Summary
Het algemene doel van het protocol is om meer dan een miljoen geordende, uniforme, stabiele en biocompatibele femtoliter druppels voor te bereiden op een 1 cm2 vlakke substraat die kan worden gebruikt voor celvrije eiwitsynthese.
Abstract
De vooruitgang in ruimtelijke resolutie en detectiegevoeligheid van wetenschappelijke instrumentatie maakt het mogelijk om kleine reactoren toe te passen voor biologisch en chemisch onderzoek. Om aan de vraag naar hoogwaardige microreactoren te voldoen, ontwikkelden we een femtoliter druppelarray (FemDA) apparaat en illustreerden we de toepassing ervan in massaal parallelle celvrije eiwitsynthese (CFPS) reacties. Meer dan een miljoen uniforme druppels werden gemakkelijk gegenereerd binnen een vinger-sized gebied met behulp van een twee-staps olie-afdichting protocol. Elke druppel was verankerd in een femtoliter microkamer bestaande uit een hydrofiele bodem en een hydrofobe zijwand. De hybride hydrofiele hydrofiele structuur en de speciale afdichtingsoliën en oppervlakteactieve stoffen zijn cruciaal voor het stabiel vasthouden van de femtoliter waterige oplossing in de femtoliter ruimte zonder verdampingsverlies. De femtoliter configuratie en de eenvoudige structuur van het FemDA apparaat maakten een minimaal reagensverbruik mogelijk. De uniforme dimensie van de druppelreactoren maakte grootschalige kwantitatieve en tijdsmetingen overtuigend en betrouwbaar. De FemDA-technologie correleerde de eiwitopbrengst van de CFPS-reactie met het aantal DNA-moleculen in elke druppel. We hebben de procedures over de microfabricage van het apparaat, de vorming van de femtoliterdruppels en de verwerving en analyse van de microscopische beeldgegevens gestroomlijnd. Het gedetailleerde protocol met de geoptimaliseerde lage bedrijfskosten maakt de FemDA-technologie toegankelijk voor iedereen die standaard cleanroomfaciliteiten en een conventionele fluorescentiemicroscoop op zijn eigen plaats heeft.
Introduction
Onderzoekers gebruiken reactoren om bio/chemische reacties uit te voeren. Er zijn aanzienlijke inspanningen geleverd om de omvang van de reactor te verkleinen en de experimentele doorvoer te verhogen om het reagensverbruik te verlagen en tegelijkertijd de werkefficiëntie te verbeteren. Beide aspecten zijn erop gericht onderzoekers te bevrijden van een zware werkdruk, de kosten te verlagen en onderzoek en ontwikkeling te versnellen. We hebben een duidelijke historische routekaart over de ontwikkeling van de reactortechnologieën vanuit het oogpunt van reactievolumes en doorvoer: enkele bekers/kolf/reageerbuizen, milliliterbuizen, microliterbuizen, microliter 8-buisstrips, microliter 96/384/1536-putplaat en microfluïde nanoliter/picoliter/femtoliterreactoren1,2,3,4,5,6,7. Analoog aan het verkleinen van de functiegrootte van transistors op geïntegreerde circuitchips in de halfgeleiderindustrie in de afgelopen decennia, bio/ chemische microreactoren gaan door volumereductie en systeemintegratie. Dergelijke kleinschalige instrumenten hebben een diepgaande impact gehad op celgebaseerde of celvrije synthetische biologie, biomanufacturing en prototyping en screening met hoge doorvoer8,9,10,11,12. Dit document beschrijft onze recente inspanningen op de ontwikkeling van een unieke druppel array technologie en toont de toepassing ervan in CFPS13, een fundamentele technologie voor synthetische biologie en moleculaire screening gemeenschappen14. In het bijzonder bieden we bewust een geoptimaliseerd en goedkoop protocol om het FemDA-apparaat voor iedereen toegankelijk te maken. Het goedkope en gemakkelijk te hanteren protocol voor het geminiaturiseerde apparaat zou bijdragen aan de educatieve doeleinden van universiteiten en de technologie helpen verspreiden.
FemDA bereidt femtoliterdruppels met een ultrahoge dichtheid van 106 per 1 cm2 op een vlakke glazen substraat. We hebben een hydrofoob polymeer, CYTOP15,op het glazen substraat gecoat en selectief geëtst (verwijderd) CYTOP op vooraf gedefinieerde posities om een microkamerarray op het substraat te genereren. Zo bestaat de resulterende microkamer uit een hydrofobe zijwand (CYTOP) en een hydrofiele bodem (glas). Wanneer achtereenvolgens stromend water en olie over het patroonoppervlak stromen, kan het water worden gevangen en verzegeld in de microkamers. De hydrofiele hydrofiele structuur is van vitaal belang voor het afweren van water buiten de microkamers, het isoleren van individuele microreactoren en het behouden van een kleine waterige oplossing in de femtoliterruimte. De unieke eigenschap werd met succes toegepast voor de bereiding van water-in-olie druppels en lipide bilayer microcompartimenten16,17. Vergeleken met het prototype apparaat16,hebben we eerst geoptimaliseerd de microfabricage proces om een volledige verwijdering van de CYTOP polymeer en een volledige blootstelling van de glazen bodem te realiseren. CYTOP is een speciaal fluorpolymeer met een extreem lage oppervlaktespanning (19 mN/m) lager dan die van conventionele microreactormaterialen zoals glas, kunststoffen en siliconen. De goede optische, elektrische en chemische prestaties zijn reeds gebruikt bij de oppervlaktebehandeling van microfluïde apparaten18,19,20,21,22,23,24. In het FemDA-systeem moet, om een goede bevochtiging van de olie op het CYTOP-oppervlak te bereiken, de oppervlaktespanning van de olie lager zijn dan die van het vaste oppervlak25. Anders, de vloeibare olie in contact met het vaste oppervlak heeft de neiging om bolvormig te worden in plaats van zich te verspreiden over het oppervlak. Bovendien vonden we dat sommige populaire perfluorkoolwaterstofoliën (bijvoorbeeld 3M FC-40)16 en hydrofluoroether oliën (bijvoorbeeld 3M Novec-serie) CYTOP kunnen oplossen als gevolg van de amorfe morfologie van CYTOP, wat dodelijk is voor kwantitatieve metingen en twijfelachtig zou zijn in termen van kruisbesmetting tussen druppels. Gelukkig hebben we een biocompatibele en milieuvriendelijke olie geïdentificeerd die een lagere (< 19 mN/m) oppervlaktespanningvertoont 13. We vonden ook een nieuwe oppervlakteactieve stof die kan oplossen in de geselecteerde olie en functie in een lage concentratie (0,1%, ten minste 10 keer lager dan eerder gemeld populaire degenen26,27)13. De resulterende water/olie-interface kan worden gestabiliseerd door de oppervlakteactieve. Vanwege de hoge verdampingssnelheid van de olie, na de spoeling met de olie, hebben we een andere biocompatibele en milieuvriendelijke olie aangebracht om de eerste te vervangen om de microkamers te verzegelen. We noemen de eerste olie (ASAHIKLIN AE-3000 met 0,1 wt % SURFLON S-386) de "spoelolie" en de tweede olie (Fomblin Y25) de "afdichtingsolie", respectievelijk.
De twee-staps olie-afdichting strategie kan een robuuste vorming van de femtoliter druppel array te realiseren binnen enkele minuten en zonder geavanceerde instrumentatie. Als gevolg van de verdamping probleem, is het beschouwd als een uitdaging om microreactoren kleiner dan picoliter volumes28genereren . FemDA heeft dit probleem aangepakt door de materialen en processen die worden gebruikt voor de bereiding van microreactoren/druppels systematisch te optimaliseren. Verschillende opmerkelijke kenmerken van de resulterende druppels zijn de hoge uniformiteit (of monodispersity), stabiliteit, en biocompatibiliteit op de femtoliter schaal. De variatiecoëfficiënt (CV) van het druppelvolume is slechts 3% (zonder vignetteringscorrectie voor de microscopische beelden), het kleinste CV onder druppelplatforms ter wereld, wat zorgt voor een zeer parallelle en kwantitatieve meting. De femtoliter druppel is stabiel voor ten minste 24 uur zonder kruisbesmetting tussen druppels bij kamertemperatuur, wat waardevol is voor een betrouwbare tijd-cursus meting. Wat de biocompatibiliteit betreft, zijn we erin geslaagd om verschillende eiwitten te synthetiseren uit een enkelkopiesjabloon-DNA in de druppel van de femtoliter, die voorheen als moeilijk of inefficiënt29,30werd beschouwd . Het zou het waard zijn om te verduidelijken waarom sommige eiwitten die in staat zijn om gesynthetiseerd te worden in de FemDA niet kunnen worden gesynthetiseerd in andere druppelsystemen. FemDA was niet alleen een technische vooruitgang, maar realiseerde ook een ongekend kwantitatieve meting die de eiwitopbrengst (zoals weerspiegeld door de fluorescentieintensiteit van de druppel) kan correleren met het aantal sjabloon-DNA-moleculen in elke druppel. Als gevolg hiervan toonde het histogram van de fluorescentieintensiteit van druppels van femda-gebaseerde CFPS een discrete verdeling die mooi kan worden gemonteerd door een som Gaussische verdelingen van gelijke piek-naar-piekintervallen. Bovendien was de waarschijnlijkheid van het optreden van druppels met verschillende aantallen DNA-moleculen een perfecte pasvorm voor een Poisson-distributie31. Zo kan de verschillende eiwitopbrengst in elke druppel worden genormaliseerd op basis van de discrete verdeling. Deze kritieke eigenschap stelt ons in staat om de enzymatische activiteitsinformatie te scheiden van de schijnbare intensiteit, die nog niet beschikbaar is met andere microreactorplatforms. Bestaande microfluïde cel/druppelsorteersystemen zijn bedreven in volautomatisch sorteren en zijn goed in het concentreren van monsters, maar kunnen soms alleen een relatief breed of langstaart histogram produceren in het analytische aspect32,33. Ons zeer kwantitatieve en biocompatibel FemDA-systeem zet een nieuwe maatstaf en een hoge analytische standaard op het gebied van microreactorontwikkeling.
De oliën en oppervlakteactieve stoffen die kunnen worden gebruikt voor de bereiding van druppels zijn nog steeds zeer beperkt34. De combinatie van ASAHIKLIN AE-3000 en SURFLON S-386 gevestigd in FemDA is een nieuw lid van het groeiende arsenaal van de fysiochemische interface tussen de waterige fase en de oliefase13. De nieuwe interface in FemDA is fysiek stabiel, chemisch inert en biologisch compatibel met de complexe transcriptie-, vertaal- en post-translationele modificatiemachines voor vele soorten eiwitten13. Het zou eerder aantrekkelijk zijn om een eiwit te vinden dat niet in plaats daarvan in de druppelinstellingen kan worden gesynthetiseerd. Bovendien is de kostenbesparing van reagentia meer zichtbaar in het femtoliter druppelsysteem dan in nanoliter- en picoliterreactorsystemen35,36. In het bijzonder zou er vaak een groot dood volume, dat voornamelijk wordt veroorzaakt door buizen of externe leveringen, in microfluïde druppelgeneratie systemen, maar niet in onze FemDA. Het arrayformaat wordt ook begunstigd door herhaalde en gedetailleerde microscopische karakterisering (vergelijkbaar met de zogenaamde high-content analyse) voor elke reactor37,in plaats van slechts een enkele momentopname voor een snel bewegend object. De femtoliter schaal maakte de integratie van meer dan een miljoen reactoren op een vinger-sized gebied, terwijl hetzelfde aantal nanoliter reactoren (indien het bestaat) vereist meer dan vierkante meter gebied, die ongetwijfeld onpraktisch zou zijn voor de vervaardiging of het gebruik van een dergelijk systeem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Microfabricage van het femtoliter microkamersubstraat
OPMERKING: Voer het volgende microfabricage-experiment uit in een cleanroom. Draag handschoenen en een cleanroom pak voor het invoeren van de cleanroom.
- Reinigingsdekselglas substraat
- Zet het afdekglas op een afdekglas kleuringsrek. Soniceer het afdekglas in 8 M natriumhydroxide (NaOH) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT).
LET OP: NaOH in hoge concentraties is zeer gevaarlijk voor huid en oog. Ga er voorzichtig mee om zonder splash. - Haal het rek uit de NaOH-oplossing en spoel het dekglas tien keer af met water. Bewaar het afdekglas in het zuivere water.
LET OP: Gooi het alkalische afval terug naar de aangewezen tank. De NaOH-oplossing kan worden gerecycled tot de originele fles en tot vijf keer worden gebruikt. - Droog elk stuk van dek glas met een lucht blaaspistool.
- Bak het gedroogde dekglas op een hete plaat op 200 °C gedurende 5 min. Houd de oriëntatie van de bovenzijde van het glazen substraat consistent tijdens de volgende behandelingsprocessen.
- Zet het afdekglas op een afdekglas kleuringsrek. Soniceer het afdekglas in 8 M natriumhydroxide (NaOH) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Silanisatie van het glasoppervlak
- Reset het gereinigde afdekglas op een droog kleurrek.
- Voeg 150 mL ethanol toe aan een PTFE bekerglas. Gebruik een met 22 G x 70 mm uitgeruste 1 mL spuit om 0,075 mL (3-aminopropyl)triethoxysilane te trekken en deze onmiddellijk in te spuiten in de ethanol (d.w.z. 0,05 vol %). Trek en duw de spuit meerdere malen om de binnenkant van de spuit te spoelen. Roer de oplossing met de naald om het homogeen te maken.
OPMERKING: (3-aminopropyl)triethoxysilane kan twee jaar lang bij kamertemperatuur en 1 atmdruk worden opgeslagen met een strakke afdichting. Absolute ethanol moet na gebruik goed worden afgesloten. We raden het gebruik van verlopen reagentia af. - Het afdekglas in de 0,05 vol% aminosilaneoplossing voor 1 uur bij RT uitbroeden.
- Spoel het dekglas vijf keer af met zuiver water. Bewaar het afdekglas in het zuivere water.
LET OP: Gooi het afval terug naar de aangewezen tank. - Droog elk stuk van dek glas met de lucht blow gun.
- Plaats al het gedroogde dekglas op aluminiumfolie. Bak het dekglas op de hete plaat op 80 °C gedurende 5 minuten.
- Spincoating CYTOP perfluoropolymeer
- Plaats het afdekglas op een aangepaste vacuümspuit van een spincoater(figuur 1A). Zet de vacuümschakelaar aan om het glazen substraat te bevestigen.
OPMERKING: Het ontwerp van de vacuümverrassing is cruciaal voor een uniforme coating van viskeuze polymeer op het rechthoekige (24 mm × 32 mm) en dun (0,13-0,17 mm) substraat(figuur 1A). We vonden dat een rechthoekig monster stadium met meerdere gaten (48 gaten, elk met een diameter van 1 mm) aansluiten op het vacuümkanaal werkte beter dan de ronde fase met een enkel centraal gat deed. - Drop 70-90 μL type-A CYTOP polymeer in het midden van het glazen substraat. Onmiddellijk spin-coat het polymeer (Figuur 1B).
LET OP: De spin-coating conditie (3.400 rpm, 30 s) biedt 3 μm dikte. Gebruik de micropipet ontworpen voor viskeuze vloeistof. Houd de micropipet rechtop om het polymeer te laten vallen in de buurt van perfect cirkel op het substraat. Een luchtbel wordt vaak gegenereerd in de pipet tip als de zuiger naar beneden beweegt. Laat de laatste druppel CYTOP niet met de bel vallen. - Pak het gecoate glas met vingers die hoeken van het glazen substraat vasthouden en plaats het op aluminiumfolie.
- Herhaal stap 1.3.1-1.3.3 om alle resterende stukken van het afdekglas te laten draaien.
- Bak het gecoate glas op 80 °C gedurende 30 minuten en vervolgens op 200 °C gedurende 1 uur.
LET OP: Deze verwerking geneest de CYTOP volledig en bindt de CYTOP covalent aan het glasoppervlak. Bedek het bakgebied met een deksel gemaakt van aluminiumfolie om mogelijk stof te voorkomen tijdens het lange tijd bakproces indien nodig. - Haal het met CYTOP gecoate afdekglas uit de kookplaat en koel af tot RT. Pak zorgvuldig elk stuk van het gecoate glas op en inspecteer het om te zien of het goed is gecoat. Gooi het substraat met eenhomogene coating weg.
LET OP: Het oppervlak van een mooi gecoate CYTOP moet er plat uitzien zonder onregelmatige regenboogachtige patronen(figuur 1C). Visuele inspectie vanuit een goede hoek kan snel beoordelen de vlakheid en de coating kwaliteit. Het protocol kan hier worden onderbroken.
- Plaats het afdekglas op een aangepaste vacuümspuit van een spincoater(figuur 1A). Zet de vacuümschakelaar aan om het glazen substraat te bevestigen.
- Spin-coating fotoresist
- Leg het CYTOP-gecoate afdekglas op de vacuümspuit (zie stap 1.3.1) van de spincoater. Schakel de vacuümschakelaar in om het afdekglas te bevestigen.
- Drop 0.2-0.3 mL van fotoresist in het midden van het substraat. Onmiddellijk spin-coat de fotoresist op 6.000 rpm voor 60 s.
LET OP: Laat de laatste druppel van de fotoresist niet vallen met bubbels. Als de spincoater een hogere draaisnelheid ondersteunt, kan de rotatiesnelheid oplopen tot 7.500 rpm om een dunnere coating te bereiken. De lage oppervlakte-energie van CYTOP voorkomt dat de meeste fotoresists op het oppervlak worden vastgehouden. Als AZ P4903 fotoresist niet beschikbaar is, is AZ P4620 fotoresist een goed alternatief. - Pak het gecoate substraat met twee vingers die hoeken van het substraat vasthouden. Veeg de overtollige fotoresist in de buurt van het substraat rand (vaak genoemd als rand kraal verwijderen of EBR) met behulp van een ethanol doordrenkte ruitenwisser(Figuur 1D). Plaats het substraat op de aluminiumfolie.
LET OP: Aceton wordt NIET aanbevolen voor EBR. - Herhaal stappen 1.4.1-1.4.3 om de fotoresist te laten draaien voor de overige stukken cytop-gecoate afdekglas. Pak elk stuk van het gecoate glas en inspecteer het om te zien of het goed is gecoat.
LET OP: Het oppervlak van een mooi gecoate fotoresist moet er plat uitzien zonder onregelmatige patronen(figuur 1D). Visuele inspectie vanuit een goede hoek kan snel beoordelen de vlakheid en de coating kwaliteit. Het substraat vertonen inhomogene coating kan worden gerecycled door het wassen met aceton, 2-propanol, en H2O in volgorde, en hergebruikt. - Bak het gecoate substraat 5 min op de kookplaat.
- Haal het gecoate substraat van de kookplaat en koel af tot RT. Laat staan voor 30 min bij een relatieve vochtigheid van 40%-60% voor rehydratie van de fotoresist.
LET OP: H2O is noodzakelijk voor de volgende fotochemische reactie. De gebakken fotoresist verloor de H2O inhoud in de fotoresist. Het rehydratieproces maakt het mogelijk H2O uit de lucht te absorberen. Relatieve luchtvochtigheid lager dan 20% of hoger dan 80% is niet geschikt voor het rehydratieproces.
- Fotolithografie
- Start tijdens de wachttijd van rehydratie (zie stap 1.4.6) de masker aligner op. Warm de lichtbron op. Laad het chroomfotomasker.
OPMERKING: Volg de handleiding om de masker aligner te bedienen. Het fotomasker kan worden vervaardigd via elektronenbundel (EB) lithografie als de EB-faciliteit beschikbaar is. Als alternatief kan het fotomasker worden uitbesteed aan een lokaal bedrijf. - Laad het gehydrateerde substraat (na het afwerken van stap 1.4.6) op de klem (figuur 1E).
- Belichtingsparameters instellen. Leg het substraat bloot voor 25 s met een UV-intensiteit van 13 mW/cm2 (h-line) in de vacuümcontactmodus. Laad vervolgens het substraat en zet het op het deksel glas kleuring rek (hetzelfde rek gebruikt in stap 1.1.1).
- Herhaal stap 1.5.2-1.5.3 om de resterende delen van het gehydrateerde substraat bloot te leggen.
- Start tijdens de wachttijd van rehydratie (zie stap 1.4.6) de masker aligner op. Warm de lichtbron op. Laad het chroomfotomasker.
- Ontwikkeling
- Ontwikkel het substraat gedurende 5 minuten om de blootgestelde fotoresist op te lossen (figuur 1F). Gedurende die, schud het rek in de ontwikkelaar een keer op het momentpunt van 4 minuten.
LET OP: De ontwikkelaar was AZ 300 MIF. Alternatieve alkalische ontwikkelaars (bijvoorbeeld AZ 400 K) zijn algemeen toepasbaar voor de ontwikkeling, maar moeten optimalisatie van de ontwikkelingsomstandigheden vereisen (bijvoorbeeld tijd, temperatuur, agitatie). Gebruik GEEN glazen bekers als ontwikkelaarscontainer. - Spoel het substraat tien keer af met zuiver water. Bewaar het afdekglas in het zuivere water.
OPMERKING: Gooi de ontwikkelaar terug naar de aangewezen tank. - Droog elk stukje substraat grondig met het luchtblaaspistool.
- Ontwikkel het substraat gedurende 5 minuten om de blootgestelde fotoresist op te lossen (figuur 1F). Gedurende die, schud het rek in de ontwikkelaar een keer op het momentpunt van 4 minuten.
- Reactieve ionenets
- Plaats het gedroogde substraat (vanaf stap 1.6.3) in de reactiekamer van de reactieve ionenets (RIE) machine.
OPMERKING: Volgens de onderhoudsregel van de faciliteit kan de RIE-machine altijd aan of uit de as staan. Als de schakelaar is uitgeschakeld, schakelt u de schakelaar in volgens de handleiding. - Etch de fotoresist-uncovered CYTOP met de O2 plasma (Figuur 1G).
LET OP: De RIE-toestand was als volgt. O2 gasstroom: 50 sccm; kamerdruk: 10,0 Pa; RF-vermogen: 50 W; etsen: 27 min. De etstijd werd geoptimaliseerd voor het volledig etsen van 3 μm dikte van CYTOP. - Pak elk stuk substraat uit de reactiekamer met behulp van de pincet en plaats ze op de cover glas vlekken rek.
OPMERKING: Volgens de onderhoudsregel van de faciliteit kan de2 reactiekamer een kort O 2-plasmareinigingsproces (bijvoorbeeld etstijd: 5 min) vereisen om de reactiekamer na elke run schoon te houden.
- Plaats het gedroogde substraat (vanaf stap 1.6.3) in de reactiekamer van de reactieve ionenets (RIE) machine.
- Fotoresist verwijderen en schoonmaken
- Soniceer het substraat in aceton gedurende 5 minuten bij RT om de resterende fotoresist op te lossen.
- Sonicate het substraat in 2-propanol voor 5 min op RT.
- Spoel het substraat vijf keer af met zuiver water. Soniceer het substraat gedurende 5 minuten bij RT. Spoel het monster nog vijf keer af met zuiver water. Bewaar het substraat in zuiver water.
- Droog elk stuk substraat met het luchtblaaspistool(figuur 1H).
LET OP: Het substraat kan worden opgeslagen in een plastic petrischaaltje. Het gefabriceerde substraat is bij RT gedurende ten minste één jaar structureel stabiel. Het protocol kan hier worden onderbroken. - Karakteriseer het oppervlakteprofiel van het zoals voorbereide substraat door driedimensionale (3D) laserscanning confocale microscopie, witte licht interferometrie (of coherentie scanning interferometrie), of scannen elektronenmicroscopie. Gebruik de betreffende software om de diameter en diepte van de resulterende microkamers te meten.
OPMERKING: Het monster kan worden hergebruikt voor andere experimenten na de karakterisering met de contactloze en niet-destructieve 3D-laserscannmicroscoop of witte licht interferometer. Het protocol kan hier worden onderbroken.
2. Bereiding van polydimethylsiloxaan (PDMS) microkanaal
LET OP: Draag GEEN latex handschoenen om PDMS te hanteren. Draag in plaats daarvan polyethyleen (PE) handschoenen.
- De microkanaalmaster maken
- Snijd een dubbelgecoate lijm Kapton filmtape in een gedefinieerde (3 mm x 19 mm) microkanaalvorm met behulp van een desktop cutter.
OPMERKING: De Kapton tape was no. 7602 #25 (Teraoka Seisakusho), wat resulteert in een kanaalhoogte van 135 μm. De STIKA-desktopsnijder maakt gebruik van een plug-in (beschikbaar op de Roland-website: https://www.rolanddga.com) van Adobe Illustrator om het snijden uit te voeren volgens de tekening in het Adobe Illustrator-bestand. Het protocol kan hier worden onderbroken. - Plak elke gesneden Kapton tape op de platte bodem van een petrischaaltje. De standaard petrischaal van 90 mm is geschikt voor 12 stuks tape.
OPMERKING: De reliëfstructuur dient als een meester voor de replica lijst van PDMS. Druk het tapeoppervlak voorzichtig met een pincet als er luchtbellen tussen de tape en het petrischaalsubstraat zitten. Als alternatief kan klassieke soft-lithografie worden toegepast om de meester voor te bereiden op een silicium wafer38. Het protocol kan hier worden onderbroken.
- Snijd een dubbelgecoate lijm Kapton filmtape in een gedefinieerde (3 mm x 19 mm) microkanaalvorm met behulp van een desktop cutter.
- Uitharding VAN PDMS-hars in de petrischaal met tapepatroon
- Draag nieuwe PE handschoenen, en breng 2,5 g uithardingsmiddel van SYLGARD 184 siliconen elastomeer met behulp van een wegwerp plastic pipet in de gespecificeerde plastic beker (Figuur 2A).
- Verander in nieuwe handschoenen en breng 25 g van de prepolymeerbasis van SYLGARD 184 siliconene elastomeer met behulp van een wegwerp spuit van 50 mL over in het bovenstaande plastic bekerglas.
OPMERKING: Verander de handschoenen hierin om de mogelijke kruisbesmetting van het uithardingsmiddel naar de basis te voorkomen. - Gebruik een deaeratiemixer om het mengsel te mengen en te deaereren (programma: 3 min mengen gevolgd door 2 min deaeratie).
OPMERKING: Als de deaeratiemixer niet beschikbaar is, kan een handmatig geagiteerd (voor ongeveer 15 minuten) mengsel worden ontgast in een vacuümkamer. - Giet het PDMS-mengsel in de petrischaal met tapepatroon(figuur 2B). Stel de petrischaal in een mini-vacuümkamer en deaerate het PDMS-mengsel voor 1-3 uur(figuur 2C).
OPMERKING: Als er na 1 uur lucht in het PDMS-mengsel achterblijft, haal dan de petrischaal uit de vacuümkamer, breek de luchtbel met een luchtblazer en zet de petrischaal terug in de vacuümkamer en zet het deaeratieproces voort. - Plaats de petrischaal 's nachts in een oven op 60 °C om de PDMS(figuur 2D)te genezen.
OPMERKING: Hoewel het verhogen van de temperatuur de uithardingstijd kan verkorten, is de maximale temperatuur die kan worden getolereerd door de polystyreen petrischaal zonder fysieke vervorming ongeveer 60 °C.
- Replica-lijstwerk van PDMS-kanaal
- Pel de uitgeharde PDMS-elastomer van het petrischaaltje(figuur 2E).
- Snijd elk stuk PDMS-kanaalblokken af met een platte kabelsnijder(figuur 2F).
- Plaats de PDMS elastomer op een snijmat naar boven gericht kanaal. Punch een gat aan elk uiteinde van het kanaal met behulp van een biopsie punch(Figuur 2G).
- Maak het oppervlak van het PDMS-kanaal schoon met Plakband. Wikkel vervolgens de PDMS-hars in een ander stuk plakband om het schoon te houden voor gebruik. Bewaar het geprepareerde PDMS-kanaal in een schone petrischaal.
LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken.
3. Montage van femtoliter microkamer array apparaat
- Plaats enkele stukken met water doordrenkte ruitenwissers langs de binnenwand van een petrischaaltje om een vereenvoudigde bevochtigingskamer te maken. Plaats de PDMS hars bedekt met de Scotch tape in de bevochtigingskamer en verzegel de kamer met behulp van paraffine film. Incubeer voor ten minste 3 uur, maar niet langer dan een dag.
OPMERKING: PDMS is een poreus materiaal waarmee gas over de hars39kan gaan. De poreuze structuur van PDMS leidt tot een absorptie van watermoleculen uit de omgeving tot het bereiken van een evenwicht. Deze voorbehandeling vult de poriën van PDMS met waterdamp en kan de verdamping van waterdruppels naast de rand van het PDMS-kanaal aanzienlijk onderdrukken. - Haal de plakband van de PDMS hars. Plaats het PDMS-kanaal op het microkamerarraygebied van het substraat(figuur 2H).
OPMERKING: De PDMS resin kleven reversibly aan het CYTOP oppervlak. Druk voorzichtig op het PDMS-blok met een pincet om eventuele luchtbellen tussen de PDMS-hars en het substraat te verwijderen als deze bestaat. - Plaats een 200 μL niet-gefilterde pipetpunt in één (als uitlaat) van de gaten van het PDMS-kanaal.
OPMERKING: De hechtingssterkte tussen PDMS en CYTOP is beperkt. Om fysieke vervorming van de PDMS hars en het losmaken van het PDMS-kanaal van het oppervlak te voorkomen, moet u de pipettenpunt niet te diep plaatsen.
4. Laadreactieoplossing op het geassembleerde apparaat
- Zet een aluminium microtube standaard op het ijs. Prechill de spoelolie (ASAHIKLIN AE-3000 olie gemengd met 0,1 wt % SURFLON S-386 oppervlakteactieve) in een 1,5 mL microbuis op de aluminium standaard.
- Zet nog een aluminium blok op ijs.
- Voorbereiding van de GMPPS-reactieoplossing
- Bereid de CFPS-reactieoplossing voor in een PCR-buis. Meng elke aliquot component van de CFPS kit, een verdunde template DNA (zoals hierin geïllustreerd door fluorescerende eiwit mNeonGreen40 en Escherichia coli alkalische fosfatase41) oplossing, en andere noodzakelijke componenten volgens de specifieke behoeften (bijvoorbeeld RNase remmer, fluorogeen substraat, chaperonne).
OPMERKING: Het sjabloon-DNA dat voor CFPS wordt gebruikt, moet worden bereid volgens de instructies van de bijbehorende CFPS-kit. Deze demonstratie paste een T7-gebaseerd expressiesysteemtoe 42. Omdat het reagensverbruik in het FemDA-apparaat vrij klein is, is 10 μL groot genoeg om het hele PDMS-kanaal te vullen. - Meng voor mNeonGreen fluorescerende eiwitsynthese de componenten in de volgende volgorde: voeg 2,7 μL nuclease-vrij H2O toe aan een 6 μL aliquot van oplossing A (uit de CFPS-kit); voeg 0,3 μL RNase-remmer toe; voeg 1,5 μL verdunde sjabloon-DNA-oplossing toe; meng en breng het mengsel kort over naar een 4,5 μL aliquot van oplossing B (uit de CFPS-kit).
LET OP: Het totale volume is 15 μL. Aangezien de hoeveelheid van elke aliquot evenredig is met het totale volume van het uiteindelijke mengsel, kan een totaal volume van minder dan 10 μL resulteren in een veel te klein volume (< 0,2 μL) van sommige componenten aliquot. - Voor alkalische fosforfosfatasesynthese, meng de componenten in de volgende volgorde: voeg 1,2 μL H2O tot 6 μL oplossing A toe; voeg 0,3 μL RNase-remmer toe; voeg 0,6 μL disulfide binding enhancer 1 en 2 (uit een kit); voeg 0,3 μL 5 mM 6,8-difluoro-4-methylumbelliferylfosfaat (DiFMUP) toe; voeg 1,5 μL DNA-oplossing toe; meng en breng het mengsel kort over op 4,5 μL oplossing B.
OPMERKING: In de test van alkalische fosforfosfatase kan het fluorogene substraat DiFMUP zeer fluorescerend 6,8-difluor-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU) produceren op enzymatische decolleté van de terminale fosfaatgroep.
- Bereid de CFPS-reactieoplossing voor in een PCR-buis. Meng elke aliquot component van de CFPS kit, een verdunde template DNA (zoals hierin geïllustreerd door fluorescerende eiwit mNeonGreen40 en Escherichia coli alkalische fosfatase41) oplossing, en andere noodzakelijke componenten volgens de specifieke behoeften (bijvoorbeeld RNase remmer, fluorogeen substraat, chaperonne).
- Stel 10 μL van het mengsel op met behulp van een 200 μL niet-gefilterde pipetpunt. Plaats de pipettepunt in het inlaatgat (zie stap 3.3) van het PDMS-kanaal. Duw naar beneden op de zuiger om de oplossing te injecteren naar het kanaal totdat het overstroomt van de uitlaat (waar een andere pipet tip is al ingevoegd bij stap 3.3).
- Scheid de pipet van de pipetpunt en houd deze twee pipettetips nog steeds in de inlaat en uitlaat gestoken.
OPMERKING: Vermijd het genereren van luchtbellen tijdens het leidingen. Laat de duim niet van de zuiger achter totdat u de pipet van de pipetpunt scheidt om de terugstroom van de oplossing in het PDMS-kanaal te voorkomen.
5. Het genereren van femtoliter droplet array (FemDA) voor CFPS
- Breng de hele set van het geassembleerde apparaat over naar het voorgekoelde aluminiumblok (zie stap 4.2). Bevestig zorgvuldig dat het arraygebied microkamer snel verandert van doorschijnend (figuur 2I) naar transparant (figuur 2J).
OPMERKING: De CFPS-reactieoplossing kan niet rechtstreeks in de microkamers komen. De oplosbaarheid van lucht in water is omgekeerd in verhouding tot de temperatuur. De gevangen lucht lost op in de oplossing nadat het apparaat van RT naar de lage temperatuur is verplaatst. De transparantieverandering is een handige visuele indicator om te beoordelen of de oplossing in de microkamers terechtkomt. - Teken 30 μL van de voorgekoelde spoelolie (zie stap 4.1) en breng de olie onmiddellijk in de inlaatingebrachte pipetpunt van de bovenste opening. De spoelolie beweegt zich in het kanaal en extrudeert de overtollige reactieoplossing buiten de microkamers. Elke microkamer wordt geïsoleerd door de spoelolie.
OPMERKING: De bewegende interface tussen de reactieoplossing en de spoelolie is zichtbaar, wat de mensen helpt om de beweging van de vloeistof in het kanaal te observeren. De geëxtrudeerde oplossing kan worden verzameld in de vorige buis, opgeslagen bij 4 °C, en hergebruikt voor een ander FemDA-apparaat of een parallelle bulkreactie (in de microbuis of een microtiterplaat). - Pre-draw 30 μL afdichtingsolie (Fomblin Y25) tot een 200 μL gefilterde pipetpunt. Hang de pipet ergens rechtop.
- Verwijder tegelijkertijd de twee ingebrachte pipettips (zie de stappen 3.3 en 4.4) van het apparaat. Verplaats het apparaat onmiddellijk van het aluminium blok naar parafilm.
OPMERKING: Gebruik een pincet om het apparaat op het aluminiumblok vast te stellen (maar blijf uit de buurt van het kanaalgebied) tijdens de periode van het verwijderen van de pipettips. - Steek onmiddellijk de kant-en-klare pipetpunt met de afdichtingsolie (zie stap 5.3) in de inlaat van het PDMS-kanaal en injecteer de olie in het kanaal totdat deze uit de uitlaat overstroomt.
OPMERKING: Voer deze stap uit zodra u het apparaat naar RT verplaatst. Om de terugstroom in het kanaal te voorkomen, laat u de duim niet van de zuiger achter totdat de afdichtingsolie uit de uitlaat stroomt. De spoelolie verdampt onmiddellijk na het bewegen uit de uitlaat van het kanaal, terwijl de volgende afdichtingsolie zich ophoopt in de uitlaat vanwege het extreem lage verdampingsverlies. - Scheid de pipet van de pipetpunt en verwijder vervolgens de pipetpunt van het apparaat. Reinig het PDMS-oppervlak met een stuk van de ruitenwisser en breng vervolgens een nieuwe druppel afdichtingsolie aan op respectievelijk de inlaat en uitlaat. De femtoliter druppels worden in individuele microkamers verzegeld door de olie.
OPMERKING: Gebruik een pincet om het PDMS-kanaal op het substraat vast te stellen (maar weg te houden van het kanaalgebied) tijdens de periode van het verwijderen van de micropipet-tip. - Veeg het vocht dat zich op het onderste oppervlak van het afdekglas ophoopt. Het as-prepared FemDA-apparaat is nu klaar voor incubatie en microscopiebeeldvorming.
6. Microscopie beeldvorming
- Start een omgekeerde fluorescentiemicroscoop. Wacht op de stabilisatie (koeling) van de camera. Gebruik een 60x of 100x olie onderdompeling objectieve lens. Zet het FemDA-apparaat op het gemotoriseerde podium. Stel de beeldvormingsparameters in.
OPMERKING: De beeldvormingsparameters omvatten het bestandspad, beeldkanalen, filters, belichtingstijden (in het algemeen is 100 ms voldoende; kortere of langere tijd is ook mogelijk volgens de specificatie van de camera) en lichtintensiteit. - Zoek het brandpuntsvlak. Pas de z-aspositie van de objectieve lens aan en bevestig het brandpuntsvlak met behulp van een intern autofocussysteem. Stel het interessegebied in (ROI; d.w.z. x, y-as) om te worden afgebeeld.
OPMERKING: De grote microscoopfabrikanten (Nikon, Olympus, Zeiss, Leica) bieden allemaal de mogelijkheid om het autofocussysteem met de microscoop te integreren. Dit autofocussysteem is nodig om het brandpuntsvlak constant te houden tijdens de automatische weergave van meerdere gebieden. De ROI's bestrijken het FemDA-gebied in het PDMS-kanaal. - Leg de fluorescentiebeelden vast. Leg één frame vast van een gedefocuseerd BF-beeld (Bright-Field) voor elke ROI. Wijzig de volgorde en de coördinaten van de ROI's NIET bij het beeldvorming van de verschillende kanalen.
7. Beeldgegevensanalyse
OPMERKING: Analyseer de beeldgegevens met behulp van een zelfgemaakte plug-in (genaamd "FemDA") op basis van Fiji (http://fiji.sc) om de fluorescentieintensiteit van elke druppel43te extraheren. Installeer de juiste versie van Fiji volgens het besturingssysteem. Fiji ondersteunt de meeste beeldbestandsformaten (bijvoorbeeld het nd2-bestand van Nikon microscope, czi-bestand van Zeiss microscoop) met behulp van een ingebouwde plugin "Bio-Formats."
- Installatie van plug-ins
- Kopieer en plak het plug-in-bestand (dat beschikbaar is na onderzoek naar de betreffende auteur of via de volgende institutionele link: https://fbox.jamstec.go.jp/public/FcsQwAsMKIqA9j0B2MJwLUMeHGsxp09hAkAFdVhQIDkZ) in fiji's "plugins" map.
- Start de Fiji-software; de plugin "FemDA" is te vinden in de drop-down menu "Plugins" van Fiji.
- Voorverwerking van afbeeldingsgegevens
- Open de gedefocuseerde BF-afbeelding (zie stap 6.3). Klik op Proces | Achtergrond aftrekken... het verwijderen van vloeiende doorlopende achtergronden van elk frame van de afbeeldingsgegevens(figuur 4B). Klik op Proces | Filters | Mediaan om de ruis van elk frame van de beeldgegevens te verminderen(figuur 4C).
- Klik op Afbeelding | Aanpassen | Drempel om de voorgrond (met vermelding van de microkamers) te controleren en te scheiden van de achtergrond (met vermelding van het gebied buiten de microkamers) van elk frame van de beeldgegevens (vergrootvosels in figuur 4A-C).
OPMERKING: Selecteer een goed algoritme uit de vervolgkeuzelijst in het venster Drempel, zodat alleen de microkamergebieden, evenals de randen van elke microkamer, als voorgrond kunnen worden geïdentificeerd en gemarkeerd. In het bijzonder moeten de meeste gemarkeerde randen continu zijn zonder hiaten.
- Druppelcoördcoördinatenbepaling
- Klik op Plug-ins | FemDA | FemDA Analysis om de grafische gebruikersinterface (GUI) van de aangepaste plugin (bovenste helft van figuur 4D)te openen.
- Voer het geschatte minimum- en maximumaantal pixels van één microkamer in. Voer de verwachte minimale en maximale circulariteit (0: willekeurige vorm; 1: perfecte cirkel) van de microkamers. Voer het framenummer van het startframe en het eindframe in.
- Klik op ROI genereren op de GUI om elke microkamer te detecteren en de met succes gedetecteerde ROI's worden weergegeven in een ROITablevoor pop-upvenster.
- Ga terug naar het venster FemDA Analysis en klik op de knop Roi-masker toepassen om te controleren of de microkamers over de frames correct zijn gedetecteerd (linksonder van figuur 4D). Als dit niet het gaat, wijzigt u een aantal van deze gegevens en herhaal u op Het genereren van ROI en het masker ROI toepassen. Zo ja, ga dan naar de volgende stap.
OPMERKING: Er kunnen zeer weinig microkamers zijn die niet goed kunnen worden geïdentificeerd als de ROI (zie de onderste helft van figuur 4D)door een algoritme van de drempel vanwege het onvoldoende contrast tussen de voorgrond en de achtergrond. Het is niet problematisch in het statistische oogpunt.
- Fluorescentieintensiteit extractie
- Open het fluorescentiebeeld en breng het naar voren. Klik nogmaals op ROI-masker toepassen om de bepaalde ROI's toe te passen op de fluorescentieafbeelding (rechtsonder van figuur 4D).
- Selecteer one-shot voor het analyseren van een eindpuntafbeelding (zoals geïllustreerd met de mNeonGreen-gegevens) of Time-Lapse voor het analyseren van een tijdsloopgegevens (zoals geïllustreerd met de alkalische fosfatasegegevens).
- Invoer 100 in het vak Aantal toppixels betekent dat alleen de bovenste 100 pixels van elke ROI worden gebruikt om de gemiddelde intensiteit van de bijbehorende druppel te berekenen. Als invoer 0 in het aantal toppixelswordt gebruikt, worden alle pixels van elke ROI gebruikt om de gemiddelde intensiteit van de bijbehorende druppel te berekenen.
OPMERKING: Er kan een afwijking van meerdere pixels tussen de BF en de fluorescentie beelden, wat betekent dat sommige pixels binnen de ROI's kunnen behoren tot de achtergrond van de fluorescentie beeld. Daarom biedt de plug-in een optie om het aantal pixels met de hoogste intensiteit te specificeren voor de berekening van de gemiddelde intensiteit van elke druppel. - Voor de analyse van de eindpuntafbeelding (d.w.z. selecteert u One-Shot bij stap 7.4.2), klikt u op de knop Intensiteit meten om de gemiddelde intensiteit van alle gedetecteerde druppels te berekenen. De ROITable wordt bijgewerkt met de nieuwe gegevens uit de fluorescentieafbeelding. Ondertussen wordt een histogram weergegeven in een nieuw pop-upvenster Histogram (Figuur 4E).
OPMERKING: Als u de opslaglocatiegrootte in het vak Bin Number wijzigt, kan de weergave van het histogram worden geoptimaliseerd. Een aanpassing aan een som gaussian distributies kan in de ontwikkelde GUI worden verwezenlijkt. Het pop-uplogvenster van Fiji geeft de passende resultaten weer. U de gegevens exporteren door op de knop op te slaan als tekst en verschillende statistische analyses uit te voeren met andere software(figuur 4F, G). - Voor de analyse van de tijdscursusafbeelding (d.w.z. selecteer Time-Lapse bij stap 7.4.2) is het pop-upvenster Intensity Time Course in plaats van Histogram, dat een histogram bevat dat overeenkomt met een specifiek tijdspunt en een tijdsintensiteitsplot(figuur 5). De tekstuele gegevens kunnen ook worden geëxporteerd via het menu Bestand van het pop-upvenster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het microfabricageproces bestaat uit substraatreiniging, oppervlaktefunctionalisatie, CYTOP-coating, fotolithografie, droge etsen, fotoresisten strippen en uiteindelijke reiniging. Belangrijk is dat het gepresenteerde protocol volledige verwijdering van het hydrofobe CYTOP-polymeer in de microkamers figuur 3Amogelijk liet , waardoor een zeer parallelle hydrofiele hydrofiele-in-hydrofobe structuur op een standaard afdekglassubstraat werd geproduceerd. Met behulp van het olieafdichtingsprotocol werd de uniforme dimensie van de resulterende druppels gecontroleerd door fluorescerende oplossing in de microkamers(figuur 3B)in te kapselen. De fluorescentie intensiteit gewonnen met behulp van de ontwikkelde software is een goede indicator van de druppelgrootte. Het CV van de fluorescentieintensiteit, 3%, weerspiegelde de smalle verdeling van de druppelgrootte over de gehele array(figuur 3C). Het gereconstrueerde 3D-beeld van confocale microscopie toonde ook het consistente druppelvolume in de loop van de tijd (figuur 3D, aanvullende film 1)44. Ter vergelijking, een veel gebruikte FC-40 olie gegenereerd de druppels vertonen een severalfold verschil in de fluorescentie intensiteit45. De gevormde druppels in FemDA waren stabiel op RT voor ten minste 24 uur(Figuur 3E). De hoge kwaliteit van de druppels vormde uiteindelijk de basis van kwantitatieve meting.
Gegevens met een hoge doorvoer moeten tools voor het analyseren van gegevens met een hoge doorvoer gebruiken46,47. De ontwikkelde plugin sterk vereenvoudigd en versneld de beeldgegevens analyse. Op basis van de theorie van digitale beeldverwerking48kan het gedefocuste BF-beeld worden binarized en gebruikt om de coördinateninformatie van elke druppel na achtergrondcorrectie en ruisonderdrukking te verstrekken (figuur 4A-C). Dit idee maakte de precieze lokalisatie van donkere druppels mogelijk.
Het fluorescerende eiwit mNeonGreen werd gesynthetiseerd in FemDA. Template DNA met een concentratie van 0,05 moleculen per druppel werd willekeurig verdeeld in elke druppel om de eiwitsynthese te starten met gekoppelde celvrije transcriptie- en vertaalreacties. Omdat het gemiddelde aantal DNA-moleculen per druppel kleiner was dan 1, bevatten sommige druppeltjes nul sjabloon-DNA, terwijl andere een of meer DNA-moleculen bevatten. Na 6 uur incubatie bij RT werd het eindpuntbeeld vastgelegd met behulp van de microscoop. De stack beeldgegevens werd geanalyseerd door de ontwikkelde software met behulp van de gelijktijdige onscherpe BF beeld (Figuur 4A-E). De fluorescentieintensiteit van elke druppel is een maat voor de eiwitopbrengst in de overeenkomstige druppel. Het histogram van de fluorescentieintensiteiten toonde een discrete verdeling en werd goed uitgerust door een som Gaussische verdelingen van gelijke piek-naar-piekintervallen(figuur 4F), die sterk een bezetting van verschillende aantallen DNA-moleculen per druppel suggereerden. Vergelijkbaar met de herhaalde munt-flipping spel, het aantal onafhankelijke willekeurige gebeurtenissen die zich voordoen is wiskundig beschreven door de Poisson distributie. De waarschijnlijkheid van het optreden van druppels met verschillende getallen (tot 3 in dit voorbeeld) van DNA-moleculen paste perfect bij een Poisson-verdeling (P = e-λ • λk / k!, waar λ is het verwachte gemiddelde aantal DNA-moleculen per druppel en k is het werkelijke aantal DNA-moleculen in een druppel) met een gemiddelde van 0,05 DNA-moleculen per druppel (Figuur 4G)31, zoals verwacht voor een willekeurige verdeling van DNA-moleculen. Omdat de laadconcentratie van de template DNA-oplossing hetzelfde was als de uiteindelijke λ (d.w.z. 0,05), was de CFPS-reactie-efficiëntie in onze FemDA 100% (of bijna 100%). Met andere woorden, een enkel DNA-molecuul is voldoende om de CFPS-reactie in de femtoliterdruppel efficiënt te activeren.
De CFPS-reactie van alkalisch fosfor werd elke 5 minuten geregistreerd. De ontwikkelde software ondersteunt ook het analyseren van de tijdsloopgegevens(figuur 5). De gekoppelde fluorogene reactie vertoonde een vergelijkbare discrete verdeling van de fluorescentieintensiteit van de druppels op eerdere tijdstippen. De histogram resultaten controleerden ook een bezetting van verschillende aantallen DNA-moleculen in de druppel. De fluorescentieintensiteit kwam uiteindelijk samen met de geleidelijke uitputting van het fluorgene substraat DiFMUP samen met de geleidelijke uitputting van het fluorgene substraat DiFMUP.
Figuur 1: Microfabricageproces van het ultrahoge microkamermicrostraat. (A) Technische tekening van de aangepaste vacuümklain. Eenheid: mm. (B) CYTOP filmdikte vs. spin snelheid gegevens. (C) Spincoating van het perfluorpolymeer CYTOP op een gesilarmiseerd glazen substraat. De foto's toonden een goed voorbeeld van homogene coating en een slecht voorbeeld van inhomogene coating, respectievelijk. De zwarte pijl gaf de specifieke positie van de inhomogene CYTOP film aan. (D) Spincoating van fotoresist op het substraat met CYTOP-coating. Na de spincoating moet de fotoresist in de buurt van de substraatrand worden verwijderd met behulp van een met ethanol doordrenkte ruitenwisser (middelste foto). De foto's toonden een goed voorbeeld van homogene coating en een slecht voorbeeld van inhomogene coating, respectievelijk. De witte pijl wees op de specifieke positie van de inhomogene fotoresistische film. (E) Blootstelling van de gecoate fotoresist met behulp van een masker aligner. (F) Ontwikkeling van de blootgestelde fotoresist in een ontwikkelaar. Het blootgestelde deel van de fotoresist is oplosbaar in de ontwikkelaarsoplossing. (G) Reactieve ionenets van CYTOP. De onbedekte CYTOP werd verwijderd door O2 plasma. (H) Verwijdering van het fotoresistenmasker. De fotoresist werd verwijderd door aceton. Het substraat werd gereinigd met behulp van 2-propanol en H2O. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Voorbereiding en gebruik van het microkamerarrayapparaat. aA) Het wegwegen van het uithardingsmiddel en het voorpolymeer van PDMS. (B) Gieten van de gemengde en gedeaereerde mengsel in een tape-patroon Petri schotel. Er waren een aantal nieuw gegenereerde luchtbellen in het polymeer mengsel. (C) Het mengsel opnieuw in een vacuümkamer ontluchten. De luchtbellen stegen en barstten op het bovenoppervlak. (D) De gedeaereerde en genezen PDMS hars. (E) Peeling uit de genezen PDMS elastomeren uit de Petri schotel. (F) Het afsnijden van elk stuk PDMS-kanaalblokken met behulp van een flat-cable cutter. (G) Ponsen gaten aan elk uiteinde van het PDMS-kanaal met behulp van een biopsie punch. (H) De geassembleerde inrichting. De PDMS-hars kan zich aan het CYTOP-oppervlak hechten. (I)Doorschijnende microkamerarrayruimte in het PDMS-kanaal dat met de waterige oplossing is gevuld voordat deze wordt gekoeld. (J) Transparant microkamerarraygebied in het PDMS-kanaal na het koelen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Ultra-uniforme en ultrastalre femtoliterdruppels. (A) 3D-laser scanning confocale microscopie beeldvorming voor het gefabriceerde substraat. De cilindrische microkamers in het voorbeeldbeeld toonden een hoogte van 3 μm en een diameter van 4 μm. (B) Uniforme femtoliterdruppels over een groot gebied van de vlakke array. Slechts een gedeeltelijk gebied van de gehele array werd hierin getoond. In elke druppel werd een fluorescerende oplossing (10 μM ATTO-514) verzegeld. (C) De grootteverdeling van de druppels over een volledige enkele array. De fluorescentieintensiteit werd gebruikt als indicator van de druppelgrootte. Het CV was slechts 3%. (D) Volumetrische meting aan de hand van confocale z-stack tijd-cursusgegevens. Het volume van druppels over de array werd gegeven door de microscoop software (NOS-Elements, Nikon). (E) Fluorescentie herstel na fotobleaching. Na het eerste frame werden verschillende druppels volledig gefotobleekt met behulp van een beperkte laserstraal van een confocale microscoop. Hun fluorescentieintensiteit werd geregistreerd voor 24 uur, en geen fluorescentie herstel werd waargenomen (rode lijn). De fluorescentie intensiteit van andere niet-gefotobleached druppels in hetzelfde gezichtsveld werd opgenomen in de zwarte lijn. Fout balken (doorschijnende kleuren) waren 1 SD voor elke time-point. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Analyseprocedure van de eindpuntmicroscopische beeldgegevens. Het gedefocuste beeld werd gebruikt om de coördinaat van elke microkamer/druppels te extraheren. Op basis van het intensiteitsverschil tussen de rand van microkamers (als voorgrond) en andere gebieden (als achtergrond), kan de continue en bijna-cirkelvormige rand uit de achtergrond worden gehaald. Vanwege de ongelijke achtergrondverdeling over het gezichtsveld(A)is een afbeeldingsvoorverwerking over het algemeen nodig om de kwaliteit van de binariserende uitvoer te verbeteren. Na het aftrekken van de achtergrond (B), werd de achtergrond van elk frame geüniformeerd. Empirisch gezien was de invoerwaarde in de "Rolling ball radius" (stap 1) 20-50 voor 2048 pixel × 2048 pixel beelden en 10-20 voor 512 pixel × 512 pixel beelden. Hoe groter de waarde, hoe korter de verwerkingstijd. Als u de ruis in de afgetrokken afbeelding op de achtergrond wilt verminderen, past u een mediaanfilter toe op de afbeelding(C). Over het algemeen was de invoerwaarde in de straal (stap 3) 1-2 pixels. Zoals weergegeven in de vergrote insert, kan de achtergrond-afgetrokken en gefilterde afbeelding mooi worden binarized met behulp van de ingebouwde drempel plugin, zodat de voorgrond die overeenkomt met de randen en het gebied van belangen (ROIs) nauwkeurig kan worden herkend. De ROIs detectie voor alle frames van het beeld werd uitgevoerd met behulp van de geïnstalleerde zelfgemaakte plugin FemDA Analysis (D). De pixelgrootte (stappen 5 en 6) en circulariteit (stappen 7 en 8) van ROI's, de frames die we in de berekening willen stoppen (stappen 9 en 10) zijn handmatig gedefinieerd op basis van de werkelijke gegevens. Na het klikken op Roi genereren (stap 11) en wachten, werd de coördinaten van elke ROI voor de invoerframes bepaald. Na het klikken op het masker ROI toepassen (stap 12), werd elke gedetecteerde ROI ingesloten en gemarkeerd door een gele lijn. Nadat u de fluorescentieafbeelding had geopend en opnieuw op het ROI-masker toepassen klikt, werd het bepaalde ROIs-masker toegepast op de fluorescentieafbeelding. Het aantal toppixels (stap 14) specificeerde het aantal pixels met de hoogste intensiteit van elke ROI voor de berekening van de gemiddelde intensiteit van de respectieve druppels. Na het klikken op De intensiteit van de meten (stap 15) en wachten, werd het histogram gegenereerd (E). Het histogram kan worden uitgerust met een som Gaussische distributies met behulp van de parameters die beschikbaar zijn in het histogramvenster. Als alternatief kunnen de gemiddelde intensiteitsgegevens worden geëxporteerd naar een tekstbestand (stap 16) en geanalyseerd door andere software(F). (G) De kans op het optreden van druppels met verschillende aantallen DNA-moleculen in de gegeven array. Het histogram (grijze kleur) werd mooi gemonteerd door een Poisson-verdeling (rode stippellijn) met een gemiddelde van 0,05 DNA-moleculen per druppel, zoals verwacht voor een willekeurige verdeling van DNA-moleculen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Analyse van de tijdscursus microscopische beeldgegevens. De gedetecteerde ROI's (volgens de stappen 1-12 van figuur 4)werden rechtstreeks toegepast op de tijdsloopgegevens. Selecteer in stap 13 van figuur 4 Time-lapse en voer het werkelijke tijdsinterval (in minuten) tussen aangrenzende frames in tijdsinterval [min]in . Na het klikken op De intensiteit van de meting (stap 15 van figuur 4)en wachten, werden de tijdsintensiteitsplot en het histogram (hetzelfde als figuur 4E)gegenereerd. De Hist-positie specificeerde het tijdstip van het histogram, dat werd weergegeven als een verticale rode lijn. De plugin ondersteunt ook het opgeven van kleuren voor elke tracelijn. Geel: 0 DNA; blauw was 1 DNA; rood: 2 DNA; zwart: 3 DNA. De tijdsloopgegevens kunnen ook worden geëxporteerd naar een tekstbestand. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende film 1. Klik hier om deze film te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De zeer kwantitatieve meting op basis van de zeer uniforme, stabiele en biocompatibele druppels in FemDA maakte de discrete distributie mogelijk, het unieke kenmerk van onze studie die verschilt van andere. We hebben de processen voor microfabricage en druppelvorming systematisch geoptimaliseerd en gedetailleerd in dit document. Er zijn verschillende kritieke stappen in het vastgestelde protocol.
Ten eerste bepaalt de uniforme coating van zeer viskeuze CYTOP-polymeer op het rechthoekige dunne glazen substraat grotendeels de kwaliteit van het resulterende substraat. Gezien de over het algemeen korte werkafstand van de objectieve lens met hoge vergrotingen (zie stap 6.1) moet het dunne afdekglas worden gebruikt. Een hoogwaardige spincoating op een dun en flexibel substraat is over het algemeen lastig. We hebben nog niet alle mogelijke ontwerpen getest, maar hebben ontdekt dat de multi-hole vacuüm chuck met dezelfde rechthoekige dimensie goed werkte voor de spin-coating. Het is belangrijk om het CYTOP-polymeer in het midden van het afdekglasubstraat te laten vallen en onmiddellijk te beginnen met de spincoating (zie stap 1.3.2). De moeilijkheidsgraad is minder gerelateerd aan de vorm van het substraat, maar de viscositeit van het polymeer. De CYTOP productlijn biedt verschillende concentraties van het commercieel verkrijgbaar pakket. Het bijbehorende verdunningsmiddel in de verpakking kan ook worden gebruikt om het oorspronkelijke product indien nodig tot een lagere viscositeit te verdunnen. CYTOP 816 dat we gebruikten in het experiment is het commerciële product met de hoogste concentratie die in staat is om het polymeer stabiel op te lossen in het oplosmiddel. De dikkere coating vereist een lagere rotatiesnelheid of meerdere rondes van coating en uitharding. Een plot van karakteristieke dikte versus spin snelheid curve is sterk aanbevolen bij het gebruik van een nieuwe spin coater in een nieuwe omgeving.
Ten tweede is de juiste vochtigheid van de cleanroom cruciaal voor ideale fotolithografie en de volledige verwijdering van de fotoresist op de opgegeven positie. De fotochemische reactie in fotolithografie gebruikt H2O als een van de reactanten. Echter, de softbake bij de temperatuur hoger dan de kooktemperatuur van H2O verwijdert H2O gehalte uit de gecoate fotoresist. De "gedroogde" fotoresist moet de tijd nemen om H2O weer uit de lucht te absorberen (zie stap 1.4.6). Dit punt wordt vaak over het hoofd gezien. Gezien het feit dat veel laboratoria slechts een aantal vereenvoudigde cleanroom faciliteiten zonder vochtigheid controle hebben, zou de vochtigheid drastisch fluctueren over het seizoen of worden beïnvloed door het weer. Een goedkope oplossing is het gebruik van een huis-gebruik bevochtiger of ontvochtiger in de cleanroom. De volledig belichte CYTOP-laag na de ontwikkeling kan selectief en volledig worden verwijderd door RIE, waardoor de glazen bodem volledig wordt blootgelegd. Uiteindelijk is de hybride structuur van de hydrofiele glazen bodem en de hydrofobe CYTOP zijwand belangrijk voor het stabiel vangen van waterige oplossing voor de femtoliter ruimte.
Ten derde, de nieuw gevonden oliën (ASAHIKLIN AE-3000, Fomblin Y25) en oppervlakteactieve stoffen (SURFLON S-386) toonde ongekende afdichting prestaties voor de fluoropolymeer reactor13. De injectie van de spoelolie moet worden uitgevoerd op het gekoelde platte metalen blok (zie stap 5.2); anders kunnen druppels in de buurt van de inlaat van het kanaal niet worden gevormd. De injectie van de tweede afdichtingsolie kan worden uitgevoerd bij RT (zie stap 5.5). Deze oliën en oppervlakteactieve stoffen zijn nog nooit eerder gebruikt in biologisch onderzoek. Er zijn voorlopig geen betere alternatieven gevonden. Om het arsenaal van de nuttige combinatie van oliën en oppervlakteactieve stoffen voor druppelbereiding uit te breiden, zijn het nieuwe lid van de oliën (of dergelijke in dezelfde productlijn) en de oppervlakteactieve stoffen (of soortgelijke in dezelfde productlijn) het waard om te proberen te worden toegepast in microfluïde druppelsystemen.
Hier zijn twee extra punten op te merken. Een daarvan is het feit dat er een vertraging is onder ROI's tijdens de microscopie beeldvorming. De totale beeldtijd voor één cyclus is voornamelijk afhankelijk van de arraygrootte en de vergroting van de objectieve lens. De belichtingstijd, sluitertijd, en de bewegende snelheid van de gemotoriseerde fase zijn ook kleine factoren. Als vuistregel, imaging 106 druppels op 60 × vergroting zou ten minste vereisen 10-20 minuten. Deze onvermijdelijke vertraging introduceert een aantal fouten in de gegevensanalyse, die altijd zorgvuldig in overweging moeten worden genomen. De andere is het feit dat het totale aantal druppels op een enkel substraat niet hoger zou zijn dan 108–109,zelfs het verhogen van de dichtheid van de druppels of het verminderen van de individuele grootte van de druppel. Dit komt omdat de grootte van het glazen substraat dat kan worden behandeld door het masker aligner (voor 4-inch wafers) is beperkt. Een verdere verhoging van de grootte van het afdekglas is niet aan te bevelen omdat een groot, dun en breekbaar glazen substraat moeilijk te hanteren is.
FemDA kan worden beschouwd als een super geminiaturiseerde microtiterplaat. Alle biochemische reacties die zijn uitgevoerd in 96-well microtiterplaten kunnen worden geprobeerd uit te voeren met behulp van FemDA. Het kan zeker worden gebruikt voor enzym activiteit meting zonder ingewikkelde eiwitzuivering. Het kan ook compatibel zijn met digitale polymerase kettingreactie (digitale PCR) en digitale enzym-gekoppelde immunosorbent test (digitale ELISA)31,49. Het kleine volume, de grote array en de hoge stabiliteit zouden enkele voordelen opleveren ten opzichte van bestaande digitale bioassay-methoden. Het FemDA-systeem dat in staat is om verschillende aantallen sjabloon-DNA-moleculen in femtoliterdruppels op te lossen, heeft al de kracht getoond van nauwkeurige eiwitscreening13. FemDA is een nieuw in vitro compartimenteringssysteem dat in staat is om een verscheidenheid aan enzymen snel te ontwikkelen. Met de vooruitgang in bio-informatica en bibliotheek bouwtechnieken, het tijdperk van een snelle on-demand creatie van high-performance eiwitten zal zeker komen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door JSPS KAKENHI subsidienummer JP18K14260 en het budget van Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology. Wij danken Shigeru Deguchi (JAMSTEC) en Tetsuro Ikuta (JAMSTEC) voor het leveren van de karakteriseringsfaciliteiten. Wij danken Ken Takai (JAMSTEC) voor commerciële software ondersteuning. De microfabricage werd uitgevoerd op Takeda Sentanchi Supercleanroom, de Universiteit van Tokio, ondersteund door "Nanotechnology Platform Program" van het Ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie (MEXT), Japan, Grant Number JPP09F19UT0087.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
| 2-propanol | Kanto Chemical | EL grade | EL: for electronic use. |
| 3D laser scanning confocal microscope | Lasertec | OPTELICS HYBRID | Other similar microscopes (e.g., Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) are also applicable. |
| 50 mL syringe | Terumo | SS-50LZ | |
| 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate | Thermo Fisher Scientific | D6567 | Prepare a 5 mM stock solution in dimethyl sulfoxide |
| Acetone | Kanto Chemical | EL grade | EL: for electronic use. Purity 99.8%. |
| Air blower | Hozan | Z-263 | |
| Aluminum block | BIO-BIK | AB-24M-02 | |
| Aluminum microtube stand | BIO-BIK | AB-136C | |
| ASAHIKLIN AE-3000 | AGC | (Test sample) | Free test sample may be available upon inquiry to AGC. |
| BEMCOT PS-2 wiper | Ozu | 028208 | |
| Biopsy punch with plunger | Kai | BPP-10F | |
| Cover glass | Matsunami Glass | No. 1 (24 mm × 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness) | Size-customized. |
| Cover glass staining rack | Nakayama | 803-131-11 | |
| CRECIA TechnoWipe clean wiper | Nippon Paper Crecia | C100-M | |
| Cutting mat | GE Healthcare | WB100020 | |
| CYTOP | AGC | CTL-816AP | |
| Deaeration mixer | Thinky | AR-100 | |
| Desktop cutter | Roland | STIKA SV-8 | |
| Developer | AZ Electronic Materials | AZ 300 MIF | AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. Other alkaline developers may be also applicable but should require optimization of development conditions (time, temperature, etc.) |
| Double-coated adhesive Kapton film tape | Teraoka Seisakusho | 7602 #25 | |
| Ethanol | Kanto Chemical | EL grade | EL: for electronic use. Purity 99.5%. |
| Fiji | Version: ImageJ 1.51n | ||
| Flat-cable cutter | Tokyo-IDEAL | MT-0100 | |
| Fomblin oil | Solvay | Y25, or Y25/6 | Free test sample may be available upon inquiry to Solvay. Fomblin Y25/6 is an alternative if Y25 is not readily available. |
| Hot plate | AS ONE | TH-900 | |
| Injection needle | Terumo | NN-2270C | 22G × 70 mm |
| Inverted fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | Epifluorescence specification, CCD or sCMOS camera, motorized stage, autofocus system, and high NA objective lens are required. |
| KaleidaGraph | Synergy | Version: 4.5 | |
| Mask aligner | SUSS | MA-6 | Other mask aligners are also applicable as long as the vacuum contact mode is avaliable. |
| MICROMAN pipette | GILSON | E M250E | Capillary piston tip: CP250 |
| Microsoft Excel | Microsoft | Version: 16.16.15 | |
| Mini vacuum chamber | AS ONE | MVP-100MV | |
| Nuclease-free water | NIPPON GENE | 316-90101 | |
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| PCR tube | NIPPON Genetics | FG-021D/SP | |
| Petri dish | AS ONE | GD90-15 | Diameter 90 mm, height 15 mm. |
| Photoresist | AZ Electronic Materials | AZ P4903 | AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. AZ P4620 is an alternative. |
| Plate reader | BioTek | POWERSCAN HT | |
| Polyethelene gloves | AS ONE | 6-896-02 | Trade name: Saniment. |
| PURExpress in vitro protein synthesis kit | New England Biolabs | E6800S or E6800L | For cell-free protein synthesis reaction. |
| Reactive-ion etching system | Samco | RIE-10NR | Other RIE systems are also applicable but should require optimization of RIE conditions (gas flow rate, chamber pressure, RF power, etching time, etc.) |
| RNase inhibitor | New England Biolabs | M0314S | |
| Scotch tape | 3M | 810-1-18D | |
| Sodium hydroxide solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 194-09575 | 8 M concentration; danger. |
| Spin coater | Oshigane | SC-308 | |
| SURFLON S-386 surfactant | AGC | (Test sample) | Free test sample may be available upon inquiry to AGC. |
| SYLGARD 184 silicone elastomer | Dow | Sylgard184 | Chemical composition: polydimethylsiloxane. The default mixing ratio is base : curing agent = 10 : 1 (m/m). |
| Tweezers | Ideal-tek | 2WF.SA.1 2A |
|
| Ultrasonic cleaner | AS ONE | ASU-2M | |
| Vacuum chuck | Oshigane | (Customized) | Material: delrin; rectangular sample stage with multiple holes (48 holes, each with 1 mm diameter); the size is customzied to fit the size of the cover glass (24 mm × 32 mm). |
References
- Chiu, D. T., Lorenz, R. M., Jeffries, G. D. M. Droplets for ultrasmall-volume analysis. Analytical Chemistry. 81 (13), 5111-5118 (2009).
- Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77 (3), 977-1026 (2005).
- Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. Droplet microfluidics for high-throughput biological assays. Lab on a Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).
- Zhu, P. A., Wang, L. Q. Passive and active droplet generation with microfluidics: a review. Lab on a Chip. 17 (1), 34-75 (2017).
- Griffiths, A. D., Tawfik, D. S. Miniaturising the laboratory in emulsion droplets. Trends in Biotechnology. 24 (9), 395-402 (2006).
- Tran, T. M., Lan, F., Thompson, C. S., Abate, A. R. From tubes to drops: droplet-based microfluidics for ultrahigh-throughput biology. Journal of Physics D: Applied Physics. 46 (11), 114004 (2013).
- Zhang, Y., Jiang, X. Microfluidic tools for DNA analysis. DNA Nanotechnology. Fan, C. , Springer. Heidelberg. 113-153 (2013).
- Dubuc, E., et al. Cell-free microcompartmentalised transcription-translation for the prototyping of synthetic communication networks. Current Opinion in Biotechnology. 58, 72-80 (2019).
- Damiati, S., Mhanna, R., Kodzius, R., Ehmoser, E. K. Cell-free approaches in synthetic biology utilizing microfluidics. Genes. 9 (3), (2018).
- Lee, K. H., Kim, D. M. Applications of cell-free protein synthesis in synthetic biology: Interfacing bio-machinery with synthetic environments. Biotechnology Journal. 8 (11), 1292-1300 (2013).
- Supramaniam, P., Ces, O., Salehi-Reyhani, A. Microfluidics for artificial life: techniques for bottom-up synthetic biology. Micromachines. 10 (5), (2019).
- Bowman, E. K., Alper, H. S. Microdroplet-assisted screening of biomolecule production for metabolic engineering applications. Trends in Biotechnology. , (2019).
- Zhang, Y., et al. Accurate high-throughput screening based on digital protein synthesis in a massively parallel femtoliter droplet array. Science Advances. 5 (8), 8185 (2019).
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. , (2019).
- Sakane, Y., Suzuki, Y., Kasagi, N. The development of a high-performance perfluorinated polymer electret and its application to micro power generation. Journal of Micromechanics and Microengineering. 18 (10), 104011 (2008).
- Sakakihara, S., Araki, S., Iino, R., Noji, H. A single-molecule enzymatic assay in a directly accessible femtoliter droplet array. Lab on a Chip. 10 (24), 3355-3362 (2010).
- Watanabe, R., et al. Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity. Nature Communications. 5, 4519 (2014).
- Chiu, C., Lisicka-Skrzek, E., Tait, R. N., Berini, P. Fabrication of surface plasmon waveguides and devices in Cytop with integrated microfluidic channels. Journal of Vacuum Science & Technology B. 28 (4), 729-735 (2010).
- Krupin, O., Asiri, H., Wang, C., Tait, R. N., Berini, P. Biosensing using straight long-range surface plasmon waveguides. Optics Express. 21 (1), 698-709 (2013).
- Hanada, Y., Ogawa, T., Koike, K., Sugioka, K. Making the invisible visible: a microfluidic chip using a low refractive index polymer. Lab on a Chip. 16 (13), 2481-2486 (2016).
- Berry, S., Kedzierski, J., Abedian, B. Low voltage electrowetting using thin fluoroploymer films. Journal of Colloid and Interface Science. 303 (2), 517-524 (2006).
- Lin, Y. Y., et al. Low voltage electrowetting-on-dielectric platform using multi-layer insulators. Sensors and Actuators B-Chemical. 150 (1), 465-470 (2010).
- Kimura, H., Yamamoto, T., Sakai, H., Sakai, Y., Fujii, T. An integrated microfluidic system for long-term perfusion culture and on-line monitoring of intestinal tissue models. Lab on a Chip. 8 (5), 741-746 (2008).
- Yang, T. J., Choo, J., Stavrakis, S., de Mello, A. Fluoropolymer-coated PDMS microfluidic devices for application in organic synthesis. Chemistry-a European Journal. 24 (46), 12078-12083 (2018).
- de Gennes, P. G. Wetting: statics and dynamics. Reviews of Modern Physics. 57 (3), 827-863 (1985).
- Holtze, C., et al. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a Chip. 8 (10), 1632-1639 (2008).
- Wagner, O., et al. Biocompatible fluorinated polyglycerols for droplet microfluidics as an alternative to PEG-based copolymer surfactants. Lab on a Chip. 16 (1), 65-69 (2016).
- Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, D. A., van Oijen, A. M. Droplet microfluidics: a tool for biology, chemistry and nanotechnology. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 82, 118-125 (2016).
- Mazutis, L., et al. Droplet-based microfluidic systems for high-throughput single DNA molecule isothermal amplification and analysis. Analytical Chemistry. 81 (12), 4813-4821 (2009).
- Galinis, R., et al. DNA nanoparticles for improved protein synthesis in vitro. Angewandte Chemie-International Edition. 55 (9), 3120-3123 (2016).
- Zhang, Y., Noji, H. Digital bioassays: theory, applications, and perspectives. Analytical Chemistry. 89 (1), 92-101 (2017).
- Mazutis, L., et al. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nature Protocols. 8 (5), 870-891 (2013).
- Courtois, F., et al. An integrated device for monitoring time-dependent in vitro expression from single genes in picolitre droplets. ChemBioChem. 9 (3), 439-446 (2008).
- Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
- Agresti, J. J., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4004-4009 (2010).
- Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab on a Chip. 12 (5), 882-891 (2012).
- Duncombe, T. A., Dittrich, P. S. Droplet barcoding: tracking mobile micro-reactors for high-throughput biology. Current Opinion in Biotechnology. 60, 205-212 (2019).
- Qin, D., Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
- Mukhopadhyay, R. When PDMS isn't the best. Analytical Chemistry. 79 (9), 3248-3253 (2007).
- Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nature Methods. 10 (5), 407-409 (2013).
- Bradshaw, R. A., et al. Amino acid sequence of Escherichia coli alkaline phosphatase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (6), 3473-3477 (1981).
- Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Mantilla, C. B., Prakash, Y. S., Sieck, G. C. Volume measurements in confocal microscopy. Techniques in Confocal Microscopy. Conn, P. M. , Academic Press. Oxford, UK. 143-162 (2010).
- Noji, H. Single-molecule counting of biomolecules with femtoliter dropret chamber array. The 17th International Conference on Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems (TRANSDUCERS & EUROSENSORS XXVII. , 630-632 (2013).
- Zhang, Y., et al. Matrix-localization for fast analysis of arrayed microfluidic immunoassays. Analytical Methods. 4 (10), 3466-3470 (2012).
- Zhang, Y., et al. Two dimensional barcode-inspired automatic analysis for arrayed microfluidic immunoassays. Biomicrofluidics. 7 (3), 034110 (2013).
- Gonzalez, R. C., Woods, R. E. Digital image processing. , Pearson. New York, NY. (2018).
- Cohen, L., Walt, D. R. Single-molecule arrays for protein and nucleic acid analysis. Annual Review of Analytical Chemistry. 10 (1), 345-363 (2017).
