Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

מערך מערכת Droplet ליטר ליצירת חלבון מקבילי בנפט ממולקולות דנ א יחיד

Published: June 20, 2020 doi: 10.3791/60945
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3
1SUGAR Program, X-star, Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC), 2Center for Mathematical Science and Advanced Technology, Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC), 3Deep-Sea Nanoscience Research Group, Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC)

Summary

המטרה הכוללת של הפרוטוקול היא להכין מעל 1,000,000 הורה, אחיד, יציב, ותואם ביולוגי טיפות של ליטר על 1 ס מ2 מצע מישורי שניתן להשתמש בו עבור סינתזה של חלבון תא ללא.

Abstract

ההתקדמות ברזולוציה מרחבית ורגישות האיתור של מכשור מדעי מאפשרים ליישם כורים קטנים למחקר ביולוגי וכימי. כדי לענות על הביקוש למכשירים בעלי ביצועים גבוהים, פיתחנו מערך מיקרוליטר של המכשיר (מכשיר "פרמי") ולמעשה היישום שלה באמצעות סינתזה של חלבון מקביל בנפט ללא מקבילים (CFPS) תגובות. מעל 1,000,000 טיפות מדים שנוצרו בקלות בתוך שטח בגודל אצבע באמצעות פרוטוקול איטום שני צעדים שמן. כל droplet עגנה בתוך חדר מיקרו-ליטר שמורכב מתחתית הידרופילי ומקיר צדדי הידרופובי. היברידית הידרופיפילית-in-הידרופובי מבנה ושמני איטום ייעודי והרב הם חיוניים עבור שמירה באופן שטחי הפתרון המימית ליטר בחלל ליטר ללא אובדן אידוי. תצורת הפליטר והמבנה הפשוט של המכשיר הינו מותר לצריכה מזערית. המימד האחיד של כורי ה-droplet הכין מדידות כמותית ומדידה בקנה מידה גדול משכנע ואמין. הטכנולוגיה הנשית מתאם את תפוקת החלבון של תגובת CFPS עם מספר מולקולות ה-DNA ב-droplet כל. אנו מתקנים את ההליכים לגבי המיקרו-בנייה של המכשיר, היווצרות טיפות ליטר, ורכישה וניתוח של נתוני התמונה המיקרוסקופיים. הפרוטוקול המפורט עם עלות הריצה הנמוכה והממוטב הופך את טכנולוגיית הטכנולוגיה הממוטבת לנגישה לכל מי שיש לו מתקני חדר נקי סטנדרטיים ומיקרוסקופ של זריחה קונבנציונאלית במקום שלהם.

Introduction

החוקרים משתמשים בכורים כדי לבצע תגובות ביו/כימיות. ישנם מאמצים משמעותיים שנעשו כדי להקטין את גודל הכור ולהגדיל את התפוקה הניסיונית כדי להקטין את צריכת הדלק תוך שיפור יעילות העבודה. שני ההיבטים מכוונים לשחרור חוקרים מעומס עבודה כבד, הפחתת העלות והאצת המחקר והפיתוח. יש לנו מפת דרכים היסטורית ברורה על פיתוח טכנולוגיות הכור מנקודת המבט של אמצעי התגובה ותפוקה: כוסות יחיד/בקבוקון/מבחן-צינוריות, צינורות מיליליטר, צינורות מיקרוליטר, מיקרוליטר 8-שפופרת, מיקרוליטר 96/384/1536-באר צלחת, ו מיקרופלואידיק/picoliter/פיאוליטר/כורים ליטר1,2,3,4,5,6,7. מקבילה לצמצום גודל התכונה של טרנזיסטורים על שבבי מעגלים משולבים בתעשיית מוליכים למחצה בעשורים האחרונים, ביו/כימי מיקרוקטורים עוברים הפחתת עוצמה ואינטגרציה מערכת. כלים קטנים כאלה השפיעו מאוד על הביולוגיה הסינתטית של התאים או על התאים, ביולוגיה סינתטי, ובדיקת אבי-טיפוס בתפוקה גבוהה והקרנת8,9,10,11,12. נייר זה מתאר את המאמצים האחרונים שלנו על פיתוח של טכנולוגיית מערך droplet ייחודי ומדגים את יישומו ב-CFPS13, טכנולוגיה יסודית לביולוגיה סינתטית וקהילות סינון מולקולריות14. בפרט, אנו מספקים במכוון פרוטוקול מיטבי ובעלות נמוכה כדי להפוך את ההתקן הניתן לגישה של התקן החיצוני לכולם. בעלות נמוכה וקל לטפל פרוטוקול המכשיר המזעור יתרום למטרות חינוכיות של אוניברסיטאות ולעזור להפיץ את הטכנולוגיה.

מכינה לנשים טיפות של ליטר בצפיפות גבוהה של 106 לכל 1 ס מ2 על מצע זכוכית מישורי. אנו מצופים פולימר הידרופובי, CYTOP15, על מצע זכוכית חרוט סלקטיבי (הוסר) cytop במיקומים מוגדרים מראש כדי ליצור מערך מיקרוקאמריים על מצע. לפיכך, המיקרו-חדר המתקבל מורכב מקיר צדדי הידרופובי (CYTOP) ומתחתית הידרופילי (זכוכית). כאשר זורמים באופן רציף מים ושמן על פני השטח עם תבנית, המים יכולים להיות לכודים ואטומים לתוך המיקרותאי. מבנה ההידרופיפילית-בהידרופובי חיוני למים מחוץ למיקרוצ'יימברס, בידוד שחקנים בודדים, ושמירה על תמיסה זעירה ומימית בתוך החלל הפטויטר. המאפיין הייחודי הוחל בהצלחה על הכנת טיפות מים בשמן מיקרו מיקרוליפיד16,17. בהשוואה למכשיר אב טיפוס16, אנחנו הראשונים אופטימיזציה תהליך מיקרוייצור כדי להגשים הסרה מלאה של פולימר cytop, כמו גם חשיפה מלאה של התחתון זכוכית. CYTOP הוא מfluoropolymer מיוחד הכולל מתח נמוך מאוד בפני השטח (19 mN/m) נמוך יותר מזה של חומרים קונבנציונליים מיקרוריאקטור כגון זכוכית, פלסטיק, סיליקון. שלה טוב אופטי, חשמל, ביצועים כימיים כבר נוצל טיפול פני השטח של התקנים microflu,18,19,20,21,22,23,24. במערכת נשית, כדי להשיג הרטבה טובה של השמן על פני CYTOP, מתח פני השטח של הנפט חייב להיות נמוך יותר מאשר המשטח המוצק25. אחרת, השמן הנוזלי במגע עם המשטח המוצק נוטה להיות כדורי במקום להתפשט על פני השטח. חוץ מזה, מצאנו כי כמה שמנים ביולואורופחמן פופולריים (g., 3M FC-40)16 ו הידרופלואורואואתר שמנים (למשל, 3m הסדרה novec) יכול לפזר cytop כתוצאה של מורפולוגיה אמורפיות של cytop, אשר קטלנית למדידה כמותית יהיה מפוקפק במונחים של זיהום בין טיפות. למרבה המזל, זיהינו שמן ביולוגי תואם וידידותי לסביבה מפגין נמוך יותר (< 19 mN/m) מתח פני השטח13. כמו כן מצאנו מסורסטנט חדש שיכול להתמוסס בשמן שנבחר ולתפקד בריכוז נמוך (0.1%, לפחות 10 מקפלים נמוך יותר מאשר דיווחו26בעבר הפופולריים 26,27)13. ניתן לייצב את ממשק המים/הנפט שנוצר על ידי הגולש. בגלל שיעור האידוי הגבוה של השמן, בעקבות הסומק עם השמן, התחלנו עוד שמן ביולוגי תואם וידידותי לסביבה להחליף את הראשון לאטום את המיקרוצ'יימברס. אנו מכנים את השמן הראשון (אסייקלין AE-3000 עם 0.1 wt x SURFLON S-386) "שמן הריקון" ואת השמן השני (פומעבלין Y25) "שמן איטום", בהתאמה.

אסטרטגיית איטום השמן בשני השלבים מסוגלת לממש היווצרות מחזק של מערך ה-droplet של הנשים בתוך דקות ובלי מכשור מתוחכם. בשל בעיית האידוי, הוא נחשב מאתגרת ליצור מיקרואורנים קטנים יותר מאשר picoliter כרכים28. בעיה זו התייחסה לבעיה זו באופן שיטתי מיטוב החומרים והתהליכים המשמשים להכנת מיקרוקטורים/טיפות. כמה מאפיינים ראויים לציון של הטיפות כתוצאה מכך כוללים אחידות גבוהה (או מונוטוני), יציבות, וביותאימות בקנה מידה של ליטר. מקדם הווריאציה (CV) של כרך ה-droplet הוא רק 3% (ללא תיקון כהות לתמונות מיקרוסקופיים), קורות החיים הקטנים ביותר בין פלטפורמות ה-droplet בעולם, המבטיח מדידה מקבילה וכמותית מאוד. ה-droplet הנשית הינה יציבה לפחות 24 שעות ללא זיהום בקרב טיפות בטמפרטורת החדר, שהיא רבת ערך עבור מדידה אמינה בזמן הקורס. בנוגע לביו-תאימות, הצלחנו לסנתז חלבונים שונים מהדנ א של תבנית בעלת עותק יחיד ב-droplet של ליטר, שנחשבה בעבר לקשה או לא יעילה29,30. זה יהיה ראוי להבהיר מדוע חלבונים מסוימים המסוגלים להיות מסונתז בתוך הנשים לא יכול להיות מסונתז במערכות droplet אחרות. היא לא הייתה רק התקדמות טכנית, אלא גם הבינה מדידה כמותית unprecedentedly שיכולה לתאם את תפוקת החלבון (כפי שהיא משתקפת בעוצמת הקרינה של ה-droplet) למספר מולקולות ה-DNA של תבנית ב-droplet. כתוצאה מכך, ההיסטוגרמה של העוצמה הפלואורסצנטית של טיפות מ-CFPS מבוסס-הראה התפלגות בדידה שניתן להתאים בצורה יפה על-ידי סכום של הפצות גאוס במרווחים שווים של שיא לשיא. יתר על כן, ההסתברות של התרחשות של טיפות המכילות מספרים שונים של מולקולות DNA היה התאמה מושלמת התפלגות פואסון31. לכן, ניתן לנרמל את תפוקת החלבון השונה בכל droplet בהתבסס על ההתפלגות הדיסקרטית. תכונה קריטית זו מאפשרת לנו להפריד בין מידע הפעילות האנזימטי לבין העוצמה הנראית לעין, שעדיין לא היתה זמינה עם פלטפורמות אחרות של מיקרומושחקנים. מערכות מיון של תא מיקרופלואידיג קיימים מיומנים במיון אוטומטי לחלוטין וטוב להתרכז בדגימות, אך לעתים ניתן ליצור פלט של היסטוגרמה רחבה או ארוכת זנב יחסית בהיבט האנליטי32,33. שלנו מערכת נשית מאוד כמותית ותואמת סתיימים קובע בחינת ביצועים חדשה ותקן אנליטי גבוה בתחום התפתחות מיקרוריאקטור.

השמנים והחומרים שניתן להשתמש בהם להכנת טיפות הם עדיין מאוד מוגבל34. השילוב של אסהיקלין AE-3000 ו SURFLON S-386 הוקמה בשנת החברה הוא חבר חדש של ארסנל גדל של הממשק הפיזיוכימי בין השלב מימית ובשלב הנפט13. הממשק החדש של למעשה הוא יציב פיזית, מבחינה כימית, ותואם ביולוגית עם תמלול, תרגום ומכונות שינוי פוסט-טרנסלליות עבור סוגים רבים של חלבונים13. זה יהיה מאוד אטרקטיבי למצוא חלבון שלא ניתן לסינתזה בהגדרות ה-droplet במקום. חוץ מזה, החיסכון בעלויות של ריאגנטים הוא ברור יותר במערכת droplet ליטר של הרבה יותר מאשר ב nanoliter ו picoliter הכור מערכות35,36. במיוחד, לעתים קרובות יהיה נפח מת גדול, אשר נגרמת בעיקר על ידי צינורות או אספקה חיצונית, במערכות מיקרופלואידיג מערכות הדור, אבל לא ב-שלנו הנשים. תבנית המערך מעדיפה גם על-ידי אפיון מיקרוסקופי חוזר ומפורט (בדומה לניתוח התוכן הגבוה שנקרא) עבור כל המגיב היחיד37, ולא רק תמונה אחת עבור אובייקט הנע מהיר. בקנה מידה של ליטר מאופשר שילוב של מעל 1,000,000 כורים על האזור בגודל אצבע, בעוד מספר זהה של כורים nanoliter (אם הוא קיים) דורש מעל שטח מרובע, אשר יהיה ללא ספק לייצר או להשתמש במערכת כגון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. המיקרו-מיקרוקנה של מצע המיקרו-ליטר של המערך

הערה: בצע את הניסוי המיקרוייצור הבאים בחדר נקי. לבשו כפפות וחליפת חדר נקי לפני הכניסה לחדר הנקי.

  1. המצע לניקוי מזכוכית
    1. הגדר את הזכוכית המכסה על מדף כיסוי זכוכית מכתים. Sonicate את הזכוכית המכסה ב 8 M נתרן הידרוקסיד (NaOH) עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
      התראה: NaOH בריכוזים גבוהים הוא מסוכן מאוד לעור ולעין. . טפל בזה בעדינות בלי להתיז
    2. קח את המתלה מתוך פתרון NaOH ולשטוף את זכוכית המכסה באמצעות מים 10 פעמים. שמור את הזכוכית המכסה. במים הטהורים
      הערה: השמט את הפסולת האלקליין למיכל המיועד. הפתרון NaOH ניתן למחזר לבקבוק המקורי משמש עד חמש פעמים.
    3. יבש כל פיסת זכוכית כיסוי עם אקדח מפוצץ אוויר.
    4. אופים את הזכוכית המכסה מיובש על צלחת חמה ב 200 ° c עבור 5 דקות. לשמור על הכיוון של הצד העליון של המצע זכוכית עקבי במהלך הטיפול הבאים התהליכים.
  2. סילניזציה של משטח הזכוכית
    1. מאפס את זכוכית הכיסוי הנקוע על מדף מכתים יבש.
    2. מוסיפים 150 מ ל של אתנול לתוך גביע השתמש במחט (22 גרם x 70 מ"מ) מצויד מזרק 1 מ ל לצייר 0.075 mL של (3-aminopropyl) triethoxysilane ומיד להזריק אותו לאתנול (כלומר, 0.05 vol%). למשוך ולדחוף את המזרק מספר פעמים כדי לשטוף את החלק הפנימי של המזרק. מערבבים את הפתרון עם המחט כדי להפוך אותו הומוגנית.
      הערה: (3-aminopropyl) triethoxysilane ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר ו 1 כספומט הלחץ במשך שנתיים עם איטום צר. אתנול מוחלט צריך להיות אטום הדוק לאחר השימוש. אנחנו לא ממליצים על שימוש בריאגנטים שפג תוקפם.
    3. דגירה את הזכוכית כיסוי 0.05 vol% עמינח הפתרון עבור 1 h ב RT.
    4. שטפו את זכוכית הכיסוי במים טהורים חמש פעמים. שמור את הזכוכית המכסה. במים הטהורים
      הערה: השמט את הפסולת למיכל המיועד.
    5. יבש כל פיסת זכוכית כיסוי עם האקדח מפוצץ האוויר.
    6. מניחים את כל זכוכית העטיפה מיובשים על רדיד אלומיניום. אופים את זכוכית הכיסוי על הפלטה החמה ב-80 ° c עבור 5 דקות.
  3. ציפוי הספין CYTOP perfluoropolymer
    1. מניחים את הזכוכית המכסה על צ ' אק ואקום מותאם אישית של מסתובב ספין (איור 1A). הפעל את מתג הוואקום כדי לתקן את מצע הזכוכית.
      הערה: העיצוב של צ'אק ואקום הוא חיוני לציפוי אחיד של פולימר צמיגי על מלבני (24 מ"מ × 32 מ"מ) ו דק (0.13-0.17 mm) המצע (איור 1A). מצאנו כי שלב לדוגמה מלבנית עם חורים מרובים (48 חורים, כל אחד עם קוטר 1 מ"מ) חיבור לערוץ ואקום עבד טוב יותר מאשר השלב העגול עם חור מרכזי אחד עשה.
    2. ירידה 70-90 μL מסוג-פולימר CYTOP במרכז מצע הזכוכית. מיד ספין-מעיל הפולימר (איור 1B).
      הערה: מצב ציפוי ספין (3,400 rpm, 30 s) מספק 3 יקרומטר עובי. השתמשו במיקרופיפטה. שמיועד לנוזל צמיגי להחזיק את המיקרופיפטה זקוף כדי להפוך את הפולימר ליפול קרוב לשלמות מעגל על המצע. בועת אוויר נוצרת לעתים קרובות בתוך הקצה הפיפטה כאשר הבוכנה נעה כלפי מטה. אל תפיל את הטיפה האחרונה של CYTOP עם הבועה.
    3. להרים את הזכוכית מצופה עם האצבעות מחזיק פינות של מצע הזכוכית, ומניחים אותו על רדיד אלומיניום.
    4. חזור על הצעדים 1.3.1-1.3.3 כדי ספין-מעיל את כל החלקים הנותרים של זכוכית המכסה.
    5. אופים את הזכוכית מצופה ב 80 ° c עבור 30 דקות ולאחר מכן ב 200 ° c עבור 1 h.
      הערה: עיבוד זה מרפא באופן מלא את CYTOP והקשר הטוב CYTOP למשטח הזכוכית. מכסים את אזור האפייה עם מכסה עשוי רדיד אלומיניום כדי למנוע אבק פוטנציאלי במהלך תהליך האפייה הארוכה במידת הצורך.
    6. הסר את זכוכית מכסה CYTOP מצופה מפלטת הפלטה וקריר למטה RT. בזהירות להרים כל פיסת זכוכית מצופה ולבדוק את זה כדי לראות אם הוא מצופה כראוי. להיפטר המצע מציג ציפוי הומוגנית.
      הערה: פני השטח של CYTOP מצופה יפה צריך להיראות שטוח ללא הקשת לא סדיר תבניות כמו (איור 1C). בדיקה חזותית מזווית נאותה יכולה לשפוט במהירות את השטצות, כמו גם את איכות הציפוי. הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן.
  4. ציפוי ספין photoresist
    1. מניחים את הזכוכית המכסה CYTOP-מצופה על צ ' אק ואקום (ראה שלב 1.3.1) של מרובע ספין. הפעל את מתג הוואקום כדי לתקן את הזכוכית המכסה.
    2. ירידה 0.2-0.3 מ ל של photoresist במרכז המצע. מיד ספין-מעיל הphotoresist ב 6,000 סל ד עבור 60 s.
      הערה: אל תפיל את הטיפה האחרונה של הphotoresist עם בועות. אם מסתובב ספין תומך מהירות ספין גבוהה יותר, מהירות ספין יכול להיות עד 7,500 סל ד כדי להשיג ציפוי דק יותר. האנרגיה של פני השטח נמוך של CYTOP מונעת את רוב הפוטורסיוסטים מלהיות מדבק לפני השטח שלה. אם AZ P4903 photoresist אינו זמין, AZ P4620 photoresist היא חלופה טובה.
    3. להרים את המצע מצופה עם שתי אצבעות מחזיק פינות של המצע. נגב את עודף photoresist בסמוך לקצה המצע (נקרא לעתים להסרת קצה חרוז או EBR) באמצעות מנגב האתנול-ספוג נקי (איור 1D). מניחים את המצע על רדיד אלומיניום.
      הערה: אצטון אינו מומלץ עבור EBR.
    4. חזור על שלבים 1.4.1-1.4.3 כדי לכסות את הphotoresist עבור החלקים הנותרים של זכוכית כיסוי מצופה CYTOP. לאסוף כל פיסת זכוכית מצופה ולבדוק את זה כדי לראות אם הוא מצופה כראוי.
      הערה: המשטח של photoresist מצופה יפה צריך להיראות שטוח ללא דפוסים חריגים (איור 1D). בדיקה חזותית מזווית נאותה יכולה לשפוט במהירות את השטצות, כמו גם את איכות הציפוי. המצע מציג ציפוי הומוגנית ניתן למחזר באמצעות כביסה עם אצטון, 2-propanol, ו H2O ברצף, ולאחר מכן שימוש חוזר.
    5. אופים את המצע מצופה ב 110 ° c עבור 5 דקות על פלטת הפלטה.
    6. להסיר את המצע מצופה מפלטת הפלטה וקריר עד RT. בואו לעמוד 30 דקות בלחות יחסית של 40%-60% עבור הסבה של הphotoresist.
      הערה: H2O הוא הכרחי עבור התגובה הבאה פוטוכימית. Photoresist אפוי איבד את ה-H2O תוכן בתוך photoresist. תהליך החידוש מאפשר ל-H2O להיקלט מהאוויר. לחות יחסית נמוכה מ-20% או יותר מ-80% אינה מתאימה לתהליך החידוש.
  5. פוטוליתוגרפיה
    1. בזמן ההמתנה של היום (ראה שלב 1.4.6), הפעל את מסכת התנינים. . תחמם את מקור האור טען את הפושאול הכרום.
      הערה: בצע את מדריך ההוראות כדי להפעיל את המסכה מסכה. ניתן לזייף את הפוטובול באמצעות קרן אלקטרונים (EB) אם מתקן EB זמין. לחלופין, הפושאול יכול להיות מיקור חוץ לחברה מקומית.
    2. טען את המצע הרטוב (לאחר סיום שלב 1.4.6) על צ'אק (איור 1E).
    3. הגדר פרמטרים לחשיפה. לחשוף את המצע עבור 25 s עם עוצמת UV של 13 mW/cm2 (h-line) במצב מגע ואקום. ואז לפרוק את המצע ולהגדיר אותו על מתלה זכוכית כיסוי מכתים (אותו ארון המשמש בשלב 1.1.1).
    4. חזור על שלבים 1.5.2-1.5.3 כדי לחשוף את החלקים הנותרים של המצע הרטוב.
  6. פיתוח
    1. לפתח את המצע עבור 5 דקות לפזר את הphotoresist החשופים (איור 1F). במהלכו, לנענע בעדינות את המדף במפתח פעם אחת בנקודת הזמן של 4 דקות.
      הערה: המפתח היה AZ 300 MIF. מפתחים אלקליין חלופיים (למשל, AZ 400 K) חלים בדרך כלל עבור הפיתוח, אך צריך לדרוש אופטימיזציה של תנאי פיתוח (למשל, זמן, טמפרטורה, עצבנות). אין להשתמש בכוסות זכוכית כמכל המפתחים.
    2. שטפו את המצע במים טהורים עשר פעמים. שמור את הזכוכית המכסה. במים הטהורים
      הערה: מחק את המפתח למיכל המיועד.
    3. יבש ביסודיות כל פיסת מצע עם אקדח המכה האוויר.
  7. תחריט מגיב
    1. הניחו את המצע היבש (משלב 1.6.3) בחדר התגובות של מכונת החריטה התגובתית (RIE).
      הערה: על פי שלטון התחזוקה של המתקן, מכונת ה-RIE יכולה להיות תמיד מופעלת או כיבוי בכל פעם. אם המתג היה כבוי, הפעל את המתג בהתאם למדריך.
    2. לאיכול CYTOP photoresist החשופה עם פלזמה O2 (איור 1g).
      הערה: מצב RIE היה כדלקמן. O2 שיעור זרימת גז: 50 sccm; לחץ החדר: 10.0 Pa; כוח RF: 50 W; תצריב זמן: 27 דקות זמן החריטה היה מותאם לחריטה לחלוטין 3 יקרומטר עובי של cytop.
    3. להרים כל פיסת מצע מן התא התגובה באמצעות פינצטה ולמקם אותם על מתלה זכוכית כיסוי מכתים.
      הערה: על פי שלטון התחזוקה של המתקן, תא התגובות עשוי לדרוש תהליך ניקוי הפלזמה קצר O2 (למשל, זמן התחריט: 5 דקות) כדי לשמור על חדר התגובה נקי לאחר כל ריצה.
  8. הסרת photoresist וניקוי
    1. Sonicate את המצע באצטון עבור 5 דקות ב-RT כדי לפזר את הphotoresist הנותרים.
    2. Sonicate את המצע ב 2-propanol עבור 5 דקות ב RT.
    3. שטפו את המצע במים טהורים חמש פעמים. Sonicate המצע עבור 5 דקות ב RT. לשטוף את המדגם באמצעות מים טהורים חמש פעמים נוספות. שמור את המצע במים טהורים.
    4. יבש כל פיסת מצע עם האקדח המכה האוויר (איור 1H).
      הערה: ניתן לאחסן את המצע בצלחת פטרי מפלסטיק. המצע מפוברק יציב מבנית ב RT לפחות שנה אחת. הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן.
    5. אפיון פרופיל פני השטח של המצע המוכן על-ידי סריקת לייזר תלת-ממדית (3D), מיקרוסקופ באור לבן, אינטרפרומטריה (או מטרימטריה לסריקת קוהרנטיות), או סריקת מיקרוסקופ אלקטרוני. השתמש בתוכנה המתאימה כדי למדוד את הקוטר והעומק של המיקרותאי המתקבלים.
      הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר במדגם לניסויים אחרים לאחר האפיון בעזרת המיקרוסקופ התלת-ממדי של סריקת לייזר תלת-ממד ומיקרוסקופ בלתי הרסני או אינטרלומטר לאור לבן. הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן.

2. הכנת מיקרואוקסיטן (PDMS)

הערה: אל תלבש כפפות גומי לטיפול ב-PDMS. במקום זאת, לבשו כפפות פוליאתילן (PE).

  1. ביצוע המאסטר של המיקרוערוצים
    1. חותכים את קלטת הסרט Kapton מצופה כפול לתוך a מוגדר (3 מ"מ x 19 מ"מ) מיקרוערוץ צורה באמצעות חותך שולחני.
      הערה: הקלטת Kapton היה No. 7602 #25 (Teraoka Seisakusho), וכתוצאה מכך גובה הערוץ של 135 μm. חותך שולחן העבודה STIKA משתמש תוסף (זמין מאתר האינטרנט של רולנד: https://www.rolanddga.com) של Adobe Illustrator להפעיל את חיתוך בהתאם לציור בקובץ Adobe Illustrator. הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן.
    2. תקע כל קלטת של קאפטון על החלק התחתון השטוח של צלחת פטרי. המנה הסטנדרטית 90 מ"מ בצלחת פטרי יכולה להכיל 12 פיסות מהקלטת.
      הערה: מבנה הסיוע משמש כמאסטר לעיצוב עותק משוכפל של PDMS. לחץ על משטח הקלטת בעדינות עם הטוויצר אם יש בועות אוויר בין הקלטת למצע צלחת פטרי. לחילופין, ליתוגרפיה קלאסית הקלאסי ניתן להחיל כדי להכין את המאסטר על סיליקון וופל38. הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן.
  2. אשפרה את שרף PDMS בתוך הסרט בדוגמת צלחת פטרי
    1. ללבוש כפפות PE חדש, ולהעביר 2.5 g של ריפוי סוכן של SYLGARD 184 אלסטורר סיליקון באמצעות פיפטה פלסטיק חד פעמי לתוך גביע פלסטיק שצוין (איור 2A).
    2. לשנות לתוך כפפות חדשות, ולהעביר 25 גרם של בסיס טרום פולימר של SYLGARD 184 אלסטורר סיליקון באמצעות מזרק חד פעמי 50 mL לתוך גביע פלסטיק מעל.
      הערה: לשנות את הכפפות בזאת כדי למנוע את הזיהום הפוטנציאלי של סוכן הריפוי לבסיס.
    3. השתמש מיקסר deaeration לערבב ומאוורר את התערובת (תוכנית: 3 דקות ערבוב ואחריו 2 דקות deaeration).
      הערה: אם מערבל ההקפאה אינו זמין, התערובת מוטרדת באופן ידני (עבור כ -15 דקות) ניתן לניטרול בתאי ואקום.
    4. יוצקים את התערובת PDMS לתוך צלחת פטרי בדוגמת הסרט (איור 2B). הגדר את צלחת פטרי בחדר ריק מיני ומאוורר את התערובת PDMS עבור 1-3 h (איור 2C).
      הערה: אם האוויר נשאר בתערובת PDMS לאחר 1 h, קח את צלחת פטרי מתוך תא הוואקום, שבור את בועת האוויר באמצעות מפוח אוויר, ולאחר מכן שים את צלחת פטרי חזרה בחדר הריק והמשך בתהליך הדאנטנה.
    5. מניחים את צלחת פטרי בתנור ב 60 ° c ללילה כדי לרפא את PDMS (איור 2D).
      הערה: למרות הגדלת הטמפרטורה יכול לקצר את זמן הריפוי, את הטמפרטורה המקסימלית שניתן לסבול על ידי קלקר צלחת פטרי ללא דפורמציה פיזית היא כ 60 ° c.
  3. יציקת עותק משוכפל של ערוץ PDMS
    1. לקלף את התרופה הנרפאת מכלי פטרי (איור 2E).
    2. חתוך כל פיסת בלוקים של ערוץ PDMS באמצעות חותך כבל שטוח (איור 2F).
    3. הניחו את האלסטואר PDMS במשטח חיתוך הפונה לכיוון הערוץ כלפי מעלה. ניקוב חור בכל קצה של הערוץ באמצעות פונץ ' ביופסיה (איור 2G).
    4. נקה את פני השטח של ערוץ PDMS עם סלוטייפ. לאחר מכן לעטוף את שרף PDMS בחלק אחר של קלטת וויסקי כדי לשמור אותו נקי לפני השימוש. אחסן את ערוץ PDMS המוכן בצלחת פטרי נקיה.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

3. הרכבת מערך מיקרותאי מיקרו ליטר

  1. מניחים כמה חתיכות של מנקי מים נקיים לאורך הקיר הפנימי של צלחת פטרי כדי להפוך את החדר לחות מפושטת. מניחים את שרף PDMS מכוסה על ידי קלטת וויסקי בחדר מחולל לחות וחותם את התא באמצעות סרט פרפין. דגירה לפחות 3 שעות אבל לא יותר מיום.
    הערה: PDMS הוא חומר נקבובי המאפשר גז לעבור על פני שרף39. המבנה הנקבובי של PDMS מוביל לספיגת מולקולות מים מהסביבה עד להשגת שיווי משקל. זה טרום טיפול ממלא את הנקבוביות של PDMS עם אדי מים והוא יכול לדכא באופן משמעותי את האידוי של טיפות מימית בסמוך לקצה של ערוץ PDMS.
  2. קח את קלטת הוויסקי. משרף ה-PDMS הצב את ערוץ PDMS באזור המערך המיקרותאי של המצע (איור 2H).
    הערה: שרף PDMS המהווה הפיך הדבקה על פני השטח CYTOP. לחץ על לחסום pdms בעדינות עם פינצטה כדי להסיר בועות אוויר בין שרף pdms לבין המצע אם היה קיים.
  3. הוסף לאחד (כשקע) את קצה הצינורות הבלתי מסונן של 200 μL לאחת (כפורקן) של החורים בערוץ PDMS.
    הערה: עוצמת הדבקה בין PDMS ו-CYTOP מוגבלת. כדי למנוע דפורמציה פיזית של שרף PDMS, כמו גם התנתקות של ערוץ PDMS מעל פני השטח, לא להוסיף את הטיפ של פיפטה עמוק מדי.

4. טעינת פתרון תגובה למכשיר המורכב

  1. שימו דוכן מיקרוצינורית אלומיניום על הקרח. לצנן את שמן הריקון (אסייקלין AE-3000 שמן מעורבב עם 0.1 wt x SURFLON S-386 1.5 הגולש) בתוך מיקרוצינורית מיקרו mL על דוכן האלומיניום.
  2. . שים עוד בלוק אלומיניום על הקרח
  3. הכנת פתרון התגובה של CFPS
    1. הכינו את פתרון התגובה של CFPS בצינור PCR. מערבבים כל מרכיב סדרת מחלקים של ערכת cfps, DNA תבנית מדולל (כפי שהיא להלן על ידי חלבון פלורסנט מנמובגרין40 ו es, מונכיה coli פוספאטאז41) פתרון, ורכיבים אחרים הנחוצים על פי הצרכים הספציפיים (למשל, rnase מעכב, המצע fluorogenic, מלווה).
      הערה: ה-DNA של התבנית המשמשת עבור CFPS חייב להיות מוכן על פי ההוראה של ערכת CFPS המתאים. הפגנה זו החלה מערכת ביטוי מבוססת T742. מכיוון שצריכת האגמיכימית בהתקן הפשידה היא קטנה למדי, 10 μL גדול מספיק כדי למלא את כל הערוץ PDMS.
    2. עבור סינתזה חלבון פלואורסצנטי ירוק, לערבב את הרכיבים בסדר הבא: להוסיף 2.7 μL של nuclease-H חינם2O כדי 6 μL ליטר של פתרון a (מתוך ערכת cfps); להוסיף 0.3 μL של מעכב RNase; להוסיף 1.5 μL של פתרון DNA תבנית מדולל; בקצרה לערבב ולהעביר את התערובת ל-4.5 μl סדרת מחלקים של פתרון B (מתוך ערכת cfps).
      הערה: אמצעי האחסון הכולל הוא 15 μL. כמות כל סדרת מחלקים הוא פרופורציונלי הנפח הכולל של התערובת הסופית, נפח הכולל פחות מ 10 μl עלול לגרום לנפח קטן מדי (< 0.2 μl) של חלק מרכיב סדרת מחלקים.
    3. עבור סינתזה פוספספטאז אלקליין, לערבב את הרכיבים בסדר הבא: להוסיף 1.2 μL של H2O כדי 6 μl של פתרון A; להוסיף 0.3 μL של מעכב RNase; להוסיף 0.6 μl של שיפור אג ח קשר דיסולפידי 1 ו-2 (מתוך ערכה); הוסף 0.3 μL של 5 מ"מ 6, 8-difluoro-4-מתושלח פוספט (הפצת); להוסיף 1.5 μL של פתרון ה-DNA; בקצרה לערבב ולהעביר את התערובת כדי 4.5 μL של פתרון B.
      הערה: בתוך הסדר של פוספספטאז אלקליין, המצע פלואורוגנטי יכול לייצר פלורסנט מאוד 6, 8-difluoro-7-הידרוxy-4-מתילקוארין (מפזרת) על מחשוף אנזימטי של קבוצת פוספט מסוף.
  4. לצייר את 10 μL של התערובת באמצעות קצה הצינורות 200 μL לא מסונן. הכנס את קצה הפיפטה לחור האוויר (עיין בצעד 3.3) של ערוץ PDMS. לחץ על הבוכנה כדי להזריק את הפתרון לערוץ עד שהוא יגלוש מן השקע (שם עוד קצה הצינור כבר הוכנס בשלב 3.3).
  5. הפרידו את הפיפטה מקצה הפיפטה ושמרו על שני הטיפים האלה שעדיין מוכנסים לשקע החשמל.
    הערה: הימנע מיצירת בועות אוויר במהלך הליטוף. אל תשאירו את האגודל מהבוכנה עד שתפריד את הפיפטה מעצת הפיפטה כדי למנוע את הזרמת התמיסה בערוץ PDMS.

5. יצירת מערך droplet של ליטר (שליטה נשית) עבור CFPS

  1. העבר את כל הסט של המכשיר המורכב לבלוק אלומיניום מקורר מראש (ראה שלב 4.2). ודא בזהירות שאזור המערך המיקרו-קאמרית מגיע במהירות משקוף למחצה (איור 2I) לשקוף (איור 2i).
    הערה: פתרון התגובה CFPS לא יכול ליישר לתוך המיקרוצ'יימברס. מסיסות האוויר במים היא ביחס הפוך לטמפרטורה. האוויר לכוד להתמוסס לתוך הפתרון לאחר המכשיר הועבר מ-RT לטמפרטורה נמוכה. שינוי השקיפות הוא מחוון חזותי נוח לשפוט אם הפתרון נכנס למיקרו-תאי.
  2. לצייר 30 μL של שמן מקורר לפני המים (ראה שלב 4.1), ומיד להעביר את השמן לתוך משקע הצינורות מוכנס לתוך הפתח העליון שלה. שמן סומק נע לתוך הערוץ והבלטת הפתרון העודף התגובה הממוקם מחוץ למיקרו-צ'יימברס. . כל מיקרותאי מבודדים בשמן הסומק
    הערה: הממשק הנע בין פתרון הריאקציה לבין שמן הריקון גלוי, המסייע לאנשים להתבונן בתנועת הנוזל בתוך התעלה. ניתן לאסוף את הפתרון המרובד לתוך הצינור הקודם, המאוחסן ב-4 ° c, ולעשות שימוש חוזר עבור התקן משני של המכשיר, או תגובה בצובר מקבילה (במיקרו-צינורית או בלוח מיקרוטיטר).
  3. מראש לצייר 30 μL של איטום שמן (פועבלין Y25) לקצה מסוננים 200 μL. תתלה את הפיפטה. במקום כלשהו
  4. הסירו בו את שני הטיפים המוכנסים (ראו שלבים 3.3 ו-4.4) מהמכשיר. מייד להזיז את המכשיר מבלוק אלומיניום כדי parafilm.
    הערה: השתמש בטוויזר כדי לתקן (אך התרחק מאזור הערוץ) המכשיר בבלוק האלומיניום במהלך הסרת העצות הפיפטה.
  5. מיד הכנס את הקצה המוכן של הפיפטה המכיל את שמן האיטום (ראה שלב 5.3) לתוך מפרץ הערוץ של PDMS, והכנס את השמן לערוץ עד שהוא יגלוש משקע החשמל.
    הערה: בצע את השלב הזה ברגע הזזת המכשיר ל-RT. כדי למנוע את הזרמת הרקע בתוך הערוץ, אל תשאירו את האגודל מהבוכנה עד ששמן האיטום יגלוש מהשקע. שמן פלאש מתאדה מיד לאחר שעבר משקע של הערוץ, בעוד שמן איטום הבאים מצטבר בשקע בשל אובדן אידוי נמוך מאוד שלה.
  6. הפרידו את הפיפטה מקצה הפיפטה ולאחר מכן הסירו את קצה הפיפטה מהמכשיר. נקה את משטח PDMS באמצעות פיסת מגב נקי ולאחר מכן להחיל טיפה חדשה של איטום שמן אל השקע ואת הפורקן, בהתאמה. הטיפות הפטופליטר חתומות במיקרותאי-מיקרו בשמן.
    הערה: השתמש בטוויזר כדי לתקן (אך התרחק מאזור הערוץ) ערוץ PDMS במצע במהלך הסרת הטיפ המיקרופיפטה.
  7. נגב את הלחות המצטברת על המשטח התחתון של הזכוכית המכסה. המכשיר המוכן ביותר מוכן להדמיה והדמיה מיקרוסקופית.

6. הדמיה מיקרוסקופית

  1. תתחילו במיקרוסקופ. הפוך לקרינה פלואורסצנטית המתן לייצוב (קירור) של המצלמה. השתמש בעדשת היעד של השמן 60x או 100x. הגדר את המכשיר לנשים על הבמה המונעת. הגדר את פרמטרי ההדמיה.
    הערה: פרמטרי הדמיה כוללים את נתיב הקובץ, ערוצי הדמיה, מסננים, זמני חשיפה (באופן כללי, 100 ms הוא מספיק; זמן קצר או ארוך יותר ניתן גם בהתאם למפרט של המצלמה), ועוצמת אור.
  2. . מצא את המטוס המוקד להתאים את המיקום של ציר z של העדשה האובייקטיבית ולתקן את המטוס המוקד באמצעות מערכת פוקוס אוטומטי פנימי. הגדר את אזור הריבית (ROI; כלומר, x, ציר y) ליצירת תמונה.
    הערה: יצרני המיקרוסקופ העיקריים (ניקון, אולימפוס, Zeiss, לייקה) כל לספק את האפשרות לשלב את מערכת פוקוס אוטומטי עם המיקרוסקופ. זו מערכת פוקוס אוטומטי הכרחי לשמירה על קבוע מטוס מוקד במהלך הדמיה מרובת השטח האוטומטי. ROIs לכסות את האזור הפרמי בערוץ PDMS.
  3. . לכדו את התמונות הפלואורסצנטית לכידת מסגרת בודדת של תמונת שדה בהיר ממוקדת (BF) עבור כל ROI. אין לשנות את הסדר ואת הקואורדינטות של ROIs בעת הדמיה של ערוצים שונים.

7. ניתוח נתוני תמונה

הערה: לנתח את נתוני התמונה באמצעות תוסף תוצרת בית (המכונה "שליטה נשית") על בסיס פיג'י (http://fiji.sc) כדי לחלץ את עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית של כל droplet43. התקן את הגירסה הנכונה של פיג'י בהתאם למערכת ההפעלה. פיג'י תומך ברוב תבניות קובץ התמונה (למשל, קובץ nd2 ממיקרוסקופ ניקון, קובץ czi ממיקרוסקופ Zeiss) באמצעות תוסף לבנות ב-"ביו פורמטים".

  1. התקנת תוסף
    1. העתק והדבק את קובץ ה-plugin (אשר זמין על פי בירור המחבר המתאים או דרך הקישור המוסדי הבא: https://fbox.jamstec.go.jp/public/FcsQwAsMKIqA9j0B2MJwLUMeHGsxp09hAkAFdVhQIDkZ) לתוך התיקייה "תוספים" של פיג'י.
    2. הפעל את תוכנת פיג'י; את התוסף "שליטה נשית" ניתן למצוא בתפריט הנפתח "תוספים" של פיג'י.
  2. עיבוד מקדים של נתוני תמונה
    1. פתח את תמונת BF הממוקדה (ראה שלב 6.3). לחץ על תהליך | הפחת רקע. .. כדי להסיר את הרקע הרציף החלק של כל מסגרת של נתוני התמונה (איור 4B). לחץ על תהליך | מסננים | חציון כדי להקטין את הרעש של כל מסגרת של נתוני התמונה (איור 4c).
    2. לחץ על תמונה | כוונן | הסף כדי לבדוק ולהפריד את הקידמה (המציינת את המיקרותאי) מהרקע (המציין את האזור שמחוץ למיקרו-תאי) של כל מסגרת של נתוני התמונה (הוספות מוגדלות באיור 4א-ג).
      הערה: בחר אלגוריתם מתאים מהרשימה הנפתחת בחלון הסף כך שרק האזורים המיקרוקאמריים, כמו גם הקצוות של כל מיקרוקאמריים, יכולים להיות מזוהים ומסומנים כקידמה. במיוחד, רוב הקצוות המסומנים חייבים להיות רציפים ללא פערים.
  3. קביעת קואורדינטות Droplet
    1. לחץ על תוספים | שליטה נשית | ניתוח לפתיחת ממשק המשתמש הגרפי (GUI) של התוסף המותאם אישית (המחצית העליונה של איור 4d).
    2. הקלט את המספר המינימלי והמקסימלי של פיקסלים של מיקרותא יחיד. קלט את המעגל המינימלי הצפוי והמקסימלי (0: צורה שרירותית; 1: מעגל מושלם) של המיקרוצ'יימברס. הקלט את מספר המסגרת של מסגרת ההתחלה ומסגרת הסיום.
    3. לחץ ליצור ROI על GUI כדי לזהות כל מיקרו-תא, ואת rois זיהה בהצלחה מוצגים בחלוןמוקפץ.
    4. חזור אל החלון ניתוח לאחר שליטה בחלונות ולחץ על הלחצן החל מסכת ROI כדי לבדוק אם המיקרוצ'יימברס מעל המסגרות זוהו כראוי (השמאלי התחתון של איור 4d). אם לא, לשנות חלק מהם וחזרה לחיצה ליצור roi ולהחיל רועי מסכה. אם כן, עבור לשלב הבא.
      הערה: ייתכנו מיקרותאי מיקרו מאוד שלא ניתן לזהותם היטב כהחזר התשואה (ראה את החצי התחתון של איור 4D) על ידי אלגוריתם כלשהו של הסף בשל הניגוד האין מספיק בין הקידמה לרקע. זה לא בעייתי בנקודת המבט הסטטיסטית.
  4. חילוץ בעצימות פלואורסצנטית
    1. פתח את התמונה הפלואורסצנטית. והבא אותו לחזית לחץ על החל מסכת ROI שוב כדי להחיל את rois הנחוש על התמונה הפלואורסצנטית (הימנית התחתונה של איור 4d).
    2. בחרו באחת משתי התמונות לניתוח תמונת נקודת קצה (כפי שניתן לציין בנתונים הקיצורים) או בקפיצה בזמן לניתוח נתוני מסלול הזמן (לדוגמה, עם נתוני פוספספטאז אלקליין).
    3. קלט 100 במספר התיבה של העליון פיקסלים פירושו שרק העליון 100 פיקסלים של כל ROI ישמש כדי לחשב את העוצמה הממוצע של ה-droplet המתאים. אם הקלט 0 במספר הפיקסלים העליונים, כל הפיקסלים של כל ROI ישמשו לחישוב העוצמה הממוצע של ה-droplet המתאים.
      הערה: ייתכן שיהיה הסחף של מספר פיקסלים בין BF לבין תמונות הזריחה, כלומר כמה פיקסלים בתוך ה-ROIs עשויים להשתייך לרקע של התמונה הפלואורסצנטית. מכאן, תוסף מספק אפשרות לציין את מספר הפיקסלים המדורגים בעוצמה מדורגת לחישוב העוצמה הממוצע של כל droplet.
    4. לניתוח של התמונה נקודת קצה (כלומר, בחר אחד-Shot בשלב 7.4.2), לחץ על כפתור למדוד עוצמה כדי לחשב את עוצמות ממוצע של כל טיפות שזוהו. התמונה מתעדכנת עם הנתונים החדשים מהתמונה הפלואורסצנטית. בינתיים, היסטוגרמה מוצגת בהיסטוגרמה חדשה של חלון מוקפץ (איור 4e).
      הערה: שינוי גודל הסל במספר סל התיבה יכול למטב את תצוגת ההיסטוגרמה. ניתן להשיג התאמה לסכום של הפצות גאוסיאנית בממשק הGUI המפותח. חלון היומן המוקפץ של פיג'י מציג את תוצאות ההתאמה. לחילופין, לייצא את הנתונים על ידי לחיצה על לחצן שמור כטקסט ולבצע ניתוחים סטטיסטיים שונים עם תוכנות אחרות (איור 4F, G).
    5. לניתוח של תמונת הזמן-קורס (כלומר, לבחור את הזמן פקיעה בשלב 7.4.2), החלון המוקפץ הוא חוזק קורס הזמן במקום היסטוגרמה, אשר מכיל היסטוגרמה המתאימה לנקודת זמן מסוימת ומזימה בעלת עוצמת זמן (איור 5). ניתן גם לייצא את הנתונים הטקסטואליים באמצעות תפריט הקובץ של החלון המוקפץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תהליך המיקרוייצור כולל ניקוי מצע, פונקציונליזציה לפני השטח, ציפוי CYTOP, פוטוגרפיה, תחריט יבש, photoresist להתפשט וניקוי סופי. חשוב מכך, הפרוטוקול המוצג איפשר הסרה מלאה של פולימר CYTOP הידרופובי בתוך המיקרוצ'יימברס איור 3A), הפקת מבנה מקביל במיוחד הידרופיפילית-בהידרופובי על מצע זכוכית כיסוי סטנדרטי. בעזרת פרוטוקול איטום השמן, המימד האחיד של הטיפות המתקבל אומת על ידי פתרון פלורסנט encapsulating במיקרוצ'יימברס (איור 3 ב'). עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית שחולצו באמצעות התוכנה המפותחת הוא מחוון טוב של גודל ה-droplet. קורות החיים של עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית, 3%, שיקפו את ההתפלגות הצרה של גודל ה-droplet מעל המערך כולו (איור 3C). תמונה תלת-ממדית משוחזרת ממיקרוסקופיה הראתה גם את נפח ה-droplet העקבי לאורך זמן (איור 3D, סרט משלים 1)44. לעומת זאת, בשימוש נרחב FC-40 שמן שנוצר טיפות המציגות את ההבדל הרבה יותר בעוצמה פלואורסצנטית45. טיפות של הוקם בתוך הבית הינם יציבים ב-RT לפחות 24 שעות (איור 3E). איכות גבוהה של טיפות בסופו של דבר הקימו את הבסיס של מדידה כמותית.

נתוניםבתפוקה גבוהה מחייבים כלים לניתוח נתונים בתפוקהגבוהה46,47. התוסף המפותח פשוט מאוד ומתח את ניתוח נתוני התמונה. בהתבסס על התאוריה של עיבוד תמונה דיגיטלית48, התמונה הממוקדה של BF יכול להיות משומש ומשמש כדי לספק את מידע הקואורדינטות של כל droplet לאחר תיקון רקע והפחתת רעש (איור 4A-C). רעיון זה עשה את ההתאמה המדויקת של טיפות כהה אפשרי.

החלבון הפלואורסצנטי מאוונוב היה מסונתז בתוך שליטה. DNA תבנית עם ריכוז של 0.05 מולקולות לכל droplet היה מופץ באופן אקראי לתוך כל droplet כדי ליזום את סינתזה חלבון עם מצמידים שעתוק חינם תא ותגובות תרגום. בגלל המספר הממוצע של מולקולות DNA ל-droplet היה קטן יותר מ 1, כמה טיפות הכילו DNA תבנית אפס, בעוד אחרים הכילו מולקולות DNA אחת או יותר. לאחר 6 שעות של דגירה ב-RT, תמונת נקודת הקצה נתפסה באמצעות המיקרוסקופ. נתוני תמונת המחסנית נותחו על-ידי התוכנה המפותחת בעזרת תמונת BF הממוקדה בו (איור 4א-ה). עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית של כל droplet היא מדד של תפוקת החלבון ב-droplet המתאים. היסטוגרמה של עוצמות הזריחה הראתה התפלגות דיסקרטית והיא הותאמה היטב לסכום של הפצות גאוסיאנית של מרווחי שיא שווים לשיא (איור 4F), אשר הציע בחריפות תפוסת מספרים שונים של מולקולות DNA ל-droplet. בדומה למשחק היפוך המטבעות החוזר, מספר האירועים האקראיים הבלתי תלויים המתרחשים מבחינה מתמטית, המתואר בהתפלגות פואסון. ההסתברות של התרחשות של טיפות המכילות מספרים שונים (עד 3 בדוגמה זו) של מולקולות DNA היה התאמה מושלמת התפלגות פואסון (P = e-λ • λk /k!, כאשר λ הוא המספר הממוצע הצפוי של מולקולות dna ל-droplet ו- k הוא המספר הממשי של מולקולות dna ב-droplet) עם ממוצע של 0.05 מולקולות Dna לכל droplet (איור 4g)31, כצפוי להפצה אקראית של מולקולות dna. בגלל הריכוז טעינת של פתרון ה-DNA של התבנית היה זהה לλ הסופי מצויד (כלומר, 0.05), את היעילות התגובה CFPS ב-שלנו להיות מ100% (או ליד 100%). במילים אחרות, מולקולת ה-DNA יחיד מספיק כדי להפעיל את תגובת CFPS ב-droplet ליטר ביעילות.

תגובת CFPS של פוספאטאז אלקליין הוקלטה כל 5 דקות. התוכנה המפותחת גם תומכת בניתוח נתוני מסלול הזמן (איור 5). התגובה בשילוב fluorogenic הראה התפלגות נפרדת דומה של עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית של טיפות בזמן מוקדם יותר נקודות. תוצאות ההיסטוגרמה אומתו גם התפוסה של מספר שונים של מולקולות DNA ב-droplet. עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית בסופו של דבר התכנס לערך יחד עם דלדול הדרגתי של המצע fluorogenic הפצת.

Figure 1
איור 1: תהליך המיקרו-ייצור של המצע המיקרו-מיקרותאי בצפיפות גבוהה. (א) ציור טכני של צ'אק ואקום מותאם אישית. יחידה: mm. (ב) הסרט cytop עובי לעומת מהירות ספין נתונים. (ג) ספין-ציפוי של perfluoropolymer cytop על מצע זכוכית silanized. התצלומים הראו דוגמה טובה לציפוי הומוגנית ודוגמה גרועה לציפוי בלתי הומוגנית, בהתאמה. החץ השחור מציין את המיקום הספציפי של הסרט CYTOP האינגניות. (ד) ספין-ציפוי של photoresist על מצע cytop מצופה. לאחר ציפוי ספין, photoresist ליד המצע חייב להיות מוסר באמצעות המגב נקי אתנול (התמונה האמצעית). התצלומים הראו דוגמה טובה לציפוי הומוגנית ודוגמה גרועה לציפוי בלתי הומוגנית, בהתאמה. החץ הלבן מציין את המיקום הספציפי של הסרט photoresist הומוגנית. (ה) חשיפה של הphotoresist המצופה באמצעות מסכת תנינים. (ו) פיתוח הphotoresist החשופים במפתח. החלק החשוף של הphotoresist מסיסים בפתרון המפתחים. (G) התגובתית-תחריט יון של cytop. CYTOP החשופה הוסר על ידי הפלזמה O2 . (ח) הסרת המסכה הphotoresist. . הphotoresist הוסר על ידי אצטון המצע נוקה באמצעות 2-propanol ו-H2O. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הכנה ושימוש בהתקן המערך המיקרותאי. (א) שקילה על הסוכן הריפוי ואת טרום פולימר של pdms. (ב) הופך תערובת מעורבת ומבלבלת לצלחת פטרי בעלת תבנית לטייפ. היו כמה בועות אוויר שנוצרו. לאחרונה בתערובת הפולימר (ג) ביטול התערובת שוב בחדר ואקום. בועות האוויר קמו והתפוצצו על המשטח העליון. (ד) הדיגז ונרפא שרף pdms. (ה) מקלף את ה-pdms אלסטומר הנרפא מצלחת פטרי. (ו) חותך כל פיסת בלוקים של ערוץ pdms באמצעות חותך בכבלים שטוחים. (G) ניקוב חורים בכל קצה של ערוץ pdms באמצעות פונץ ' ביופסיה. (H) ההתקן המורכב. שרף PDMS יכול לדבוק המשטח CYTOP. (I) שטח מערך מיקרותאי שקוף בתוך הערוץ pdms מלא הפתרון מימית לפני מצמרר. (J) אזור מערך מיקרותאי שקוף בתוך ערוץ pdms לאחר הצינון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: טיפות אולטרה אחיד ויציב במיוחד-ליטר לנשים. (א) 3d סריקת לייזר מיקרוסקופיה מיקרוסקופית הדמיה עבור מצע מפוברק. מיקרותאי גלילי בתמונה לדוגמה הראו גובה של 3 יקרומטר וקוטר של 4 יקרומטר. (ב) מדים שטופי-ליטר טיפות מעל אזור גדול של מערך מישורי. רק אזור חלקי של המערך כולו הוצג במסמך זה. פתרון פלורסנט (10 μM ATTO-514) נאטם בכל droplet. (ג) התפלגות גודל הטיפות על מערך יחיד שלם. עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית שימש כמחוון של גודל ה-droplet. . קורות החיים היו רק 3% (ד) מדידה נפחי באמצעות קונפוקלית z-מחסנית זמן מסלול נתונים. נפח של טיפות מעל המערך ניתנה על ידי תוכנת המיקרוסקופ (ש ח-רכיבים, ניקון). (ה) התאוששות פלואורסצנטית לאחר פוטוהלהלבנת. לאחר המסגרת הראשונה, טיפות מספר היו לגמרי פוטופריים באמצעות קרן לייזר מוגבלת של מיקרוסקופ קונפוקלית וקד. עוצמת הקרינה שלהם הוקלטה 24 h, ואין התאוששות הזריחה נצפתה (הקו האדום). עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית של טיפות אחרות שאינן מראות לצילום באותו שדה של התצוגה נרשמה בקו השחור. קווי שגיאה (צבעים שקופים) היו 1 SD עבור כל נקודת זמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: הליכי ניתוח של נתוני התמונה המיקרוסקופיים של נקודת הקצה. התמונה בשדה בהיר ממוקד שימש כדי לחלץ את הקואורדינטות של כל מיקרותאי/טיפות. בהתבסס על הבדלי האינטנסיביות בין קצה המיקרוצ'יימברס (כחזית) לבין אזורים אחרים (כרקע), ניתן לחלץ את הקצה הרציף והקרוב לעיגול מהרקע. עקב התפלגות הרקע האחידה בשדה התצוגה (A), נדרש בדרך כלל חלק מתהליך העיבוד של התמונה כדי לשפר את איכות הפלט הבינגריון. לאחר הפחתת הרקע (ב), הרקע של כל מסגרת היה חד ממדי. אמפירי, ערך הקלט של "רדיוס כדור מתגלגל" (שלב 1) היה 20-50 עבור 2048 פיקסל × 2048 פיקסל תמונות ו 10-20 עבור 512 פיקסל × 512 תמונות פיקסל. ככל שהערך גדול יותר, כך זמן העיבוד קצר יותר. כדי להקטין את הרעש בתמונה המופחת רקע, החל מסנן חציון על התמונה (C). באופן כללי, ערך הקלט ברדיוס (שלב 3) היה 1-2 פיקסלים. כפי שמוצג בתוספת מוגדלת, התמונה מופחתים ומסוננים יכול להיות בנייה יפה באמצעות תוסף סף הבנייה, כך הקידמה המתאימה לקצוות, כמו גם אזור האינטרסים (ROIs) ניתן לזהות במדויק. גילוי ROIs עבור כל המסגרות של התמונה בוצע באמצעות תוסף מותקן תוצרת בית באמצעות ניתוח (ד). גודל הפיקסל (שלבים 5 ו-6) ומעגליות (שלבים 7 ו-8) של ROIs, המסגרות שאנו רוצים להכניס לתוך החישוב (שלבים 9 ו-10) הוגדרו באופן ידני בהתאם לנתונים בפועל. לאחר לחיצה על ליצור roi (שלב 11) ומחכה, הקואורדינטות של כל ROI על פני מסגרות הקלט נקבע. לאחר לחיצה על מסכת ה-Roi החל (שלב 12), כל ROI שזוהה הוקף והודגש על-ידי קו צהוב. לאחר פתיחת התמונה הפלואורסצנטית ולחיצה שוב על המסיכה החל ROI , מסיכת rois הנחושה הוחלה על התמונה הפלואורסצנטית. מספר הפיקסלים העליונים (שלב 14) ציין את מספר הפיקסלים המדורגים בעוצמה מדורגת של כל ROI לחישוב העוצמה הממוצע של הטיפות המתאימות. לאחר לחיצה על עוצמת מדידה (שלב 15) וממתינה, ההיסטוגרמה נוצרה (E). ניתן להתאים את ההיסטוגרמה לסכום של הפצות גאוסיאנית באמצעות הפרמטרים הזמינים בחלון ההיסטוגרמה. לחילופין, ניתן לייצא את נתוני העוצמה הממוצע לקובץ טקסט (שלב 16) ולנתח תוכנה אחרת (F). (G) ההסתברות להתרחשות של טיפות המכילות מספר שונה של מולקולות DNA במערך נתון. ההיסטוגרמה (צבע אפור) הותאמה יפה על ידי התפלגות פואסון (קו מקווקו אדום) עם ממוצע של 0.05 מולקולות DNA ל-droplet, כצפוי להפצה אקראית של מולקולות DNA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: ניתוח נתוני התמונה המיקרוסקופיים של מסלול הזמן. ה-ROIs שזוהה (בעקבות השלבים 1-12 של איור 4) הוחל ישירות על נתוני מסלול הזמן. בשלב 13 מתוך איור 4, בחר באפשרות מועד לקפיצה וקלט את מרווח הזמן הממשי (בדקות) בין מסגרות סמוכות בזמן-מרווח [min]. לאחר לחיצה על עוצמת מדידה (שלב 15 של איור 4) וממתינה, ההתוויה של עוצמת הזמן וההיסטוגרמה (זהה לאיור 4e) נוצרו. מיקום Hist ציין את נקודת הזמן של ההיסטוגרמה, שמוצגת כקו אדום אנכי. התוסף תומך גם בציון צבעים עבור כל קו מעקב. צהוב: 0 דנ א; כחול היה 1 DNA; אדום: 2 דנ א; שחור: 3 דנ א. ניתן גם לייצא את נתוני מסלול הזמן לקובץ טקסט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

סרט משלים 1. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

המדידה הכמותית ביותר המבוססת על הטיפות האחידה, היציבות והביו-מתאימות באמצעות החלוקה הדיסקרטית, מאפשרת את ההפצה הנפרדת, התכונה הייחודית של המחקר שלנו שונה מאחרים. באופן שיטתי אופטימיזציה והפרטים את תהליכי היווצרות המיקרוייצור ו-droplet בנייר זה. קיימים מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול המבוסס.

ראשית, ציפוי אחיד של פולימר CYTOP מאוד פולימרי על מצע זכוכית מלבני דק במידה רבה קובע את האיכות של המצע שנוצר. בהינתן מרחק עבודה קצר בדרך כלל העדשה האובייקטיבית עם הגדלה גבוהה (ראה שלב 6.1), את הזכוכית לכסות דק יש להשתמש. ציפוי ספין באיכות גבוהה על מצע דק וגמיש הוא בדרך כלל מסובך. עדיין לא בדקנו את כל העיצובים האפשריים אך מצאו כי צ'אק ואקום רב החורים עם ממד מלבני זהה היה עובד היטב עבור ציפוי ספין. חשוב להפיל את פולימר CYTOP במרכז המצע זכוכית כיסוי ומיד להתחיל את ציפוי ספין (ראה שלב 1.3.2). דרגת הקושי קשורה פחות לצורת המצע, אך צמיגות של הפולימר. קו המוצרים CYTOP מציע מספר ריכוזים שונים של החבילה הזמינה מסחרית. הדילול הנלווה בחבילה יכול לשמש גם כדי לדלל את המוצר המקורי צמיגות נמוכה אם יש צורך. CYTOP 816 שאנו משתמשים בניסוי הוא מוצר מסחרי עם הריכוז הגבוה ביותר המסוגל לפרק את הפולימר ב ממיס. ציפוי עבה דורש מהירות ספין נמוכה או סיבובים מרובים של ציפוי וריפוי. מגרש של עקומת מהירות אופייני לעומת ספין מומלץ מאוד בעת שימוש בקואטר ספין חדש בסביבה חדשה.

שנית, הלחות המתאימה של החדר הנקי היא חיונית עבור הפוטוגרפיה אידיאלי, כמו גם את ההסרה המלאה של photoresist במיקום שצוין. התגובה פוטוכימית בפוטוגרפיה משתמשת H2O כאחד המגיבים. עם זאת, לאפות את הטמפרטורה גבוה יותר מאשר הטמפרטורה הרותחת של H2o מסיר h2o תוכן מphotoresist מצופה. הphotoresist היבשים חייבים לקחת זמן כדי לקלוט H2O שוב מהאוויר (ראה שלב 1.4.6). לעתים קרובות מתעלמים מנקודה זו. בהתחשב בעובדה כי מעבדות רבות יכול להיות רק כמה מתקני חדר נקי מפושט ללא שליטה בלחות, הלחות היתה לעבור באופן דרמטי במהלך העונה או להיות מושפע ממזג האוויר. פתרון בעלות נמוכה הוא להשתמש באדים לשימוש ביתי או מכשיר האדים בחדר הנקי. שכבת CYTOP חשוף לחלוטין לאחר פיתוח יכול להיות סלקטיבי והוסר באופן מלא על ידי RIE, חושף לחלוטין את תחתית הזכוכית. בסופו של דבר, מבנה היברידית של התחתון זכוכית ידרופילי ואת ההידרופובי cytop sidewall חשוב להשמנה באופן בלתי מימית פתרון לחלל ליטר שליטה.

שלישי, השמנים החדשים שנמצאו (אסקלין-3000 AE, פועבלין Y25) וסורפסטנט (חומרים פעילי שטח S-386) הראו ביצועי איטום חסרי תקדים עבור הכור הfluoropolymer13. ההזרקה של שמן הסומק חייב להתבצע על בלוק מתכת שטוח מקורר (ראה שלב 5.2); אחרת, לא ניתן יהיה ליצור טיפות ליד מפרץ הערוץ. ההזרקה של שמן איטום השני יכול להתבצע ב RT (ראה שלב 5.5). השמנים והחומרים האתריים הללו מעולם לא שימשו במחקר ביולוגי. לא נמצאו חלופות טובות יותר לעכשיו. כדי להרחיב את ארסנל של שילוב שימושי של שמנים ומפעילי עבור הכנת droplet, החבר החדש של השמנים (או הדומים באותו קו מוצר) ואת הטפלסטנט (או אלה דומים באותו קו מוצר) ראויים לנסות להיות מיושם במערכות droplet microfluidic.

להלן שתי נקודות נוספות להתראה. אחד הוא העובדה כי יש זמן השהיה בקרב ROIs במהלך הדמיה מיקרוסקופית. זמן ההדמיה הכולל עבור מחזור אחד תלוי בעיקר בגודל המערך ובהגדלה של העדשה האובייקטיבית. זמן החשיפה, מהירות התריס והמהירות הנעה של השלב המונע הם גם גורמים משניים. ככלל אגודל, הדמיה 106 טיפות ב 60 × ההגדלה לפחות ידרוש 10-20 דקות. זה זמן בלתי נמנע להשהיה מציג כמה טעויות בניתוח נתונים, אשר תמיד צריך להילקח בחשבון זהיר. השני הוא העובדה כי המספר הכולל של טיפות על מצע אחד לא יעלה 108– 109, אפילו הגדלת צפיפות של טיפות או להקטין את הגודל הבודד של ה-droplet. הסיבה לכך היא בגודל של מצע הזכוכית כי ניתן לטפל על ידי המסכה מסכה (עבור וופלים 4 אינץ ') הוא מוגבל. עוד הגדלת הגודל של הזכוכית המכסה אינו recommendable כי המצע גדול, רזה, שברירי זכוכית קשה להתמודד.

ניתן להתייחס לנשים בתור לוחית מיקרוטיטר סופר-מיניאטורי. כל התגובות הביוכימיות שבוצעו ב-96-היטב לוחיות המיקרוטיפנטר עלולות להיות מנסות לבצע שימוש בפרמי. זה בהחלט יכול לשמש למדידת פעילות אנזימים ללא טיהור חלבון מסובך. זה יכול להיות גם תואם עם תגובת שרשרת פולימראז דיגיטלי (PCR דיגיטלי) ו-האנזים הדיגיטלי המקושר לאנזימים מקושרים (אליסה דיגיטלי)31,49. הנפח הקטן, המערך הגדול והיציבות הגבוהה יביאו לכמה יתרונות בשיטות הביוגרפיות הדיגיטליות הקיימות. מערכת נשית מסוגל לפתור מספרים שונים של מולקולות DNA תבנית ב-ליטר טיפות הראו כבר את הכוח על הקרנת חלבון מדויק13. מערכת מידור מחוץ לגוף הינה מסוגלת להתפתח במהירות במגוון אנזימים. עם ההתקדמות בביואינפורמטיקה וטכניקות בנייה ספריה, התקופה של הצגת בקשה על פי דרישה של חלבונים בעלי ביצועים גבוהים יהיה בוודאי לבוא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי JSPS KAKENHI גרנט מספר JP18K14260 ואת התקציב של הסוכנות היפנית עבור מדעי הארץ ימית וטכנולוגיה. אנו מודים לשייגרו דגוצ'י (JAMSTEC) ו Tetsuro Ikuta (JAMSTEC) למתן מתקני אפיון. אנו מודים לקן Takai (JAMSTEC) עבור תמיכה בתוכנה מסחרית. המיקרו-הייצור נערך ב-"טקדה", האוניברסיטה של טוקיו, הנתמכת על-ידי "תוכנית הטכנולוגיה הטכנולוגית" של משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה (MEXT), יפן, גרנט מספר JPMXP09F19UT0087.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-aminopropyl)triethoxysilane Sigma-Aldrich 440140
1 mL syringe Terumo SS-01T
2-propanol Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
3D laser scanning confocal microscope Lasertec OPTELICS HYBRID Other similar microscopes (e.g., Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) are also applicable.
50 mL syringe Terumo SS-50LZ
6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate Thermo Fisher Scientific D6567 Prepare a 5 mM stock solution in dimethyl sulfoxide
Acetone Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
Purity 99.8%.
Air blower Hozan Z-263
Aluminum block BIO-BIK AB-24M-02
Aluminum microtube stand BIO-BIK AB-136C
ASAHIKLIN AE-3000 AGC (Test sample) Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
BEMCOT PS-2 wiper Ozu 028208
Biopsy punch with plunger Kai BPP-10F
Cover glass Matsunami Glass No. 1 (24 mm × 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness) Size-customized.
Cover glass staining rack Nakayama 803-131-11
CRECIA TechnoWipe clean wiper Nippon Paper Crecia C100-M
Cutting mat GE Healthcare WB100020
CYTOP AGC CTL-816AP
Deaeration mixer Thinky AR-100
Desktop cutter Roland STIKA SV-8
Developer AZ Electronic Materials AZ 300 MIF AZ Electronic Materials was now acquired by Merck.
Other alkaline developers may be also applicable but should require optimization of development conditions (time, temperature, etc.)
Double-coated adhesive Kapton film tape Teraoka Seisakusho 7602 #25
Ethanol Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
Purity 99.5%.
Fiji Version: ImageJ 1.51n
Flat-cable cutter Tokyo-IDEAL MT-0100
Fomblin oil Solvay Y25, or Y25/6 Free test sample may be available upon inquiry to Solvay. Fomblin Y25/6 is an alternative if Y25 is not readily available.
Hot plate AS ONE TH-900
Injection needle Terumo NN-2270C 22G × 70 mm
Inverted fluorescence microscope Nikon Eclipse Ti-E Epifluorescence specification, CCD or sCMOS camera, motorized stage, autofocus system, and high NA objective lens are required.
KaleidaGraph Synergy Version: 4.5
Mask aligner SUSS MA-6 Other mask aligners are also applicable as long as the vacuum contact mode is avaliable.
MICROMAN pipette GILSON E M250E Capillary piston tip: CP250
Microsoft Excel Microsoft Version: 16.16.15
Mini vacuum chamber AS ONE MVP-100MV
Nuclease-free water NIPPON GENE 316-90101
Parafilm Amcor PM-996
PCR tube NIPPON Genetics FG-021D/SP
Petri dish AS ONE GD90-15 Diameter 90 mm, height 15 mm.
Photoresist AZ Electronic Materials AZ P4903 AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. AZ P4620 is an alternative.
Plate reader BioTek POWERSCAN HT
Polyethelene gloves AS ONE 6-896-02 Trade name: Saniment.
PURExpress in vitro protein synthesis kit New England Biolabs E6800S or E6800L For cell-free protein synthesis reaction.
Reactive-ion etching system Samco RIE-10NR Other RIE systems are also applicable but should require optimization of RIE conditions (gas flow rate, chamber pressure, RF power, etching time, etc.)
RNase inhibitor New England Biolabs M0314S
Scotch tape 3M 810-1-18D
Sodium hydroxide solution FUJIFILM Wako Pure Chemical 194-09575 8 M concentration; danger.
Spin coater Oshigane SC-308
SURFLON S-386 surfactant AGC (Test sample) Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
SYLGARD 184 silicone elastomer Dow Sylgard184 Chemical composition: polydimethylsiloxane. The default mixing ratio is base : curing agent = 10 : 1 (m/m).
Tweezers Ideal-tek 2WF.SA.1
2A
Ultrasonic cleaner AS ONE ASU-2M
Vacuum chuck Oshigane (Customized) Material: delrin; rectangular sample stage with multiple holes (48 holes, each with 1 mm diameter); the size is customzied to fit the size of the cover glass (24 mm × 32 mm).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chiu, D. T., Lorenz, R. M., Jeffries, G. D. M. Droplets for ultrasmall-volume analysis. Analytical Chemistry. 81 (13), 5111-5118 (2009).
  2. Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77 (3), 977-1026 (2005).
  3. Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. Droplet microfluidics for high-throughput biological assays. Lab on a Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).
  4. Zhu, P. A., Wang, L. Q. Passive and active droplet generation with microfluidics: a review. Lab on a Chip. 17 (1), 34-75 (2017).
  5. Griffiths, A. D., Tawfik, D. S. Miniaturising the laboratory in emulsion droplets. Trends in Biotechnology. 24 (9), 395-402 (2006).
  6. Tran, T. M., Lan, F., Thompson, C. S., Abate, A. R. From tubes to drops: droplet-based microfluidics for ultrahigh-throughput biology. Journal of Physics D: Applied Physics. 46 (11), 114004 (2013).
  7. Zhang, Y., Jiang, X. Microfluidic tools for DNA analysis. DNA Nanotechnology. Fan, C. , Springer. Heidelberg. 113-153 (2013).
  8. Dubuc, E., et al. Cell-free microcompartmentalised transcription-translation for the prototyping of synthetic communication networks. Current Opinion in Biotechnology. 58, 72-80 (2019).
  9. Damiati, S., Mhanna, R., Kodzius, R., Ehmoser, E. K. Cell-free approaches in synthetic biology utilizing microfluidics. Genes. 9 (3), (2018).
  10. Lee, K. H., Kim, D. M. Applications of cell-free protein synthesis in synthetic biology: Interfacing bio-machinery with synthetic environments. Biotechnology Journal. 8 (11), 1292-1300 (2013).
  11. Supramaniam, P., Ces, O., Salehi-Reyhani, A. Microfluidics for artificial life: techniques for bottom-up synthetic biology. Micromachines. 10 (5), (2019).
  12. Bowman, E. K., Alper, H. S. Microdroplet-assisted screening of biomolecule production for metabolic engineering applications. Trends in Biotechnology. , (2019).
  13. Zhang, Y., et al. Accurate high-throughput screening based on digital protein synthesis in a massively parallel femtoliter droplet array. Science Advances. 5 (8), 8185 (2019).
  14. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. , (2019).
  15. Sakane, Y., Suzuki, Y., Kasagi, N. The development of a high-performance perfluorinated polymer electret and its application to micro power generation. Journal of Micromechanics and Microengineering. 18 (10), 104011 (2008).
  16. Sakakihara, S., Araki, S., Iino, R., Noji, H. A single-molecule enzymatic assay in a directly accessible femtoliter droplet array. Lab on a Chip. 10 (24), 3355-3362 (2010).
  17. Watanabe, R., et al. Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity. Nature Communications. 5, 4519 (2014).
  18. Chiu, C., Lisicka-Skrzek, E., Tait, R. N., Berini, P. Fabrication of surface plasmon waveguides and devices in Cytop with integrated microfluidic channels. Journal of Vacuum Science & Technology B. 28 (4), 729-735 (2010).
  19. Krupin, O., Asiri, H., Wang, C., Tait, R. N., Berini, P. Biosensing using straight long-range surface plasmon waveguides. Optics Express. 21 (1), 698-709 (2013).
  20. Hanada, Y., Ogawa, T., Koike, K., Sugioka, K. Making the invisible visible: a microfluidic chip using a low refractive index polymer. Lab on a Chip. 16 (13), 2481-2486 (2016).
  21. Berry, S., Kedzierski, J., Abedian, B. Low voltage electrowetting using thin fluoroploymer films. Journal of Colloid and Interface Science. 303 (2), 517-524 (2006).
  22. Lin, Y. Y., et al. Low voltage electrowetting-on-dielectric platform using multi-layer insulators. Sensors and Actuators B-Chemical. 150 (1), 465-470 (2010).
  23. Kimura, H., Yamamoto, T., Sakai, H., Sakai, Y., Fujii, T. An integrated microfluidic system for long-term perfusion culture and on-line monitoring of intestinal tissue models. Lab on a Chip. 8 (5), 741-746 (2008).
  24. Yang, T. J., Choo, J., Stavrakis, S., de Mello, A. Fluoropolymer-coated PDMS microfluidic devices for application in organic synthesis. Chemistry-a European Journal. 24 (46), 12078-12083 (2018).
  25. de Gennes, P. G. Wetting: statics and dynamics. Reviews of Modern Physics. 57 (3), 827-863 (1985).
  26. Holtze, C., et al. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a Chip. 8 (10), 1632-1639 (2008).
  27. Wagner, O., et al. Biocompatible fluorinated polyglycerols for droplet microfluidics as an alternative to PEG-based copolymer surfactants. Lab on a Chip. 16 (1), 65-69 (2016).
  28. Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, D. A., van Oijen, A. M. Droplet microfluidics: a tool for biology, chemistry and nanotechnology. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 82, 118-125 (2016).
  29. Mazutis, L., et al. Droplet-based microfluidic systems for high-throughput single DNA molecule isothermal amplification and analysis. Analytical Chemistry. 81 (12), 4813-4821 (2009).
  30. Galinis, R., et al. DNA nanoparticles for improved protein synthesis in vitro. Angewandte Chemie-International Edition. 55 (9), 3120-3123 (2016).
  31. Zhang, Y., Noji, H. Digital bioassays: theory, applications, and perspectives. Analytical Chemistry. 89 (1), 92-101 (2017).
  32. Mazutis, L., et al. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nature Protocols. 8 (5), 870-891 (2013).
  33. Courtois, F., et al. An integrated device for monitoring time-dependent in vitro expression from single genes in picolitre droplets. ChemBioChem. 9 (3), 439-446 (2008).
  34. Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
  35. Agresti, J. J., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4004-4009 (2010).
  36. Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab on a Chip. 12 (5), 882-891 (2012).
  37. Duncombe, T. A., Dittrich, P. S. Droplet barcoding: tracking mobile micro-reactors for high-throughput biology. Current Opinion in Biotechnology. 60, 205-212 (2019).
  38. Qin, D., Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
  39. Mukhopadhyay, R. When PDMS isn't the best. Analytical Chemistry. 79 (9), 3248-3253 (2007).
  40. Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nature Methods. 10 (5), 407-409 (2013).
  41. Bradshaw, R. A., et al. Amino acid sequence of Escherichia coli alkaline phosphatase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (6), 3473-3477 (1981).
  42. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
  43. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  44. Mantilla, C. B., Prakash, Y. S., Sieck, G. C. Volume measurements in confocal microscopy. Techniques in Confocal Microscopy. Conn, P. M. , Academic Press. Oxford, UK. 143-162 (2010).
  45. Noji, H. Single-molecule counting of biomolecules with femtoliter dropret chamber array. The 17th International Conference on Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems (TRANSDUCERS & EUROSENSORS XXVII. , 630-632 (2013).
  46. Zhang, Y., et al. Matrix-localization for fast analysis of arrayed microfluidic immunoassays. Analytical Methods. 4 (10), 3466-3470 (2012).
  47. Zhang, Y., et al. Two dimensional barcode-inspired automatic analysis for arrayed microfluidic immunoassays. Biomicrofluidics. 7 (3), 034110 (2013).
  48. Gonzalez, R. C., Woods, R. E. Digital image processing. , Pearson. New York, NY. (2018).
  49. Cohen, L., Walt, D. R. Single-molecule arrays for protein and nucleic acid analysis. Annual Review of Analytical Chemistry. 10 (1), 345-363 (2017).

Tags

כימיה סוגיה 160 מיקרופילמנט droplet ליטר ושליטה סינתזה של חלבון תאי חלבון פלורסנט אנזים מולקולה בודדת התפלגות פואסון ניתוח תמונה מידור מתורבת
מערך מערכת Droplet ליטר ליצירת חלבון מקבילי בנפט ממולקולות דנ א יחיד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Y., Kurosawa, K., Nishiura,… More

Zhang, Y., Kurosawa, K., Nishiura, D., Tei, M., Tsudome, M. A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules. J. Vis. Exp. (160), e60945, doi:10.3791/60945 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter