färg). Skala bar = 50 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Liveavbildning av hornhinnedotel i centrala hornhinnan.
Monolayer av sexkantiga hornhinnans endotelceller (vit pilspets). Skala bar = 50 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Liveavbildning av limbalepitelet.
Levande bilder av limbal epitel i dubbla fluorescerande transgena möss visade vacuolated kärnor. Skala bar = 50 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 6
Bild 6: Livebildtagning och den tredimensionella rekonstruktionen av kärlnätet i konjunktiva.
(A) Kapillärer i konjunktival stroma visualiserades. Skala bar = 50 μm. (B) 3D-rekonstruktion av kapillärnätverk som utförs med hjälp av en kommersiell programvara. Skala bar = 50 μm. (C,D) Förstorade 3D-vyer av bilden som visas på panel B. Fluorescerande vaskulära endotelceller skisserade kapillärerna (vita och gula pilspetsar). Skalstång för panel C = 6,26 μm och för panel D = 10 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denna specialbyggda MPM imaging plattform med en kontroll programvara användes för intravital avbildning av mus epitelial organ, inklusive huden10, hårsäcken10 och okulär yta9,10 (Figur 1A). Det specialbyggda systemet användes för sin flexibilitet i att ändra de optiska komponenterna för olika experiment, sedan början av vårt projekt. Denna bildmetodik är mångsidig för kommersiella MPM-produkter. Detta protokoll beskriver en detaljerad metod för intravital avbildning av musen okulär yta genom MPM bildframställning plattform. Med hjälp av en stereotaxisk mushållare (Figur 1B), kunde vi visualisera olika regioner över hela okulär yta. Den exakta positioneringsmöjligheten gör det möjligt att övervaka temporala celldynamiska ändringar i en angiven region.

Även om flera studier av murine hornhinnans MPM imaging har rapporterats in vivo19,20,21,22, det finns flera tekniska begränsningar som man behöver övervinna för att uppnå kontinuerlig bildbehandling under en lång period t.ex., hålla ögongloben i en stabil position, minska rörelse artefakter under bildframställning och förvärva bilderna under en lång period utan photobleaching. Jämfört med den ögonmussla av plast som är avsedd för hornhinneavbildning in vivo med relativt begränsad tillgång till ögonytan20, håller vår ögonhållare inte bara ögongloben fullt exponerad utan gör också hela okulär yta tillgänglig för objektivet (Figur 1C).

Även om vitala färgämnen eller sonder rutinmässigt används som fluorescerande reportrar att märka celler20,21,22, kan invasivitet nål injektion störa den naturliga cellen dynamik organ under fysiologiska homeostat eller vävnad regenerering process. R26R-GR transgena möss stam uttrycker stabilt och ljust grönt fluorescerande protein i cellkärnan och har använts för visualisering av celldynamiken i muskelstamfaitorer i spökfibrer23. mT-mG reporter transgen mus linje användes för att analysera differentiering av epidermala celler inhomeostasis24. Jämfört med en enda reporter fluorescerande transgen mus linje, detta dubbla fluorescerande transgena mus stam minskade tiden för bild förvärv till hälften genom att samtidigt tillhandahålla informationen cellstruktur både cellkärnor och cellmembran. Genom att rotera mushållaren visualiserades platta kärnor av både endotelceller och blodceller inom kärllumen med hjälp av dubbel fluorescerande transgen musstam (Figur 6). Därför kan denna transgena muslinje användas för att undersöka celldynamiken i kapillärer i framtiden, vilket är nyckeln till den patologiska hornhinnans kärlnyfysiologi. Dessutom kan denna in vivo imaging plattform också användas för att utforska immunsvar i hornhinnans patologier genom fluorescerande märkning av olika immunceller, såsom neutrofiler25, langerhans celler26, reglerande T-celler (Tregs)27 och mastceller28.

Sammanfattningsvis har vi visat en kraftfull intravital MPM bildframställning plattform för mus okulär yta studie. Kombinationen av live MPM stereotaxic stage och speciella fluorescerande transgena möss möjliggör realtidsvisualisering av distinkta cellulära och extracellulära strukturer i den okulära ytan, inklusive hornhinna, limbus och bindhinna. Denna intravital imaging plattform kan bidra till att utforska celldynamiken i den okulär yta och, med ytterligare utveckling, kan potentiellt användas för oftalmisk drog screening i framtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Vi tackar bidragsstödet från ministeriet för vetenskap och teknik, Taiwan (106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089, 108-2628-B-002-023, 108-2628-B-002-023), National Taiwan University Hospital (NTUH108-T17) och Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan (CMRPG3G1621, CMRPG3G1622, CMRPG3G1623).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AVIZO Lite software Thermo Fisher Scientific Version: 2019.3.0
Bandpass filters Semrock FF01-434/17
FF01-500/24
FF01-585/40
Dichroic mirrors Semrock FF495-Di01-25x36
FF580-Di01-25x36
Galvano Thorlabs GVS002
Jade BIO control software SouthPort Corporation Jade BIO
Oxybuprocaine hydrochloride Sigma O0270000
PMT Hamamatsu H7422A-40
Polyesthylene Tube BECTON DICKINSON 427401
Stereotaxic mouse holder Step Technology Co.,Ltd 000111
Ti: Sapphire laser Spectra-Physics Mai-Tai DeepSee
Upright microscopy Olympus BX51WI
Vidisic Gel Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH D13581
Zoletil Virbac VR-2831

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37, (3), 588-598 (2011).
  2. Van Buskirk, E. M. The anatomy of the limbus. Eye (London). 3, Pt 2 101-108 (1989).
  3. Hodges, R. R., Dartt, D. A. Tear film mucins: front line defenders of the ocular surface; comparison with airway and gastrointestinal tract mucins. Experimental Eye Research. 117, 62-78 (2013).
  4. Tan, H. Y., et al. Multiphoton fluorescence and second harmonic generation imaging of the structural alterations in keratoconus ex vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, (12), 5251-5259 (2006).
  5. Konig, K. Multiphoton microscopy in life sciences. Journal of Microscopy. 200, Pt 2 83-104 (2000).
  6. Rompolas, P., et al. Spatiotemporal coordination of stem cell commitment during epidermal homeostasis. Science. 352, (6292), 1471-1474 (2016).
  7. Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19, (2), 155-163 (2017).
  8. Xin, T., Gonzalez, D., Rompolas, P., Greco, V. Flexible fate determination ensures robust differentiation in the hair follicle. Nature Cell Biology. 20, (12), 1361-1369 (2018).
  9. Wu, Y. F., et al. Intravital multiphoton microscopic imaging platform for ocular surface imaging. Experimental Eye Research. 182, 194-201 (2019).
  10. Wu, Y. F., Tan, H. Y., Lin, S. J. Long-Term Intravital Imaging of the Cornea, Skin, and Hair Follicle by Multiphoton Microscope. Methods in Molecular Biology. (2019).
  11. Lo, W., et al. Fast Fourier transform-based analysis of second-harmonic generation image in keratoconic cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, (7), 3501-3507 (2012).
  12. Tan, H. Y., et al. Multiphoton fluorescence and second harmonic generation microscopy for imaging infectious keratitis. Journal of Biomedical Optics. 12, (2), 024013 (2007).
  13. Jester, J. V., et al. Four-dimensional multiphoton confocal microscopy: the new frontier in cellular imaging. Oculur Surface. 2, (1), 10-20 (2004).
  14. Morishige, N., et al. Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48, (3), 1087-1094 (2007).
  15. Hao, M., et al. In vivo non-linear optical (NLO) imaging in live rabbit eyes using the Heidelberg Two-Photon Laser Ophthalmoscope. Experimental Eye Research. 91, (2), 308-314 (2010).
  16. Chen, Y. T., et al. R26R-GR: a Cre-activable dual fluorescent protein reporter mouse. PLoS One. 7, (9), 46171 (2012).
  17. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, (9), 593-605 (2007).
  18. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  19. Masihzadeh, O., Lei, T. C., Ammar, D. A., Kahook, M. Y., Gibson, E. A. A multiphoton microscope platform for imaging the mouse eye. Molecular Vision. 18, 1840-1848 (2012).
  20. Zhang, H., et al. Two-photon imaging of the cornea visualized in the living mouse using vital dyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54, (10), 6526-6536 (2013).
  21. Lee, J. H., et al. Comparison of confocal microscopy and two-photon microscopy in mouse cornea in vivo. Experimental Eye Research. 132, 101-108 (2015).
  22. Ehmke, T., et al. In vivo nonlinear imaging of corneal structures with special focus on BALB/c and streptozotocin-diabetic Thy1-YFP mice. Experimental Eye Research. 146, 137-144 (2016).
  23. Webster, M. T., Manor, U., Lippincott-Schwartz, J., Fan, C. M. Intravital Imaging Reveals Ghost Fibers as Architectural Units Guiding Myogenic Progenitors during Regeneration. Cell Stem Cell. 18, (2), 243-252 (2016).
  24. Mesa, K. R., et al. Homeostatic Epidermal Stem Cell Self-Renewal Is Driven by Local Differentiation. Cell Stem Cell. 23, (5), 677-686 (2018).
  25. Goh, C. C., et al. Real-time imaging of dendritic cell responses to sterile tissue injury. Journal of Investigative Dermatology. 135, (4), 1181-1184 (2015).
  26. Kissenpfennig, A., et al. Dynamics and function of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic cells colonize lymph node areas distinct from slower migrating Langerhans cells. Immunity. 22, (5), 643-654 (2005).
  27. Chow, Z., Mueller, S. N., Deane, J. A., Hickey, M. J. Dermal regulatory T cells display distinct migratory behavior that is modulated during adaptive and innate inflammation. Journal of Immunology. 191, (6), 3049-3056 (2013).
  28. Dudeck, A., et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34, (6), 973-984 (2011).
En anpassad Multiphoton Mikroskopi plattform för Live Imaging av Mus Hornhinna och Bindhinna
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, Y. F., Ye, R. T., Pan, M. K., Lin, S. J., Tan, H. Y. A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva. J. Vis. Exp. (159), e60944, doi:10.3791/60944 (2020).More

Wu, Y. F., Ye, R. T., Pan, M. K., Lin, S. J., Tan, H. Y. A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva. J. Vis. Exp. (159), e60944, doi:10.3791/60944 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter