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Chemistry

Un arreglo de gotas Femtoliter para la síntesis masiva de proteínas paralelas a partir de moléculas de ADN únicas

Published: June 20, 2020 doi: 10.3791/60945
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3
1SUGAR Program, X-star, Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC), 2Center for Mathematical Science and Advanced Technology, Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC), 3Deep-Sea Nanoscience Research Group, Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC)

Summary

El objetivo general del protocolo es preparar más de un millón de gotas de femtoliter ordenadas, uniformes, estables y biocompatibles sobre un sustrato plano de 1 cm2 que se puede utilizar para la síntesis de proteínas libres de células.

Abstract

Los avances en la resolución espacial y la sensibilidad de detección de la instrumentación científica permiten aplicar pequeños reactores para la investigación biológica y química. Para satisfacer la demanda de microrreactores de alto rendimiento, desarrollamos un dispositivo de matriz de gotas femtoliter (FemDA) y ejemplificamos su aplicación en reacciones de síntesis de proteínas sin células (CFPS) masivamente paralelas. Más de un millón de gotas uniformes se generaron fácilmente dentro de un área del tamaño de un dedo utilizando un protocolo de sellado de aceite de dos pasos. Cada gota estaba anclada en una microcámara femtoliter compuesta de un fondo hidrófilo y una pared lateral hidrófoba. La estructura híbrida hidrófila en hidrofóbica y los aceites y tensioactivos de sellado dedicados son cruciales para retener establemente la solución acuosa femtoliter en el espacio femtoliter sin pérdida de evaporación. La configuración de femtoliter y la estructura simple del dispositivo FemDA permitían un consumo mínimo de reactivos. La dimensión uniforme de los reactores de gotas hizo que las mediciones cuantitativas y de tiempo a gran escala fueran convincentes y confiables. La tecnología FemDA correlacionó el rendimiento proteico de la reacción CFPS con el número de moléculas de ADN en cada gota. Hemos simplificado los procedimientos sobre la microfabricación del dispositivo, la formación de las gotas femtoliter y la adquisición y análisis de los datos de imagen microscópica. El protocolo detallado con el bajo costo de funcionamiento optimizado hace que la tecnología FemDA sea accesible para todos los que tienen instalaciones estándar de salas limpias y un microscopio de fluorescencia convencional en su propio lugar.

Introduction

Los investigadores utilizan reactores para llevar a cabo reacciones bio/químicas. Hay esfuerzos significativos que se han hecho para reducir el tamaño del reactor y aumentar el rendimiento experimental con el fin de reducir el consumo de reactivos al tiempo que se mejora la eficiencia del trabajo. Ambos aspectos tienen como objetivo liberar a los investigadores de una carga de trabajo pesada, disminuyendo el costo y acelerando la investigación y el desarrollo. Tenemos una hoja de ruta histórica clara sobre el desarrollo de las tecnologías de reactores desde el punto de vista de los volúmenes de reacción y el rendimiento: vasos individuales / matraz / tubos de prueba, tubos de mililitro, tubos microlitro, tiras de microlitro de 8 tubos, placa de microlitro 96/384/1536-well, y reactores microfluídicos nanolitros/picolitr/femtoliter1,2,3,4,5,6,7. Análogos a la reducción del tamaño de las características de los transistores en chips de circuito integrado en la industria de semiconductores en las últimas décadas, los microrreactores bioquímicos están pasando por la reducción de volumen y la integración del sistema. Estas herramientas a pequeña escala han tenido un profundo impacto en la biología sintética basada en células o en la sin células, la biomanufactura y el prototipado y cribado de alto rendimiento8,,9,,10,,11,,12. Este artículo describe nuestro reciente esfuerzo en el desarrollo de una tecnología única de arreglos de gotas y demuestra su aplicación en CFPS13,una tecnología fundamental para la biología sintética y las comunidades de cribado molecular14. En particular, proporcionamos intencionalmente un protocolo optimizado y de bajo costo para hacer que el dispositivo FemDA sea accesible para todos. El protocolo de bajo costo y fácil de manejar para el dispositivo miniaturizado contribuiría a los propósitos educativos de las universidades y ayudaría a difundir la tecnología.

FemDA prepara gotas de femtoliter a una densidad ultra alta de 106 por 1 cm2 en un sustrato de vidrio plano. Recubrimos un polímero hidrófobo, CYTOP15,sobre el sustrato de vidrio y grabado selectivamente (eliminado) CYTOP en posiciones predefinidas para generar una matriz de microcámaras en el sustrato. Por lo tanto, la microcámara resultante se compone de una pared lateral hidrófoba (CYTOP) y un fondo hidrófilo (vidrio). Cuando el agua y el aceite fluyen secuencialmente sobre la superficie estancada, el agua puede ser atrapada y sellada en las microcámaras. La estructura hidrófila-en-hidrofóbica es vital para repeler el agua fuera de las microcámaras, aislar microrreactores individuales y retener una pequeña solución acuosa dentro del espacio femtoliter. La propiedad única se aplicó con éxito para la preparación de gotas de agua en aceite y microcomplementos de bicapas de lípidos16,17. En comparación con el prototipo de dispositivo16,primero optimizamos el proceso de microfabricación para realizar una eliminación completa del polímero CYTOP, así como una exposición completa del fondo de vidrio. CYTOP es un fluoropolímero especial con una tensión superficial extremadamente baja (19 mN/m) inferior a la de los materiales de microrreactor convencionales como vidrio, plásticos y silicona. Su buen rendimiento óptico, eléctrico y químico ya se ha utilizado en el tratamiento superficial de dispositivos microfluídicos18,,19,20,21,22,23,24. En el sistema FemDA, para lograr una buena humectación del aceite en la superficie CYTOP, la tensión superficial del aceite debe ser inferior a la de la superficie sólida25. De lo contrario, el aceite líquido en contacto con la superficie sólida tiende a ser esférico en lugar de extenderse por la superficie. Además, encontramos que algunos aceites de perfluorocarbono populares (por ejemplo, 3M FC-40)16 y aceites hidrofluoroéter (por ejemplo, la serie 3M Novec) pueden disolver CYTOP como resultado de la morfología amorfa de CYTOP, que es fatal para la medición cuantitativa y sería cuestionable en términos de contaminación cruzada entre gotas. Afortunadamente, identificamos un aceite biocompatible y respetuoso con el medio ambiente que exhibe una tensión superficial inferior (< 19 mN/m)13. También encontramos un nuevo tensioactivo que puede disolverse en el aceite seleccionado y funcionar en una concentración baja (0,1%, al menos 10 veces menor que los populares reportados anteriormente26,27)13. El surfactante puede estabilizar la interfaz de agua/aceite resultante. Debido a la alta tasa de evaporación del aceite, después del lavado con el aceite, aplicamos otro aceite biocompatible y respetuoso con el medio ambiente para reemplazar el primero para sellar las microcámaras. Llamamos al primer aceite (ASAHIKLIN AE-3000 con 0,1 wt % SURFLON S-386) el "aceite de lavado" y el segundo aceite (Fomblin Y25) el "aceite de sellado", respectivamente.

La estrategia de sellado de aceite de dos pasos puede realizar una formación robusta de la matriz de gotas femtoliter en cuestión de minutos y sin instrumentación sofisticada. Debido al problema de evaporación, se ha considerado difícil generar microrreactores más pequeños que los volúmenes de picolitr28. FemDA abordó este problema optimizando sistemáticamente los materiales y procesos utilizados para la preparación de microrreactores/gotas. Varias características destacables de las gotas resultantes incluyen la alta uniformidad (o monodispersidad), estabilidad y biocompatibilidad a escala femtoliter. El coeficiente de variación (CV) del volumen de las gotas es de sólo 3% (sin corrección de viñetas para las imágenes microscópicas), el CV más pequeño entre las plataformas de gotas en el mundo, lo que asegura una medición altamente paralela y cuantitativa. La gota femtoliter es estable durante al menos 24 horas sin contaminación cruzada entre gotas a temperatura ambiente, lo que es valioso para una medición fiable del tiempo. En cuanto a la biocompatibilidad, logramos sintetizar varias proteínas a partir de una plantilla de ADN de una sola copia en la gota femtoliter, que anteriormente se había considerado difícil o ineficiente29,,30. Sería digno de esclarecer por qué algunas proteínas capaces de ser sintetizadas en el FemDA no se pueden sintetizar en otros sistemas de gotas. FemDA no fue simplemente un avance técnico, sino que también realizó una medición cuantitativa sin precedentes que puede correlacionar el rendimiento proteico (como refleja la intensidad de fluorescencia de la gota) con el número de moléculas de ADN de plantilla en cada gota. Como resultado, el histograma de la intensidad de fluorescencia de las gotas de CFPS basado en FemDA mostró una distribución discreta que puede ser bien ajustada por una suma de distribuciones gaussianas de intervalos iguales pico a pico. Además, la probabilidad de aparición de gotas que contienen diferentes números de moléculas de ADN era un ajuste perfecto a una distribución de Poisson31. Por lo tanto, el rendimiento proteico diferente en cada gota se puede normalizar en función de la distribución discreta. Esta característica crítica nos permite separar la información de actividad enzimática de la intensidad aparente, que aún no ha estado disponible con otras plataformas de microrreactores. Los sistemas de clasificación de células/gotas microfluídicas existentes son expertos en clasificación totalmente automática y buenos para concentrar muestras, pero a veces sólo pueden generar un histograma relativamente amplio o de cola larga en el aspecto analítico32,,33. Nuestro sistema FemDA altamente cuantitativo y biocompatible establece un nuevo punto de referencia y un alto estándar analítico en el campo del desarrollo de microrreactores.

Los aceites y tensioactivos que podrían ser utilizados para la preparación de gotas son todavía muylimitados 34. La combinación de ASAHIKLIN AE-3000 y SURFLON S-386 establecida en FemDA es un nuevo miembro del creciente arsenal de la interfaz fisioquímica entre la fase acuosa y la fase de aceite13. La nueva interfaz de FemDA es físicamente estable, químicamente inerte y biológicamente compatible con la compleja herramienta de transcripción, traducción y modificación post-traduccional para muchos tipos de proteínas13. Sería bastante atractivo encontrar una proteína que no se puede sintetizar en la configuración de gotas en su lugar. Además, el ahorro de costes de los reactivos es más evidente en el sistema de gotas femtoliter que en los sistemas de reactores nanolitros y picolitros35,36. En particular, a menudo habría un gran volumen muerto, que es causado principalmente por tubos o suministros externos, en sistemas de generación de gotas microfluídicas, pero no en nuestro FemDA. El formato de matriz también se ve favorecido por la caracterización microscópica repetida y detallada (similar al llamado análisis de alto contenido) para cada reactor37,en lugar de una sola instantánea para un objeto de movimiento rápido. La escala femtoliter permitió la integración de más de un millón de reactores en un área del tamaño de un dedo, mientras que el mismo número de reactores nanolitros (si existe) requiere sobre un área de metros cuadrados, lo que sin duda no sería práctico fabricar o utilizar dicho sistema.

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Protocol

1. Microfabricación del sustrato de la matriz de microcámaras femtoliter

NOTA: Lleve a cabo el siguiente experimento de microfabricación en una sala limpia. Use guantes y un traje de cuarto limpio antes de entrar en la sala limpia.

  1. Sustrato de vidrio de la cubierta de limpieza
    1. Ponga el vidrio de la cubierta en un estante de tinción de vidrio de cubierta. Sonicar el vidrio de la cubierta en hidróxido de sodio de 8 M (NaOH) durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT).
      ADVERTENCIA: NaOH en altas concentraciones es altamente peligroso para la piel y los ojos. Manéjelo suavemente sin ningún tipo de salpicaduras.
    2. Saque el bastidor de la solución NaOH y enjuague el vaso de la cubierta con agua durante diez veces. Mantenga el vaso de la cubierta en el agua pura.
      NOTA: Deseche los residuos alcalinos en el tanque designado. La solución NaOH se puede reciclar en la botella original y utilizarse hasta cinco veces.
    3. Seque cada pieza de vidrio de la cubierta con una pistola de aire.
    4. Hornee el vidrio de la cubierta seca sobre una placa caliente a 200 oC durante 5 min. Mantenga la orientación de la parte superior del sustrato de vidrio consistente durante los siguientes procesos de manipulación.
  2. Silanización de la superficie de vidrio
    1. Restablezca el cristal de la cubierta limpia en un estante de tinción en seco.
    2. Añadir 150 ml de etanol en un vaso de precipitados de PTFE. Utilice una aguja (22 G x 70 mm) equipada con jeringa de 1 ml para extraer 0,075 ml de trietilatoxisilano (3-aminopropil) e inyecte inmediatamente al etanol (es decir, 0,05 vol %). Tire y empuje la jeringa varias veces para enjuagar el interior de la jeringa. Revuelva la solución con la aguja para que sea homogénea.
      NOTA: (3-aminopropil)triexisilano se puede almacenar a temperatura ambiente y 1 atm de presión durante dos años con un sellado hermético. El etanol absoluto debe estar herméticamente sellado después de su uso. No recomendamos el uso de reactivos caducados.
    3. Incubar el vidrio de la cubierta en la solución de 0,05 vol % de aminosilano durante 1 h en RT.
    4. Enjuague el vaso de la cubierta con agua pura durante cinco veces. Mantenga el vaso de la cubierta en el agua pura.
      NOTA: Deseche los residuos en el tanque designado.
    5. Seque cada pieza de vidrio de la cubierta con la pistola de aire.
    6. Coloque todo el vidrio de la cubierta seca en papel de aluminio. Hornee el cristal de la cubierta en la placa caliente a 80 oC durante 5 min.
  3. Perfluoropolímero CYTOP de recubrimiento de espín
    1. Coloque el cristal de la cubierta en un mandril de vacío personalizado de una recubridora de espín(Figura 1A). Encienda el interruptor de vacío para fijar el sustrato de vidrio.
      NOTA: El diseño del portabrocas de vacío es crucial para un recubrimiento uniforme de polímero viscoso en el sustrato rectangular (24 mm x 32 mm) y delgado (0,13-0,17 mm)(Figura 1A). Encontramos que una etapa de muestra rectangular con múltiples orificios (48 agujeros, cada uno con 1 mm de diámetro) que se conectaba al canal de vacío funcionaba mejor que la etapa redonda con un solo agujero central.
    2. Suelte 70-90 l del polímero CYTOP tipo A en el centro del sustrato de vidrio. Inmediatamente spin-coat el polímero (Figura 1B).
      NOTA: La condición de recubrimiento de espín (3.400 rpm, 30 s) proporciona un espesor de 3 m. Utilice la micropipeta diseñada para líquido viscoso. Sujete la micropipeta en posición vertical para que el polímero caiga casi perfectamente en el sustrato. A menudo se genera una burbuja de aire dentro de la punta de la pipeta a medida que el émbolo se mueve hacia abajo. No deje caer la última gota de CYTOP con la burbuja.
    3. Recoja el vidrio recubierto con los dedos sosteniendo las esquinas del sustrato de vidrio, y colóquelo en papel de aluminio.
    4. Repita los pasos 1.3.1-1.3.3 para recubrir todas las piezas restantes del vidrio de la cubierta.
    5. Hornear el vaso recubierto a 80oC durante 30 min y luego a 200oC durante 1 h.
      NOTA: Este procesamiento cura completamente el CYTOP y une covalentemente el CYTOP a la superficie de vidrio. Cubra el área de horneado con una tapa hecha de papel de aluminio para evitar el polvo potencial durante el proceso de horneado durante mucho tiempo si es necesario.
    6. Retire el cristal de la cubierta recubierto con CYTOP de la placa de cocción y enfríe hasta RT. Recoja cuidadosamente cada pieza del vidrio recubierto e inspeccione para ver si está correctamente recubierto. Deseche el sustrato que exhibe recubrimiento inhomogéneo.
      NOTA: La superficie de un CYTOP bien recubierto debe verse plana sin patrones irregulares de arco iris(Figura 1C). La inspección visual desde un ángulo adecuado puede juzgar rápidamente la planitud, así como la calidad del recubrimiento. El protocolo se puede pausar aquí.
  4. Fotorresista de revestimiento giratorio
    1. Coloque el vidrio de la cubierta recubierto con CYTOP en el portabrocas de vacío (ver paso 1.3.1) de la recubridora de espín. Encienda el interruptor de vacío para fijar el cristal de la cubierta.
    2. Colocar 0,2-0,3 ml de fotorresistir en el centro del sustrato. Inmediatamente gira-recubrir el fotorresistir a 6.000 rpm durante 60 s.
      NOTA: No deje caer la última gota del fotorresista con burbujas. Si la recubridora de centrifugado admite una mayor velocidad de giro, la velocidad de centrifugado podría ser de hasta 7.500 rpm para lograr un recubrimiento más delgado. La baja energía superficial de CYTOP evita que la mayoría de los fotorresistentes se adhieran a su superficie. Si AZ P4903 fotorresistero no está disponible, AZ P4620 fotoresiste es una buena alternativa.
    3. Recoger el sustrato recubierto con dos dedos sosteniendo las esquinas del sustrato. Limpie el exceso de fotorresistir cerca del borde del sustrato (a menudo llamado eliminación de perlas de borde o EBR) utilizando un limpiaparabrisas empapado en etanol (Figura 1D). Coloque el sustrato sobre la lámina de aluminio.
      NOTA: La acetona NO se recomienda para EBR.
    4. Repita los pasos 1.4.1-1.4.3 para recubrir el fotorresisto para las piezas restantes de vidrio de cubierta recubierto con CYTOP. Recoja cada pieza del vidrio recubierto e inspeccione para ver si está bien recubierto.
      NOTA: La superficie de un fotorresista bien recubierto debe verse plana sin patrones irregulares(Figura 1D). La inspección visual desde un ángulo adecuado puede juzgar rápidamente la planitud, así como la calidad del recubrimiento. El sustrato que presenta recubrimiento inhomogéneo se puede reciclar mediante lavado con acetona, 2-propanol y H2O en secuencia, y reutilizado.
    5. Hornee el sustrato recubierto a 110 oC durante 5 minutos en la placa de cocción.
    6. Retire el sustrato recubierto de la placa de cocción y enfríe a RT. Dejar reposar durante 30 min a una humedad relativa del 40%-60% para la rehidratación del fotorresistero.
      NOTA: H2O es necesario para la siguiente reacción fotoquímica. El fotorresista horneado perdió el contenido de H2O dentro del fotorresista. El proceso de rehidratación permite que H2O sea absorbido del aire. La humedad relativa inferior al 20% o superior al 80% no es adecuada para el proceso de rehidratación.
  5. Fotolitografía
    1. Durante el tiempo de espera de la rehidratación (ver paso 1.4.6), encienda el alineador de máscara. Caliente la fuente de luz. Cargue la fotomasca cromada.
      NOTA: Siga el manual de instrucciones para utilizar el alineador de máscara. La fotomasca se puede fabricar a través de la litografía de haz de electrones (EB) si la instalación EB está disponible. Alternativamente, la fotomasca se puede subcontratar a una empresa local.
    2. Cargue el sustrato rehidrado (después del paso de acabado 1.4.6) en el mandril (Figura 1E).
    3. Establezca los parámetros de exposición. Exponga el sustrato durante 25 s con una intensidad UV de 13 mW/cm2 (línea h) en el modo de contacto de vacío. A continuación, descargue el sustrato y póngalo en el estante de tinción de vidrio de la cubierta (el mismo bastidor utilizado en el paso 1.1.1).
    4. Repita los pasos 1.5.2-1.5.3 para exponer las piezas restantes del sustrato rehidrado.
  6. Desarrollo
    1. Desarrollar el sustrato durante 5 min para disolver el fotorresista expuesto (Figura 1F). Durante el cual, agitar suavemente el bastidor en el desarrollador una vez en el punto de tiempo de 4 minutos.
      NOTA: El desarrollador era AZ 300 MIF. Los desarrolladores alcalinos alternativos (por ejemplo, AZ 400 K) son generalmente aplicables para el desarrollo, pero deben requerir la optimización de las condiciones de desarrollo (por ejemplo, tiempo, temperatura, agitación). NO utilice vasos de vidrio como contenedor para desarrolladores.
    2. Enjuague el sustrato con agua pura durante diez veces. Mantenga el vaso de la cubierta en el agua pura.
      NOTA: Deseche al desarrollador al tanque designado.
    3. Seque completamente cada pieza de sustrato con la pistola de soplado de aire.
  7. Grabado de iones reactivos
    1. Coloque el sustrato seco (del paso 1.6.3) en la cámara de reacción de la máquina de grabado de iones reactivos (RIE).
      NOTA: De acuerdo con la regla de mantenimiento de la instalación, la máquina RIE puede estar siempre encendida o apagada cada vez. Si el interruptor estaba apagado, encienda el interruptor de acuerdo con el manual.
    2. Etch el CYTOP descubierto fotorresistido con el plasma O2 (Figura 1G).
      NOTA: La condición de RIE era la siguiente. O2 caudal de gas: 50 sccm; Presión de la cámara: 10.0 Pa; Potencia RF: 50 W; Tiempo de grabado: 27 min. El tiempo de grabado se optimizó para el grabado completamente de 3 m de espesor de CYTOP.
    3. Recoja cada pieza de sustrato de la cámara de reacción con la pinza y colóquela en el estante de tinción de vidrio de la cubierta.
      NOTA: De acuerdo con la regla de mantenimiento de la instalación, la cámara de reacción puede requerir un proceso corto de limpieza plasmática O2 (por ejemplo, tiempo de grabado: 5 min) para mantener la cámara de reacción limpia después de cada carrera.
  8. Eliminación del fotorresistir y la limpieza
    1. Sonicar el sustrato en acetona durante 5 min en RT para disolver el fotorresistir restante.
    2. Sonicar el sustrato en 2-propanol durante 5 min en RT.
    3. Enjuague el sustrato con agua pura durante cinco veces. Sonicar el sustrato durante 5 min en RT. Enjuague la muestra con agua pura durante otras cinco veces. Mantener el sustrato en agua pura.
    4. Seque cada pieza de sustrato con la pistola de aire(Figura 1H).
      NOTA: El sustrato se puede almacenar en un plato de plástico Petri. El sustrato fabricado es estructuralmente estable en RT durante al menos un año. El protocolo se puede pausar aquí.
    5. Caracterice el perfil de superficie del sustrato preparado mediante microscopía confocal de barrido láser tridimensional (3D), interferometría de luz blanca (o interferometría de exploración de coherencia) o microscopía electrónica de barrido. Utilice el software respectivo para medir el diámetro y la profundidad de las microcámaras resultantes.
      NOTA: La muestra se puede reutilizar para otros experimentos después de la caracterización con el microscopio confocal de escaneo láser 3D no destructivo y sin contacto o el interferómetro de luz blanca. El protocolo se puede pausar aquí.

2. Preparación del microcanal polidimetilsiloxano (PDMS)

NOTA: NO use guantes de látex para manejar PDMS. En su lugar, use guantes de polietileno (PE).

  1. Hacer el maestro de microcanal
    1. Corte una cinta adhesiva de doble recubrimiento con película Kapton en una forma de microcanal definida (3 mm x 19 mm) utilizando un cortador de escritorio.
      NOTA: La cinta Kapton fue No. 7602 #25 (Teraoka Seisakusho), lo que resultó en una altura de canal de 135 m. El cortador de escritorio STIKA utiliza un plugin (disponible en el sitio web de Roland: https://www.rolanddga.com) de Adobe Illustrator para ejecutar el corte según el dibujo en el archivo de Adobe Illustrator. El protocolo se puede pausar aquí.
    2. Pega cada cinta Kapton cortada en el fondo plano de un plato de Petri. El plato Petri estándar de 90 mm puede acomodar 12 piezas de la cinta.
      NOTA: La estructura de desahogo sirve como maestro para el moldeo de réplica de PDMS. Presione suavemente la superficie de la cinta con una pinza si hay burbujas de aire empareadas entre la cinta y el sustrato del plato Petri. Alternativamente, la litografía suave clásica se puede aplicar para preparar al maestro en una oblea de silicio38. El protocolo se puede pausar aquí.
  2. Curado de resina PDMS en el plato Petri con patrón de cinta
    1. Use guantes de PE nuevos y transfiera 2,5 g del agente de curado de elastómero de silicona SYLGARD 184 utilizando una pipeta de plástico desechable en el vaso de plástico especificado (Figura 2A).
    2. Cambie a nuevos guantes y transfiera 25 g de la base del prepolímero de elastómero de silicona SYLGARD 184 utilizando una jeringa desechable de 50 ml al vaso de plástico anterior.
      NOTA: Cambie los guantes aquí presentes para evitar la posible contaminación cruzada del agente de curado a la base.
    3. Utilice un mezclador de desaeración para mezclar y desaerar la mezcla (programa: 3 min mezcla seguida de 2 min de deaeración).
      NOTA: Si el mezclador de desaeración no está disponible, se puede desgaserar una mezcla agitada manualmente (durante unos 15 minutos) en una cámara de vacío.
    4. Vierta la mezcla PDMS en la placa Petri con patrón de cinta (Figura 2B). Ajuste el plato Petri en una mini cámara de vacío y desaerte la mezcla PDMS para 1-3 h(Figura 2C).
      NOTA: Si queda aire en la mezcla de PDMS después de 1 h, saque el plato Petri de la cámara de vacío, rompa la burbuja de aire con un soplador de aire y, a continuación, vuelva a colocar el plato Petri en la cámara de vacío y continúe con el proceso de desaeración.
    5. Colocar el plato Petri en un horno a 60oC durante la noche para curar el PDMS(Figura 2D).
      NOTA: Aunque el aumento de la temperatura puede acortar el tiempo de curado, la temperatura máxima que puede tolerar el plato de poliestireno Petri sin deformación física es de unos 60 oC.
  3. Replica de moldeo del canal PDMS
    1. Pelar el elastómero PDMS curado de la placa Petri (Figura 2E).
    2. Corte cada pieza de bloques de canales PDMS utilizando una cortadora de cable plano (Figura 2F).
    3. Coloque el elastómero PDMS en una estera de corte que mira hacia arriba el canal. Perforar un agujero en cada extremo del canal usando un punzón de biopsia(Figura 2G).
    4. Limpie la superficie del canal PDMS con cinta escocesa. A continuación, envuelva la resina PDMS en otra pieza de cinta escocesa para mantenerla limpia antes de usarla. Almacene el canal PDMS preparado en un plato limpio de Petri.
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.

3. Montaje del dispositivo de matriz de microcámara femtoliter

  1. Coloque algunos trozos de limpiaparabrisas limpios empapados en agua a lo largo de la pared interior de un plato de Petri para hacer una cámara humidificadora simplificada. Coloque la resina PDMS cubierta por la cinta escocesa en la cámara humidificadora y selle la cámara con película de parafina. Incubar durante al menos 3 h, pero no más de un día.
    NOTA: PDMS es un material poroso que permite que el gas pase a través de la resina39. La estructura porosa de PDMS conduce a una absorción de moléculas de agua desde el entorno hasta alcanzar un equilibrio. Este pretratamiento llena los poros de PDMS con vapor de agua y puede reprimir significativamente la evaporación de gotas acuosas adyacentes al borde del canal PDMS.
  2. Quite la cinta escocesa de la resina PDMS. Coloque el canal PDMS en el área de la matriz de microcámaras del sustrato (Figura 2H).
    NOTA: La resina PDMS se adhiere reversiblemente a la superficie CYTOP. Presione suavemente el bloque PDMS con una pinza para eliminar cualquier burbuja de aire entre la resina PDMS y el sustrato si existiera.
  3. Inserte una punta de pipeta no filtrada de 200 ml en una (como salida) de los orificios del canal PDMS.
    NOTA: La resistencia a la adhesión entre PDMS y CYTOP es limitada. Para evitar la deformación física de la resina PDMS, así como el desprendimiento del canal PDMS fuera de la superficie, no inserte la punta de la pipeta demasiado profunda.

4. Carga de la solución de reacción en el dispositivo montado

  1. Ponga un soporte de microtubo de aluminio en el hielo. Precaer el aceite de descarga (aceite ASAHIKLIN AE-3000 mezclado con 0,1 wt % SURfactante SURFLON S-386) en un microtubo de 1,5 ml en el soporte de aluminio.
  2. Pon otro bloque de aluminio en el hielo.
  3. Preparación de la solución de reacción CFPS
    1. Prepare la solución de reacción CFPS en un tubo PCR. Mezclar cada componente alícuota del kit CFPS, un ADN de plantilla diluido (como se ejemplifica en este documento por la solución de proteína fluorescente mNeonGreen40 y Escherichia coli fosfatasa alcalina41)y otros componentes necesarios según las necesidades específicas (por ejemplo, inhibidor de la RNase, sustrato fluorogénico, caperido).
      NOTA: El ADN de la plantilla utilizado para CFPS debe prepararse de acuerdo con las instrucciones del kit CFPS correspondiente. Esta demostración aplicó un sistema de expresión basado en T742. Debido a que el consumo de reactivos en el dispositivo FemDA es bastante pequeño, 10 l es lo suficientemente grande como para llenar todo el canal PDMS.
    2. Para la síntesis de proteínas fluorescentes mNeonGreen, mezcle los componentes en el siguiente orden: añadir 2,7 ml de H2O libre de nucleasas a una alícuota de 6 l de la solución A (del kit CFPS); añadir 0,3 l de inhibidor de la RNase; añadir 1,5 l de solución de ADN de plantilla diluida; mezclar y transferir brevemente la mezcla a una alícuota de 4,5 ml de la solución B (del kit CFPS).
      NOTA: El volumen total es de 15 l. Dado que la cantidad de cada alícuota es proporcional al volumen total de la mezcla final, un volumen total inferior a 10 l puede dar lugar a un volumen demasiado pequeño (< 0,2 l) de alguna alícuota componente.
    3. Para la síntesis de fosfatasa alcalina, mezclar los componentes en el siguiente orden: añadir 1,2 l de H2O a 6 l de la solución A; añadir 0,3 l de inhibidor de la RNase; añadir 0,6 l de potenciador de unión de disulfuro 1 y 2 (de un kit); añadir 0,3 l de 5 mM 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl fosfato (DiFMUP); añadir 1,5 l de solución de ADN; mezclar brevemente y transferir la mezcla a 4,5 ml de la solución B.
      NOTA: En el ensayo de fosfatasa alcalina, el sustrato fluorogénico DiFMUP puede producir altamente fluorescente 6,8-difluoro-7-hidroxi-4-metilcoumarina (DiFMU) tras el escisión enzimática del grupo de fosfato terminal.
  4. Dibuje 10 l de la mezcla con una punta de pipeta no filtrada de 200 l. Inserte la punta de la pipeta en el orificio de entrada (consulte el paso 3.3) del canal PDMS. Empuje hacia abajo el émbolo para inyectar la solución en el canal hasta que se desborde de la salida (donde ya se ha insertado otra punta de pipeta en el paso 3.3).
  5. Separe la pipeta de la punta de la pipeta y mantenga estas dos puntas de pipeta todavía insertadas en la entrada y salida.
    NOTA: Evite generar burbujas de aire durante el pipeteo. No deje el pulgar del émbolo hasta separar la pipeta de la punta de la pipeta para evitar el flujo posterior de la solución dentro del canal PDMS.

5. Generación de matriz de gotas femtoliter (FemDA) para CFPS

  1. Transfiera todo el conjunto del dispositivo montado al bloque de aluminio pre-refrigerado (ver paso 4.2). Confirme cuidadosamente que el área de la matriz de microcámaras pasa rápidamente de translúcida (Figura 2I) a transparente (Figura 2J).
    NOTA: La solución de reacción CFPS no puede entrar directamente en las microcámaras. La solubilidad del aire en el agua es inversamente proporcional a la temperatura. El aire atrapado se disolverá en la solución después de que el dispositivo se movió de RT a la baja temperatura. El cambio de transparencia es un indicador visual conveniente para juzgar si la solución entra en las microcámaras.
  2. Extraiga 30 l del aceite de descarga preenfriado (ver paso 4.1) e inmediatamente transfiera el aceite a la punta de la pipeta insertada desde su abertura superior. El aceite al ras se mueve en el canal y extruye la solución de reacción excesiva situada fuera de las microcámaras. Cada microcámara es aislada por el aceite de descarga.
    NOTA: La interfaz móvil entre la solución de reacción y el aceite de descarga es visible, lo que ayuda a las personas a observar el movimiento del fluido dentro del canal. La solución extruida se puede recoger en el tubo anterior, almacenarse a 4 oC y reutilizarse para otro dispositivo FemDA o una reacción a granel paralela (en el microtubo o en una placa de microtíter).
  3. Pre-dibujar 30 l de aceite de sellado (Fomblin Y25) a una punta de pipeta filtrada de 200 l. Cuelgue la pipeta en posición vertical en alguna parte.
  4. Retire simultáneamente las dos puntas de pipeta insertadas (consulte los pasos 3.3 y 4.4) del dispositivo. Mueva inmediatamente el dispositivo del bloque de aluminio al parafilm.
    NOTA: Utilice una pinza para fijar (pero mantener alejado del área del canal) el dispositivo en el bloque de aluminio durante el período de extracción de las puntas de la pipeta.
  5. Inserte inmediatamente la punta de pipeta lista que contiene el aceite de sellado (ver paso 5.3) en la entrada del canal PDMS e inyecte el aceite en el canal hasta que se desborde de la salida.
    NOTA: Realice este paso tan pronto como mueva el dispositivo a RT. Para evitar el contraflujo dentro del canal, no deje el pulgar del émbolo hasta que el aceite de sellado se desborde de la salida. El aceite de descarga se evapora inmediatamente después de salir de la salida del canal, mientras que el siguiente aceite de sellado se acumula en la salida debido a su pérdida de evaporación extremadamente baja.
  6. Separe la pipeta de la punta de la pipeta y, a continuación, retire la punta de la pipeta del dispositivo. Limpie la superficie de PDMS con una pieza del limpiaparabrisas limpio y, a continuación, aplique una nueva gota de aceite de sellado a la entrada y salida, respectivamente. Las gotas femtoliter están selladas en microcámaras individuales por el aceite.
    NOTA: Utilice una pinza para fijar (pero mantener alejado del área del canal) el canal PDMS en el sustrato durante el período de eliminación de la punta de micropipeta.
  7. Limpie la humedad acumulada en la superficie inferior del vidrio de la cubierta. El dispositivo FemDA preparado ya está listo para la incubación y la microscopía de imágenes.

6. Imágenes de microscopía

  1. Poner en marcha un microscopio de fluorescencia invertido. Espere a que la estabilización (refrigeración) de la cámara. Utilice una lente objetivo de inmersión de aceite de 60x o 100x. Ajuste el dispositivo FemDA en el escenario motorizado. Establezca los parámetros de imagen.
    NOTA: Los parámetros de imagen incluyen la ruta del archivo, los canales de imagen, los filtros, los tiempos de exposición (en general, 100 ms es suficiente; el tiempo más corto o más largo también es posible de acuerdo con las especificaciones de la cámara) y la intensidad de la luz.
  2. Encuentra el plano focal. Ajuste la posición del eje z de la lente objetivo y fije el plano focal mediante un sistema de enfoque automático interno. Establezca la región de interés (ROI; es decir, x, Y-axis) que se va a crear una imagen.
    NOTA: Los principales fabricantes de microscopios (Nikon, Olympus, Zeiss, Leica) ofrecen la opción de integrar el sistema de enfoque automático con el microscopio. Este sistema de enfoque automático es necesario para mantener el plano focal constante durante la toma automática de imágenes multiárea. Los ROI cubren el área FemDA en el canal PDMS.
  3. Capturar las imágenes de fluorescencia. Capture un solo fotograma de una imagen de campo brillante (BF) desenfocada para cada ROI. NO cambie el orden y las coordenadas de los ROI al tomar imágenes de los diferentes canales.

7. Análisis de datos de imagen

NOTA: Analice los datos de la imagen utilizando un plugin casero (llamado "FemDA") basado en Fiji (http://fiji.sc) para extraer la intensidad de fluorescencia de cada gota43. Instale la versión correcta de Fiji según el sistema operativo. Fiji es compatible con la mayoría de los formatos de archivo de imagen (por ejemplo, el archivo nd2 del microscopio Nikon, archivo czi del microscopio Zeiss) utilizando un plugin integrado "Bio-Formats."

  1. Instalación de plugins
    1. Copie y pegue el archivo del plugin (que está disponible tras la consulta al autor correspondiente o a través del siguiente enlace institucional: https://fbox.jamstec.go.jp/public/FcsQwAsMKIqA9j0B2MJwLUMeHGsxp09hAkAFdVhQIDkZ) en la carpeta "plugins" de Fiji.
    2. Inicie el software Fiji; el plugin "FemDA" se puede encontrar en el menú desplegable "Plugins" de Fiji.
  2. Preprocesamiento de datos de imagen
    1. Abra la imagen BF desenfocada (consulte el paso 6.3). Haga clic en Proceso de proceso ( Process) Restar fondo... para eliminar fondos continuos suaves de cada fotograma de los datos de imagen (Figura 4B). Haga clic en Proceso de proceso ( Process) Filtros ? Mediana para reducir el ruido de cada fotograma de los datos de la imagen (Figura 4C).
    2. Haga clic en Imagen ( Image) Ajustar ? Umbral para comprobar y separar el primer plano (que indica las microcámaras) del fondo (que indica el área fuera de las microcámaras) de cada fotograma de los datos de la imagen (inserciones magnificadas en la Figura 4A-C).
      NOTA: Seleccione un algoritmo adecuado de la lista desplegable de la ventana Umbral para que solo las áreas de microcámara, así como los bordes de cada microcámara, puedan identificarse y resaltarse como primer plano. En particular, la mayoría de los bordes resaltados deben ser continuos sin huecos.
  3. Determinación de coordenadas de gotas
    1. Haga clic en Plugins (Plugins) FemDA ? FemDA Analysis para abrir la interfaz gráfica de usuario (GUI) del plugin personalizado (la mitad superior de la Figura 4D).
    2. Introduzca el número mínimo y máximo aproximado de píxeles de una sola microcámara. Introduzca la circularidad mínima y máxima esperada (0: forma arbitraria; 1: círculo perfecto) de las microcámaras. Introduzca el número de fotograma del fotograma inicial y el fotograma final.
    3. Haga clic en Generar ROI en la GUI para detectar cada microcámara, y los ROI detectados correctamente se muestran en una ventana emergente ROITable.
    4. Vuelva a la ventana Análisis FemDA y haga clic en el botón Aplicar máscara de ROI para comprobar si las microcámaras sobre las tramas se detectaron correctamente (abajo a la izquierda de la Figura 4D). Si no, modifique algunos de ellos y repita haciendo clic en Generar ROI y Aplicar máscara de ROI. En caso afirmativo, vaya al siguiente paso.
      NOTA: Puede haber muy pocas microcámaras que no se pueden identificar bien como el ROI (ver la mitad inferior de la Figura 4D)por cualquier algoritmo del Umbral debido al contraste insuficiente entre el primer plano y el fondo. No es problemático en el punto de vista estadístico.
  4. Extracción de intensidad de fluorescencia
    1. Abra la imagen de fluorescencia y tráela al frente. Haga clic en Aplicar máscara de ROI de nuevo para aplicar los ROI determinados a la imagen de fluorescencia (abajo a la derecha de la Figura 4D).
    2. Seleccione One-Shot para analizar una imagen de punto final (como se ejemplifica con los datos mNeonGreen) o Time-Lapse para analizar datos de curso de tiempo (como se ejemplifica con los datos de fosfatasa alcalina).
    3. Entrada 100 en el cuadro Número de píxeles superiores significa que solo se utilizarán los 100 píxeles superiores de cada ROI para calcular la intensidad media de la gota correspondiente. Si la entrada 0 en el Número de píxeles superiores, se utilizarán todos los píxeles de cada ROI para calcular la intensidad media de la gota correspondiente.
      NOTA: Puede haber una deriva de varios píxeles entre el BF y las imágenes de fluorescencia, lo que significa que algunos píxeles dentro de los ROI pueden pertenecer al fondo de la imagen de fluorescencia. Por lo tanto, el plugin proporciona una opción para especificar el número de píxeles clasificados de intensidad superior para el cálculo de la intensidad media de cada gota.
    4. Para el análisis de la imagen de punto final (es decir, seleccione One-Shot en el paso 7.4.2), haga clic en el botón Medir intensidad para calcular las intensidades medias de todas las gotas detectadas. ROITable se actualiza con los nuevos datos de la imagen de fluorescencia. Mientras tanto, se muestra un histograma en una nueva ventana emergente Histograma (Figura 4E).
      NOTA: Cambiar el tamaño de la bandeja en el cuadro Número de ubicación puede optimizar la visualización del histograma. Una adaptación a una suma de distribuciones gaussianas se puede lograr en la interfaz gráfica de usuario desarrollada. La ventana emergente Registro de Fiji muestra los resultados de la conexión. Alternativamente, exporte los datos haciendo clic en el botón Guardar como texto y realizar varios análisis estadísticos con otro software ( Figura4F, G).
    5. Para el análisis de la imagen del curso de tiempo (es decir, seleccione Time-Lapse en el paso 7.4.2), la ventana emergente es Curso de tiempo de intensidad en lugar de Histograma, que contiene un histograma correspondiente a un punto de tiempo específico y una gráfica de intensidad de tiempo (Figura 5). Los datos textuales también se pueden exportar mediante el menú Archivo de la ventana emergente.

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Representative Results

El proceso de microfabricación consiste en limpieza de sustratos, funcionalización de la superficie, recubrimiento CYTOP, fotolitografía, grabado en seco, desmontaje fotorresista y limpieza final. Es importante destacar que el protocolo presentado permitió la eliminación completa del polímero HIDROfóbico CYTOP dentro de las microcámaras Figura 3A),produciendo una estructura hidrófila-en-hidrófoba altamente paralela sobre un sustrato de vidrio de cubierta estándar. Con la ayuda del protocolo de sellado de aceite, la dimensión uniforme de las gotas resultantes se verificó encapsulando la solución fluorescente en las microcámaras (Figura 3B). La intensidad de fluorescencia extraída utilizando el software desarrollado es un buen indicador del tamaño de las gotas. El CV de la intensidad de fluorescencia, 3%, reflejaba la estrecha distribución del tamaño de las gotas en toda la matriz (Figura 3C). La imagen 3D reconstruida a partir de microscopía confocal también mostró el volumen consistente de gotas a lo largo del tiempo (Figura 3D, Película Suplementaria 1)44. En comparación, un aceite FC-40 ampliamente utilizado generó las gotas exhibiendo una diferencia múltiple en la intensidad de fluorescencia45. Las gotas formadas en FemDA fueron estables en RT durante al menos 24 horas(Figura 3E). La alta calidad de las gotas finalmente formó la base de la medición cuantitativa.

Los datos de alto rendimiento requieren herramientas de análisis de datos de alto rendimiento46,47. El plugin desarrollado simplifica en gran medida y aceleró el análisis de datos de imagen. Sobre la base de la teoría del procesamiento de imágenes digitales48, la imagen BF desenfocada se puede binarizar y utilizar para proporcionar la información de coordenadas de cada gota después de la corrección de fondo y la reducción de ruido (Figura 4A-C). Esta idea hizo posible la localización precisa de las gotas oscuras.

La proteína fluorescente mNeonGreen fue sintetizada en FemDA. El ADN de la plantilla con una concentración de 0,05 moléculas por gota se distribuyó aleatoriamente en cada gota para iniciar la síntesis de proteínas con reacciones de transcripción y traducción sin células acopladas. Debido a que el número promedio de moléculas de ADN por gota era menor que 1, algunas gotas contenían ADN de plantilla cero, mientras que otras contenían una o más moléculas de ADN. Después de 6 horas de incubación en RT, la imagen de punto final fue capturada usando el microscopio. Los datos de imagen de pila fueron analizados por el software desarrollado con la ayuda de la imagen BF desenfocada simultánea(Figura 4A-E). La intensidad de fluorescencia de cada gota es una medida del rendimiento proteico en la gota correspondiente. El histograma de las intensidades de fluorescencia mostró una distribución discreta y estaba bien ajustado por una suma de distribuciones gaussianas de intervalos iguales de pico a pico (Figura 4F), que sugería fuertemente una ocupación de diferentes números de moléculas de ADN por gota. Al igual que el repetido juego de volteo de monedas, el número de eventos aleatorios independientes que ocurren es descrito matemáticamente por la distribución de Poisson. La probabilidad de aparición de gotas que contienen diferentes números (hasta 3 en este ejemplo) de moléculas de ADN era un ajuste perfecto a una distribución de Poisson (P - e-o •k / k!, donde es el número medio esperado de moléculas de ADN por gota y k es el número real de moléculas de ADN en una gota) con un promedio de 0,05 moléculas de ADN por gota (Figura 4G)31, como se espera para una distribución aleatoria de moléculas de ADN. Debido a que la concentración de carga de la solución de ADN de la plantilla era la misma que la final ajustada (es decir, 0,05), la eficiencia de reacción CFPS en nuestra FemDA fue del 100% (o cerca del 100%). En otras palabras, una sola molécula de ADN es suficiente para desencadenar la reacción CFPS en la gota femtoliter eficientemente.

La reacción CFPS de fosfatasa alcalina se registró cada 5 minutos. El software desarrollado también admite el análisis de los datos del curso de tiempo(Figura 5). La reacción fluorogénica acoplada mostró una distribución discreta similar de la intensidad de fluorescencia de las gotas en puntos de tiempo anteriores. Los resultados del histograma también verificaron una ocupación de diferentes números de moléculas de ADN en la gota. La intensidad de la fluorescencia finalmente convergió a un valor junto con el agotamiento gradual del sustrato fluorogénico DiFMUP.

Figure 1
Figura 1: Proceso de microfabricación del sustrato de la matriz de microcámara de ultra alta densidad. (A) Dibujo técnico del portabrocas de vacío personalizado. Unidad: mm. (B) Datos de espesor de película CYTOP frente a datos de velocidad de giro. (C) Recubrimiento giratorio del perfluoropolímero CYTOP sobre un sustrato de vidrio silanizado. Las fotografías mostraron un buen ejemplo de recubrimiento homogéneo y un mal ejemplo de recubrimiento inhomogéneo, respectivamente. La flecha negra indicaba la posición específica de la película CYTOP inhomogénea. (D) Recubrimiento giratorio de fotorresisí en el sustrato recubierto con CYTOP. Después del recubrimiento de espín, el fotorresistente cerca del borde del sustrato debe retirarse con un limpiaparabrisas limpio empapado en etanol (fotografía intermedia). Las fotografías mostraron un buen ejemplo de recubrimiento homogéneo y un mal ejemplo de recubrimiento inhomogéneo, respectivamente. La flecha blanca indicaba la posición específica de la película fotorresista inhomogénea. (E) Exposición del fotorresista recubierto utilizando un alineador de máscara. (F) Desarrollo del fotorresista expuesto en un desarrollador. La parte expuesta del fotorresistir es soluble en la solución para desarrolladores. (G) Grabado de iones reactivos de CYTOP. El CYTOP descubierto fue eliminado por plasma O2. (H) Eliminación de la máscara fotorresistir. El fotorresista fue eliminado por acetona. El sustrato se limpió usando 2-propanol y H2O. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Preparación y uso del dispositivo de matriz de microcámaras. (A) Pesar el agente de curado y el prepolímero de PDMS. (B) Verter la mezcla mezcla mezclada y desaérada en un plato de Petri con estampado de cinta. Había algunas burbujas de aire recién generadas en la mezcla de polímeros. (C) Desaertura de la mezcla de nuevo en una cámara de vacío. Las burbujas de aire estaban subiendo y estallaban en la superficie superior. (D) La resina PDMS desaérada y curada. (E) Pelar el elastómero PDMS curado del plato Petri. (F) Cortar cada pieza de bloques de canal PDMS mediante una cortadora de cable plano. (G) Perforación de agujeros en cada extremo del canal PDMS mediante un punzón de biopsia. (H) El dispositivo montado. La resina PDMS puede adherirse a la superficie CYTOP. (I) El área de la matriz de microcámaras translúcidas dentro del canal PDMS llena con la solución acuosa antes de enfriar. (J) Área transparente de la matriz de microcámaras dentro del canal PDMS después del enfriamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Gotas de femtoliter ultra uniform uniformes y ultraestables. (A) Imágenes de microscopía confocal de escaneo láser 3D para el sustrato fabricado. Las microcámaras cilíndricas de la imagen de ejemplo mostraban una altura de 3 m y un diámetro de 4 m. (B) Gotas femtoliter uniformes sobre un área grande de la matriz plana. Aquí solo se muestra un área parcial de toda la matriz. Se selló una solución fluorescente (10 m ATTO-514) en cada gota. (C) La distribución del tamaño de las gotas sobre una matriz única completa. La intensidad de fluorescencia se utilizó como un indicador del tamaño de las gotas. El CV era sólo del 3%. (D) Medición volumétrica utilizando datos de tiempo de pila z confocales. El volumen de gotas sobre la matriz fue dado por el software del microscopio (NIS-Elements, Nikon). (E) Recuperación de la fluorescencia después de la fotoblancada. Después del primer fotograma, varias gotas fueron completamente fotoblancadas usando un rayo láser confinado de un microscopio confocal. Su intensidad de fluorescencia se registró durante 24 h, y no se observó ninguna recuperación de fluorescencia (línea roja). La intensidad de fluorescencia de otras gotas no fotoblancadas en el mismo campo de visión se registró en la línea negra. Las barras de error (colores translúcidos) eran 1 SD por cada punto de tiempo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Procedimiento de análisis de los datos de imagen microscópica de punto final. La imagen de campo brillante desenfocada se utilizó para extraer la coordenada de cada microcámaras/gotas. En función de la diferencia de intensidad entre el borde de las microcámaras (como primer plano) y otras áreas (como fondo), el borde continuo y casi circular se puede extraer del fondo. Debido a la distribución desigual de fondo en el campo de visión (A), generalmente se requiere algún preprocesamiento de imagen para mejorar la calidad de la salida de binarización. Después de restar el fondo (B), el fondo de cada fotograma se uniformó. Empíricamente, el valor de entrada en el"Radio de bola rodante"(paso 1) fue de 20-50 para las imágenes de 2048 píxeles a 2048 píxeles y 10-20 para las imágenes de 512 píxeles a 512 píxeles. Cuanto mayor sea el valor, menor será el tiempo de procesamiento. Para reducir el ruido de la imagen restada por fondo, aplique un filtro mediano a la imagen (C). En general, el valor de entrada en el Radio (paso 3) era de 1-2 píxeles. Como se muestra en la inserción ampliada, la imagen restada y filtrada por fondo se puede binarizar muy bien utilizando el complemento de umbral incorporado para que el primer plano correspondiente a los bordes, así como la región de intereses (ROI) se pueda reconocer con precisión. La detección de ROI para todos los fotogramas de la imagen se llevó a cabo mediante el uso del plugin casero instalado FemDA Analysis (D). El tamaño de píxel (pasos 5 y 6) y la circularidad (pasos 7 y 8) de los ROI, los fotogramas que queremos poner en el cálculo (pasos 9 y 10) se definieron manualmente de acuerdo con los datos reales. Después de hacer clic en Generar ROI (paso 11) y en espera, se determinó la coordenada de cada ROI en los marcos de entrada. Después de hacer clic en la máscara Aplicar ROI (paso 12), cada ROI detectado fue encerrado y resaltado por una línea amarilla. Después de abrir la imagen de fluorescencia y hacer clic en la máscara Aplicar ROI de nuevo, la máscara de ROI determinada se aplicó a la imagen de fluorescencia. El Número de píxeles superiores (paso 14) especificó el número de píxeles clasificados de intensidad superior de cada ROI para el cálculo de la intensidad media de las gotas respectivas. Después de hacer clic en Medir intensidad (paso 15) y esperar, se generó el histograma (E). El histograma se puede equipar con una suma de distribuciones gaussianas utilizando los parámetros disponibles en la ventana del histograma. Alternativamente, los datos de intensidad media pueden ser exportados a un archivo de texto (paso 16) y analizados por otro software (F). (G) La probabilidad de aparición de gotas que contienen diferentes números de moléculas de ADN en la matriz dada. El histograma (color gris) fue bien ajustado por una distribución de Poisson (línea discontinua roja) con un promedio de 0.05 moléculas de ADN por gota, como se esperaba para una distribución aleatoria de moléculas de ADN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Análisis de los datos de imagen microscópica de curso de tiempo. Los ROI detectados (siguiendo los pasos 1-12 de la Figura 4) se aplicaron directamente a los datos del curso de tiempo. En el paso 13 de la Figura 4, seleccione Time-lapse e introduzca el intervalo de tiempo real (en minutos) entre fotogramas adyacentes en Intervalo de tiempo [min]. Después de hacer clic en Medir intensidad (paso 15 de la Figura 4)y esperar, se generaron la gráfica de intensidad de tiempo y el histograma (el mismo que la Figura 4E). La posición Hist especificó el punto de tiempo del histograma, que se mostró como una línea roja vertical. El plugin también admite la especificación de colores para cada línea de seguimiento. Amarillo: 0 ADN; azul era 1 ADN; rojo: 2 ADN; negro: 3 ADN. Los datos del curso de tiempo también se pueden exportar a un archivo de texto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Película Complementaria 1. Por favor, haga clic aquí para descargar esta película. 

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Discussion

La medición altamente cuantitativa basada en las gotas altamente uniformes, estables y biocompatibles en FemDA permitió la distribución discreta, la característica única de nuestro estudio diferenciándose de otros. Optimizamos y detallamos sistemáticamente los procesos de microfabricación y formación de gotas en este documento. Hay varios pasos críticos en el protocolo establecido.

En primer lugar, el recubrimiento uniforme del polímero CYTOP altamente viscoso en el sustrato rectangular de vidrio delgado determina en gran medida la calidad del sustrato resultante. Dada la distancia de trabajo generalmente corta de la lente objetivo con aumentos altos (ver paso 6.1), se debe utilizar el vidrio de cubierta delgada. Un recubrimiento de espín de alta calidad en un sustrato delgado y flexible es generalmente complicado. Todavía no hemos probado todos los diseños posibles, pero hemos encontrado que el mandril de vacío multi-agujero con la misma dimensión rectangular funcionó bien para el revestimiento de espín. Es importante dejar caer el polímero CYTOP en el centro del sustrato de vidrio de la cubierta e iniciar inmediatamente el recubrimiento de espín (ver paso 1.3.2). El grado de dificultad está menos relacionado con la forma del sustrato pero la viscosidad del polímero. La línea de productos CYTOP ofrece varias concentraciones diferentes del paquete disponible comercialmente. El diluyente que acompaña al envase también se puede utilizar para diluir el producto original a una viscosidad más baja si es necesario. CYTOP 816 que utilizamos en el experimento es el producto comercial con mayor concentración capaz de disolver establemente el polímero en el disolvente. El recubrimiento más grueso requiere una menor velocidad de centrifugado o múltiples rondas de recubrimiento y curado. Se recomienda encarecidamente una gráfica de grosor característico frente a curva de velocidad de giro cuando se utiliza una nueva recubridora de centrifugado en un nuevo entorno.

En segundo lugar, la humedad adecuada de la sala limpia es crucial para la fotolitografía ideal, así como para la eliminación completa del fotorresistir en la posición especificada. La reacción fotoquímica en la fotolitografía utiliza H2O como uno de los reactivos. Sin embargo, el softbake a una temperatura superior a la temperatura de ebullición de H2O elimina el contenido de H2O del fotorresista recubierto. El fotorresistero "secado" debe tomar tiempo para absorber H2O de nuevo del aire (ver paso 1.4.6). Este punto a menudo se pasa por alto. Dado que muchos laboratorios sólo pueden tener algunas instalaciones simplificadas de salas limpias sin control de humedad, la humedad fluctuaría dramáticamente a lo largo de la temporada o se vería afectada por el clima. Una solución de bajo costo es utilizar un humidificador o deshumidificador de uso doméstico en la sala limpia. La capa CYTOP totalmente expuesta después del desarrollo puede ser eliminada selectiva y completamente por RIE, exponiendo completamente el fondo de vidrio. Eventualmente, la estructura híbrida del fondo de vidrio hidrófilo y la pared lateral hidrofóbica CYTOP es importante para atrapar establemente la solución acuosa al espacio femtoliter.

En tercer lugar, los aceites recién encontrados (ASAHIKLIN AE-3000, Fomblin Y25) y el tensioactivo (SURFLON S-386) mostraron un rendimiento de sellado sin precedentes para el reactor de fluoropolímero13. La inyección del aceite al ras debe llevarse a cabo en el bloque de metal plano refrigerado (ver paso 5.2); de lo contrario, no se pueden formar gotas cerca de la entrada del canal. La inyección del segundo aceite de sellado se puede llevar a cabo en RT (ver paso 5.5). Estos aceites y tensioactivos nunca se han utilizado en la investigación biológica antes. No se han encontrado mejores alternativas por ahora. Para ampliar el arsenal de la útil combinación de aceites y tensioactivos para la preparación de gotas, el nuevo miembro de los aceites (o los similares en la misma línea de productos) y el tensioactivo (o los similares en la misma línea de productos) son dignos de tratar de ser aplicados en sistemas de gotas microfluídicas.

Aquí hay dos puntos adicionales para notar. Uno es el hecho de que hay un retraso en el tiempo entre los ROI durante la microscopía. El tiempo total de imagen para un ciclo depende principalmente del tamaño de la matriz y de la ampliación de la lente objetivo. El tiempo de exposición, la velocidad de obturación y la velocidad de movimiento de la etapa motorizada también son factores menores. Como regla general, la toma de imágenes de10 6 gotas a una ampliación de 60o requeriría al menos 10-20 minutos. Este inevitable retraso de tiempo introduce algunos errores en el análisis de datos, que siempre deben tenerse en cuenta cuidadosamente. El otro es el hecho de que el número total de gotas en un solo sustrato no superaría 108–109,incluso aumentando la densidad de las gotas o reduciendo el tamaño individual de la gota. Esto se debe a que el tamaño del sustrato de vidrio que puede ser manejado por el alineador de máscara (para obleas de 4 pulgadas) es limitado. No se recomienda aumentar aún más el tamaño del vidrio de la cubierta porque un sustrato de vidrio grande, delgado y frágil es difícil de manejar.

FemDA se puede considerar como una placa de microtiter súper miniaturizada. Cualquier reacción bioquímica que se haya llevado a cabo en placas de microtíteres de 96 pozos podría ser probada para llevar a cabo usando FemDA. Seguramente se puede utilizar para la medición de la actividad enzimática sin una complicada purificación de proteínas. También podría ser compatible con la reacción en cadena de la polimerasa digital (PCR digital) y el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas digitales (ELISA digital)31,49. El pequeño volumen, la gran matriz y la alta estabilidad traerían algunas ventajas sobre los métodos de bioensayo digital existentes. El sistema FemDA capaz de resolver diferentes números de moléculas de ADN de plantilla en gotas de femtoliter ya ha demostrado el poder en el cribado preciso de proteínas13. FemDA es un nuevo sistema de compartimentación in vitro capaz de evolucionar rápidamente una variedad de enzimas. Con los avances en la bioinformática y las técnicas de construcción de bibliotecas, la era de una rápida creación bajo demanda de proteínas de alto rendimiento seguramente vendrá.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el número de subvención JP18K14260 de JSPS KAKENHI y el presupuesto de la Agencia Japonesa de Ciencia y Tecnología Marina-Tierra. Agradecemos a Shigeru Deguchi (JAMSTEC) y Tetsuro Ikuta (JAMSTEC) por proporcionar las instalaciones de caracterización. Agradecemos a Ken Takai (JAMSTEC) por el soporte de software comercial. La microfabricación se llevó a cabo en Takeda Sentanchi Supercleanroom, la Universidad de Tokio, con el apoyo del "Programa de Plataforma de Nanotecnología" del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología (MEXT), Japón, Número de Subvención JPMXP09F19UT0087.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-aminopropyl)triethoxysilane Sigma-Aldrich 440140
1 mL syringe Terumo SS-01T
2-propanol Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
3D laser scanning confocal microscope Lasertec OPTELICS HYBRID Other similar microscopes (e.g., Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) are also applicable.
50 mL syringe Terumo SS-50LZ
6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate Thermo Fisher Scientific D6567 Prepare a 5 mM stock solution in dimethyl sulfoxide
Acetone Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
Purity 99.8%.
Air blower Hozan Z-263
Aluminum block BIO-BIK AB-24M-02
Aluminum microtube stand BIO-BIK AB-136C
ASAHIKLIN AE-3000 AGC (Test sample) Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
BEMCOT PS-2 wiper Ozu 028208
Biopsy punch with plunger Kai BPP-10F
Cover glass Matsunami Glass No. 1 (24 mm × 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness) Size-customized.
Cover glass staining rack Nakayama 803-131-11
CRECIA TechnoWipe clean wiper Nippon Paper Crecia C100-M
Cutting mat GE Healthcare WB100020
CYTOP AGC CTL-816AP
Deaeration mixer Thinky AR-100
Desktop cutter Roland STIKA SV-8
Developer AZ Electronic Materials AZ 300 MIF AZ Electronic Materials was now acquired by Merck.
Other alkaline developers may be also applicable but should require optimization of development conditions (time, temperature, etc.)
Double-coated adhesive Kapton film tape Teraoka Seisakusho 7602 #25
Ethanol Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
Purity 99.5%.
Fiji Version: ImageJ 1.51n
Flat-cable cutter Tokyo-IDEAL MT-0100
Fomblin oil Solvay Y25, or Y25/6 Free test sample may be available upon inquiry to Solvay. Fomblin Y25/6 is an alternative if Y25 is not readily available.
Hot plate AS ONE TH-900
Injection needle Terumo NN-2270C 22G × 70 mm
Inverted fluorescence microscope Nikon Eclipse Ti-E Epifluorescence specification, CCD or sCMOS camera, motorized stage, autofocus system, and high NA objective lens are required.
KaleidaGraph Synergy Version: 4.5
Mask aligner SUSS MA-6 Other mask aligners are also applicable as long as the vacuum contact mode is avaliable.
MICROMAN pipette GILSON E M250E Capillary piston tip: CP250
Microsoft Excel Microsoft Version: 16.16.15
Mini vacuum chamber AS ONE MVP-100MV
Nuclease-free water NIPPON GENE 316-90101
Parafilm Amcor PM-996
PCR tube NIPPON Genetics FG-021D/SP
Petri dish AS ONE GD90-15 Diameter 90 mm, height 15 mm.
Photoresist AZ Electronic Materials AZ P4903 AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. AZ P4620 is an alternative.
Plate reader BioTek POWERSCAN HT
Polyethelene gloves AS ONE 6-896-02 Trade name: Saniment.
PURExpress in vitro protein synthesis kit New England Biolabs E6800S or E6800L For cell-free protein synthesis reaction.
Reactive-ion etching system Samco RIE-10NR Other RIE systems are also applicable but should require optimization of RIE conditions (gas flow rate, chamber pressure, RF power, etching time, etc.)
RNase inhibitor New England Biolabs M0314S
Scotch tape 3M 810-1-18D
Sodium hydroxide solution FUJIFILM Wako Pure Chemical 194-09575 8 M concentration; danger.
Spin coater Oshigane SC-308
SURFLON S-386 surfactant AGC (Test sample) Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
SYLGARD 184 silicone elastomer Dow Sylgard184 Chemical composition: polydimethylsiloxane. The default mixing ratio is base : curing agent = 10 : 1 (m/m).
Tweezers Ideal-tek 2WF.SA.1
2A
Ultrasonic cleaner AS ONE ASU-2M
Vacuum chuck Oshigane (Customized) Material: delrin; rectangular sample stage with multiple holes (48 holes, each with 1 mm diameter); the size is customzied to fit the size of the cover glass (24 mm × 32 mm).

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References

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Química Número 160 Microfabricación gota femtoliter síntesis de proteínas libres de células proteína fluorescente enzima monomolía distribución de Poisson análisis de imágenes compartimentación in vitro
Un arreglo de gotas Femtoliter para la síntesis masiva de proteínas paralelas a partir de moléculas de ADN únicas
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Zhang, Y., Kurosawa, K., Nishiura, D., Tei, M., Tsudome, M. A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules. J. Vis. Exp. (160), e60945, doi:10.3791/60945 (2020).

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