Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

En femtoliter droplet array for massivt parallell proteinsyntese fra enkelt DNA molekyler

Published: June 20, 2020 doi: 10.3791/60945
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3
1SUGAR Program, X-star, Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC), 2Center for Mathematical Science and Advanced Technology, Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC), 3Deep-Sea Nanoscience Research Group, Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC)

Summary

Det overordnede målet med protokollen er å forberede over en million bestilte, ensartede, stabile og biokompatible femtoliterdråper på et 1 cm2 planar substrat som kan brukes til cellefri proteinsyntese.

Abstract

Fremskritt innen romlig oppløsning og deteksjonsfølsomhet for vitenskapelig instrumentering gjør det mulig å bruke små reaktorer for biologisk og kjemisk forskning. For å møte etterspørselen etter mikroreaktorer med høy ytelse utviklet vi en femtoliterdråpearray (FemDA) og eksemplifiserte applikasjonen i massivt parallelle cellefrie proteinsyntese (CFPS) reaksjoner. Over en million ensartede dråper ble lett generert innenfor et fingerstørrelsesområde ved hjelp av en to-trinns oljeforseglingsprotokoll. Hver dråpe ble forankret i et femtoliter mikrokammer bestående av en hydrofil bunn og en hydrofob sidevegg. Den hybride hydrofile-i-hydrofobe strukturen og de dedikerte tetningsoljer og overflateaktive midler er avgjørende for å stikke femtoliter vandig løsning i femtoliter plass uten fordampningstap. Femtoliterkonfigurasjonen og den enkle strukturen til FemDA-enheten tillot minimalt reagensforbruk. Den ensartede dimensjonen til dråpereaktorene gjorde store kvantitative og tidskursmålinger overbevisende og pålitelige. FemDA-teknologien korrelerte proteinutbyttet til CFPS-reaksjonen med antall DNA-molekyler i hver dråpe. Vi strømlinjeformet prosedyrene om mikrofabrikasjon av enheten, dannelsen av femtoliterdråpene og oppkjøpet og analysen av mikroskopiske bildedata. Den detaljerte protokollen med den optimaliserte lave driftskostnaden gjør FemDA-teknologien tilgjengelig for alle som har standard renromsfasiliteter og et konvensjonelt fluorescensmikroskop på sitt eget sted.

Introduction

Forskere bruker reaktorer for å utføre bio/ kjemiske reaksjoner. Det er gjort betydelige anstrengelser for å redusere størrelsen på reaktoren og øke eksperimentell gjennomstrømning for å redusere reagensforbruket samtidig som arbeidseffektiviteten forbedres. Begge aspektene tar sikte på å frigjøre forskere fra en tung arbeidsbelastning, redusere kostnadene og fremskynde forskning og utvikling. Vi har et klart historisk veikart om utviklingen av reaktorteknologiene fra synspunktet til reaksjonsvolumer og gjennomstrømning: enkeltbeger/kolbe/reagensrør, milliliter rør, mikroliter rør, mikroliter 8-rørsstrimler, mikroliter 96/384/1536-brønn plate, og mikrofluidisk nanoliter / picoliter / femtoliter reaktorer1,2,3,4,5,6,7. Analogt med nedbemanning av funksjonsstørrelsen på transistorer på integrerte kretsbrikker i halvlederindustrien de siste tiårene, går bio / kjemiske mikroreaktorer gjennom volumreduksjon og systemintegrasjon. Slike småskala verktøy har hatt en dyp innvirkning på cellebasert eller cellefri syntetisk biologi, biomanufacturing, og høy gjennomstrømning prototyping og screening8,,9,10,,11,12. Dette papiret beskriver vår nylige innsats på utviklingen av en unik dråpe array teknologi og demonstrerer sin anvendelse i CFPS13,en grunnleggende teknologi for syntetisk biologi og molekylær screening samfunn14. Spesielt tilbyr vi med vilje en optimalisert og rimelig protokoll for å gjøre FemDA-enheten tilgjengelig for alle. Den rimelige og lett-å-håndtere protokollen for miniatyrisert enhet ville bidra til pedagogiske formål universiteter og bidra til å spre teknologien.

FemDA forbereder femtoliter dråper med en ultrahøy tetthet på 106 per 1 cm2 på et planar glass substrat. Vi belagt en hydrofob polymer, CYTOP15,på glasssubstratet og selektivt etset (fjernet) CYTOP ved forhåndsdefinerte posisjoner for å generere et mikrokammerarray på substratet. Dermed består det resulterende mikrokammeret av en hydrofob sidevegg (CYTOP) og en hydrofil bunn (glass). Når sekvensielt strømmer vann og olje over den mønstrede overflaten, kan vannet bli fanget og forseglet i mikrokamrene. Den hydrofile-i-hydrofobe strukturen er avgjørende for å avvise vann utenfor mikrokamrene, isolere individuelle mikroreaktorer og beholde en liten vandig løsning inne i femtoliterrommet. Den unike egenskapen ble vellykket søkt om fremstilling av vann-i-olje dråper og lipid bilayer mikrokompartments16,17. Sammenlignet med prototypeenheten16,optimaliserte vi først mikrofabrikasjonsprosessen for å realisere en fullstendig fjerning av CYTOP-polymeren, samt en full eksponering av glassbunnen. CYTOP er en spesiell fluoropolymer med ekstremt lav overflatespenning (19 mN/m) lavere enn for konvensjonelle mikroreaktormaterialer som glass, plast og silikon. Den gode optiske, elektriske og kjemiske ytelsen er allerede benyttet i overflatebehandling av mikrofluidiske enheter18,,19,,20,,21,,22,,23,,24. I FemDA-systemet, for å oppnå god fukting av oljen på CYTOP-overflaten, må overflatespenningen til oljen være lavere enn den av den faste overflaten25. Ellers har væskeoljen i kontakt med den faste overflaten en tendens til å bli sfærisk i stedet for å spre seg over overflaten. Dessuten fant vi at noen populære perfluorokarbonoljer (f.eks. 3M FC-40)16 og hydrofluoroetheroljer (f.eks. 3M Novec-serien) kan oppløse CYTOP som følge av den amorfe morfologien til CYTOP, som er dødelig for kvantitativ måling og ville være tvilsom når det gjelder krysskontaminering blant dråper. Heldigvis identifiserte vi en biokompatibel og miljøvennlig oljeutpeende lavere (< 19 mN/m) overflatespenning13. Vi fant også et nytt overflateaktivt middel som kan oppløses i den valgte oljen og fungere i lav konsentrasjon (0,1%, minst 10 ganger lavere enn tidligere rapportert populære26,27)13. Det resulterende vann-/oljegrensesnittet kan stabiliseres av overflateaktivt middel. På grunn av oljens høye fordampningshastighet, etter spylingen med oljen, brukte vi en annen biokompatibel og miljøvennlig olje for å erstatte den første til å forsegle mikrokamrene. Vi kaller den første oljen (ASAHIKLIN AE-3000 med 0,1 wt % SURFLON S-386) "flush oil" og den andre oljen (Fomblin Y25) henholdsvis "tetningsolje".

Den to-trinns oljeforseglingsstrategien kan realisere en robust dannelse av femtoliterdråpearrayet i løpet av minutter og uten sofistikert instrumentering. På grunn av fordampningsproblemet har det vært ansett som utfordrende å generere mikroreaktorer mindre enn picolitervolumer28. FemDA tok opp dette problemet ved systematisk å optimalisere materialene og prosessene som brukes til fremstilling av mikroreaktorer/dråper. Flere bemerkelsesverdige trekk ved de resulterende dråpene inkluderer høy ensartethet (eller monodispersitet), stabilitet og biokompatibilitet på femtoliterskalaen. Variasjonskoeffisienten (CV) av dråpevolumet er bare 3 % (uten vignetter korreksjon for mikroskopiske bilder), den minste CV-en blant dråpeplattformer i verden, noe som sikrer en svært parallell og kvantitativ måling. Femtoliterdråpen er stabil i minst 24 timer uten krysskontaminering blant dråper ved romtemperatur, noe som er verdifullt for en pålitelig tidskursmåling. Når det gjelder biokompatibilitet, lyktes vi i å syntetisere ulike proteiner fra en enkeltkopi mal DNA i femtoliter dråpe, som tidligere hadde vært ansett som vanskelig eller ineffektiv29,30. Det ville være verdig å belyse hvorfor noen proteiner som er i stand til å bli syntetisert i FemDA kan ikke syntetiseres i andre dråpesystemer. FemDA var ikke bare et teknisk fremskritt, men innså også en enestående kvantitativ måling som kan korrelere proteinutbyttet (som gjenspeiles av fluorescensintensiteten til dråpene) til antall mal-DNA-molekyler i hver dråpe. Som et resultat viste histogrammet av fluorescensintensiteten av dråper fra FemDA-baserte CFPS en diskret fordeling som kan monteres pent av en sum av gaussiske distribusjoner av like topp-til-topp intervaller. Videre var sannsynligheten for forekomst av dråper som inneholder forskjellige antall DNA-molekyler en perfekt passform til en Poisson-fordeling31. Dermed kan det forskjellige proteinutbyttet i hver dråpe normaliseres basert på den diskrete fordelingen. Denne kritiske funksjonen gjør det mulig for oss å skille den enzymatiske aktivitetsinformasjonen fra den tilsynelatende intensiteten, som ikke har vært tilgjengelig med andre mikroreaktorplattformer ennå. Eksisterende mikrofluidiske celle / dråpesorteringssystemer er dyktige i helautomatisk sortering og god til å konsentrere prøver, men noen ganger kan bare sende ut et relativt bredt eller langhalet histogram i det analytiske aspektet32,33. Vårt svært kvantitative og biokompatibele FemDA-system setter en ny standard og en høy analytisk standard innen mikroreaktorutvikling.

Oljer og tensider som kan brukes til fremstilling av dråper er fortsatt svært begrenset34. Kombinasjonen av ASAHIKLIN AE-3000 og SURFLON S-386 etablert i FemDA er et nytt medlem av det voksende arsenalet av det fysiokjemiske grensesnittet mellom den vandige fasen og oljefasen13. Det nye grensesnittet i FemDA er fysisk stabilt, kjemisk inert, og biologisk kompatibel med komplekse transkripsjon, oversettelse, og post-translasjonelle modifisering maskiner for mange typer proteiner13. Det ville være ganske attraktivt å finne et protein som ikke kan syntetiseres i dråpeinnstillingene i stedet. Dessuten er kostnadsbesparelsen av reagenser tydeligere i femtoliterdråpesystemet enn det i nanoliter- og picoliterreaktorsystemer35,36. Spesielt vil det ofte være et stort dødt volum, som hovedsakelig skyldes rør eller eksterne forsyninger, i mikrofluidiske dråpegenereringssystemer, men ikke i vår FemDA. Matriseformatet favoriseres også av gjentatt og detaljert mikroskopisk karakterisering (ligner på såkalt analyse av høyt innhold) for hver enkelt reaktor37, i stedet for bare et enkelt øyeblikksbilde for et objekt i rask bevegelse. Femtoliterskalaen gjorde det mulig å integrere over en million reaktorer på et fingerstørrelsesområde, mens samme antall nanoliterreaktorer (hvis den eksisterer) krever over kvadratmeterområdet, noe som utvilsomt ville være upraktisk å produsere eller bruke et slikt system.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Mikrofabrikasjon av femtoliter mikrokammer array substrat

MERK: Utfør følgende mikrofabrikasjonseksperiment i et renrom. Bruk hansker og en renromsdress før du går inn i renrommet.

  1. Rengjøringsdeksel glass substrat
    1. Sett dekkglasset på et dekkglassfargestativ. Soniker dekkglasset i 8 M natriumhydroksid (NaOH) i 15 min ved romtemperatur (RT).
      FORSIKTIG: NaOH i høye konsentrasjoner er svært farlig for hud og øye. Håndter den forsiktig uten sprut.
    2. Ta stativet ut av NaOH-oppløsningen og skyll dekkglasset med vann i ti ganger. Hold dekkglasset i rent vann.
      MERK: Kast alkalisk avfall til den angitte tanken. NaOH-løsningen kan resirkuleres til den originale flasken og brukes i opptil fem ganger.
    3. Tørk hvert kolleglass med en luftblåpistol.
    4. Stek det tørkede dekkglasset på en kokeplate ved 200 °C i 5 min. Hold orienteringen til oversiden av glasssubstratet konsistent under følgende håndteringsprosesser.
  2. Silanisering av glassoverflaten
    1. Tilbakestill det rengjorte dekkglasset på et tørt fargestativ.
    2. Tilsett 150 ml etanol i et PTFE-beger. Bruk en kanyle (22 G x 70 mm) utstyrt 1 ml sprøyte til å tegne 0,075 ml (3-aminopropyl)triethoxysilane og injiser den umiddelbart til etanol (dvs. 0,05 vol %). Trekk og skyv sprøyten flere ganger for å skylle innsiden av sprøyten. Rør løsningen med nålen for å gjøre den homogen.
      MERK: (3-aminopropyl)triethoxysilane kan lagres ved romtemperatur og 1 atm trykk i to år med en tett forsegling. Absolutt etanol bør tett forsegles etter bruk. Vi anbefaler ikke å bruke utløpte reagenser.
    3. Inkuber dekkglasset i 0,05 vol % aminosilane-oppløsningen i 1 timer ved RT.
    4. Skyll dekkglasset med rent vann i fem ganger. Hold dekkglasset i rent vann.
      MERK: Kast avfallet på den angitte tanken.
    5. Tørk hvert kolleglass med luftblåpistolen.
    6. Plasser alt tørket dekkglass på aluminiumsfolie. Stek dekkglasset på kokeplaten ved 80 °C i 5 min.
  3. Spin-belegg CYTOP perfluoropolymer
    1. Plasser dekkglasset på en tilpasset vakuumkaster på en spin coater (Figur 1A). Slå på vakuumbryteren for å fikse glasssubstratet.
      MERK: Utformingen av vakuum chuck er avgjørende for et jevnt belegg av viskøs polymer på rektangulær (24 mm × 32 mm) og tynn (0,13-0,17 mm) substrat (Figur 1A). Vi fant at et rektangulært prøvetrinn med flere hull (48 hull, hver med 1 mm diameter) som koblet til vakuumkanalen fungerte bedre enn det runde stadiet med et enkelt sentralt hull gjorde.
    2. Slipp 70-90 μL av type-A CYTOP polymer i midten av glasssubstratet. Umiddelbart spin-coat polymeren (Figur 1B).
      MERK: Spin-coating tilstand (3400 rpm, 30 s) gir 3 μm tykkelse. Bruk mikropipetten som er konstruert for viskøs væske. Hold mikropipetten oppreist for å få polymeren til å slippe nesten perfekt sirkel på underlaget. En luftboble genereres ofte inne i pipettespissen når stempelet beveger seg nedover. Ikke slipp den siste dråpen av CYTOP med boblen.
    3. Plukk opp det belagte glasset med fingrene som holder hjørner av glasssubstratet, og plasser det på aluminiumsfolie.
    4. Gjenta trinn 1.3.1-1.3.3 for å spinne alle de resterende delene av dekkglasset.
    5. Stek det belagte glasset ved 80 °C i 30 min og deretter ved 200 °C i 1 time.
      MERK: Denne behandlingen herder CYTOP og binder CYTOP til glassoverflaten. Dekk bakeområdet med et lokk laget av aluminiumsfolie for å unngå potensiell støv under den lange bakeprosessen om nødvendig.
    6. Fjern det CYTOP-belagte dekselglasset fra kokeplaten og avkjøl deg til RT. Plukk forsiktig opp hvert stykke av det belagte glasset og inspiser det for å se om det er riktig belagt. Kast underlaget som viser inhomogent belegg.
      MERK: Overflaten på en pent belagt CYTOP skal se flat ut uten uregelmessige regnbuelignende mønstre (Figur 1C). Visuell inspeksjon fra en riktig vinkel kan raskt bedømme flatheten samt beleggkvaliteten. Protokollen kan settes på pause her.
  4. Fotoresist med spinbelegg
    1. Plasser det CYTOP-belagte dekselglasset på vakuumkasteren (se trinn 1.3.1) på spincoaten. Slå på vakuumbryteren for å feste dekkglasset.
    2. Slipp 0,2-0,3 ml fotoresist i midten av underlaget. Umiddelbart spin-coat photoresist på 6000 rpm for 60 s.
      MERK: Ikke slipp den siste dråpen av fotoresisten med bobler. Hvis spin coater støtter høyere spinnhastighet, kan spin-hastigheten være opptil 7500 rpm for å oppnå et tynnere belegg. Den lave overflateenergien til CYTOP forhindrer at de fleste fotoresistene blir festet til overflaten. Hvis AZ P4903 fotoresist ikke er tilgjengelig, er AZ P4620 fotoresist et godt alternativ.
    3. Plukk opp det belagte substratet med to fingre som holder hjørner av underlaget. Tørk av overflødig fotoresist nær substratkanten (ofte kalt kantperlefjerning eller EBR) ved hjelp av en etanol-gjennomvåt ren vindusvisker (Figur 1D). Plasser underlaget på aluminiumsfolien.
      MERK: Aceton anbefales IKKE for EBR.
    4. Gjenta trinn 1.4.1-1.4.3 for å spinne fotoresist for de resterende delene av CYTOP-belagt dekkglass. Plukk opp hver del av det belagte glasset og inspiser det for å se om det er riktig belagt.
      MERK: Overflaten på en pent belagt fotoresist skal se flat ut uten uregelmessige mønstre (Figur 1D). Visuell inspeksjon fra en riktig vinkel kan raskt bedømme flatheten samt beleggkvaliteten. Underlaget som viser inhomogent belegg kan resirkuleres gjennom vasking med aceton, 2-propanol og H2O i rekkefølge, og gjenbrukes.
    5. Stek det belagte substratet ved 110 °C i 5 min på kokeplaten.
    6. Fjern det belagte substratet fra kokeplaten og avkjøl til RT. La stå i 30 min ved en relativ fuktighet på 40%-60% for rehydrering av fotoresist.
      MERK: H2O er nødvendig for følgende fotokjemiske reaksjon. Den bakte fotoresisten mistet H2O-innholdet inne i fotoresisten. Rehydreringsprosessen gjør at H2O kan absorberes fra luften. Relativ fuktighet lavere enn 20% eller høyere enn 80% er ikke egnet for rehydreringsprosessen.
  5. Fotolithografi
    1. I løpet av ventetiden for rehydrering (se trinn 1.4.6), start opp maskejusteren. Varm opp lyskilden. Last krom fotomaske.
      MERK: Følg bruksanvisningen for å betjene maskejusteren. Fotomasken kan fremstilles via elektronstråle (EB) litografi hvis EB-anlegget er tilgjengelig. Alternativt kan fotomasken outsources til et lokalt selskap.
    2. Legg den rehydrerte underlaget (etter endt trinn 1.4.6) på chucken (Figur 1E).
    3. Angi eksponeringsparametere. Utsett underlaget i 25 s med en UV-intensitet på 13 mW/cm2 (h-line) i vakuumkontaktmodus. Deretter losser du underlaget og setter det på glassfargestativet (det samme stativet som ble brukt i trinn 1.1.1).
    4. Gjenta trinn 1.5.2-1.5.3 for å eksponere de gjenværende delene av det rehydrerte underlaget.
  6. Utvikling
    1. Utvikle substratet i 5 min for å oppløse den eksponerte fotoresist (Figur 1F). Der rist forsiktig stativet i utvikleren en gang på tidspunktet på 4 minutt.
      MERK: Utvikleren var AZ 300 MIF. Alternative alkaliske utviklere (f.eks. AZ 400 K) gjelder vanligvis for utviklingen, men bør kreve optimalisering av utviklingsforhold (f.eks. tid, temperatur, agitasjon). IKKE bruk glassbeger som utviklerbeholder.
    2. Skyll underlaget med rent vann i ti ganger. Hold dekkglasset i rent vann.
      MERK: Kast utvikleren til den angitte tanken.
    3. Tørk grundig hvert stykke substrat med luftblåspistolen.
  7. Reaktiv-ion etsing
    1. Plasser det tørkede substratet (fra trinn 1.6.3) i reaksjonskammeret til den reaktive ionetsetingsmaskinen (RIE).
      MERK: I henhold til vedlikeholdsregelen til anlegget kan RIE-maskinen enten alltid være på eller slått av hver gang. Hvis bryteren var slått av, slår du på bryteren i henhold til håndboken.
    2. Etse fotoresist-avdekket CYTOP med O2 plasma (Figur 1G).
      MERK: RIE-tilstanden var som følger. O2 gass strømningshastighet: 50 sccm; kammertrykk: 10,0 Pa; RF-effekt: 50 W; etsetid: 27 min. Etsingtiden ble optimalisert for fullstendig etsing av 3 μm tykkelse av CYTOP.
    3. Plukk opp hvert stykke substrat fra reaksjonskammeret ved hjelp av pinsett og plasser dem på dekselet glass farging rack.
      MERK: I henhold til vedlikeholdsregelen til anlegget, kan reaksjonskammeret kreve en kort O2 plasmarengjøringsprosess (f.eks. etsing tid: 5 min) for å holde reaksjonskammeret rent etter hver kjøring.
  8. Fjerne fotoresist og rengjøring
    1. Sonicate substratet i aceton i 5 min ved RT for å oppløse de resterende fotoresist.
    2. Sonicate substratet i 2-propanol i 5 min ved RT.
    3. Skyll underlaget med rent vann i fem ganger. Soniker substratet i 5 min ved RT. Skyll prøven med rent vann i ytterligere fem ganger. Hold underlaget i rent vann.
    4. Tørk hvert stykke substrat med luftblåspistolen (Figur 1H).
      MERK: Underlaget kan lagres i en plast petriskål. Det fabrikkerte substratet er strukturelt stabilt ved RT i minst ett år. Protokollen kan settes på pause her.
    5. Karakterisere overflateprofilen til det as-preparerte substratet ved tredimensjonal (3D) laserskanning konkarosell mikroskopi, hvitt lys interferometry (eller sammenheng skanning interferometry), eller skanning elektron mikroskopi. Bruk den respektive programvaren til å måle diameteren og dybden på de resulterende mikrokamrene.
      MERK: Prøven kan brukes på nytt for andre eksperimenter etter karakteriseringen med ikke-kontakt og ikke-destruktiv 3D-laserskanning konfuofocal mikroskop eller hvitt lys interferometer. Protokollen kan settes på pause her.

2. Utarbeidelse av polydimetylsiloxane (PDMS) mikrokanal

MERK: BRUK IKKE latekshansker for å håndtere PDMS. Bruk i stedet polyetylen (PE) hansker.

  1. Gjør mikrokanalmesteren
    1. Klipp en dobbeltdraslet kapton filmtape i en definert (3 mm x 19 mm) mikrokanalform ved hjelp av en stasjonær kutter.
      MERK: Kapton-båndet var #25 nr. STIKA-skrivebordskutteren bruker en plugin (tilgjengelig fra Roland-nettstedet: https://www.rolanddga.com) av Adobe Illustrator til å kjøre skjæringen i henhold til tegningen i Adobe Illustrator-filen. Protokollen kan settes på pause her.
    2. Stikk hver kutt Kapton tape på den flate bunnen av en Petri parabolen. Standard 90 mm Petriskål har plass til 12 stykker av båndet.
      MERK: Reliefstrukturen fungerer som en mester for replikastøping av PDMS. Trykk forsiktig på tapeoverflaten med en pinsett hvis det er noen luftbobler klemt mellom tapen og petriskålen. Alternativt kan klassisk myk-litografi brukes til å forberede mesteren på en silisium wafer38. Protokollen kan settes på pause her.
  2. Herding PDMS harpiks i tape-mønstret Petri parabolen
    1. Bruk nye PE-hansker, og overfør 2,5 g herdemiddel av SYLGARD 184 silikonelekta ved hjelp av en engangs plastpipette til det angitte plastbegeret (Figur 2A).
    2. Bytt til nye hansker, og overfør 25 g av prepolymerbasen til SYLGARD 184 silikonelekta med en engangssprøyte på 50 ml til det oversiktsglasset.
      MERK: Bytt hanskene her for å hindre at du kan krysskontaminere herdes til basen.
    3. Bruk en deaerasjonsmikser til å blande og deaerate blandingen (program: 3 min blanding etterfulgt av 2 min deaeration).
      MERK: Hvis deaerasjonsmikseren ikke er tilgjengelig, kan en manuelt opphisset (i ca. 15 min) blanding avgasses i et vakuumkammer.
    4. Hell PDMS-blandingen i den tapemønstrede petriskålen (figur 2B). Sett petriskålen i et minivakuumkammer og deaerate PDMS-blandingen i 1-3 timer (Figur 2C).
      MERK: Hvis det forblir luft i PDMS-blandingen etter 1 time, ta petriskålen ut av vakuumkammeret, bryte luftboblen ved hjelp av en luftblåser, og sett deretter petriskålen tilbake i vakuumkammeret og fortsett avluftingsprosessen.
    5. Plasser petriskålen i en ovn ved 60 °C over natten for å kurere PDMS (figur 2D).
      MERK: Selv om det å øke temperaturen kan forkorte herdetiden, er den maksimale temperaturen som kan tolereres av polystyren Petriskål uten fysisk deformasjon ca. 60 °C.
  3. Replikastøping av PDMS-kanal
    1. Fjern den herdede PDMS-elastomeren fra petriskålen (figur 2E).
    2. Klipp av hver del av PDMS-kanalblokker ved hjelp av en flat (Figur 2F).
    3. Plasser PDMS-elastomeren på en skjærematte vendt mot kanalsiden opp. Slå et hull i hver ende av kanalen ved hjelp av en biopsi punch (Figur 2G).
    4. Rengjør overflaten på PDMS-kanalen med scotch tape. Pakk deretter PDMS-harpiksen i et annet stykke scotch tape for å holde den ren før bruk. Oppbevar den tilberedte PDMS-kanalen i en ren petriskål.
      MERK: Protokollen kan settes på pause her.

3. Montering av femtoliter mikrokammer array enhet

  1. Legg noen biter av vann-gjennomvåt rene vindusviskere langs innsiden av en Petri parabolen for å lage et forenklet fuktingskammer. Plasser PDMS-harpiksen dekket av scotch-båndet i fuktingskammeret og forsegle kammeret ved hjelp av parafinfilm. Inkuber i minst 3 timer, men ikke lenger enn en dag.
    MERK: PDMS er et porøs materiale som gjør at gass kan passere over harpiksen39. Den porøse strukturen til PDMS fører til en absorpsjon av vannmolekyler fra omgivelsene til de når en likevekt. Denne pre-behandlingen fyller porene av PDMS med vanndamp og kan betydelig undertrykke fordampning av vandige dråper ved siden av kanten av PDMS-kanalen.
  2. Ta scotch tape av PDMS harpiks. Plasser PDMS-kanalen på mikrokammerarrayområdet i underlaget (figur 2H).
    MERK: PDMS-harpiksen holder seg reversibel til CYTOP-overflaten. Trykk forsiktig på PDMS-blokken med en pinsett for å fjerne eventuelle luftbobler mellom PDMS-harpiksen og underlaget hvis det finnes.
  3. Sett inn en pipettespiss på 200 μL til én (som utløp) på hullene i PDMS-kanalen.
    MERK: Vedheftstyrken mellom PDMS og CYTOP er begrenset. For å unngå fysisk deformasjon av PDMS-harpiksen samt løsrivelse av PDMS-kanalen av overflaten, må du ikke sette pipettespissen for dypt inn.

4. Laste reaksjonsløsning på den monterte enheten

  1. Sett et mikrorørstativ i aluminium på isen. Før spyleoljen (ASAHIKLIN AE-3000 olje blandet med 0,1 wt % SURFLON S-386 overflateaktivt middel) i et 1,5 ml mikrorør på aluminiumsstativet.
  2. Sett en annen aluminiumblokk på is.
  3. Utarbeidelse av CFPS reaksjonsløsning
    1. Forbered CFPS-reaksjonsløsningen i et PCR-rør. Bland hver aliquot komponent av CFPS kit, en fortynnet mal DNA (som eksemplifisert heri av fluorescerende protein mNeonGreen40 og Escherichia coli alkalisk fosfatase41) løsning, og andre nødvendige komponenter i henhold til de spesifikke behovene (f.eks RNase hemmere, fluorgen substrat, chaperone).
      MERK: Mal-DNA som brukes for CFPS må tilberedes i henhold til instruksjonen fra det tilsvarende CFPS-settet. Denne demonstrasjonen brukte et T7-basert uttrykkssystem42. Fordi reagensforbruket i FemDA-enheten er ganske liten, er 10 μL stort nok til å fylle hele PDMS-kanalen.
    2. For mNeonGreen fluorescerende proteinsyntese, bland komponentene i følgende rekkefølge: tilsett 2,7 μL kjernefri H2O til en 6 μL aliquot av oppløsning A (fra CFPS-settet); tilsett 0,3 μL RNase-hemmer; legge til 1,5 μL fortynnet mal DNA-løsning; bland og overfør blandingen til en 4,5 μL aliquot av løsning B (fra CFPS-settet).
      MERK: Det totale volumet er 15 μL. Siden mengden av hvert aliquot er proporsjonalt med det totale volumet av den endelige blandingen, kan et totalt volum mindre enn 10 μL resultere i et altfor lite volum (< 0,2 μL) av noe komponent aliquot.
    3. For alkalisk fosfatasesyntese, bland komponentene i følgende rekkefølge: tilsett 1,2 μL H2O til 6 μL oppløsning A; tilsett 0,3 μL RNase-hemmer; tilsett 0,6 μL disulfidbindeforsterker 1 og 2 (fra et sett); tilsett 0,3 μL på 5 mM 6,8-difluoro-4-methylumbelliferylfosfat (DiFMUP); tilsett 1,5 μL DNA-løsning; bland og overfør blandingen til 4,5 μL oppløsning B.
      MERK: I analysen av alkalisk fosfatase kan det fluorgene substratet DiFMUP produsere svært fluorescerende 6,8-difluoro-7-hydroksy-4-methylcoumarin (DiFMU) ved enzymatisk spalting av terminalfosfatgruppen.
  4. Trekk opp 10 μL av blandingen ved hjelp av en 200 μL ikke-filtrert pipettespiss. Sett pipettespissen inn i innløpshullet (se trinn 3.3) i PDMS-kanalen. Trykk ned stempelet for å injisere oppløsningen til kanalen til den renner over fra uttaket (der en annen pipettespiss allerede er satt inn i trinn 3.3).
  5. Skill pipetten fra pipettespissen og hold disse to pipettespissene fortsatt satt inn i innløpet og utløpet.
    MERK: Unngå å generere luftbobler under pipetteringen. Ikke la tommelen stå fra stempelet før du skiller pipetten fra pipettespissen for å hindre at oppløsningen er tilbake i PDMS-kanalen.

5. Genererer femtoliterdråpearray (FemDA) for CFPS

  1. Overfør hele settet av den monterte enheten til den forhåndskjølte aluminiumsblokken (se trinn 4.2). Kontroller forsiktig at mikrokammerarrayområdet raskt går fra gjennomskinnelig (figur 2I) til gjennomsiktig (Figur 2J).
    MERK: CFPS-reaksjonsløsningen kan ikke umiddelbart gå inn i mikrokamrene. Løseligheten av luft i vann er i omvendt forhold til temperaturen. Den fanget luften vil oppløses i løsningen etter at enheten ble flyttet fra RT til lav temperatur. Gjennomsiktighetsendringen er en praktisk visuell indikator for å bedømme om løsningen går inn i mikrokamrene.
  2. Trekk 30 μL av den forhåndskjølte spyleoljen (se trinn 4.1), og overfør straks oljen til innløpsinnsettet pipettespissen fra den øvre åpningen. Spyleoljen beveger seg inn i kanalen og ekstruderer den overskytende reaksjonsløsningen som ligger utenfor mikrokamrene. Hvert mikrokammer er isolert av spyleoljen.
    MERK: Det bevegelige grensesnittet mellom reaksjonsløsningen og spyleoljen er synlig, noe som hjelper folk til å observere bevegelsen av væsken inne i kanalen. Den ekstruderte oppløsningen kan samles inn i det forrige røret, lagres ved 4 °C og brukes på nytt for en annen FemDA-enhet eller en parallell bulkreaksjon (i mikrorøret eller en mikrotiterplate).
  3. Pre-draw 30 μL av tetningsolje (Fomblin Y25) til en 200 μL filtrert pipettespiss. Heng pipetten oppreist et sted.
  4. Fjern samtidig de to pipettespissene (se trinn 3.3 og 4.4) fra enheten. Flytt umiddelbart enheten fra aluminiumsblokken til parafilm.
    MERK: Bruk en pinsett til å feste (men hold deg unna kanalområdet) enheten på aluminiumsblokken i løpet av perioden med å fjerne pipettespissene.
  5. Sett straks den ferdige pipettespissen som inneholder tetningsoljen (se trinn 5.3) inn i innløpet til PDMS-kanalen, og injiser oljen inn i kanalen til den renner over fra utløpet.
    MERK: Utfør dette trinnet så snart du flytter enheten til RT. For å unngå tilbakestrømningen inne i kanalen må du ikke la tommelen stå fra stempelet før tetningsoljen renner over fra stikkontakten. Spyleoljen fordamper umiddelbart etter at den beveger seg ut av utløpet av kanalen, mens følgende tetningsolje akkumuleres i uttaket på grunn av det ekstremt lave fordampningstapet.
  6. Skill pipetten fra pipettespissen, og fjern deretter pipettespissen fra enheten. Rengjør PDMS-overflaten med et stykke av den rene viskeren og påfør deretter en ny dråpe tetningsolje på henholdsvis innløp og utløp. Femtoliterdråpene er forseglet i individuelle mikrokamre av oljen.
    MERK: Bruk en pinsett til å reparere (men hold deg unna kanalområdet) PDMS-kanalen på underlaget i perioden med å fjerne mikropipettespissen.
  7. Tørk av fuktigheten som er akkumulert på den nedre overflaten av dekkglasset. Den as-prepared FemDA enheten er nå klar for inkubasjon og mikroskopi avbildning.

6. Mikroskopi avbildning

  1. Start opp et invertert fluorescensmikroskop. Vent til stabilisering (kjøling) på kameraet. Bruk en objektiv på 60 x eller 100 x oljenedsenking. Sett FemDA-enheten på det motoriserte trinnet. Angi bildemetrene.
    MERK: Bildemetrene inkluderer filbanen, bildekanalene, filtre, eksponeringstider (generelt er 100 ms nok; kortere eller lengre tid er også mulig i henhold til spesifikasjonen til kameraet) og lysintensitet.
  2. Finn fokalplanet. Juster z-akseposisjonen til objektivet og fest brennplanet ved hjelp av et internt autofokussystem. Angi at interesseområdet (ROI; dvs. x, y-aksen) skal avbildes.
    MERK: De store mikroskoprodusentene (Nikon, Olympus, Zeiss, Leica) gir alle muligheten til å integrere autofokussystemet med mikroskopet. Dette autofokussystemet er nødvendig for å holde fokusplanet konstant under den automatiske multi-area imaging. ROIene dekker FemDA-området i PDMS-kanalen.
  3. Ta fluorescensbildene. Ta opp en enkelt ramme av et defokusert BF-bilde (bright-field) for hver avkastning. IKKE endre rekkefølgen og koordinatene til ROIene når du avbilder de forskjellige kanalene.

7. Analyse av bildedata

MERK: Analyser bildedataene ved hjelp av en hjemmelaget plugin (kalt "FemDA") basert på Fiji (http://fiji.sc) for å trekke ut fluorescensintensiteten til hver dråpe43. Installer riktig versjon av Fiji i henhold til operativsystemet. Fiji støtter de fleste bildefilformater (f.eks. den andre filen fra Nikon-mikroskopet, czi-filen fra Zeiss-mikroskopet) ved hjelp av en innebygd plugin "Bio-Formats".

  1. Installasjon av plugin
    1. Kopier og lim inn plugin-filen (som er tilgjengelig ved forespørsel til den tilsvarende forfatteren eller via følgende institusjonelle kobling: https://fbox.jamstec.go.jp/public/FcsQwAsMKIqA9j0B2MJwLUMeHGsxp09hAkAFdVhQIDkZ) i Fijis "plugins" -mappe.
    2. Start Fiji-programvaren; plugin "FemDA" kan bli funnet i rullegardinmenyen "Plugins" av Fiji.
  2. Forhåndsbehandling av bildedata
    1. Åpne det defokuserte BF-bildet (se trinn 6.3). Klikk prosess | Trekk fra bakgrunn... for å fjerne jevne kontinuerlige bakgrunner i hver ramme av bildedataene (Figur 4B). Klikk prosess | Filtre | Median for å redusere støyen i hver ramme av bildedataene (Figur 4C).
    2. Klikk på Bilde | Juster | Terskel for å sjekke og skille forgrunnen (som indikerer mikrokamrene) fra bakgrunnen (som indikerer området utenfor mikrokamrene) av hver ramme av bildedataene (forstørrede innsatser i figur 4A-C).
      MERK: Velg en riktig algoritme fra rullegardinlisten i terskelvinduet, slik at bare mikrokammerområdene, samt kantene på hvert mikrokammer, kan identifiseres og utheves som forgrunnen. Spesielt må de fleste av de uthevede kantene være kontinuerlige uten hull.
  3. Bestemmelse av koordinat for dråpekoordinat
    1. Klikk på Programtillegg | FemDA | FemDA Analyse for å åpne det grafiske brukergrensesnittet (GUI) av den tilpassede plugin (øvre halvdel av figur 4D).
    2. Skriv inn omtrentlig minimums- og maksimumsantall piksler av et enkelt mikrokammer. Skriv inn forventet minimum og maksimal sirkularitet (0: vilkårlig form; 1: perfekt sirkel) av mikrokamrene. Skriv inn rammenummeret på startrammen og sluttrammen.
    3. Klikk Generer avkastning på GUI for å oppdage hvert mikrokammer, og de oppdagede ROIene vises i et popup-vindusoppr..Click Generate ROI on the GUI to detect every microchamber, and the successfully detected ROIs is shown in as popup window ROITable.
    4. Gå tilbake til vinduet FemDA Analyse og klikk på knappen Bruk ROI-maske for å sjekke om mikrokamrene over rammene ble riktig oppdaget (nederst til venstre i figur 4D). Hvis nei, endrer du noen av dem og gjentar klikk på Generer avkastning og Bruk ROI-maske. Hvis ja, gå til neste trinn.
      MERK: Det kan være svært få mikrokamre som ikke kan identifiseres som avkastningen (se den nedre halvdelen av figur 4D) av en algoritme av terskelen på grunn av den utilstrekkelige kontrasten mellom forgrunnen og bakgrunnen. Det er ikke problematisk i det statistiske synspunktet.
  4. Fluorescensintensitet ekstraksjon
    1. Åpne fluorescensbildet og ta det til fronten. Klikk Påfør ROI-maske på nytt for å bruke de bestemte ROIene på fluorescensbildet (nederst til høyre i figur 4D).
    2. Velg enten One-Shot for å analysere et sluttpunktbilde (som eksemplifisert med mNeonGreen-dataene) eller Time-Lapse for å analysere en tidsemnedata (som eksemplifisert med alkaliske fosfatasedata).
    3. Inndata 100 i boksen Antall topppiksler betyr at bare de 100 beste pikslene av hver avkastning vil bli brukt til å beregne gjennomsnittsintensiteten til den tilsvarende dråpen. Hvis inndata 0 i Antall topppiksler, brukes alle bildepunkter for hver avkastning til å beregne gjennomsnittsintensiteten til den tilsvarende dråpen.
      MERK: Det kan være en drift av flere piksler mellom BF og fluorescensbildene, noe som betyr at noen piksler i ROIene kan tilhøre bakgrunnen til fluorescensbildet. Derfor gir plugin et alternativ for å angi antall toppintensitetsrangerte piksler for beregning av gjennomsnittlig intensitet for hver dråpe.
    4. For analysen av sluttpunktbildet (dvs. velg One-Shot i trinn 7.4.2), klikk knappen Mål intensitet for å beregne gjennomsnittligintensitet for alle oppdagede dråper. ROITable oppdateres med de nye dataene fra fluorescensbildet. I mellomtiden vises et histogrammet i et nytt popup-vindu Histogram (Figur 4E).
      MERK: Hvis du endrer hyllestørrelsen i boksen Hyllenummer, kan du optimalisere visningen av histogrammet. En tilpasning til en sum av gaussiske distribusjoner kan oppnås i den utviklede GUI. Popup-loggvinduet på Fiji viser tilpasningsresultatene. Alternativt kan du eksportere dataene ved å klikke på knappen lagre som tekst og utføre ulike statistiske analyser med annen programvare ( Figur4F, G).
    5. For analysen av tidskursbildet (dvs. velg Time-Lapse i trinn 7.4.2), popup-vinduet er Intensitetstidskurs i stedet for Histogram, som inneholder et histogram som tilsvarer et bestemt tidspunkt og et tidsintensitetsplott (Figur 5). Tekstdataene kan også eksporteres ved hjelp av Fil-menyen i popup-vinduet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mikrofabrikasjonsprosessen består av substratrengjøring, overflatefunksjonalisering, CYTOP-belegg, fotolittografi, tørr etsing, fotoresist stripping og sluttrengjøring. Viktigere, den presenterte protokollen tillot fullstendig fjerning av hydrofob CYTOP polymer inne i mikrokamrene Figur 3A), produsere en svært parallell hydrofil-i-hydrofob struktur på en standard deksel glass substrat. Ved hjelp av oljeforseglingsprotokollen ble den ensartede dimensjonen til de resulterende dråpene verifisert ved å innkapsle fluorescerende oppløsning i mikrokamrene (figur 3B). Fluorescensintensiteten som ekstraheres ved hjelp av den utviklede programvaren, er en god indikator på dråpestørrelsen. CVen for fluorescensintensiteten, 3 %, reflekterte den smale fordelingen av dråpestørrelsen over hele matrisen (figur 3C). Det rekonstruerte 3D-bildet fra konfisk mikroskopi viste også det konsekvente dråpevolumet over tid (Figur 3D,Tilleggsfilm 1)44. Til sammenligning genererte en mye brukt FC-40 olje dråpene som viste en fleredoblet forskjell i fluorescensintensiteten45. De dannede dråpene i FemDA var stabile ved RT i minst 24 timer (figur 3E). Den høye kvaliteten på dråpene dannet til slutt grunnlaget for kvantitativ måling.

Data med høy gjennomstrømning krever dataanalyseverktøy med høy gjennomstrømning46,,47. Den utviklede plugin sterkt forenklet og fremskyndet bildedataanalysen. Basert på teorien om digital bildebehandling48,kan det defokuserte BF-bildet binariseres og brukes til å gi koordinatinformasjonen til hver dråpe etter bakgrunnskorrigering og støyreduksjon (figur 4A-C). Denne ideen gjorde nøyaktig lokalisering av mørke dråper mulig.

Det fluorescerende proteinet mNeonGreen ble syntetisert i FemDA. Mal-DNA med en konsentrasjon på 0,05 molekyler per dråpe ble tilfeldig fordelt inn i hver dråpe for å initiere proteinsyntesen med sammenkoblet cellefri transkripsjon og oversettelsesreaksjoner. Fordi gjennomsnittlig antall DNA-molekyler per dråpe var mindre enn 1, inneholdt noen dråper null mal DNA, mens andre inneholdt ett eller flere DNA-molekyler. Etter 6 timer med inkubasjon ved RT ble sluttpunktbildet tatt ved hjelp av mikroskopet. Stabelbildedataene ble analysert av den utviklede programvaren ved hjelp av det samtidige defokuserte BF-bildet (Figur 4A-E). Fluorescensintensiteten til hver dråpe er et mål på proteinutbyttet i tilsvarende dråpe. Histogrammet i fluorescensintensiteten viste en diskret fordeling og var godt utstyrt av en sum av gaussiske fordelinger med like høy-til-topp intervaller (Figur 4F), som sterkt foreslo et belegg av forskjellige antall DNA-molekyler per dråpe. I likhet med det gjentatte mynt-flipping spillet, antall uavhengige tilfeldige hendelser som oppstår er matematisk beskrevet av Poisson distribusjon. Sannsynligheten for forekomst av dråper som inneholder forskjellige tall (opptil 3 i dette eksemplet) av DNA-molekyler var en perfekt passform til en Poisson-fordeling (P = e-λ • λk / k!, hvor λ er det forventede gjennomsnittlige antallet DNA-molekyler per dråpe og k er det faktiske antallet DNA-molekyler i en dråpe) med et gjennomsnitt på 0,05 DNA-molekyler per dråpe (Figur 4G)31, som forventet for en tilfeldig fordeling av DNA-molekyler. Fordi lastekonsentrasjonen av malen DNA-løsningen var den samme som den endelige montert λ (dvs. 0,05), CFPS reaksjonseffektivitet i vår FemDA var 100% (eller nær 100%). Med andre ord er et enkelt DNA-molekyl nok til å utløse CFPS-reaksjonen i femtoliterdråpen effektivt.

CFPS-reaksjonen av alkalisk fosfatase ble registrert hvert 5. Den utviklede programvaren støtter også analyse av tidsemnedata (Figur 5). Den sammenkodede fluorgene reaksjonen viste en lignende diskret fordeling av fluorescensintensiteten til dråpene på tidligere tidspunkter. Histogrammet resultatene også bekreftet et belegg av ulike antall DNA molekyler i dråpen. Fluorescensintensiteten konvergerte til slutt til en verdi sammen med gradvis uttømming av det fluorgene substratet DiFMUP.

Figure 1
Figur 1: Mikrofabrikasjonsprosessen av mikrokammersubstratet med ultrahigh tetthet. (A)Teknisk tegning av den tilpassede vakuum chuck. Enhet: mm. (B) CYTOP filmtykkelse vs. spin hastighet data. (C) Spin-belegg av perfluoropolymer CYTOP på et silanisert glasssubstrat. Fotografiene viste et godt eksempel på homogent belegg og et dårlig eksempel på henholdsvis inhomogent belegg. Den svarte pilen indikerte den spesifikke posisjonen til den inhomogene CYTOP-filmen. (D)Spin-belegg av fotoresist på CYTOP-belagt substrat. Etter spin-belegg, fotoresist nær substrat kanten må fjernes ved hjelp av en etanol-gjennomvåt ren vindusvisker (midtre fotografi). Fotografiene viste et godt eksempel på homogent belegg og et dårlig eksempel på henholdsvis inhomogent belegg. Den hvite pilen indikerte den spesifikke posisjonen til den inhomogene fotoresistfilmen. (E)Eksponering av den belagte fotoresisten ved hjelp av en maskejuster. (F)Utvikling av den eksponerte fotoresist i en utvikler. Den eksponerte delen av fotoresisten er løselig i utviklerløsningen. (G) Reaktiv ion etsing av CYTOP. Den avdekkede CYTOP ble fjernet av O2 plasma. (H)Fjerning av fotoresistmasken. Fotoresisten ble fjernet av aceton. Underlaget ble rengjort ved hjelp av 2-propanol og H2O. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Tilberedning og bruk av mikrokammermatriseenheten. (A)Veiing av herdemiddel og prepolymer av PDMS. (B)Hell den blandede og avserte blandingen i en tapemønstret petriskål. Det var noen nygenererte luftbobler i polymerblandingen. (C) Deaerer blandingen igjen i et vakuumkammer. Luftboblene steg og brast på den øverste overflaten. (D)Den deaerated og herdet PDMS harpiks. Peelingav den herdede PDMS-elastomeren fra petriskålen. (F) Kutte av hver del av PDMS kanal blokker ved hjelp av en flat-kabel cutter. (G)Stansehull i hver ende av PDMS-kanalen ved hjelp av en biopsistans. (H) Den monterte enheten. PDMS harpiks kan feste seg til CYTOP-overflaten. (I)Gjennomskinnelig mikrokammerarrayområde inne i PDMS-kanalen fylt med vandig løsning før avkjøling. (J)Gjennomsiktig mikrokammerarrayområde inne i PDMS-kanalen etter avkjøling. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Ultra-uniform og ultra-stabile femtoliter dråper. (A) 3D laser skanning confocal mikroskopi avbildning for fabrikkert substrat. De sylindriske mikrokamrene i eksempelbildet viste en høyde på 3 μm og en diameter på 4 μm. (B) Ensartede femtoliterdråper over et stort område av planar-arrayet. Bare et delvis område av hele matrisen ble vist her. En fluorescerende oppløsning (10 μM ATTO-514) ble forseglet i hver dråpe. (C) Størrelsesfordelingen av dråpene over en hel enkelt matrise. Fluorescensintensiteten ble brukt som en indikator på dråpestørrelsen. CVen var bare 3%. (D) Volumetrisk måling ved hjelp av confocal z-stack tidskursdata. Volumet av dråper over matrisen ble gitt av mikroskopprogramvaren (NIS-Elements, Nikon). (E)Fluorescens utvinning etter fotobleking. Etter den første rammen ble flere dråper helt fotobleket ved hjelp av en begrenset laserstråle av et konfusisk mikroskop. Fluorescensintensiteten ble registrert i 24 timer, og ingen fluorescensrekonstruksjon ble observert (rød linje). Fluorescensintensiteten til andre ikke-fotobleket dråper i samme synsfelt ble registrert i den svarte linjen. Feilfelt (gjennomsiktige farger) var 1 SD for hver tidspunkt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Analyseprosedyre for endepunkt mikroskopiske bildedata. Det defokuserte lysfeltbildet ble brukt til å trekke ut koordinaten til hvert mikrokammer/dråper. Basert på intensitetsforskjellen mellom kanten av mikrokamre (som forgrunn) og andre områder (som bakgrunn), kan den kontinuerlige og nærsirkelformede kanten trekkes ut fra bakgrunnen. På grunn av den ujevne bakgrunnsfordelingen på tvers av synsfeltet (A), er det vanligvis nødvendig med en forhåndsbehandling av bilder for å forbedre kvaliteten på binarizing-utdataene. Etter at du har trukket fra bakgrunnen (B), ble bakgrunnen for hver ramme uniformert. Empirisk var inngangsverdien i"Rolling ball radius"(trinn 1) 20-50 for 2048 pixel × 2048 pixel bilder og 10-20 for 512 pixel × 512 pixel bilder. Jo større verdi, jo kortere behandlingstid. Hvis du vil redusere støyen i bildet med bakgrunnstegn, bruker du et medianfilter på bildet (C). Generelt var inndataverdien i Radius (trinn 3) 1-2 piksler. Som vist i den forstørrede innsatsen, kan det bakgrunnstegnede og filtrerte bildet fint binarized ved hjelp av innbyggingstersketillegget, slik at forgrunnen som tilsvarer kantene, samt interesseområdet (ROIer), kan gjenkjennes nøyaktig. ROIs-deteksjonen for alle bilder ble utført ved hjelp av den installerte hjemmelagde plugin FemDA Analysis (D). Pikselstørrelsen (trinn 5 og 6) og sirkulariteten (trinn 7 og 8) av ROIer, rammene vi ønsker å sette inn i beregningen (trinn 9 og 10) ble manuelt definert i henhold til de faktiske dataene. Etter å ha klikket generer avkastning (trinn 11) og ventet, ble koordinaten for hver avkastning på tvers av inndatarammene bestemt. Når du har klikket på Bruk ROI-maske (trinn 12), ble hver oppdaget avkastning vedlagt og uthevet av en gul linje. Etter å ha åpnet fluorescensbildet og klikket på Bruk ROI-masken på nytt, ble den bestemte ROIer-masken brukt på fluorescensbildet. Antall topppiksler (trinn 14) spesifiserte antall toppintensitetsrangerte piksler for hver avkastning for beregningen av gjennomsnittsintensiteten til de respektive dråpene. Etter å ha klikket Mål intensitet (trinn 15) og venter, ble histogrammet generert (E). Histogrammet kan utstyres med en sum av gaussiske distribusjoner ved hjelp av parametrene som er tilgjengelige i histogrammet vinduet. Alternativt kan gjennomsnittlig intensitetsdata eksporteres til en tekstfil (trinn 16) og analyseres av annen programvare (F). (G) Sannsynligheten for forekomst av dråper som inneholder forskjellige antall DNA-molekyler i den gitte matrisen. Histogrammet (grå farge) var pent utstyrt av en Poisson-fordeling (rød stiplet linje) med et gjennomsnitt på 0,05 DNA-molekyler per dråpe, som forventet for en tilfeldig fordeling av DNA-molekyler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Analyse av tidskurs mikroskopiske bildedata. De oppdagede ROIene (etter trinnene 1-12 i figur 4)ble direkte brukt på tidsemnedataene. I trinn 13 i figur 4velger du Tidsforløp og skriver inn det faktiske tidsintervallet (i minutter) mellom tilstøtende rammer i tidsintervall [min]. Etter å ha klikket Mål intensitet (trinn 15 i figur 4) og venter, ble tidsintensitetsplottet og histogrammet (det samme som figur 4E) generert. Hist-posisjonen spesifiserte tidspunktet for histogrammet, som ble vist som en vertikal rød linje. Plugin støtter også å spesifisere farger for hver sporingslinje. Gul: 0 DNA; blå var 1 DNA; rød: 2 DNA; svart: 3 DNA. Tidsemnedataene kan også eksporteres til en tekstfil. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplerende film 1. Vennligst klikk her for å laste ned denne filmen. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den svært kvantitative målingen basert på de svært ensartede, stabile og biokompatible dråpene i FemDA gjorde det mulig å fordele diskrete distribusjonen, det unike ved studien vår som skiller seg fra andre. Vi systematisk optimalisert og detaljert mikrofabrikasjon og dråpedannelse prosesser i dette papiret. Det er flere kritiske trinn i den etablerte protokollen.

For det første bestemmer det ensartede belegget av svært viskøs CYTOP-polymer på det rektangulære tynne glasssubstratet i stor grad kvaliteten på det resulterende substratet. Gitt den generelle korte arbeidsavstanden til objektivet med høye forstørrelser (se trinn 6.1), må det tynne dekselglasset brukes. Et spinnbelegg av høy kvalitet på et tynt og fleksibelt substrat er generelt vanskelig. Vi har ennå ikke testet alle mulige design, men har funnet ut at multi-hulls vakuum chuck med samme rektangulære dimensjon fungerte bra for spin-belegg. Det er viktig å slippe CYTOP-polymeren i midten av dekselet glasssubstrat og umiddelbart starte spin-belegget (se trinn 1.3.2). Graden av vanskeligheten er mindre relatert til formen på substratet, men viskositeten til polymeren. CYTOP-produktserien tilbyr flere forskjellige konsentrasjoner av den kommersielt tilgjengelige pakken. Den medfølgende fortynningen i pakningen kan også brukes til å fortynne det opprinnelige produktet til en lavere viskositet ved behov. CYTOP 816 som vi brukte i forsøket er det kommersielle produktet med høyest konsentrasjon som er i stand til å løse polymeren i oppløsningsvæsken. Det tykkere belegget krever lavere sentrifugeringshastighet eller flere runder med belegg og herding. Et plott av karakteristisk tykkelse vs. spin speed kurve anbefales sterkt når du bruker en ny spin coater i et nytt miljø.

For det andre er den riktige fuktigheten i renrommet avgjørende for ideell fotolittografi, samt fullstendig fjerning av fotoresisten i den angitte posisjonen. Den fotokjemiske reaksjonen i fotolithografi bruker H2O som en av reaktantene. Imidlertid fjerner softbake ved temperaturen høyere enn kokende temperatur på H2O H2O-innhold fra den belagte fotoresist. Den "tørkede" fotoresisten må ta tid å absorbere H2O igjen fra luften (se trinn 1.4.6). Dette punktet blir ofte oversett. Gitt at mange laboratorier bare kan ha noen forenklede renromsfasiliteter uten fuktighetskontroll, vil fuktigheten svinge dramatisk i løpet av sesongen eller bli påvirket av været. En rimelig løsning er å bruke en hjemmebrukfukter eller avfukter i renrommet. Det fullt eksponerte CYTOP-laget etter utvikling kan selektivt og fjernes helt av RIE, og eksponerer glassbunnen helt. Til slutt er hybridstrukturen til den hydrofile glassbunnen og den hydrofobe CYTOP-sideveggen viktig for å stikke opp vandig løsning på femtoliterrommet.

Tredje, de nylig funnet oljer (ASAHIKLIN AE-3000, Fomblin Y25) og overflateaktivt middel (SURFLON S-386) viste enestående forsegling ytelse for fluoropolymerreaktoren 13. Injeksjonen av spyleoljen må utføres på den avkjølte flate metallblokken (se trinn 5.2); Ellers kan ikke dråper i nærheten av innløpet på kanalen dannes. Injeksjonen av den andre tetningsoljen kan utføres ved RT (se trinn 5.5). Disse oljene og tensider har aldri vært brukt i biologisk forskning før. Ingen bedre alternativer har blitt funnet for nå. For å utvide arsenalet av den nyttige kombinasjonen av oljer og overflateaktive midler for dråpeforberedelse, er det nye medlemmet av oljene (eller lignende i samme produktlinje) og overflateaktivt middel (eller lignende i samme produktlinje) verdig til å prøve å bli brukt i mikrofluidiske dråpesystemer.

Her er to ekstra punkter å legge merke til. Det ene er det faktum at det er et tidsetterslep blant ROIer under mikroskopiavbildningen. Den totale bildetiden for én syklus er hovedsakelig avhengig av matrisestørrelsen og forstørrelsen av objektivet. Eksponeringstiden, lukkertiden og den motoriserte fasens bevegelige hastighet er også mindre faktorer. Som en tommelfingerregel ville bildebehandling 106 dråper ved 60 × forstørrelse i det minste kreve 10-20 minutter. Dette uunngåelige tidsforsinkelsen introduserer noen feil i dataanalyse, som alltid bør tas i nøye betraktning. Den andre er det faktum at det totale antall dråper på et enkelt substrat ikke ville overstige 108-109, selv øke tettheten av dråpene eller redusere den individuelle størrelsen på dråpene. Dette skyldes at størrelsen på glasssubstratet som kan håndteres av maskejusteren (for 4-tommers wafers) er begrenset. Ytterligere økende størrelsen på dekkglasset anbefales ikke fordi et stort, tynt og skjør glasssubstrat er vanskelig å håndtere.

FemDA kan betraktes som en super miniatyrisert mikrotiterplate. Eventuelle biokjemiske reaksjoner som har blitt utført i 96-brønns mikrotiterplater kan prøves å utføre ved hjelp av FemDA. Det kan sikkert brukes til enzymaktivitetsmåling uten komplisert proteinrensing. Det kan også være kompatibelt med digital polymerase kjedereaksjon (digital PCR) og digital enzym-koblet immunosorbent analyse (digital ELISA)31,,49. Det lille volumet, det store utvalget og høy stabilitet vil gi noen fordeler fremfor eksisterende digitale bioanalysemetoder. FemDA-systemet som er i stand til å løse ulike antall mal-DNA-molekyler i femtoliterdråper, har allerede vist kraften på nøyaktig proteinscreening13. FemDA er et nytt in vitro compartmentalization system i stand til raskt å utvikle en rekke enzymer. Med fremskritt innen bioinformatikk og bibliotek konstruksjon teknikker, æra av en rask on-demand etablering av høy ytelse proteiner vil være sikkert kommer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av JSPS KAKENHI tilskuddsnummer JP18K14260 og budsjettet til Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology. Vi takker Shigeru Deguchi (JAMSTEC) og Tetsuro Ikuta (JAMSTEC) for å gi karakteriseringsfasilitetene. Vi takker Ken Takai (JAMSTEC) for kommersiell programvarestøtte. Mikrofabrikasjonen ble utført ved Takeda Sentanchi Supercleanroom, Universitetet i Tokyo, støttet av "Nanotechnology Platform Program" av Kunnskapsdepartementet, Kultur, Sport, Vitenskap og teknologi (MEXT), Japan, Grant Number JPMXP09F19UT0087.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-aminopropyl)triethoxysilane Sigma-Aldrich 440140
1 mL syringe Terumo SS-01T
2-propanol Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
3D laser scanning confocal microscope Lasertec OPTELICS HYBRID Other similar microscopes (e.g., Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) are also applicable.
50 mL syringe Terumo SS-50LZ
6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate Thermo Fisher Scientific D6567 Prepare a 5 mM stock solution in dimethyl sulfoxide
Acetone Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
Purity 99.8%.
Air blower Hozan Z-263
Aluminum block BIO-BIK AB-24M-02
Aluminum microtube stand BIO-BIK AB-136C
ASAHIKLIN AE-3000 AGC (Test sample) Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
BEMCOT PS-2 wiper Ozu 028208
Biopsy punch with plunger Kai BPP-10F
Cover glass Matsunami Glass No. 1 (24 mm × 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness) Size-customized.
Cover glass staining rack Nakayama 803-131-11
CRECIA TechnoWipe clean wiper Nippon Paper Crecia C100-M
Cutting mat GE Healthcare WB100020
CYTOP AGC CTL-816AP
Deaeration mixer Thinky AR-100
Desktop cutter Roland STIKA SV-8
Developer AZ Electronic Materials AZ 300 MIF AZ Electronic Materials was now acquired by Merck.
Other alkaline developers may be also applicable but should require optimization of development conditions (time, temperature, etc.)
Double-coated adhesive Kapton film tape Teraoka Seisakusho 7602 #25
Ethanol Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
Purity 99.5%.
Fiji Version: ImageJ 1.51n
Flat-cable cutter Tokyo-IDEAL MT-0100
Fomblin oil Solvay Y25, or Y25/6 Free test sample may be available upon inquiry to Solvay. Fomblin Y25/6 is an alternative if Y25 is not readily available.
Hot plate AS ONE TH-900
Injection needle Terumo NN-2270C 22G × 70 mm
Inverted fluorescence microscope Nikon Eclipse Ti-E Epifluorescence specification, CCD or sCMOS camera, motorized stage, autofocus system, and high NA objective lens are required.
KaleidaGraph Synergy Version: 4.5
Mask aligner SUSS MA-6 Other mask aligners are also applicable as long as the vacuum contact mode is avaliable.
MICROMAN pipette GILSON E M250E Capillary piston tip: CP250
Microsoft Excel Microsoft Version: 16.16.15
Mini vacuum chamber AS ONE MVP-100MV
Nuclease-free water NIPPON GENE 316-90101
Parafilm Amcor PM-996
PCR tube NIPPON Genetics FG-021D/SP
Petri dish AS ONE GD90-15 Diameter 90 mm, height 15 mm.
Photoresist AZ Electronic Materials AZ P4903 AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. AZ P4620 is an alternative.
Plate reader BioTek POWERSCAN HT
Polyethelene gloves AS ONE 6-896-02 Trade name: Saniment.
PURExpress in vitro protein synthesis kit New England Biolabs E6800S or E6800L For cell-free protein synthesis reaction.
Reactive-ion etching system Samco RIE-10NR Other RIE systems are also applicable but should require optimization of RIE conditions (gas flow rate, chamber pressure, RF power, etching time, etc.)
RNase inhibitor New England Biolabs M0314S
Scotch tape 3M 810-1-18D
Sodium hydroxide solution FUJIFILM Wako Pure Chemical 194-09575 8 M concentration; danger.
Spin coater Oshigane SC-308
SURFLON S-386 surfactant AGC (Test sample) Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
SYLGARD 184 silicone elastomer Dow Sylgard184 Chemical composition: polydimethylsiloxane. The default mixing ratio is base : curing agent = 10 : 1 (m/m).
Tweezers Ideal-tek 2WF.SA.1
2A
Ultrasonic cleaner AS ONE ASU-2M
Vacuum chuck Oshigane (Customized) Material: delrin; rectangular sample stage with multiple holes (48 holes, each with 1 mm diameter); the size is customzied to fit the size of the cover glass (24 mm × 32 mm).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chiu, D. T., Lorenz, R. M., Jeffries, G. D. M. Droplets for ultrasmall-volume analysis. Analytical Chemistry. 81 (13), 5111-5118 (2009).
  2. Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77 (3), 977-1026 (2005).
  3. Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. Droplet microfluidics for high-throughput biological assays. Lab on a Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).
  4. Zhu, P. A., Wang, L. Q. Passive and active droplet generation with microfluidics: a review. Lab on a Chip. 17 (1), 34-75 (2017).
  5. Griffiths, A. D., Tawfik, D. S. Miniaturising the laboratory in emulsion droplets. Trends in Biotechnology. 24 (9), 395-402 (2006).
  6. Tran, T. M., Lan, F., Thompson, C. S., Abate, A. R. From tubes to drops: droplet-based microfluidics for ultrahigh-throughput biology. Journal of Physics D: Applied Physics. 46 (11), 114004 (2013).
  7. Zhang, Y., Jiang, X. Microfluidic tools for DNA analysis. DNA Nanotechnology. Fan, C. , Springer. Heidelberg. 113-153 (2013).
  8. Dubuc, E., et al. Cell-free microcompartmentalised transcription-translation for the prototyping of synthetic communication networks. Current Opinion in Biotechnology. 58, 72-80 (2019).
  9. Damiati, S., Mhanna, R., Kodzius, R., Ehmoser, E. K. Cell-free approaches in synthetic biology utilizing microfluidics. Genes. 9 (3), (2018).
  10. Lee, K. H., Kim, D. M. Applications of cell-free protein synthesis in synthetic biology: Interfacing bio-machinery with synthetic environments. Biotechnology Journal. 8 (11), 1292-1300 (2013).
  11. Supramaniam, P., Ces, O., Salehi-Reyhani, A. Microfluidics for artificial life: techniques for bottom-up synthetic biology. Micromachines. 10 (5), (2019).
  12. Bowman, E. K., Alper, H. S. Microdroplet-assisted screening of biomolecule production for metabolic engineering applications. Trends in Biotechnology. , (2019).
  13. Zhang, Y., et al. Accurate high-throughput screening based on digital protein synthesis in a massively parallel femtoliter droplet array. Science Advances. 5 (8), 8185 (2019).
  14. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. , (2019).
  15. Sakane, Y., Suzuki, Y., Kasagi, N. The development of a high-performance perfluorinated polymer electret and its application to micro power generation. Journal of Micromechanics and Microengineering. 18 (10), 104011 (2008).
  16. Sakakihara, S., Araki, S., Iino, R., Noji, H. A single-molecule enzymatic assay in a directly accessible femtoliter droplet array. Lab on a Chip. 10 (24), 3355-3362 (2010).
  17. Watanabe, R., et al. Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity. Nature Communications. 5, 4519 (2014).
  18. Chiu, C., Lisicka-Skrzek, E., Tait, R. N., Berini, P. Fabrication of surface plasmon waveguides and devices in Cytop with integrated microfluidic channels. Journal of Vacuum Science & Technology B. 28 (4), 729-735 (2010).
  19. Krupin, O., Asiri, H., Wang, C., Tait, R. N., Berini, P. Biosensing using straight long-range surface plasmon waveguides. Optics Express. 21 (1), 698-709 (2013).
  20. Hanada, Y., Ogawa, T., Koike, K., Sugioka, K. Making the invisible visible: a microfluidic chip using a low refractive index polymer. Lab on a Chip. 16 (13), 2481-2486 (2016).
  21. Berry, S., Kedzierski, J., Abedian, B. Low voltage electrowetting using thin fluoroploymer films. Journal of Colloid and Interface Science. 303 (2), 517-524 (2006).
  22. Lin, Y. Y., et al. Low voltage electrowetting-on-dielectric platform using multi-layer insulators. Sensors and Actuators B-Chemical. 150 (1), 465-470 (2010).
  23. Kimura, H., Yamamoto, T., Sakai, H., Sakai, Y., Fujii, T. An integrated microfluidic system for long-term perfusion culture and on-line monitoring of intestinal tissue models. Lab on a Chip. 8 (5), 741-746 (2008).
  24. Yang, T. J., Choo, J., Stavrakis, S., de Mello, A. Fluoropolymer-coated PDMS microfluidic devices for application in organic synthesis. Chemistry-a European Journal. 24 (46), 12078-12083 (2018).
  25. de Gennes, P. G. Wetting: statics and dynamics. Reviews of Modern Physics. 57 (3), 827-863 (1985).
  26. Holtze, C., et al. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a Chip. 8 (10), 1632-1639 (2008).
  27. Wagner, O., et al. Biocompatible fluorinated polyglycerols for droplet microfluidics as an alternative to PEG-based copolymer surfactants. Lab on a Chip. 16 (1), 65-69 (2016).
  28. Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, D. A., van Oijen, A. M. Droplet microfluidics: a tool for biology, chemistry and nanotechnology. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 82, 118-125 (2016).
  29. Mazutis, L., et al. Droplet-based microfluidic systems for high-throughput single DNA molecule isothermal amplification and analysis. Analytical Chemistry. 81 (12), 4813-4821 (2009).
  30. Galinis, R., et al. DNA nanoparticles for improved protein synthesis in vitro. Angewandte Chemie-International Edition. 55 (9), 3120-3123 (2016).
  31. Zhang, Y., Noji, H. Digital bioassays: theory, applications, and perspectives. Analytical Chemistry. 89 (1), 92-101 (2017).
  32. Mazutis, L., et al. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nature Protocols. 8 (5), 870-891 (2013).
  33. Courtois, F., et al. An integrated device for monitoring time-dependent in vitro expression from single genes in picolitre droplets. ChemBioChem. 9 (3), 439-446 (2008).
  34. Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
  35. Agresti, J. J., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4004-4009 (2010).
  36. Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab on a Chip. 12 (5), 882-891 (2012).
  37. Duncombe, T. A., Dittrich, P. S. Droplet barcoding: tracking mobile micro-reactors for high-throughput biology. Current Opinion in Biotechnology. 60, 205-212 (2019).
  38. Qin, D., Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
  39. Mukhopadhyay, R. When PDMS isn't the best. Analytical Chemistry. 79 (9), 3248-3253 (2007).
  40. Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nature Methods. 10 (5), 407-409 (2013).
  41. Bradshaw, R. A., et al. Amino acid sequence of Escherichia coli alkaline phosphatase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (6), 3473-3477 (1981).
  42. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
  43. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  44. Mantilla, C. B., Prakash, Y. S., Sieck, G. C. Volume measurements in confocal microscopy. Techniques in Confocal Microscopy. Conn, P. M. , Academic Press. Oxford, UK. 143-162 (2010).
  45. Noji, H. Single-molecule counting of biomolecules with femtoliter dropret chamber array. The 17th International Conference on Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems (TRANSDUCERS & EUROSENSORS XXVII. , 630-632 (2013).
  46. Zhang, Y., et al. Matrix-localization for fast analysis of arrayed microfluidic immunoassays. Analytical Methods. 4 (10), 3466-3470 (2012).
  47. Zhang, Y., et al. Two dimensional barcode-inspired automatic analysis for arrayed microfluidic immunoassays. Biomicrofluidics. 7 (3), 034110 (2013).
  48. Gonzalez, R. C., Woods, R. E. Digital image processing. , Pearson. New York, NY. (2018).
  49. Cohen, L., Walt, D. R. Single-molecule arrays for protein and nucleic acid analysis. Annual Review of Analytical Chemistry. 10 (1), 345-363 (2017).

Tags

Kjemi utgave 160 mikrofabrikasjon dråpe femtoliter cellefri proteinsyntese fluorescerende protein enzym enkeltmolekyl Poisson-distribusjon bildeanalyse in vitro compartmentalization
En femtoliter droplet array for massivt parallell proteinsyntese fra enkelt DNA molekyler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Y., Kurosawa, K., Nishiura,… More

Zhang, Y., Kurosawa, K., Nishiura, D., Tei, M., Tsudome, M. A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules. J. Vis. Exp. (160), e60945, doi:10.3791/60945 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter