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Chemistry

Un tableau de gouttelettes femtoliter pour la synthèse massive de protéines parallèles à partir de molécules d’ADN unique

Published: June 20, 2020 doi: 10.3791/60945
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3
1SUGAR Program, X-star, Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC), 2Center for Mathematical Science and Advanced Technology, Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC), 3Deep-Sea Nanoscience Research Group, Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC)

Summary

L’objectif global du protocole est de préparer plus d’un million de gouttelettes de femtoliter commandées, uniformes, stables et biocompatibles sur un substrat planaire de 1 cm2 qui peut être utilisé pour la synthèse des protéines sans cellules.

Abstract

Les progrès réalisés dans la résolution spatiale et la sensibilité à la détection de l’instrumentation scientifique permettent d’appliquer de petits réacteurs pour la recherche biologique et chimique. Pour répondre à la demande de microréacteurs haute performance, nous avons mis au point un dispositif femtoliter droplet array (FemDA) et illustré son application dans des réactions massivement parallèles de synthèse de protéines sans cellules (CFPS). Plus d’un million de gouttelettes uniformes ont été facilement générées dans une zone de la taille d’un doigt à l’aide d’un protocole d’étanchéité à l’huile en deux étapes. Chaque gouttelette était ancrée dans une microchamber femtoliter composée d’un fond hydrophile et d’un paroi latérale hydrophobe. La structure hydrophile-in-hydrophobe hybride et les huiles d’étanchéité et les surfactants dédiés sont essentiels pour conserver de façon stable la solution aqueuse femtoliter dans l’espace femtoliter sans perte d’évaporation. La configuration femtoliter et la structure simple du dispositif FemDA ont permis une consommation minimale de réactifs. La dimension uniforme des réacteurs à gouttelettes a rendu les mesures quantitatives et temporelles à grande échelle convaincantes et fiables. La technologie FemDA a corrélé le rendement protéique de la réaction du SCFP avec le nombre de molécules d’ADN dans chaque gouttelette. Nous avons rationalisé les procédures concernant la microfabrication de l’appareil, la formation des gouttelettes de femtoliter, et l’acquisition et l’analyse des données d’image microscopiques. Le protocole détaillé avec le faible coût de fonctionnement optimisé rend la technologie FemDA accessible à tous ceux qui ont des installations de nettoyage standard et un microscope à fluorescence classique à leur place.

Introduction

Les chercheurs utilisent des réacteurs pour effectuer des réactions bio/chimiques. Des efforts importants ont été déployés pour réduire la taille du réacteur et augmenter le débit expérimental afin de réduire la consommation de réactifs tout en améliorant l’efficacité du travail. Ces deux aspects visent à libérer les chercheurs d’une lourde charge de travail, en réduisant les coûts et en accélérant la recherche et le développement. Nous disposons d’une feuille de route historique claire sur le développement des technologies des réacteurs du point de vue des volumes de réaction et du débit : béchers/flacons/tubes à essai simples, tubes millilitres, tubes microlitres, microlitres 8 tubes, microlitres 96/384/1536-puits, et nanolitre microfluidique/picoliter/femtoliter réacteurs1,2,3,4,5,6,7. Analogue à la réduction de la taille des caractéristiques des transistors sur les puces de circuits intégrés dans l’industrie des semi-conducteurs au cours des dernières décennies, les microréacteurs bio/chimiques sont en cours de réduction du volume et d’intégration du système. Ces outils à petite échelle ont eu un impact profond sur la biologie synthétique à base de cellules ou sans cellules, la biomaufacturing, et le prototypage et le dépistage à haut débit8,9,10,11,12. Cet article décrit nos efforts récents sur le développement d’une technologie unique de tableau de gouttelettes et démontre son application dans CFPS13, une technologie fondamentale pour la biologie synthétique et les communautés de dépistage moléculaire14. En particulier, nous fournissons intentionnellement un protocole optimisé et peu coûteux pour rendre le dispositif FemDA accessible à tous. Le protocole à faible coût et facile à manipuler pour l’appareil miniaturisé contribuerait aux objectifs éducatifs des universités et aiderait à diffuser la technologie.

FemDA prépare des gouttelettes de femtoliter à une densité ultra-élevée de 106 par 1 cm2 sur un substrat en verre planaire. Nous avons enduit un polymère hydrophobe, CYTOP15, sur le substrat de verre et gravé sélectivement (enlevé) CYTOP à des positions prédéfinies pour générer un tableau de microchambre sur le substrat. Ainsi, la microchambre qui en résulte est composée d’une paroi hydrophobe (CYTOP) et d’un fond hydrophile (verre). Lorsque l’eau et l’huile coulent séquentiellement sur la surface à motifs, l’eau peut être emprisonnée et scellée dans les microchambres. La structure hydrophile-in-hydrophobe est essentielle pour repousser l’eau à l’extérieur des microchambres, isoler les microréacteurs individuels et conserver une minuscule solution aqueuse à l’intérieur de l’espace femtoliter. La propriété unique a été appliquée avec succès pour la préparation de gouttelettes d’eau dans l’huile et de microcompartements bicalaires lipidiques16,17. Par rapport au prototype16, nous avons d’abord optimisé le processus de microfabrication pour réaliser une élimination complète du polymère CYTOP ainsi qu’une exposition complète du fond de verre. CYTOP est un fluoropolymère spécial dont la tension de surface est extrêmement faible (19 mN/m) inférieure à celle des matériaux microréacteurs conventionnels tels que le verre, les plastiques et le silicone. Ses bonnes performances optiques, électriques et chimiques ont déjà été utilisées dans le traitement de surface des dispositifs microfluidiques18,19,20,21,22,23,24. Dans le système FemDA, pour obtenir un bon mouillage de l’huile sur la surface du CYTOP, la tension de surface de l’huile doit être inférieure à celle de la surface solide25. Sinon, l’huile liquide en contact avec la surface solide tend à devenir sphérique plutôt que de se répandre sur la surface. En outre, nous avons constaté que certaines huiles populaires de perfluorocarbone (par exemple, 3M FC-40)16 et les huiles hydrofluoroéther (par exemple, 3M série Novec) peuvent dissoudre CYTOP à la suite de la morphologie amorphe de CYTOP, qui est fatale à la mesure quantitative et serait discutable en termes de contamination croisée entre les gouttelettes. Heureusement, nous avons identifié une huile biocompatible et respectueuse de l’environnement présentant une tension de surface inférieure (< 19 mN/m)13. Nous avons également trouvé un nouveau surfactant qui peut se dissoudre dans l’huile sélectionnée et fonctionner dans une faible concentration (0,1%, au moins 10 fois plus faible que précédemment rapporté populaires26,27)13. L’interface eau/huile qui en résulte peut être stabilisée par le surfactant. En raison du taux d’évaporation élevé de l’huile, après la chasse d’eau avec l’huile, nous avons appliqué une autre huile biocompatible et respectueuse de l’environnement pour remplacer la première pour sceller les microchambres. Nous appelons la première huile (ASASHIKLIN AE-3000 avec 0,1 wt % SURFLON S-386) l’huile de chasse d’eau et la deuxième huile (Fomblin Y25) l’huile d’étanchéité, respectivement.

La stratégie d’étanchéité à l’huile en deux étapes peut réaliser une formation robuste du tableau de gouttelettes femtoliter en quelques minutes et sans instrumentation sophistiquée. En raison du problème d’évaporation, il a été considéré comme difficile de générer des microréacteurs plus petits que les volumes de picolteur28. FemDA a abordé ce problème en optimisant systématiquement les matériaux et les procédés utilisés pour la préparation des microréacteurs/gouttelettes. Plusieurs caractéristiques notables des gouttelettes résultantes incluent l’uniformité élevée (ou monodispersité), la stabilité, et la biocompatibilité à l’échelle femtoliter. Le coefficient de variation (CV) du volume des gouttelettes n’est que de 3% (sans correction de vignette pour les images microscopiques), le plus petit CV parmi les plates-formes de gouttelettes dans le monde, ce qui assure une mesure très parallèle et quantitative. La gouttelette de femtoliter est stable pendant au moins 24 heures sans contamination croisée entre les gouttelettes à température ambiante, ce qui est précieux pour une mesure fiable du cours du temps. En ce qui concerne la biocompatibilité, nous avons réussi à synthétiser diverses protéines à partir d’un modèle d’ADN à copie unique dans la gouttelette femtoliter, qui avait été précédemment considéré comme difficile ou inefficace29,30. Il serait digne d’élucider pourquoi certaines protéines capables d’être synthétisées dans le FemDA ne peuvent pas être synthétisées dans d’autres systèmes de gouttelettes. FemDA n’était pas seulement un progrès technique, mais a également réalisé une mesure quantitative sans précédent qui peut corréler le rendement des protéines (tel que reflété par l’intensité de fluorescence de la gouttelette) au nombre de molécules d’ADN de modèle dans chaque gouttelette. En conséquence, l’histogramme de l’intensité de fluorescence des gouttelettes du CFPS à base de FemDA a montré une distribution discrète qui peut être bien ajustée par une somme de distributions gaussiennes d’intervalles de pointe à pic égaux. En outre, la probabilité d’occurrence de gouttelettes contenant différents nombres de molécules d’ADN était un ajustement parfait à une distribution poisson31. Ainsi, le rendement protéique différent dans chaque gouttelette peut être normalisé en fonction de la distribution discrète. Cette caractéristique critique nous permet de séparer l’information d’activité enzymatique de l’intensité apparente, qui n’a pas encore été disponible avec d’autres plates-formes de microréacteurs. Les systèmes de tri des cellules/gouttelettes microfluidiques existants sont habiles dans le tri entièrement automatique et bons pour concentrer des échantillons, mais parfois ne peuvent produire qu’un histogramme relativement large ou à longue queue dans l’aspect analytique32,33. Notre système FemDA hautement quantitatif et biocompatible établit une nouvelle référence et une norme analytique élevée dans le domaine du développement des microréacteurs.

Les huiles et les surfactants qui pourraient être utilisés pour la préparation des gouttelettes sont encore très limitées34. La combinaison d’ASASHIKLIN AE-3000 et DE SURFLON S-386 établie à FemDA est un nouveau membre de l’arsenal croissant de l’interface physiochimique entre la phase aqueuse et la phase13de l’huile. La nouvelle interface de FemDA est physiquement stable, chimiquement inerte et biologiquement compatible avec les machines complexes de transcription, de traduction et de modification post-translationnelle pour de nombreuses sortes de protéines13. Il serait plutôt intéressant de trouver une protéine qui ne peut pas être synthétisée dans les paramètres de gouttelettes à la place. En outre, l’économie de coûts des réactifs est plus évidente dans le système de gouttelettes femtoliter que celle dans les systèmes de réacteurs nanolitres et picoliter35,36. En particulier, il y aurait souvent un grand volume mort, qui est principalement causé par des tubes ou des fournitures externes, dans les systèmes de génération de gouttelettes microfluidiques, mais pas dans notre FemDA. Le format de tableau est également favorisé par une caractérisation microscopique répétée et détaillée (similaire à ce qu’on appelle l’analyse à haute teneur) pour chaque réacteur37, plutôt que par un seul instantané pour un objet en mouvement rapide. L’échelle femtoliter a permis l’intégration de plus d’un million de réacteurs sur une zone de la taille d’un doigt, alors que le même nombre de réacteurs nanolitres (s’il existe) nécessite une superficie de plus de mètres carrés, ce qui ne serait sans aucun doute pas pratique pour fabriquer ou utiliser un tel système.

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Protocol

1. Microfabrication du substrat de microchambre femtoliter

REMARQUE : Effectuez l’expérience de microfabrication suivante dans une salle propre. Portez des gants et un costume de chambre blanche avant d’entrer dans la salle blanche.

  1. Substrat de verre de couverture de nettoyage
    1. Placez le verre de couverture sur une grille de coloration en verre de couverture. Soniré le verre de couverture en hydroxyde de sodium de 8 M (NaOH) pendant 15 min à température ambiante (RT).
      ATTENTION: NaOH en fortes concentrations est très dangereux pour la peau et les yeux. Manipuler doucement sans éclaboussure.
    2. Retirez la grille de la solution NaOH et rincez le verre de couverture à l’aide de l’eau pendant dix fois. Gardez le verre de couverture dans l’eau pure.
      REMARQUE : Jetez les déchets alcalins dans le réservoir désigné. La solution NaOH peut être recyclée à la bouteille d’origine et utilisée jusqu’à cinq fois.
    3. Sécher chaque morceau de verre de couverture avec un pistolet à air comprimé.
    4. Cuire le verre de couverture séché sur une plaque chaude à 200 °C pendant 5 min. Gardez l’orientation du côté supérieur du substrat en verre cohérente pendant les processus de manipulation suivants.
  2. Silanisation de la surface de verre
    1. Réinitialiser le verre de couverture nettoyé sur une grille de coloration sèche.
    2. Ajouter 150 mL d’éthanol dans un bécher PTFE. Utilisez une aiguille (22 G x 70 mm) équipée d’une seringue de 1 mL pour tirer 0,075 mL de triethoxysilane (3-aminopropyl) et l’injecter immédiatement à l’éthanol (c.-à-d. 0,05 vol %). Tirez et poussez la seringue plusieurs fois pour rincer l’intérieur de la seringue. Remuer la solution avec l’aiguille pour la rendre homogène.
      REMARQUE : (3-aminopropyl)triethoxysilane peut être stocké à température ambiante et 1 atm pression pendant deux ans avec un étanchéité serré. L’éthanol absolu doit être hermétiquement scellé après utilisation. Nous ne recommandons pas d’utiliser des réactifs expirés.
    3. Incuber le verre de couverture dans la solution 0.05 vol % aminosilane pendant 1 h à RT.
    4. Rincer le verre de couverture à l’aide d’eau pure pendant cinq fois. Gardez le verre de couverture dans l’eau pure.
      REMARQUE : Jetez les déchets dans le réservoir désigné.
    5. Séchez chaque morceau de verre de couverture avec le pistolet à air comprimé.
    6. Déposer tout le verre de couverture séché sur du papier d’aluminium. Cuire le verre de couverture sur la plaque chaude à 80 °C pendant 5 min.
  3. Perfluoropolymère CYTOP
    1. Placez le verre de couverture sur un mandrin à vide personnalisé d’un coayer de spin (Figure 1A). Allumez l’interrupteur à vide pour fixer le substrat en verre.
      REMARQUE : La conception du mandrin à vide est cruciale pour un revêtement uniforme de polymère visqueux sur le substrat rectangulaire (24 mm × 32 mm) et mince (0,13-0,17 mm)(figure 1A). Nous avons constaté qu’une étape rectangulaire d’échantillon avec plusieurs trous (48 trous, chacun avec 1 mm de diamètre) reliant au canal de vide fonctionnait mieux que l’étape ronde avec un seul trou central.
    2. Déposer 70-90 μL de polymère CYTOP de type A au centre du substrat en verre. Enrober immédiatement le polymère (figure 1B).
      REMARQUE : L’état de revêtement de spin (3 400 tr/min, 30 s) fournit une épaisseur de 3 μm. Utilisez la micropipette conçue pour le liquide visqueux. Maintenez la micropipette verticale pour faire tomber le polymère presque parfaitement cercle sur le substrat. Une bulle d’air est souvent générée à l’intérieur de la pointe de la pipette lorsque le piston se déplace vers le bas. Ne laissez pas tomber la dernière goutte de CYTOP avec la bulle.
    3. Prenez le verre enduit avec les doigts tenant les coins du substrat de verre, et placez-le sur le papier d’aluminium.
    4. Répétez les étapes 1.3.1-1.3.3 pour faire tourner tous les morceaux restants du verre de couverture.
    5. Cuire le verre enrobé à 80 °C pendant 30 min, puis à 200 °C pendant 1 h.
      REMARQUE : Ce traitement guérit entièrement le CYTOP et lie covalent le CYTOP à la surface du verre. Couvrir la zone de cuisson d’un couvercle en papier d’aluminium pour éviter les poussières potentielles pendant le processus de cuisson de longue durée si nécessaire.
    6. Retirez le verre de couverture recouvert de CYTOP de la plaque chauffante et refroidissez-le jusqu’à RT. Prenez soigneusement chaque morceau du verre enduit et inspectez-le pour voir s’il est bien enduit. Jeter le substrat présentant un revêtement inhomogène.
      REMARQUE : La surface d’un CYTOP bien enduit doit sembler plate sans motifs irréguliers ressemblant à des arcs-en-ciel (figure 1C). L’inspection visuelle d’un angle approprié peut rapidement juger de la planéité ainsi que de la qualité du revêtement. Le protocole peut être mis en pause ici.
  4. Photorésiste de spin-revêtement
    1. Placez le verre de couverture recouvert de CYTOP sur le mandrin à vide (voir étape 1.3.1) du revêtement de spin. Allumez le commutateur sous vide pour fixer le verre de couverture.
    2. Déposer 0,2 à 0,3 mL de photorésiste au centre du substrat. Tournez immédiatement le photorésiste à 6 000 tr/min pour 60 s.
      REMARQUE : Ne laissez pas tomber la dernière goutte du photorésiste avec des bulles. Si le coacker de spin prend en charge une vitesse de rotation plus élevée, la vitesse de rotation pourrait être jusqu’à 7 500 tr/min pour obtenir un revêtement plus mince. La faible énergie de surface de CYTOP empêche la plupart des photorésistes d’être adhéré à sa surface. Si le photorésiste AZ P4903 n’est pas disponible, le photorésiste AZ P4620 est une bonne alternative.
    3. Ramasser le substrat enduit avec deux doigts tenant les coins du substrat. Essuyez l’excès de photorésiste près du bord du substrat (souvent appelé enlèvement de perles de bord ou EBR) à l’aide d’un essuie-glace propre imbibé d’éthanol (figure 1D). Placer le substrat sur le papier d’aluminium.
      REMARQUE : L’acétone n’est PAS recommandée pour l’EBR.
    4. Répétez les étapes 1.4.1-1.4.3 pour faire tourner le photorésiste pour les morceaux restants de verre de couverture recouvert de CYTOP. Prenez chaque morceau de verre enduit et inspectez-le pour voir s’il est correctement recouvert.
      REMARQUE : La surface d’un photorésiste bien enduit doit sembler plate sans motifs irréguliers (Figure 1D). L’inspection visuelle d’un angle approprié peut rapidement juger de la planéité ainsi que de la qualité du revêtement. Le substrat présentant un revêtement inhomogène peut être recyclé par lavage avec de l’acétone, 2-propanol, et H2O dans l’ordre, et réutilisé.
    5. Cuire le substrat enrobé à 110 °C pendant 5 min sur la plaque chauffante.
    6. Retirer le substrat enduit de la plaque chauffante et refroidir jusqu’à RT. Laisser reposer 30 min à une humidité relative de 40%-60% pour la réhydratation du photorésiste.
      REMARQUE : H2O est nécessaire pour la réaction photochimique suivante. Le photorésiste cuit a perdu le contenu H2O à l’intérieur du photorésiste. Le processus de réhydratation permet d’absorber H2O de l’air. L’humidité relative inférieure à 20% ou supérieure à 80% ne convient pas au processus de réhydratation.
  5. Photolithographie
    1. Pendant le temps d’attente de la réhydratation (voir étape 1.4.6), démarrez l’aligneur de masque. Réchauffez la source lumineuse. Chargez le photomask chromé.
      REMARQUE : Suivez le manuel d’instructions pour faire fonctionner l’aligneur de masque. Le photomask peut être fabriqué par lithographie par faisceau d’électrons (EB) si l’installation EB est disponible. Alternativement, le photomask peut être externalisé à une entreprise locale.
    2. Chargez le substrat réhydraté (après la fin de l’étape 1.4.6) sur le mandrin (figure 1E).
    3. Définissez les paramètres d’exposition. Exposer le substrat pendant 25 s avec une intensité UV de 13 mW/cm2 (h-line) dans le mode de contact sous vide. Ensuite, déchargez le substrat et placez-le sur la grille de coloration en verre de couverture (la même grille utilisée à l’étape 1.1.1).
    4. Répétez les étapes 1.5.2-1.5.3 pour exposer les morceaux restants du substrat réhydraté.
  6. Développement
    1. Développer le substrat pendant 5 min pour dissoudre le photorésiste exposé (Figure 1F). Pendant ce temps, secouez doucement le rack dans le développeur une fois au point de temps de 4 minutes.
      NOTE: Le développeur était AZ 300 MIF. Les développeurs alcalins alternatifs (p. ex., AZ 400 K) sont généralement applicables au développement, mais devraient exiger l’optimisation des conditions de développement (p. ex., temps, température, agitation). Ne pas utiliser de béchers en verre comme conteneur de développeur.
    2. Rincer le substrat à l’aide d’eau pure pendant dix fois. Gardez le verre de couverture dans l’eau pure.
      REMARQUE : Jetez le développeur dans le réservoir désigné.
    3. Séchez soigneusement chaque morceau de substrat avec le pistolet à air comprimé.
  7. Gravure réactive-ion
    1. Placer le substrat séché (à partir de l’étape 1.6.3) dans la chambre de réaction de la machine de gravure réactive-ion (RIE).
      REMARQUE : Selon la règle d’entretien de l’installation, la machine RIE peut être toujours allumée ou arrêtée à chaque fois. Si l’interrupteur était éteint, allumez l’interrupteur selon le manuel.
    2. Etch le CYTOP photorésiste découvert avec le plasma O2 (Figure 1G).
      REMARQUE : L’état de RIE était le suivant. O2 débit de gaz: 50 sccm; pression de chambre: 10.0 Pa; Puissance RF: 50 W; temps de gravure: 27 min. Le temps de gravure a été optimisé pour une épaisseur complète de 3 μm de CYTOP.
    3. Ramasser chaque morceau de substrat de la chambre de réaction à l’aide de la pince à épiler et les placer sur la grille de coloration en verre de couverture.
      REMARQUE : Selon la règle d’entretien de l’installation, la chambre de réaction peut nécessiter un court processus de nettoyage du plasma O2 (p. ex., temps de gravure : 5 min) pour garder la chambre de réaction propre après chaque course.
  8. Suppression du photorésiste et du nettoyage
    1. Sonicate le substrat en acétone pendant 5 min à RT pour dissoudre le photorésiste restant.
    2. Sonicate le substrat en 2-propanol pendant 5 min à RT.
    3. Rincer le substrat à l’aide d’eau pure pendant cinq fois. Soninez le substrat pendant 5 min à RT. Rincez l’échantillon à l’aide d’eau pure pour cinq autres fois. Gardez le substrat dans de l’eau pure.
    4. Sécher chaque morceau de substrat avec le pistolet à air comprimé (Figure 1H).
      REMARQUE : Le substrat peut être conservé dans une boîte en plastique Petri. Le substrat fabriqué est structurellement stable à RT pendant au moins un an. Le protocole peut être mis en pause ici.
    5. Caractériser le profil de surface du substrat tel que préparé par la microscopie confocale à balayage laser tridimensionnelle (3D), l’interférométrie de la lumière blanche (ou l’interférométrie de balayage de cohérence) ou la microscopie électronique à balayage. Utilisez le logiciel respectif pour mesurer le diamètre et la profondeur des microchambres qui en résultent.
      REMARQUE : L’échantillon peut être réutilisé pour d’autres expériences après la caractérisation avec le microscope confocal à balayage laser 3D non-contact et non destructif ou l’interféromètre de lumière blanche. Le protocole peut être mis en pause ici.

2. Préparation du microcanal polydiméthylsiloxane (PDMS)

REMARQUE : Ne portez PAS de gants en latex pour manipuler le PDMS. Au lieu de cela, portez des gants en polyéthylène (PE).

  1. Faire le maître du microcanal
    1. Coupez un ruban adhésif à double revêtement kapton en une forme microcanal définie (3 mm x 19 mm) à l’aide d’un coupeur de bureau.
      REMARQUE : La bande de Kapton était no 7602 #25 (Teraoka Seisakusho), ce qui a entraîné une hauteur de canal de 135 μm. Le coupeur de bureau STIKA utilise un plugin (disponible sur le site Roland: https://www.rolanddga.com) d’Adobe Illustrator pour exécuter la coupe en fonction du dessin dans le fichier Adobe Illustrator. Le protocole peut être mis en pause ici.
    2. Collez chaque ruban Kapton coupé sur le fond plat d’une boîte de Pétri. La boîte Petri standard de 90 mm peut accueillir 12 morceaux de la bande.
      REMARQUE : La structure de relief sert de maître pour le moulage de réplique de PDMS. Appuyez doucement sur la surface du ruban adhésif à l’aide d’une pince à épiler s’il y a des bulles d’air coincées entre le ruban adhésif et le substrat de la boîte de Pétri. Alternativement, la lithographie douce classique peut être appliquée pour préparer le maître sur une plaquette de silicium38. Le protocole peut être mis en pause ici.
  2. Traitement de la résine PDMS dans la boîte de Pétri à motifs rubans
    1. Portez de nouveaux gants PE et transférez 2,5 g d’agent de durcissement de l’élastomère en silicone SYLGARD 184 à l’aide d’une pipette en plastique jetable dans le bécher en plastique spécifié (figure 2A).
    2. Transformez-vous en gants neufs et transférez 25 g de la base prépolymère de l’élastomère en silicone SYLGARD 184 à l’aide d’une seringue jetable de 50 mL dans le bécher en plastique ci-dessus.
      REMARQUE : Remplacez les gants ci-de-là pour éviter la contamination croisée potentielle de l’agent de traitement à la base.
    3. Utiliser un mélangeur de désaération pour mélanger et désaérer le mélange (programme : 3 min de mélange suivi de 2 min de désaération).
      REMARQUE : Si le mélangeur de désaération n’est pas disponible, un mélange agité manuellement (pendant environ 15 min) peut être dégazé dans une chambre à vide.
    4. Verser le mélange PDMS dans la boîte de Pétri à motifs de ruban adhésif (Figure 2B). Placez la boîte de Pétri dans une mini chambre à vide et déarérez le mélange PDMS pendant 1-3 h (figure 2C).
      REMARQUE : Si de l’air reste dans le mélange PDMS après 1 h, sortez la boîte de Pétri de la chambre à vide, brisez la bulle d’air à l’aide d’un souffleur d’air, puis remettez la boîte de Pétri dans la chambre à vide et continuez le processus de désaération.
    5. Placer la boîte de Pétri dans un four à 60 °C pendant la nuit pour guérir le PDMS (Figure 2D).
      REMARQUE : Bien que l’augmentation de la température puisse raccourcir le temps de séchage, la température maximale qui peut être tolérée par la boîte de Pétri en polystyrène sans déformation physique est d’environ 60 °C.
  3. Moulage de réplique du canal PDMS
    1. Peler l’élastomère PDMS guéri du plat Petri (Figure 2E).
    2. Couper chaque morceau de blocs de canal PDMS à l’aide d’un coupe-câble plat (Figure 2F).
    3. Placez l’élastomère PDMS sur un tapis de coupe faisant face au côté du canal vers le haut. Percer un trou à chaque extrémité du canal à l’aide d’un poinçon de biopsie (Figure 2G).
    4. Nettoyez la surface du canal PDMS avec du ruban adhésif écossais. Enveloppez ensuite la résine PDMS dans un autre morceau de ruban adhésif écossais pour la garder propre avant utilisation. Conservez le canal PDMS préparé dans une boîte de Pétri propre.
      REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.

3. Assemblage du dispositif de microchambre femtolitre

  1. Placez quelques morceaux d’essuie-glaces propres imbibés d’eau le long du mur intérieur d’une boîte de Pétri pour faire une chambre d’humidification simplifiée. Placez la résine PDMS recouverte par le ruban adhésif scotch dans la chambre humidifiante et sceller la chambre à l’aide d’un film de paraffine. Incuber pendant au moins 3 h mais pas plus d’une journée.
    REMARQUE : PDMS est un matériau poreux qui permet au gaz de passer à travers la résine39. La structure poreuse du PDMS conduit à une absorption des molécules d’eau de l’environnement jusqu’à atteindre un équilibre. Ce pré-traitement remplit les pores de PDMS de vapeur d’eau et peut réprimer de manière significative l’évaporation des gouttelettes aqueuses adjacentes au bord du canal PDMS.
  2. Retirez la bande scotch de la résine PDMS. Placer le canal PDMS sur la zone du tableau de microchambre du substrat (Figure 2H).
    REMARQUE : La résine PDMS adhère de façon inverse à la surface du CYTOP. Appuyez doucement sur le bloc PDMS à l’aide d’une pince à épiler pour éliminer les bulles d’air entre la résine PDMS et le substrat s’il existe.
  3. Insérez une pointe de pipette non filtrée de 200 μL à une pointe (comme sortie) des trous du canal PDMS.
    REMARQUE : La force d’adhérence entre PDMS et CYTOP est limitée. Pour éviter la déformation physique de la résine PDMS ainsi que le détachement du canal PDMS hors de la surface, n’insérez pas la pointe de la pipette trop profondément.

4. Solution de réaction de chargement à l’appareil assemblé

  1. Mettez un support microtube en aluminium sur la glace. Préchill l’huile de chasse d’eau (huile ASASHIKLIN AE-3000 mélangée avec 0,1 wt % SURFLON S-386 surfactant) dans un microtube de 1,5 mL sur le support en aluminium.
  2. Mettez un autre bloc d’aluminium sur la glace.
  3. Préparation de la solution de réaction du SCFP
    1. Préparer la solution de réaction CFPS dans un tube PCR. Mélangez tous les composants aliquot du kit CFPS, un modèle dilué d’ADN (comme l’illustre la protéine fluorescente mNeonGreen40 et Escherichia coli phosphatasealcaline 41)et d’autres composants nécessaires en fonction des besoins spécifiques (p. ex., inhibiteur de RNase, substrat fluorogène, chaperon).
      REMARQUE : L’ADN modèle utilisé pour le SFP doit être préparé conformément à l’instruction de la trousse du SFP correspondant. Cette démonstration a appliqué un système d’expression basé sur T742. Étant donné que la consommation de réactifs dans le dispositif FemDA est assez faible, 10 μL est assez grand pour remplir l’ensemble du canal PDMS.
    2. Pour la synthèse des protéines fluorescentes mNeonGreen, mélanger les composants dans l’ordre suivant : ajouter 2,7 μL de H2O sans nucléase à un aliquot de 6 μL de solution A (à partir du kit CFPS); ajouter 0,3 μL d’inhibiteur de la RNase; ajouter 1,5 μL de solution d’ADN de modèle dilué; mélanger brièvement et transférer le mélange dans un aliquot de 4,5 μL de solution B (à partir du kit CFPS).
      REMARQUE : Le volume total est de 15 μL. Comme la quantité de chaque aliquot est proportionnelle au volume total du mélange final, un volume total inférieur à 10 μL peut entraîner un volume beaucoup trop faible (< 0,2 μL) de certains composants aliquot.
    3. Pour la synthèse alcaline de la phosphatase, mélanger les composants dans l’ordre suivant : ajouter 1,2 μL de H2O à 6 μL de solution A; ajouter 0,3 μL d’inhibiteur de la RNase; ajouter 0,6 μL d’exhausteur de obligations disulfure 1 et 2 (à partir d’un kit); ajouter 0,3 μL de phosphate de 5 mM 6,8-difluoro-4-méthylumbelliferyl (DiFMUP); ajouter 1,5 μL de solution d’ADN; mélanger brièvement et transférer le mélange à 4,5 μL de solution B.
      REMARQUE : Dans l’analyse de la phosphatase alcaline, le substrat fluorogène DiFMUP peut produire très fluorescent 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-méthylcoumarin (DiFMU) sur le clivage enzymatique du groupe de phosphate terminal.
  4. Établir 10 μL du mélange à l’aide d’une pointe de pipette non filtrée de 200 μL. Insérez la pointe de la pipette dans le trou d’entrée (voir l’étape 3.3) du canal PDMS. Poussez vers le bas sur le piston pour injecter la solution au canal jusqu’à ce qu’il déborde de la sortie (où une autre pointe de pipette a déjà été insérée à l’étape 3.3).
  5. Séparez la pipette de la pointe de la pipette et gardez ces deux pointes de pipette encore insérées à l’entrée et à la sortie.
    REMARQUE : Évitez de générer des bulles d’air pendant le canalisation. Ne laissez pas le pouce du piston jusqu’à ce qu’il sépare la pipette de la pointe de la pipette pour empêcher le retour de la solution à l’intérieur du canal PDMS.

5. Génération de gouttelettes femtoliter (FemDA) pour CFPS

  1. Transférer l’ensemble de l’appareil assemblé dans le bloc d’aluminium pré-réfrigéré (voir l’étape 4.2). Confirmez soigneusement que la surface du tableau de microchambre passe rapidement de translucide (figure 2I) à transparente (figure 2J).
    REMARQUE : La solution de réaction du SCFP ne peut pas entrer directement dans les microchambres. La solubilité de l’air dans l’eau est inversement proportionnelle à la température. L’air emprisonné se dissout dans la solution après que l’appareil a été déplacé de RT à la basse température. Le changement de transparence est un indicateur visuel pratique pour juger si la solution entre dans les microchambres.
  2. Tirer 30 μL de l’huile de chasse pré-réfrigérée (voir l’étape 4.1) et transférer immédiatement l’huile dans la pointe de pipette insérée dans l’entrée à partir de son ouverture supérieure. L’huile de chasse se déplace dans le canal et extrude la solution de réaction excédentaire située à l’extérieur des microchambres. Chaque microchambre est isolée par l’huile de chasse d’eau.
    REMARQUE : L’interface mobile entre la solution de réaction et l’huile de chasse d’eau est visible, ce qui aide les gens à observer le mouvement du fluide à l’intérieur du canal. La solution extrudée peut être collectée dans le tube précédent, stockée à 4 °C, et réutilisée pour un autre appareil FemDA ou une réaction en vrac parallèle (dans le microtube ou une plaque microtiter).
  3. Pré-tirer 30 μL d’huile d’étanchéité (Fomblin Y25) à une pointe de pipette filtrée de 200 μL. Accrochez la pipette debout quelque part.
  4. Retirez simultanément les deux pointes de pipette insérées (voir les étapes 3.3 et 4.4) de l’appareil. Déplacez immédiatement l’appareil du bloc d’aluminium pour le parafilm.
    REMARQUE : Utilisez une pince à épiler pour fixer (mais éloignez-vous de la zone du chenal) l’appareil sur le bloc d’aluminium pendant la période d’enlèvement des pointes de pipette.
  5. Insérez immédiatement la pointe de pipette prête contenant l’huile d’étanchéité (voir l’étape 5.3) dans l’entrée du canal PDMS, et injectez l’huile dans le canal jusqu’à ce qu’elle déborde de la sortie.
    REMARQUE : Effectuez cette étape dès que le déplacement de l’appareil vers RT. Pour éviter le retour à l’intérieur du chenal, ne laissez pas le pouce du piston jusqu’à ce que l’huile d’étanchéité déborde de la sortie. L’huile de chasse s’évapore immédiatement après avoir déménagé hors de la sortie du chenal, tandis que l’huile d’étanchéité suivante s’accumule dans la sortie en raison de sa perte d’évaporation extrêmement faible.
  6. Séparez la pipette de la pointe de la pipette, puis retirez la pointe de la pipette de l’appareil. Nettoyez la surface du PDMS à l’aide d’un morceau de l’essuie-glace propre, puis appliquez une nouvelle goutte d’huile d’étanchéité à l’entrée et à la sortie, respectivement. Les gouttelettes de femtoliter sont scellées dans des microchambres individuelles par l’huile.
    REMARQUE : Utilisez une pince à épiler pour fixer (mais éloignez-vous de la zone du chenal) le canal PDMS sur le substrat pendant la période d’enlèvement de la pointe de la micropipette.
  7. Essuyez l’humidité accumulée sur la surface inférieure du verre de couverture. Le dispositif FemDA tel que préparé est maintenant prêt pour l’incubation et l’imagerie par microscopie.

6. Imagerie microscopie

  1. Démarrez un microscope à fluorescence inversée. Attendez la stabilisation (refroidissement) de la caméra. Utilisez un objectif d’immersion en huile 60x ou 100x. Placez le dispositif FemDA sur la scène motorisée. Définissez les paramètres d’imagerie.
    REMARQUE : Les paramètres d’imagerie comprennent le chemin d’accès au fichier, les canaux d’imagerie, les filtres, les temps d’exposition (en général, 100 ms suffisent; un temps plus court ou plus long est également possible selon les spécifications de la caméra) et l’intensité lumineuse.
  2. Trouvez le plan focal. Réglez la position de l’axe z de la lentille objective et fixez le plan focal à l’aide d’un système de mise au point automatique interne. Définissez la région d’intérêt (ROI; c.-à-d. x, y-axe) à imager.
    REMARQUE : Les principaux fabricants de microscopes (Nikon, Olympus, Zeiss, Leica) offrent tous la possibilité d’intégrer le système de mise au point automatique au microscope. Ce système de mise au point automatique est nécessaire pour maintenir la constante du plan focal pendant l’imagerie automatique multi-zones. Les ROI couvrent la zone FemDA dans le canal PDMS.
  3. Capturez les images de fluorescence. Capturez un seul cadre d’une image de champ lumineux (BF) déconcentrée pour chaque retour sur investissement. Ne modifiez PAS l’ordre et les coordonnées des ROV lors de l’imagerie des différents canaux.

7. Analyse des données d’image

REMARQUE : Analyser les données d’image à l’aide d’un plugin maison (appelé « FemDA ») basé sur Fidji (http://fiji.sc) pour extraire l’intensité de fluorescence de chaque gouttelette43. Installez la bonne version de Fidji selon le système d’exploitation. Fidji prend en charge la plupart des formats de fichiers d’image (par exemple, le fichier nd2 du microscope Nikon, le fichier czi du microscope Zeiss) à l’aide d’un plugin de construction « Bio-Formats. »

  1. Installation du plugin
    1. Copier et coller le fichier plugin (qui est disponible sur demande à l’auteur correspondant ou via le lien institutionnel suivant: https://fbox.jamstec.go.jp/public/FcsQwAsMKIqA9j0B2MJwLUMeHGsxp09hAkAFdVhQIDkZ) dans le dossier fidjien « plugins ».
    2. Démarrer le logiciel Fidji; le plugin « FemDA » peut être trouvé dans le menu déroulant « Plugins » de Fidji.
  2. Prétraitement des données d’image
    1. Ouvrez l’image BF déconcentrée (voir l’étape 6.3). Cliquez sur Processus | Soustraire l’arrière-plan... pour supprimer les arrière-plans continus lisses de chaque image des données d’image (Figure 4B). Cliquez sur Processus | Filtres | Médiane pour réduire le bruit de chaque image(figure 4C).
    2. Cliquez sur Image | Ajuster | Seuil pour vérifier et séparer le premier plan (indiquant les microchambres) de l’arrière-plan (indiquant la zone à l’extérieur des microchambres) de chaque image (inserts magnifiés dans la figure 4A-C).
      REMARQUE : Sélectionnez un algorithme approprié dans la liste déroulante de la fenêtre Threshold afin que seules les zones de microchambre, ainsi que les bords de chaque microchambre, puissent être identifiées et mises en évidence comme étant au premier plan. En particulier, la plupart des bords mis en évidence doivent être continus sans lacunes.
  3. Détermination de la coordination des gouttelettes
    1. Cliquez sur Plugins | FemDA | Analyse FemDA pour ouvrir l’interface utilisateur graphique (GUI) du plugin personnalisé (moitié supérieure de la figure 4D).
    2. Entrez le nombre minimal et maximum approximatif de pixels d’une seule microchambre. Introduisez la circularité minimale et maximale prévue (0: forme arbitraire; 1: cercle parfait) des microchambres. Entrez le numéro de cadre du cadre de démarrage et du cadre final.
    3. Cliquez sur Générer le retour sur investissement dans l’interface graphique pour détecter chaque microchambre, et les VOI détectés avec succès sont affichés dans une fenêtre contextuelle ROITable.
    4. Retournez à la fenêtre FemDA Analysis et cliquez sur le bouton Appliquer le masque roi pour vérifier si les microchambres sur les cadres ont été correctement détectés (en bas à gauche de la figure 4D). Si non, modifiez certains d’entre eux et répétez en cliquant sur Générer le retour sur investissement et appliquer le masque roi. Si oui, passez à l’étape suivante.
      REMARQUE : Il peut y avoir très peu de microchambres qui ne peuvent pas être bien identifiées comme le roi (voir la moitié inférieure de la figure 4D)par n’importe quel algorithme du seuil en raison du contraste insuffisant entre le premier plan et l’arrière-plan. Ce n’est pas problématique du point de vue statistique.
  4. Extraction de l’intensité de fluorescence
    1. Ouvrez l’image de fluorescence et apportez-la à l’avant. Cliquez à nouveau sur Appliquer le masque roi pour appliquer les IRO déterminés sur l’image de fluorescence (en bas à droite de la figure 4D).
    2. Sélectionnez One-Shot pour analyser une image de point final (comme illustré avec les données mNeonGreen) ou Time-Lapse pour analyser les données du cours du temps (comme illustré avec les données alcalines de phosphatase).
    3. Entrée 100 dans la zone Nombre de pixels supérieurs signifie que seuls les 100 pixels supérieurs de chaque retour sur investissement seront utilisés pour calculer l’intensité moyenne de la gouttelette correspondante. Si l’entrée 0 dans le nombre de pixels supérieurs, tous les pixels de chaque retour sur investissement seront utilisés pour calculer l’intensité moyenne de la gouttelette correspondante.
      REMARQUE : Il peut y avoir une dérive de plusieurs pixels entre les images BF et la fluorescence, ce qui signifie que certains pixels dans les ÉRI peuvent appartenir à l’arrière-plan de l’image de fluorescence. Par conséquent, le plugin fournit une option pour spécifier le nombre de pixels classés d’intensité supérieure pour le calcul de l’intensité moyenne de chaque gouttelette.
    4. Pour l’analyse de l’image de point final (c.-à-d. sélectionnez One-Shot à l’étape 7.4.2), cliquez sur le bouton Mesurer l’intensité pour calculer les intensités moyennes de toutes les gouttelettes détectées. Le ROITable est mis à jour avec les nouvelles données de l’image de fluorescence. Pendant ce temps, un histogramme est affiché dans une nouvelle fenêtre popup Histogramme (Figure 4E).
      REMARQUE : La modification de la taille du compartiment dans la zone Numéro de compartiment peut optimiser l’affichage de l’histogramme. Un ajustement à une somme de distributions gaussiennes peut être accompli dans l’interface graphique développée. La fenêtre journal popup de Fidji affiche les résultats d’ajustement. Sinon, exportez les données en cliquant sur le bouton enregistrer sous forme de texte et effectuer diverses analyses statistiques avec d’autres logiciels ( Figure4F, G).
    5. Pour l’analyse de l’image du cours du temps (c.-à-d. sélectionnez Time-Lapse à l’étape 7.4.2), la fenêtre contextuelle est Intensité Time Course au lieu de Histogramme, qui contient un histogramme correspondant à un point de temps spécifique et une parcelled’intensitétemporelle ( Figure 5 ). Les données textuelles peuvent également être exportées à l’aide du menu Fichier de la fenêtre contextuelle.

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Representative Results

Le processus de microfabrication consiste en le nettoyage du substrat, la fonctionnalisation de surface, le revêtement CYTOP, la photolithographie, la gravure sèche, le décapage photorésiste et le nettoyage final. Fait important, le protocole présenté a permis l’enlèvement complet du polymère cytop hydrophobe à l’intérieur des microchambres Figure 3A),produisant une structure hydrophile-in-hydrophobe très parallèle sur un substrat en verre de couverture standard. À l’aide du protocole d’étanchéité à l’huile, la dimension uniforme des gouttelettes résultantes a été vérifiée en encapsulant la solution fluorescente dans les microchambres (figure 3B). L’intensité de fluorescence extraite à l’aide du logiciel développé est un bon indicateur de la taille des gouttelettes. Le CV de l’intensité de fluorescence, 3 %, reflétait la répartition étroite de la taille des gouttelettes sur l’ensemble du réseau (figure 3C). L’image 3D reconstruite à partir de la microscopie confocale a également montré le volume constant des gouttelettes au fil du temps (Figure 3D, Film supplémentaire 1)44. En comparaison, une huile FC-40 largement utilisée a généré les gouttelettes présentant une différence multiple dans l’intensité de fluorescence45. Les gouttelettes formées dans FemDA étaient stables à RT pendant au moins 24 heures (figure 3E). La haute qualité des gouttelettes a finalement constitué la base de la mesure quantitative.

Les données à haut débit nécessitent des outils d’analyse de données à haut débit46,47. Le plugin développé a grandement simplifié et accéléré l’analyse des données d’image. Basé sur la théorie du traitement d’image numérique48, l’image BF déconcentrée peut être binarisée et utilisée pour fournir les informations de coordonnées de chaque gouttelette après correction de fond et réduction du bruit (Figure 4A-C). Cette idée a rendu possible la localisation précise des gouttelettes foncées.

La protéine fluorescente mNeonGreen a été synthétisée dans FemDA. L’ADN de modèle avec une concentration de 0.05 molécules par gouttelette a été aléatoirement distribué dans chaque gouttelette pour initier la synthèse de protéine avec la transcription sans cellules couplées et les réactions de traduction. Étant donné que le nombre moyen de molécules d’ADN par gouttelette était inférieur à 1, certaines gouttelettes contenaient zéro ADN de modèle, tandis que d’autres contenaient une ou plusieurs molécules d’ADN. Après 6 heures d’incubation à RT, l’image du point final a été capturée à l’aide du microscope. Les données d’image de pile ont été analysées par le logiciel développé à l’aide de l’image BF déconcentrée simultanée (Figure 4A-E). L’intensité de fluorescence de chaque gouttelette est une mesure du rendement protéique de la gouttelette correspondante. L’histogramme des intensités de fluorescence a montré une distribution discrète et a été bien équipé par une somme de distributions gaussiennes d’intervalles de pic à pic égaux (Figure 4F), qui a fortement suggéré une occupation de différents nombres de molécules d’ADN par gouttelette. Semblable au jeu répété de retournement de pièce, le nombre d’événements aléatoires indépendants qui se produisent est mathématiquement décrit par la distribution de Poisson. La probabilité d’occurrence de gouttelettes contenant différents nombres (jusqu’à 3 dans cet exemple) de molécules d’ADN correspondait parfaitement à une distribution de Poisson (P = e-λ • λk / k!, où λ est le nombre moyen prévu de molécules d’ADN par gouttelette et k est le nombre réel de molécules d’ADN dans une gouttelette) avec une moyenne de 0,05 molécules d’ADN par gouttelette (Figure 4G)31, comme prévu pour une distribution aléatoire des molécules d’ADN. Étant donné que la concentration de chargement de la solution d’ADN de modèle était la même que la λ ajustée finale (c.-à-d. 0,05), l’efficacité de réaction du CFPS dans notre FemDA était de 100 % (ou près de 100 %). En d’autres termes, une seule molécule d’ADN suffit à déclencher efficacement la réaction du CFPS dans la gouttelette femtoliter.

La réaction de CFPS de la phosphatase alcaline a été enregistrée toutes les 5 minutes. Le logiciel développé prend également en charge l’analyse des données du coursd’heure( Figure 5 ). La réaction fluorogène couplée a montré une distribution discrète similaire de l’intensité de fluorescence des gouttelettes à des moments plus tôt. Les résultats de l’histogramme ont également permis de vérifier l’occupation de différents nombres de molécules d’ADN dans la gouttelette. L’intensité de fluorescence a finalement convergé vers une valeur avec l’épuisement progressif du substrat fluorogène DiFMUP.

Figure 1
Figure 1 : Processus de microfabrication du substrat de microchambre ultra-haute densité. (A) Dessin technique du mandrin à vide personnalisé. Unité : mm. (B) Épaisseur du film CYTOP vs données de vitesse de rotation. (C) Revêtement de spin du cytop perfluoropoler sur un substrat en verre silanisé. Les photographies ont montré un bon exemple de revêtement homogène et un mauvais exemple de revêtement inhomogeneous, respectivement. La flèche noire indiquait la position spécifique du film cytop inhomogène. (D) Revêtement de spin du photorésiste sur le substrat recouvert de CYTOP. Après le revêtement de spin, le photorésiste près du bord du substrat doit être enlevé à l’aide d’un essuie-glace propre imbibé d’éthanol (photo du milieu). Les photographies ont montré un bon exemple de revêtement homogène et un mauvais exemple de revêtement inhomogeneous, respectivement. La flèche blanche indiquait la position spécifique du film photorésiste inhomogène. (E) Exposition du photorésiste enduit à l’aide d’un alignant de masque. (F) Développement du photorésiste exposé dans un développeur. La partie exposée du photorésiste est soluble dans la solution de développeur. (G) Gravure réactive-ion de CYTOP. Le CYTOP découvert a été enlevé par le plasma O2. (H) Retrait du masque photorésiste. Le photorésiste a été enlevé par l’acétone. Le substrat a été nettoyé à l’aide de 2-propanol et H2O. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Préparation et utilisation du dispositif de microchambre. (A) Peser l’agent de guérison et le prépolymère de PDMS. (B) Verser le mélange mélangé et désaéré dans une boîte de Pétri à motifs de ruban adhésif. Il y avait quelques bulles d’air nouvellement générées dans le mélange de polymère. (C) Désaérer le mélange à nouveau dans une chambre à vide. Les bulles d’air montaient et éclataient sur la surface supérieure. (D) La résine PDMS désaérée et guérie. (E) Éplucher l’élastomère PDMS guéri de la boîte de Pétri. (F) Couper chaque morceau de blocs de canal PDMS à l’aide d’un coupe-câble plat. (G) Percer des trous à chaque extrémité du canal PDMS à l’aide d’un poinçon de biopsie. (H) Le dispositif assemblé. La résine PDMS peut adhérer à la surface du CYTOP. (I) Zone translucide de tableau de microchambre à l’intérieur du canal PDMS rempli de la solution aqueuse avant de refroidir. (J) Zone transparente de tableau de microchambre à l’intérieur du canal PDMS après refroidissement. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Gouttelettes de femtoliter ultra-uniformes et ultra-stables. (A) Imagerie de microscopie confocale de balayage 3D pour le substrat fabriqué. Les microchambres cylindriques de l’image de l’exemple montraient une hauteur de 3 μm et un diamètre de 4 μm. (B)Gouttelettes uniformes de femtoliter sur une grande surface du tableau planaire. Seule une zone partielle de l’ensemble du tableau a été affichée ci-après. Une solution fluorescente (10 μM ATTO-514) a été scellée dans chaque gouttelette. (C) Répartition de la taille des gouttelettes sur un seul tableau. L’intensité de fluorescence a été utilisée comme indicateur de la taille des gouttelettes. Le CV n’était que de 3%. (D) Mesure volumétrique à l’aide de données confocales de temps de pile z. Le volume de gouttelettes sur le tableau a été donné par le logiciel microscope (NIS-Elements, Nikon). (E) Récupération de fluorescence après photobleaching. Après le premier cadre, plusieurs gouttelettes ont été complètement photobleached à l’aide d’un faisceau laser confiné d’un microscope confocal. Leur intensité de fluorescence a été enregistrée pendant 24 h, et aucune récupération de fluorescence n’a été observée (ligne rouge). L’intensité de fluorescence d’autres gouttelettes non photobleached dans le même champ de vision a été enregistrée dans la ligne noire. Les barres d’erreur (couleurs translucides) étaient 1 SD pour chaque point de temps. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Procédure d’analyse des données d’image microscopiques du point final. L’image de champ lumineux déconcentrée a été utilisée pour extraire la coordonnée de chaque microchambres/gouttelettes. En fonction de la différence d’intensité entre le bord des microchambres (au premier plan) et d’autres zones (en arrière-plan), le bord continu et quasi-circulaire peut être extrait de l’arrière-plan. En raison de la répartition inégale de l’arrière-plan dans le champ de vision (A), certains pré-traitement d’image sont généralement nécessaires pour améliorer la qualité de la sortie binarizing. Après avoir soustrait l’arrière-plan (B), l’arrière-plan de chaque cadre a été uniformisé. Empiriquement, la valeur d’entrée dans le «rayon de boule de roulement» (étape 1) était de 20-50 pour 2048 pixels × 2048 images de pixels et de 10-20 pour 512 pixels × 512 images de pixels. Plus la valeur est grande, plus le temps de traitement est court. Pour réduire le bruit dans l’image soustraite en arrière-plan, appliquez un filtre médian à l’image (C). En général, la valeur d’entrée dans le Radius (étape 3) était de 1 à 2 pixels. Comme le montre l’insert magnifié, l’image soustraite et filtrée en arrière-plan peut être bien binarisée à l’aide du plugin seuil de construction afin que le premier plan correspondant aux bords ainsi que la région d’intérêts (ROI) puisse être reconnu avec précision. La détection des ROI pour tous les cadres de l’image a été effectuée à l’aide du plugin maison installé FemDA Analysis (D). La taille des pixels (étapes 5 et 6) et la circularité (étapes 7 et 8) des ROV, les cadres que nous voulons mettre dans le calcul (étapes 9 et 10) ont été définis manuellement en fonction des données réelles. Après avoir cliqué sur Générer le retour sur investissement (étape 11) et en attente, la coordonnée de chaque retour sur investissement dans les cadres d’entrée a été déterminée. Après avoir cliqué sur le masque Appliquer le retour sur investissement (étape 12), chaque roi détecté a été fermé et mis en surbrillance par une ligne jaune. Après avoir ouvert l’image de fluorescence et cliqué à nouveau sur le masque Appliquer le retour sur investissement, le masque ROI déterminé a été appliqué à l’image de fluorescence. Le nombre de pixels supérieurs (étape 14) a spécifié le nombre de pixels classés dans l’intensité supérieure de chaque roi pour le calcul de l’intensité moyenne des gouttelettes respectives. Après avoir cliqué sur Mesurer l’intensité (étape 15) et en attente, l’histogramme a été généré (E). L’histogramme peut être équipé d’une somme de distributions gaussiennes en utilisant les paramètres disponibles dans la fenêtre histogramme. Alternativement, les données d’intensité moyenne peuvent être exportées vers un fichier texte (étape 16) et analysées par d’autres logiciels (F). (G) La probabilité d’occurrence de gouttelettes contenant différents nombres de molécules d’ADN dans le tableau donné. L’histogramme (couleur grise) a été bien équipé par une distribution de Poisson (ligne en pointillés rouges) avec une moyenne de 0,05 molécules d’ADN par gouttelette, comme prévu pour une distribution aléatoire des molécules d’ADN. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Analyse des données d’image microscopiques du cours du temps. Les ROI détectés (suivant les étapes 1 à 12 de la figure 4)ont été directement appliqués aux données du cours de temps. À l’étape 13 de la figure 4, sélectionnez Time-lapse et entrez l’intervalle de temps réel (en minutes) entre les images adjacentes dans l’intervalle de temps [min]. Après avoir cliqué sur Mesurer l’intensité (étape 15 de la figure 4)et en attente, la parcelle d’intensité temporelle et l’histogramme (le même que la figure 4E)ont été générés. La position hist a spécifié le point de temps de l’histogramme, qui a été montré comme une ligne rouge verticale. Le plugin prend également en charge la spécification des couleurs pour chaque ligne de trace. Jaune: 0 ADN; bleu était 1 ADN; rouge: 2 ADN; noir: 3 ADN. Les données du cours d’heure peuvent également être exportées vers un fichier texte. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Film supplémentaire 1. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film. 

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Discussion

La mesure hautement quantitative basée sur les gouttelettes hautement uniformes, stables et biocompatibles de FemDA a permis la distribution discrète, la caractéristique unique de notre étude différant des autres. Nous avons systématiquement optimisé et détaillé les processus de microfabrication et de formation de gouttelettes dans cet article. Il y a plusieurs étapes critiques dans le protocole établi.

Tout d’abord, le revêtement uniforme du polymère CYTOP très visqueux sur le substrat rectangulaire en verre mince détermine en grande partie la qualité du substrat résultant. Compte tenu de la distance de travail généralement courte de l’objectif avec des grossissements élevés (voir l’étape 6.1), le verre à couvercle mince doit être utilisé. Un revêtement de spin de haute qualité sur un substrat mince et flexible est généralement délicat. Nous n’avons pas encore testé toutes les conceptions possibles, mais nous avons constaté que le mandrin à vide multi-trous avec la même dimension rectangulaire a bien fonctionné pour le spin-revêtement. Il est important de déposer le polymère CYTOP au centre du substrat en verre de couverture et de commencer immédiatement le revêtement de spin (voir l’étape 1.3.2). Le degré de difficulté est moins lié à la forme du substrat, mais la viscosité du polymère. La gamme de produits CYTOP offre plusieurs concentrations différentes de l’emballage disponible dans le commerce. Le diluant qui l’accompagne dans l’emballage peut également être utilisé pour diluer le produit d’origine à une viscosité inférieure si nécessaire. CYTOP 816 que nous avons utilisé dans l’expérience est le produit commercial avec la plus forte concentration capable de dissoudre le polymère dans le solvant. Le revêtement plus épais nécessite une vitesse de rotation plus faible ou plusieurs tours de revêtement et de durcissement. Une parcelle d’épaisseur caractéristique par rapport à la courbe de vitesse de rotation est fortement recommandée lors de l’utilisation d’un nouveau coater de spin dans un nouvel environnement.

Deuxièmement, l’humidité appropriée de la salle blanche est cruciale pour la photolithographie idéale ainsi que l’enlèvement complet du photorésiste à la position spécifiée. La réaction photochimique dans la photolithographie utilise H2O comme l’un des réactifs. Cependant, le softbake à la température supérieure à la température d’ébullition de H2O élimine la teneur en H2O du photorésiste enduit. Le photorésiste « assé » doit prendre le temps d’absorber à nouveau H2O de l’air (voir étape 1.4.6). Ce point est souvent négligé. Étant donné que de nombreux laboratoires ne peuvent avoir que quelques installations simplifiées de salles propres sans contrôle de l’humidité, l’humidité fluctuerait considérablement au cours de la saison ou serait affectée par les conditions météorologiques. Une solution à faible coût consiste à utiliser un humidificateur ou un déshumidificateur à usage domestique dans la salle blanche. La couche CYTOP entièrement exposée après le développement peut être sélectivement et entièrement enlevée par RIE, exposant entièrement le fond de verre. Finalement, la structure hybride du fond de verre hydrophile et de la paroi latérale hydrophobe CYTOP est importante pour piéger la solution aqueuse au femtoliter.

Troisièmement, les huiles nouvellement découvertes (ASASHIKLIN AE-3000, Fomblin Y25) et surfactant (SURFLON S-386) ont montré des performances d’étanchéité sans précédent pour le réacteur fluoropolymère13. L’injection de l’huile de chasse doit être effectuée sur le bloc métallique plat réfrigéré (voir l’étape 5.2); sinon, les gouttelettes près de l’entrée du chenal ne peuvent pas être formées. L’injection de la deuxième huile d’étanchéité peut être effectuée à RT (voir l’étape 5.5). Ces huiles et surfactants n’ont jamais été utilisés dans la recherche biologique avant. Aucune meilleure alternative n’a été trouvée pour l’instant. Pour élargir l’arsenal de la combinaison utile d’huiles et de surfactants pour la préparation des gouttelettes, le nouveau membre des huiles (ou les similaires dans la même gamme de produits) et le surfactant (ou les similaires dans la même gamme de produits) sont dignes d’essayer d’être appliqués dans les systèmes de gouttelettes microfluidiques.

Voici deux points supplémentaires à remarquer. La première est le fait qu’il y a un décalage de temps parmi les ROI pendant l’imagerie de microscopie. Le temps total d’imagerie pour un cycle dépend principalement de la taille du tableau et du grossissement de la lentille objective. Le temps d’exposition, la vitesse d’obturation et la vitesse de déplacement de l’étape motorisée sont également des facteurs mineurs. En règle générale, l’imagerie 106 gouttelettes à 60 × grossissement nécessiterait au moins 10-20 minutes. Ce délai inévitable introduit certaines erreurs dans l’analyse des données, qui doivent toujours être prises en considération. L’autre est le fait que le nombre total de gouttelettes sur un seul substrat ne dépasserait pas 108–109,augmentant même la densité des gouttelettes ou réduisant la taille individuelle de la gouttelette. C’est parce que la taille du substrat en verre qui peut être manipulé par l’aligneur de masque (pour les gaufrettes de 4 pouces) est limitée. Il n’est pas recommandé d’augmenter davantage la taille du verre de couverture parce qu’un substrat en verre grand, mince et fragile est difficile à manipuler.

FemDA peut être considéré comme une plaque de microtitre super miniaturisée. Toutes les réactions biochimiques qui ont été effectuées dans les plaques de microtitre de 96 puits pourraient être essayées à l’aide de FemDA. Il peut sûrement être utilisé pour la mesure de l’activité enzymatique sans purification des protéines compliquée. Il pourrait également être compatible avec la réaction numérique en chaîne de polymérase (PCR numérique) et l’analyse immunosorbent numérique (ELISA numérique)31,49. Le petit volume, le grand réseau et une grande stabilité apporteraient certains avantages par rapport aux méthodes de biotest numériques existantes. Le système FemDA capable de résoudre différents nombres de molécules d’ADN de modèle dans les gouttelettes de femtoliter a déjà montré la puissance sur le criblage précis de protéine13. FemDA est un nouveau système de compartimentation in vitro capable d’évoluer rapidement une variété d’enzymes. Avec les progrès de la bioinformatique et des techniques de construction de bibliothèques, l’ère d’une création rapide à la demande de protéines de haute performance sera sûrement à venir.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ces travaux ont été soutenus par le numéro de subvention JSPS KAKENHI JP18K14260 et le budget de l’Agence japonaise pour les sciences et la technologie de la Terre marine. Nous remercions Shigeru Deguchi (JAMSTEC) et Tetsuro Ikuta (JAMSTEC) d’avoir fourni les installations de caractérisation. Nous remercions Ken Takai (JAMSTEC) pour le support logiciel commercial. La microfabrication a été réalisée à Takeda Sentanchi Supercleanroom, l’Université de Tokyo, soutenue par le « Nanotechnology Platform Program » du Ministère de l’Éducation, de la Culture, des Sports, des Sciences et de la Technologie (MEXT), Japon, Grant Number JPMXP09F19UT0087.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-aminopropyl)triethoxysilane Sigma-Aldrich 440140
1 mL syringe Terumo SS-01T
2-propanol Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
3D laser scanning confocal microscope Lasertec OPTELICS HYBRID Other similar microscopes (e.g., Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) are also applicable.
50 mL syringe Terumo SS-50LZ
6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate Thermo Fisher Scientific D6567 Prepare a 5 mM stock solution in dimethyl sulfoxide
Acetone Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
Purity 99.8%.
Air blower Hozan Z-263
Aluminum block BIO-BIK AB-24M-02
Aluminum microtube stand BIO-BIK AB-136C
ASAHIKLIN AE-3000 AGC (Test sample) Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
BEMCOT PS-2 wiper Ozu 028208
Biopsy punch with plunger Kai BPP-10F
Cover glass Matsunami Glass No. 1 (24 mm × 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness) Size-customized.
Cover glass staining rack Nakayama 803-131-11
CRECIA TechnoWipe clean wiper Nippon Paper Crecia C100-M
Cutting mat GE Healthcare WB100020
CYTOP AGC CTL-816AP
Deaeration mixer Thinky AR-100
Desktop cutter Roland STIKA SV-8
Developer AZ Electronic Materials AZ 300 MIF AZ Electronic Materials was now acquired by Merck.
Other alkaline developers may be also applicable but should require optimization of development conditions (time, temperature, etc.)
Double-coated adhesive Kapton film tape Teraoka Seisakusho 7602 #25
Ethanol Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
Purity 99.5%.
Fiji Version: ImageJ 1.51n
Flat-cable cutter Tokyo-IDEAL MT-0100
Fomblin oil Solvay Y25, or Y25/6 Free test sample may be available upon inquiry to Solvay. Fomblin Y25/6 is an alternative if Y25 is not readily available.
Hot plate AS ONE TH-900
Injection needle Terumo NN-2270C 22G × 70 mm
Inverted fluorescence microscope Nikon Eclipse Ti-E Epifluorescence specification, CCD or sCMOS camera, motorized stage, autofocus system, and high NA objective lens are required.
KaleidaGraph Synergy Version: 4.5
Mask aligner SUSS MA-6 Other mask aligners are also applicable as long as the vacuum contact mode is avaliable.
MICROMAN pipette GILSON E M250E Capillary piston tip: CP250
Microsoft Excel Microsoft Version: 16.16.15
Mini vacuum chamber AS ONE MVP-100MV
Nuclease-free water NIPPON GENE 316-90101
Parafilm Amcor PM-996
PCR tube NIPPON Genetics FG-021D/SP
Petri dish AS ONE GD90-15 Diameter 90 mm, height 15 mm.
Photoresist AZ Electronic Materials AZ P4903 AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. AZ P4620 is an alternative.
Plate reader BioTek POWERSCAN HT
Polyethelene gloves AS ONE 6-896-02 Trade name: Saniment.
PURExpress in vitro protein synthesis kit New England Biolabs E6800S or E6800L For cell-free protein synthesis reaction.
Reactive-ion etching system Samco RIE-10NR Other RIE systems are also applicable but should require optimization of RIE conditions (gas flow rate, chamber pressure, RF power, etching time, etc.)
RNase inhibitor New England Biolabs M0314S
Scotch tape 3M 810-1-18D
Sodium hydroxide solution FUJIFILM Wako Pure Chemical 194-09575 8 M concentration; danger.
Spin coater Oshigane SC-308
SURFLON S-386 surfactant AGC (Test sample) Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
SYLGARD 184 silicone elastomer Dow Sylgard184 Chemical composition: polydimethylsiloxane. The default mixing ratio is base : curing agent = 10 : 1 (m/m).
Tweezers Ideal-tek 2WF.SA.1
2A
Ultrasonic cleaner AS ONE ASU-2M
Vacuum chuck Oshigane (Customized) Material: delrin; rectangular sample stage with multiple holes (48 holes, each with 1 mm diameter); the size is customzied to fit the size of the cover glass (24 mm × 32 mm).

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Chimie Numéro 160 Microfabrication gouttelette femtoliter synthèse de protéines sans cellules protéine fluorescente enzyme monomolécule distribution de Poisson analyse d’image compartimentation in vitro
Un tableau de gouttelettes femtoliter pour la synthèse massive de protéines parallèles à partir de molécules d’ADN unique
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Zhang, Y., Kurosawa, K., Nishiura, D., Tei, M., Tsudome, M. A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules. J. Vis. Exp. (160), e60945, doi:10.3791/60945 (2020).

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