Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

A مجموعة القطيفة Femtoliter تخليق البروتين موازية على نطاق واسع من جزيئات الحمض النووي واحد

Published: June 20, 2020 doi: 10.3791/60945
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3
1SUGAR Program, X-star, Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC), 2Center for Mathematical Science and Advanced Technology, Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC), 3Deep-Sea Nanoscience Research Group, Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC)

Summary

الهدف العام للبروتوكول هو إعداد أكثر من مليون من قطرات femtoliter أمر، موحدة ومستقرة ومتناسقة بيولوجيا على الركيزة 1 سم2 2 من الألواح التي يمكن استخدامها تخليق البروتين خالية من الخلايا.

Abstract

إن التقدم في التحليل المكاني وحساسية الكشف عن الأجهزة العلمية يجعل من الممكن تطبيق مفاعلات صغيرة في البحوث البيولوجية والكيميائية. لتلبية الطلب على ردود الفعل الدقيقة عالية الأداء، قمنا بتطوير مجموعة قطرات femtoliter (FemDA) الجهاز وتجسد تطبيقه في توليف البروتين خالية من الخلايا موازية على نطاق واسع (CFPS) التفاعلات. تم توليد أكثر من مليون قطرة موحدة بسهولة داخل منطقة بحجم الإصبع باستخدام بروتوكول ختم النفط من خطوتين. كانت كل قطرة راسية في غرفة صغيرة femtoliter تتألف من قاع هيدروفيلي وجانبية مبيدة للماء. الهيكل الهجين الهيدروفيلي في الرهاب المائي وزيوت الختم المخصصة والمواد الراكعة على السطح أمر حاسم للإبقاء بشكل ثابت على محلول الفاتوليتر المائي في الفضاء الفاتوليتر دون فقدان التبخر. تكوين femtoliter وهيكل بسيط من الجهاز FemDA سمح الحد الأدنى من استهلاك الكاشف. وقد جعل البعد الموحد للمفاعلات القطيرة قياسات كمية ومدى زمني واسع النطاق مقنعة وموثوقة. تكنولوجيا FemDA ربطت العائد البروتيني لرد فعل CFPS مع عدد جزيئات الحمض النووي في كل قطرة. قمنا بتبسيط الإجراءات المتعلقة بالتكبير الدقيق للجهاز ، وتشكيل قطرات femtoliter ، واكتساب وتحليل بيانات الصورة المجهرية. البروتوكول التفصيلي مع التكلفة المنخفضة الأمثل التشغيل يجعل التكنولوجيا FemDA في متناول الجميع الذين لديها مرافق غرف نظيفة القياسية والمجهر الفلورانس التقليدية في مكانها الخاص.

Introduction

يستخدم الباحثون مفاعلات لتنفيذ التفاعلات البيولوجية/الكيميائية. وهناك جهود كبيرة بذلت لتخفيض حجم المفاعل وزيادة الإنتاجية التجريبية من أجل خفض استهلاك الكاشف مع تحسين كفاءة العمل. ويهدف كلا الجانبين إلى تحرير الباحثين من عبء العمل الثقيل، وخفض التكلفة وتسريع البحث والتطوير. لدينا خارطة طريق تاريخية واضحة حول تطوير تكنولوجيات المفاعل من وجهة نظر حجم رد الفعل والإنتاجية: قارور واحدة / قارورة / أنابيب الاختبار ، أنابيب المليلتر، أنابيب ميكروليتر، شرائط ميكروليتر 8 أنبوب، ميكرولتر 96/384/1536-well لوحة، وmicrofluidic nanoliter/picoliter/femtoliter مفاعلات1،,2،,3،,4،,5،,6،,7. مماثلة لتقليص حجم السمة من الترانزستورات على رقائق الدوائر المتكاملة في صناعة أشباه الموصلات في العقود الماضية، والمفاعلات الدقيقة الحيوية/الكيميائية تمر من خلال خفض حجم وتكامل النظام. وكان لهذه الأدوات الصغيرة تأثير عميق على الخلايا القائمة على أو الخلايا خالية من البيولوجيا التركيبية، biomanmancturinging، وارتفاع الإنتاجية تقادم وفحص8،9،10،11،12. هذه الورقة تصف جهودنا الأخيرة على تطوير تكنولوجيا مجموعة قطرات فريدة من نوعها ويوضح تطبيقه في CFPS13، وهي تقنية أساسية للبيولوجيا الاصطناعية والمسح الجزيئي المجتمعات14. على وجه الخصوص، نحن نقدم عمدا بروتوكول الأمثل ومنخفضة التكلفة لجعل الجهاز FemDA الوصول إلى الجميع. ومن شأن البروتوكول المنخفض التكلفة والسهل التعامل مع الجهاز المصغر أن يسهم في الأغراض التعليمية للجامعات ويساعد على نشر التكنولوجيا.

FemDA يعد قطرات femtoliter في كثافة عالية جدا من 106 لكل 1 سم2 على الركيزة الزجاجية المفلة. نحن المغلفة البوليمر ماء، CYTOP15، على الركيزة الزجاجية وحفرت بشكل انتقائي (إزالة) CYTOP في مواقف محددة مسبقا لتوليد مجموعة microchamber على الركيزة. وهكذا، وتتألف من microchamber الناتجة عن جدار سفلي (CYTOP) وأسفل هيدروفيلي (الزجاج). عندما يتدفق الماء والزيت على التوالي على السطح المنقوش، يمكن أن يكون محاصرا ومغلقة في microchambers. الهيكل المائي في الرهاب من الماء أمر حيوي لصد المياه خارج الزُنَق الصغيرة، وعزل المفاعلات الدقيقة الفردية، والاحتفاظ بمحلول مائي صغير داخل الفضاء الفاتوليت. تم تطبيق الخاصية الفريدة بنجاح لإعداد قطرات الماء في الزيت والدهون ثنائي الطبقات microcompartments16,17. بالمقارنة مع الجهاز النموذج16، ونحن أول الأمثل عملية microfabrication لتحقيق إزالة كاملة من البوليمر CYTOP وكذلك التعرض الكامل للقاع الزجاجي. CYTOP هو الفلوروبوليمر خاص يتميز التوتر السطحي المنخفض للغاية (19 م إن/ م) أقل من المواد التقليدية متناهية الصغر مثل الزجاج والبلاستيك والسيليكون. وقد تم بالفعل استخدام أدائها البصرية والكهرباء والكيميائية الجيدة في المعالجة السطحية للأجهزة microfluidic18،19،20،21،22،23،24. في نظام FemDA ، لتحقيق التبول الجيد للنفط على سطح CYTOP ، يجب أن يكون التوتر السطحي للنفط أقل من السطح الصلب25. خلاف ذلك، فإن الزيت السائل في اتصال مع سطح صلب يميل إلى أن تصبح كروية بدلا من الانتشار على السطح. إلى جانب ذلك، وجدنا أن بعض الزيوت البيرفلوروكربون شعبية (على سبيل المثال، 3M FC-40)16 والزيوت الهيدروفلورية (على سبيل المثال، سلسلة 3M Novec) يمكن أن تذوب CYTOP نتيجة لmorphology غير متبلور من CYTOP، والتي هي قاتلة للقياس الكمي وسيكون موضع شك من حيث التلوث المتبادل بين قطرات. لحسن الحظ، حددنا النفط صديقة للبيئة وصديقة للبيئة و معارض أقل (< 19 mN/m) التوترالسطحي 13. كما وجدنا السطحي الجديد التي يمكن أن تذوب في النفط المحدد وظيفة في تركيز منخفض (0.1٪، على الأقل 10-fold أقل من تلك التي ذكرت سابقا الشعبية26،27)13. يمكن تثبيت واجهة الماء/الزيت الناتجة عن ذلك بواسطة السطحي. بسبب ارتفاع معدل التبخر من النفط، وبعد تدفق مع النفط، ونحن تطبيق آخر النفط بيوكومباتيبل وصديقة للبيئة لتحل محل أول واحد لختم microchambers. ونحن ندعو النفط الأول (ASAHIKLIN AE-3000 مع 0.1 wt ٪ SURFLON S-386) "تدفق النفط" والنفط الثاني (Fomblin Y25) "النفط الختم" على التوالي.

استراتيجية ختم النفط على خطوتين يمكن تحقيق تشكيل قوي من مجموعة قطرات femtoliter في غضون دقائق ودون أجهزة متطورة. بسبب مشكلة التبخر، فقد اعتبر تحديا لتوليد المفاعلات الدقيقة أصغر من وحدات التخزين picoliter28. وقد عالجت المنظمة هذه المسألة عن طريق تحسين المواد والعمليات المستخدمة لإعداد المفاعلات الدقيقة/القطرات بشكل منهجي. وتشمل العديد من السمات الجديرة بالملاحظة من قطرات الناتجة عن ذلك التوحيد عالية (أو أحادية العرض)، والاستقرار، والمرونة البيولوجية في مقياس femtoliter. معامل الاختلاف (CV) من حجم قطرات هو فقط 3٪ (دون تصحيح التظليل للصور المجهرية)، والسيرة الذاتية أصغر بين منصات قطرات في العالم، والذي يضمن قياس موازي للغاية والكمية. قطرات femtoliter مستقرة لمدة 24 ساعة على الأقل دون تلوث بين قطرات في درجة حرارة الغرفة، وهو أمر قيم لقياس مسار زمني موثوق بها. فيما يتعلق بالتكواؤم الحيوي، نجحنا في تجميع البروتينات المختلفة من الحمض النووي قالب نسخة واحدة في القطيرة femtoliter، والتي كانت تعتبر في السابق صعبة أو غير فعالة29،30. سيكون من الجدير توضيح لماذا بعض البروتينات القادرة على توليفها في FemDA لا يمكن توليفها في أنظمة قطرات أخرى. لم يكن FemDA مجرد تقدم تقني ، ولكنه أدرك أيضًا قياسًا كميًا غير مسبوق يمكن أن يرتبط بين غلة البروتين (كما تعكسه كثافة الفلورانس في القطرة) بعدد جزيئات الحمض النووي في كل قطرة. ونتيجة لذلك، أظهر الرسم البياني لكثافة الفلوريسنس من قطرات من CFPS التي تعتمد على FemDA توزيعًا منفصلًا يمكن تركيبه بشكل جيد من خلال مجموعة من التوزيعات الغاوسية لفواصل زمنية متساوية من الذروة إلى الذروة. وعلاوة على ذلك، فإن احتمال حدوث قطرات تحتوي على أعداد مختلفة من جزيئات الحمض النووي كان مناسبا تماما لتوزيع بواسون31. وبالتالي، يمكن تطبيع الغلة البروتين مختلفة في كل قطرة على أساس توزيع منفصلة. هذه الميزة الهامة تسمح لنا بفصل معلومات النشاط الأنزيمي عن الكثافة الظاهرة ، التي لم تكن متاحة مع منصات أخرى صغيرة حتى الآن. القائمة microfluidic الخلية / نظم الفرز قطرات المهرة في الفرز التلقائي بالكامل وجيدة في تركيز العينات ولكن في بعض الأحيان يمكن إخراج الرسم البياني واسع نسبيا أو طويل الذيل في الجانب التحليلي32،33. لدينا نظام FemDA الكمية للغاية وبيوتيبلية يضع معيارا جديدا ومقياسا تحليليا عاليا في مجال تطوير microreactor.

الزيوت والمواد الراكعة التي يمكن استخدامها لإعداد قطرات لا تزال محدودة جدا34. مزيج من ASAHIKLIN AE-3000 و SURFLON S-386 أنشئت في FemDA هو عضو جديد في ترسانة المتنامية للواجهة الفيزيائية بين المرحلة مائي ومرحلة النفط13. واجهة جديدة في FemDA هو مستقر ماديا، خاملة كيميائيا، ومتوافقة بيولوجيا مع النسخ المعقدة، والترجمة، وآلات التعديل بعد الترجمة للعديد من أنواع البروتينات13. سيكون من الجذاب العثور على بروتين لا يمكن توليفه في إعدادات القطرات بدلاً من ذلك. الى جانب ذلك ، وتوفير التكاليف من الكواشف هو أكثر وضوحا في نظام القطيرات femtoliter من ذلك في نظم مفاعل نانولتر وpicoliter35،36. على وجه الخصوص، سيكون هناك في كثير من الأحيان حجم ميت كبير، والذي يحدث أساسا عن طريق الأنابيب أو الإمدادات الخارجية، في أنظمة توليد قطرات microfluidic ولكن ليس في FemDA لدينا. كما يفضل تنسيق الصفيف من خلال التوصيف المجهري المتكرر والمفصل (على غرار ما يسمى بتحليل المحتوى العالي) لكل مفاعلواحد 37، بدلاً من لقطة واحدة فقط لجسم سريع الحركة. وقد مكّن مقياس femtoliter من دمج أكثر من مليون مفاعل على مساحة بحجم الإصبع، في حين أن نفس العدد من مفاعلات النانولتر (إذا كان موجوداً) يتطلب أكثر من مساحة متر مربع، وهو ما سيكون بلا شك غير عملي لتصنيع أو استخدام مثل هذا النظام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Microfabrication من الركيزة الصفائف microchamber femtoliter

ملاحظة: إجراء تجربة microfabrication التالية في غرفة تنظيف. ارتداء القفازات وبدلة غرفة نظيفة قبل دخول غرفة التنظيف.

  1. تنظيف غطاء الزجاج الركيزة
    1. تعيين غطاء الزجاج على غطاء الزجاج تلطيخ رف. سونيكات الزجاج غطاء في 8 M هيدروكسيد الصوديوم (NAOH) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
      تنبيه: إن Naة الصوديوم في تركيزات عالية أمر خطير للغاية على الجلد والعين. التعامل بلطف دون أي دفقة.
    2. أخرج الحامل من محلول NaOH وشطف زجاج الغطاء باستخدام الماء لمدة عشر مرات. إبقاء غطاء الزجاج في الماء النقي.
      ملاحظة: تخلص من النفايات القلوية إلى الخزان المعين. ويمكن إعادة تدوير محلول نفايات الصوديوم إلى الزجاجة الأصلية واستخدامها لمدة تصل إلى خمس مرات.
    3. جفف كل قطعة من الزجاج غطاء مع بندقية ضربة الهواء.
    4. خبز الزجاج غطاء المجفف على لوحة ساخنة في 200 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  2. سيلانيوني من سطح الزجاج
    1. أعد ضبط زجاج الغطاء النظيف على رف تلطيخ جاف.
    2. أضف 150 مل من الإيثانول إلى PTFE beaker. استخدام إبرة (22 G × 70 مم) مجهزة 1 مل حقنة لرسم 0.075 مل من (3-أمينوبريل) triethoxysilane وحقنها على الفور إلى الإيثانول (أي 0.05 vol%). سحب ودفع حقنة عدة مرات لشطف داخل الحقنة. حرك الحل مع الإبرة لجعلها متجانسة.
      ملاحظة: (3-أمينوبريل) triethoxysilane يمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة و1 ATM الضغط لمدة عامين مع ختم ضيق. يجب أن يكون الإيثانول المطلق مختومًا بإحكام بعد الاستخدام. لا نوصي باستخدام أي الكواشف منتهية الصلاحية.
    3. احتضان الزجاج الغطاء في 0.05 vol % حل aminosilane لمدة 1 ساعة في RT.
    4. شطف الزجاج غطاء باستخدام الماء النقي لمدة خمس مرات. إبقاء غطاء الزجاج في الماء النقي.
      ملاحظة: تخلص من النفايات إلى الخزان المعين.
    5. جفف كل قطعة من الزجاج غطاء مع بندقية ضربة الهواء.
    6. وضع جميع الزجاج غطاء المجفف على رقائق الألومنيوم. اخبزي غطاء الزجاج على صفيحة ساخنة عند 80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  3. تدور طلاء CYTOP Perfluoropolymer
    1. وضع الزجاج غطاء على تشاك فراغ مخصصة من اللفة المغطي(الشكل 1A). بدوره على مفتاح فراغ لإصلاح الركيزة الزجاج.
      ملاحظة: تصميم التشاك فراغ أمر بالغ الأهمية لطلاء موحد من البوليمر لزجة على مستطيلة (24 مم × 32 مم) ورقيقة (0.13-0.17 مم) الركيزة (الشكل 1A). وجدنا أن مرحلة عينة مستطيلة مع ثقوب متعددة (48 حفرة، كل قطرها 1 ملم) الاتصال قناة فراغ عملت أفضل من المرحلة المستديرة مع حفرة مركزية واحدة فعلت.
    2. قطرة 70-90 μL من نوع-A CYTOP البوليمر في وسط الركيزة الزجاجية. تدور على الفور معطف البوليمر (الشكل 1B).
      ملاحظة: توفر حالة طلاء الدوران (3400 دورة في الدقيقة، 30 ث) 3 μm سمك. استخدام micropipette مصممة للسائل لزج. عقد micropipette تستقيم لجعل البوليمر إسقاط شبه دائرة تماما على الركيزة. وغالبا ما يتم توليد فقاعة الهواء داخل طرف ماصة كما يتحرك المكبس إلى أسفل. لا تسقط آخر قطرة من CYTOP مع فقاعة.
    3. التقاط الزجاج المغلفة مع أصابع عقد زوايا الركيزة الزجاجية، ووضعها على رقائق الألومنيوم.
    4. كرر الخطوات 1.3.1-1.3.3 لتغطية جميع القطع المتبقية من الزجاج غطاء.
    5. خبز الزجاج المطلي في 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ثم في 200 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
      ملاحظة: هذا المعالجة يعالج تماما CYTOP والسندات ببلالية CYTOP إلى السطح الزجاجي. تغطية منطقة الخبز مع غطاء مصنوع من رقائق الألومنيوم لتجنب الغبار المحتملة خلال عملية الخبز منذ فترة طويلة إذا لزم الأمر.
    6. إزالة الزجاج غطاء المغلفة CYTOP من الموقد الساخن وتبرد إلى RT. التقط بعناية كل قطعة من الزجاج المغلفة وتفقد لمعرفة ما إذا كانت مغلفة بشكل صحيح. تجاهل الركيزة التي تعرض طلاء غير مهوّس.
      ملاحظة: سطح CYTOP مغلفة بشكل جيد يجب أن ننظر شقة دون أنماط تشبه قوس قزح غير النظامية(الشكل 1C). يمكن للتفتيش البصري من زاوية مناسبة الحكم بسرعة على التسطيح وكذلك جودة الطلاء. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتًا هنا.
  4. تدور طلاء ضوئي
    1. ضع زجاج الغطاء المغلف بـ CYTOP على تشوك الفراغ (انظر الخطوة 1.3.1) من المغطية الدورانية. بدوره على مفتاح فراغ لإصلاح الزجاج الغطاء.
    2. إسقاط 0.2-0.3 مل من ناسخة ضوئية في وسط الركيزة. على الفور تدور معطف المصور في 6000 دورة في الدقيقة لمدة 60 ثانية.
      ملاحظة: لا تقم بإسقاط آخر قطرة من ناسخة التصوير مع فقاعات. إذا كان المعطف تدور يدعم ارتفاع سرعة الدوران، يمكن أن تصل سرعة الدوران إلى 7500 دورة في الدقيقة لتحقيق طلاء أرق. إن الطاقة السطحية المنخفضة لـ CYTOP تمنع معظم أخصائيي التصوير الضوئي من الالتزام بسطحه. إذا لم يكن AZ P4903 ناسخ ضوئيًا متاحًا، فإن جهاز التصوير من الألف إلى الياء P4620 بديل جيد.
    3. التقاط الركيزة المغلفة مع اثنين من أصابع عقد زوايا الركيزة. مسح قبالة photoresist الزائدة بالقرب من حافة الركيزة (غالبا ما تسمى إزالة خرز حافة أو EBR) باستخدام ممسحة نظيفة غارقة الإيثانول(الشكل 1D). وضع الركيزة على رقائق الألومنيوم.
      ملاحظة: الأسيتون غير مستحسن ل EBR.
    4. كرر الخطوات 1.4.1-1.4.3 لتغطية دوران جهاز التصوير للقطع المتبقية من الزجاج غطاء CYTOP المغلفة. التقط كل قطعة من الزجاج المطلي وتفقده لمعرفة ما إذا كانت مغلفة بشكل صحيح.
      ملاحظة: سطح ظّل ضوئيّاً مغلفاً بشكل جيد يجب أن يبدو مسطحاً بدون أنماط غير منتظمة(الشكل 1D). يمكن للتفتيش البصري من زاوية مناسبة الحكم بسرعة على التسطيح وكذلك جودة الطلاء. يمكن إعادة تدوير الركيزة التي تعرض طلاء غير مهوّس من خلال الغسيل مع الأسيتون، 2-propanol، وH2O في التسلسل، وإعادة استخدامها.
    5. خبز الركيزة المغلفة في 110 درجة مئوية لمدة 5 دقائق على الساخن.
    6. إزالة الركيزة المغلفة من اللوح الساخن وتبرد إلى RT. اسمحوا الوقوف لمدة 30 دقيقة في الرطوبة النسبية من 40٪ -60٪ لإماهة من ضوئي.
      ملاحظة: H2O ضروري للتفاعل الضوئي الكيميائي التالي. فقدت المصورة المخبوزة محتوى H2O داخل أخصائي التصوير. تسمح عملية الإماهة باستيعاب H2O من الجو. الرطوبة النسبية أقل من 20٪ أو أعلى من 80٪ غير مناسبة لعملية الإماهة.
  5. التصوير الضوئي
    1. أثناء وقت الانتظار من الإماهة (راجع الخطوة 1.4.6) ، بدء تشغيل محاذي القناع. إحماء مصدر الضوء. تحميل قناع ضوئي الكروم.
      ملاحظة: اتبع دليل الإرشادات لتشغيل محاذي القناع. يمكن تصنيع قناع ضوئي عبر الطباعة الحجرية شعاع إلكترون (EB) إذا كان مرفق EB متوفراً. بدلا من ذلك ، يمكن الاستعانة بمصادر خارجية في photomask لشركة محلية.
    2. تحميل الركيزة rehydrated (بعد الانتهاء من الخطوة 1.4.6) على تشاك (الشكل 1E).
    3. تعيين معلمات التعرض. كشف الركيزة لمدة 25 s مع كثافة الأشعة فوق البنفسجية من 13 ميغاواط / سم2 (h -line) في وضع الاتصال الفراغي. ثم قم بتفريغ الركيزة وتعيينها على رف تلوين الزجاج الغطاء (نفس الحامل المستخدم في الخطوة 1.1.1).
    4. كرر الخطوات 1.5.2-1.5.3 لعرض الأجزاء المتبقية من الركيزة المُعاد تهيْد.
  6. التنميه
    1. تطوير الركيزة لمدة 5 دقائق إلى حل ناسخة ضوئية المكشوفة (الشكل 1F). خلالها، يهز بلطف الرف في المطور مرة واحدة في نقطة زمنية من 4 دقيقة.
      ملاحظة: كان المطور من الألف إلى الياء 300 MIF. المطورين القلوية البديلة (مثل، من الألف إلى الياء 400 K) قابلة للتطبيق عموما لتطوير ولكن ينبغي أن تتطلب تحسين ظروف التنمية (على سبيل المثال، والوقت، ودرجة الحرارة، والتحريض). لا تستخدم كوب الزجاج مثل حاوية المطور.
    2. شطف الركيزة باستخدام الماء النقي لمدة عشر مرات. إبقاء غطاء الزجاج في الماء النقي.
      ملاحظة: تجاهل المطور إلى خزان المعينة.
    3. يجف جيدا كل قطعة من الركيزة مع بندقية ضربة الهواء.
  7. نقش أيون رد الفعل
    1. ضع الركيزة المجففة (من الخطوة 1.6.3) في غرفة التفاعل في آلة الحفر التفاعلية الأيونية (RIE).
      ملاحظة: وفقا لقاعدة الصيانة للمرفق، يمكن أن يكون الجهاز RIE إما على الدوام أو إيقاف تشغيله في كل مرة. إذا كان المفتاح مطفأً، قم بتشغيل المفتاح وفقًا للدليل.
    2. حفر CYTOP CYTOP كشف التصوير مع البلازما O2 (الشكل 1G).
      ملاحظة: كان شرط RIE كما يلي. O2 معدل تدفق الغاز: 50 sccm؛ ضغط الغرفة: 10.0 Pa; RF السلطة: 50 W; وقت الحفر: 27 دقيقة. تم تحسين وقت الحفر للحفر تماما 3 ميكرومتر سمك CYTOP.
    3. التقاط كل قطعة من الركيزة من غرفة رد الفعل باستخدام ملاقط ووضعها على غطاء الزجاج تلطيخ رف.
      ملاحظة: وفقا لقاعدة الصيانة في المرفق، قد تتطلب غرفة رد الفعل عملية تنظيف البلازما قصيرة O2 (على سبيل المثال، وقت الحفر: 5 دقائق) للحفاظ على غرفة رد الفعل نظيفة بعد كل شوط.
  8. إزالة أخصائي التصوير والتنظيف
    1. سونيكات الركيزة في الأسيتون لمدة 5 دقائق في RT إلى حل بقية photoresist.
    2. سونيكات الركيزة في 2-بروبانول لمدة 5 دقائق في RT.
    3. شطف الركيزة باستخدام الماء النقي لمدة خمس مرات. Sonicate الركيزة لمدة 5 دقائق في RT. شطف العينة باستخدام المياه النقية لمدة خمس مرات أخرى. الحفاظ على الركيزة في الماء النقي.
    4. جفف كل قطعة من الركيزة مع بندقية ضربة الهواء (الشكل 1H).
      ملاحظة: يمكن تخزين الركيزة في طبق بيتري البلاستيك. الركيزة ملفقة مستقرة هيكليا في RT لمدة سنة واحدة على الأقل. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتًا هنا.
    5. ميز السطح من الركيزة كما المعدة بواسطة ثلاثي الأبعاد (3D) الليزر المسح المجهري confocal، قياس التداخل الضوء الأبيض (أو التماسك المسح التداخل)، أو المجهر الإلكتروني المسح الضوئي. استخدام البرنامج المعني لقياس قطر وعمق microchambers الناتجة.
      ملاحظة: يمكن إعادة استخدام العينة لإجراء تجارب أخرى بعد التوصيف باستخدام المجهر ثلاثي الأبعاد غير المتلامس وغير المدمر لمسح الليزر أو مقياس التداخل بالضوء الأبيض. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتًا هنا.

2. إعداد البوليديميثيلسيلوكسيان (PDMS) microchannel

ملاحظة: لا ترتدي قفازات اللاتكس للتعامل مع PDMS. بدلا من ذلك، وارتداء البولي إيثيلين (PE) قفازات.

  1. جعل سيد القنوات الدقيقة
    1. قطع شريط فيلم كابونت لاصقة مزدوجة المغلفة إلى شكل microchannel (3 مم × 19 ملم) المحدد باستخدام قاطع سطح المكتب.
      ملاحظة: كان شريط كابتون رقم 7602 #25 (تيراوكا سيساكوشو)، مما أدى إلى ارتفاع القناة 135 ميكرومتر. يستخدم القاطع STIKA سطح المكتب البرنامج المساعد (المتاحة من موقع رولاند: https://www.rolanddga.com) من أدوبي المصور لتشغيل القطع وفقا للرسم في ملف أدوبي المصور. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتًا هنا.
    2. عصا كل شريط كابتون قطع على الجزء السفلي شقة من طبق بيتري. يمكن أن تستوعب طبق بيتري القياسي 90 مم 12 قطعة من الشريط.
      ملاحظة: يعمل هيكل الإغاثة كـ رئيسي لقالب النسخة المتماثلة من PDMS. اضغط على سطح الشريط بلطف مع ملاقط إذا كان هناك أي فقاعات الهواء تقع بين الشريط وركيزة طبق بيتري. بدلا من ذلك، يمكن تطبيق الكلاسيكية لينة ل lithography لإعداد سيد على رقاقة السيليكون38. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتًا هنا.
  2. علاج راتنج PDMS في طبق بيتري المنقوش على الشريط
    1. ارتداء قفازات PE جديدة، ونقل 2.5 غرام من وكيل علاج من SYLGARD 184 مطاط سيليكون باستخدام ماصة بلاستيكية يمكن التخلص منها في الكأس البلاستيكية المحددة (الشكل 2A).
    2. تغيير قفازات جديدة، ونقل 25 غرام من قاعدة prepolymer من SYLGARD 184 سيليكون elastomer باستخدام حقنة 50 مل المتاح في الكأس البلاستيكية أعلاه.
      ملاحظة: تغيير القفازات هنا لمنع التلوث المتبادل المحتمل من عامل المعالجة إلى القاعدة.
    3. استخدام خلاط deaeration لخلط و deaerate الخليط (البرنامج: 3 دقيقة الاختلاط تليها 2 دقيقة deaeration).
      ملاحظة: إذا لم يتوفر خلاط deaeration، يمكن أن يكون الخليط المهتاج يدويا (لمدة 15 دقيقة) degassed في غرفة فراغ.
    4. صب خليط PDMS في طبق بيتري الشريط المنقوشة (الشكل 2B). تعيين طبق بيتري في غرفة فراغ مصغرة و deaerate خليط PDMS لمدة 1-3 ح(الشكل 2C).
      ملاحظة: إذا بقي أي هواء في خليط PDMS بعد 1 h، خذ طبق بيتري من غرفة الفراغ، وكسر فقاعة الهواء باستخدام منفاخ الهواء، ومن ثم وضع طبق بيتري مرة أخرى في غرفة الفراغ ومواصلة عملية deaeration.
    5. ضع طبق بيتري في فرن عند 60 درجة مئوية بين عشية وضحاها لعلاج PDMS (الشكل 2D).
      ملاحظة: على الرغم من أن زيادة درجة الحرارة يمكن أن تقصر وقت المعالجة، فإن درجة الحرارة القصوى التي يمكن تحملها من قبل طبق البوليسترين بيتري دون تشوه مادي حوالي 60 درجة مئوية.
  3. صب النسخة المتماثلة من قناة PDMS
    1. قشر قبالة الشفاء PDMS مزال من طبق بيتري (الشكل 2E).
    2. قطع كل قطعة من كتل قناة PDMS باستخدام قاطع كابل مسطح (الشكل 2F).
    3. ضع مِن الـ PDMS على حصيرة قطع تواجه جانب القناة. لكمة ثقب في كل نهاية القناة باستخدام لكمة خزعة (الشكل 2G).
    4. تنظيف سطح قناة PDMS مع شريط سكوتش. ثم التفاف الراتنج PDMS في قطعة أخرى من شريط سكوتش للحفاظ على نظافته قبل الاستخدام. تخزين قناة PDMS المعدة في طبق بيتري نظيفة.
      ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.

3. جمعية femtoliter جهاز الصفيف microchamber

  1. ضع بعض قطع المساحات النظيفة المنقوعة بالماء على طول الجدار الداخلي لطبق بيتري لجعل غرفة ترطيب مبسطة. ضع راتنج PDMS الذي يغطيه شريط سكوتش في غرفة الترطيب وختم الغرفة باستخدام فيلم البارافين. احتضان لمدة 3 ساعات على الأقل ولكن ليس أكثر من يوم واحد.
    ملاحظة: PDMS هي مادة مسامية تسمح للغاز بالمرور عبر الراتنج39. يؤدي هيكل مسامي PDMS إلى امتصاص جزيئات الماء من المناطق المحيطة حتى الوصول إلى التوازن. هذا المعالجة المسبقة تملأ مسام PDMS ببخار الماء ويمكن أن تقمع بشكل كبير تبخر قطرات مائي بجوار حافة قناة PDMS.
  2. خذ شريط سكوتش من راتنج PDMS. ضع قناة PDMS على مساحة الصفيف microchamber من الركيزة (الشكل 2H).
    ملاحظة: الراتنج PDMS يتقيد بشكل عكسي إلى سطح CYTOP. اضغط على كتلة PDMS بلطف مع ملاقط لإزالة أي فقاعات الهواء بين راتنج PDMS والركيزة إذا كانت موجودة.
  3. إدراج 200 ميكرولتر غير مرشحة تلميح ماصة إلى واحد (كمأخذ) من الثقوب من قناة PDMS.
    ملاحظة: قوة التصاق بين PDMS و CYTOP محدودة. لتجنب التشوه المادي للراتنج PDMS وكذلك انفصال قناة PDMS قبالة السطح، لا تدرج تلميح ماصة عميق جدا.

4. تحميل حل رد فعل إلى الجهاز المجمعة

  1. ضعوا منصة ميكروتوب من الألومنيوم على الجليد Prechill النفط دافق (ASAHIKLIN AE-3000 النفط مختلطة مع 0.1 wt ٪ SURFLON S-386 السطحي) في 1.5 مل microtube على موقف الألومنيوم.
  2. ضع كتلة ألمنيوم أخرى على الجليد.
  3. إعداد حل رد فعل CFPS
    1. إعداد حل رد فعل CFPS في أنبوب PCR. مزيج كل عنصر aliquot من مجموعة CFPS, الحمض النووي قالب مخفف (كما يتضح هنا من البروتين الفلورية mNeonGreen40 وEscherichia القولونية القلوية الفوسفاتيز41) الحل, وغيرها من المكونات الضرورية وفقا للاحتياجات المحددة (على سبيل المثال, مثبط RNase, الركيزة الفلوروجينيك, مرافق).
      ملاحظة: يجب إعداد الحمض النووي للقوالب المستخدمة في CFPS وفقًا لتعليمات مجموعة CFPS المقابلة. تطبيق هذا العرض التوضيحي T7-يستند إلى نظام التعبير42. لأن استهلاك الكاشف في الجهاز FemDA صغير جدا، 10 ميكرولتر كبيرة بما يكفي لملء قناة PDMS بأكملها.
    2. بالنسبة لتخليق البروتين الفلوري mNeonGreen ، اخلط المكونات بالترتيب التالي: أضف 2.7 ميكرولتر من H2O الخالية من النوى إلى 6 ميكرولتر من الحل A (من مجموعة CFPS) ؛ إضافة 0.3 ميكرولتر من مثبط RNase; إضافة 1.5 μL من محلول الحمض النووي المُخفف للقوالب؛ مزيج لفترة وجيزة ونقل الخليط إلى 4.5 ميكروغرام من الحل باء (من مجموعة CFPS).
      ملاحظة: يبلغ الحجم الإجمالي 15 ميكرولتر. وبما أن كمية كل aliquot متناسبة مع الحجم الإجمالي للمخلوط النهائي، فإن الحجم الإجمالي أقل من 10 ميكرولتر قد يؤدي إلى حجم صغير جداً (< 0.2 ميكرولتر) من بعض المكونات.
    3. بالنسبة لتخليق الفوسفاتيز القلوي، اخلط المكونات بالترتيب التالي: أضف 1.2 ميكرولتر من H2O إلى 6 ميكرولتر من الحل A؛ إضافة 0.3 ميكرولتر من مثبط RNase; إضافة 0.6 ميكرولتر من محسن السندات من ثاني كبريتيد 1 و 2 (من مجموعة)؛ إضافة 0.3 μL من 5 mM 6،8-difluoro-4-ميثيلبيليفريل الفوسفات (DiFMUP)؛ إضافة 1.5 μL من حل الحمض النووي؛ مزيج لفترة وجيزة ونقل الخليط إلى 4.5 μL من الحل باء.
      ملاحظة: في مقايسة فوسفاتاتيز القلوية، يمكن للركيزة الفلورية DiFMUP إنتاج 6،8-فلورسنت عالية 6،8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU) على الانقسام الأنزيمي من مجموعة الفوسفات الطرفية.
  4. رسم 10 ميكرولتر من الخليط باستخدام 200 ميكرولتر غير مرشحة من النصائح. أدخل طرف الماصات إلى فتحة المدخل (راجع الخطوة 3.3) من قناة PDMS. ادفع لأسفل على المكبس لحقن الحل للقناة حتى يفيض من مأخذ (حيث تم بالفعل إدراج تلميح ماص آخر في الخطوة 3.3).
  5. فصل ماصة من طرف ماص والحفاظ على هذه النصائح ماصة اثنين لا تزال مدرجة إلى مدخل ومنفذ.
    ملاحظة: تجنب توليد فقاعات الهواء أثناء الخفقان. لا تترك الإبهام من المكبس حتى فصل الماصات من طرف الماصات لمنع التدفق الخلفي للحل داخل قناة PDMS.

5. توليد مجموعة القطير femtoliter (FemDA) لCFPS

  1. نقل مجموعة كاملة من الجهاز تجميعها إلى كتلة الألومنيوم ما قبل المبردة (انظر الخطوة 4.2). تأكد بعناية أن منطقة الصفيف microchamber يتحول بسرعة من شفافة (الشكل 2I) إلى شفاف (الشكل 2J).
    ملاحظة: لا يمكن حل رد فعل CFPS الدخول مباشرة في الـ microchambers. ذوبان الهواء في الماء هو في نسبة عكسية لدرجة الحرارة. سوف يذوب الهواء المحاصر في المحل بعد نقل الجهاز من RT إلى درجة الحرارة المنخفضة. تغيير الشفافية هو مؤشر بصري مناسب للحكم على ما إذا كان الحل يدخل في الـ microchambers.
  2. ارسم 30 ميكرولتر من زيت التدفق المبرد مسبقًا (انظر الخطوة 4.1)، ثم قم بنقل الزيت على الفور إلى طرف الماصات المدخل من فتحة الفتح العلوي. يتحرك تدفق النفط إلى القناة وقذف حل التفاعل الزائد الموجود خارج الفسحة الصغيرة. يتم عزل كل غرفة صغيرة من النفط دافق.
    ملاحظة: واجهة متحركة بين حل رد الفعل والنفط تدفق مرئية، مما يساعد الناس على مراقبة حركة السائل داخل القناة. يمكن جمع الحل مقذوف في أنبوب السابقة، وتخزينها في 4 درجة مئوية، وإعادة استخدامها لجهاز آخر FemDA أو رد فعل كبير موازية (في microtube أو لوحة microtiter).
  3. قبل رسم 30 ميكرولتر من زيت الختم (Fomblin Y25) إلى طرف ماصات 200 ميكرولتر. اشنق الماصة منتصبة في مكان ما.
  4. في وقت واحد إزالة اثنين من النصائح الماصات المدرجة (انظر الخطوتين 3.3 و 4.4) من الجهاز. على الفور نقل الجهاز من كتلة الألومنيوم إلى البارا فيلم.
    ملاحظة: استخدم ملاقط لإصلاح (ولكن الابتعاد عن منطقة القناة) الجهاز على كتلة الألومنيوم خلال فترة إزالة نصائح ماصة.
  5. على الفور إدراج تلميح الماصات الجاهزة التي تحتوي على النفط الختم (انظر الخطوة 5.3) في مدخل قناة PDMS، وحقن النفط في القناة حتى يفيض من مأخذ.
    ملاحظة: تنفيذ هذه الخطوة بمجرد نقل الجهاز إلى RT. لمنع تدفق الظهر داخل القناة، لا تترك الإبهام من المكبس حتى يفيض النفط الختم من منفذ. يتبخر الزيت المتدفق فورًا بعد الخروج من منفذ القناة ، في حين يتراكم زيت الختم التالي في المنفذ بسبب فقدانه المنخفض للغاية للتبخر.
  6. افصلي الماصة عن طرف الماصات ثم قم بإزالة طرف الماصات من الجهاز. تنظيف سطح PDMS باستخدام قطعة من الممسحة النظيفة ومن ثم تطبيق قطرة جديدة من النفط ختم على مدخل و منفذ، على التوالي. يتم ختم قطرات femtoliter في الخرّجات الدقيقة الفردية من النفط.
    ملاحظة: استخدام ملاقط لإصلاح (ولكن الابتعاد عن منطقة القناة) قناة PDMS على الركيزة خلال فترة إزالة تلميح micropipette.
  7. امسح الرطوبة المتراكمة على السطح السفلي من زجاج الغطاء. جهاز FemDA على النحو المعد الآن جاهز للحضانة والتصوير المجهري.

6. التصوير المجهري

  1. بدء تشغيل مجهر الفلورانس المقلوب. انتظر تثبيت (تبريد) الكاميرا. استخدام 60x أو 100x النفط غمر عدسة الهدف. تعيين جهاز FemDA على المرحلة الآلية. تعيين معلمات التصوير.
    ملاحظة: تشمل معلمات التصوير مسار الملف وقنوات التصوير والمرشحات وأوقات التعرض (بشكل عام، 100 مللي ثانية كافية؛ الوقت الأقصر أو الأطول ممكن أيضًا وفقًا لمواصفات الكاميرا)، وكثافة الضوء.
  2. ابحث عن الطائرة المحورية ضبط موضع المحور z للعدسة الهدف وإصلاح المستوى البؤري باستخدام نظام التركيز التلقائي الداخلي. تعيين المنطقة ذات الاهتمام (العائد على الاستثمار؛ أي س، y المحور) ليتم تصويرها.
    ملاحظة: الشركات المصنعة المجهر الرئيسية (نيكون، أوليمبوس، زيس، لايكا) توفر كل خيار لدمج نظام التركيز البؤري التلقائي مع المجهر. هذا النظام التلقائي ضروري للحفاظ على ثابت الطائرة البؤرية أثناء التصوير التلقائي متعدد المناطق. وتغطي هذه الـ ROIs منطقة FemDA في قناة PDMS.
  3. التقاط الصور المفلورة. التقاط إطار واحد من صورة حقل مشرق (BF) مُزيل التكون لكل عائد استثمار. لا تقم بتغيير ترتيب وإحداثيات ROIs عند تصوير القنوات المختلفة.

7- تحليل بيانات الصور

ملاحظة: تحليل بيانات الصورة باستخدام البرنامج المساعد محلية الصنع (المسمى "FemDA") على أساس فيجي (http://fiji.sc) لاستخراج كثافة الفلوريسنس لكل قطرة43. تثبيت الإصدار الصحيح من فيجي وفقا لنظام التشغيل. فيجي يدعم معظم الصور تنسيقات الملفات (على سبيل المثال، الملف nd2 من نيكون المجهر، ملف czi من المجهر زايس) باستخدام بناء في البرنامج المساعد "تنسيقات حيوية".

  1. تثبيت البرنامج المساعد
    1. نسخ ولصق ملف المساعد (الذي يتوفر عند الاستفسار إلى المؤلف المقابلة أو عن طريق الرابط المؤسسي التالي: https://fbox.jamstec.go.jp/public/FcsQwAsMKIqA9j0B2MJwLUMeHGsxp09hAkAFdVhQIDkZ) في فيجي "الإضافات" مجلد.
    2. بدء تشغيل برنامج فيجي؛ يمكن العثور على البرنامج المساعد "FemDA" في القائمة المنسدلة "الإضافات" لفيجي.
  2. معالجة بيانات الصورة مسبقاً
    1. فتح صورة BF مُنح (راجع الخطوة 6.3). انقر على معالجة | طرح الخلفية... لإزالة الخلفيات المستمرة السلسة لكل إطار من بيانات الصورة (الشكل 4B). انقر على معالجة | مرشحات | متوسط للحد من الضوضاء من كل إطار من البيانات الصورة (الشكل 4C).
    2. انقر على صورة | ضبط | عتبة للتحقق وفصل المقدمة (تشير إلى microchambers) من الخلفية (تشير إلى المنطقة خارج microchambers) من كل إطار من بيانات الصورة (إدراج المكبرة في الشكل 4A-C).
      ملاحظة: حدد خوارزمية مناسبة من القائمة المنسدلة في نافذة Threshold بحيث يمكن تحديد مناطق الخاسمة الصغيرة فقط، وكذلك حواف كل غرفة صغيرة، وتمييزها على أنها المقدمة. على وجه الخصوص، يجب أن تكون معظم الحواف المميزة مستمرة بدون ثغرات.
  3. تحديد تنسيق القطرات
    1. انقر على الإضافات | FemDA | FemDA تحليل لفتح واجهة المستخدم الرسومية (GUI) من البرنامج المساعد المخصصة (النصف العلوي من الشكل 4D).
    2. إدخال العدد الأدنى والقصوى التقريبي من وحدات البكسل للسة الصغيرة الواحدة. إدخال الحد الأدنى والحد الأقصى المتوقع من الدوران (0: شكل تعسفي؛ 1: دائرة مثالية) من الـ microchambers. إدخال رقم إطار إطار البداية والإطار النهاية.
    3. انقر فوق إنشاء عائد على واجهة المستخدم الرسومية للكشف عن كل microchamber، ويتم عرض ROIs المكتشفة بنجاح في إطار منبثق ROITable.
    4. العودة إلى إطار تحليل FemDA وانقر فوق الزر تطبيق قناع العائد على الاستثمار لمعرفة ما إذا كان تم الكشف عن microchambers على الإطارات بشكل صحيح (أسفل اليسار من الشكل 4D). إذا لم يكن هناك، قم بتعديل بعضها وكرر النقر فوق إنشاء ROI وتطبيق قناع عائد الاستثمار. إذا كانت الإجابة بنعم، انتقل إلى الخطوة التالية.
      ملاحظة: قد يكون هناك القليل جداً من microchambers التي لا يمكن أن تكون محددة جيداً على أنها عائد الاستثمار (راجع النصف السفلي من الشكل 4D)بواسطة أي خوارزمية العتبة بسبب التباين غير كافية بين المقدمة والخلفية. وهو لا يمثل مشكلة في وجهة النظر الإحصائية.
  4. استخراج كثافة الفلوريسنس
    1. افتح صورة الفلوريسنس واحضرها إلى الأمام. انقر فوق تطبيق قناع العائد على الاستثمار مرة أخرى لتطبيق ROIs المحدد على صورة الفلوريس (أسفل اليمين من الشكل 4D).
    2. حدد إما طلقة واحدة لتحليل صورة نقطة النهاية (كما هو موضح في بيانات mNeonGreen) أو الفاصل الزمني لتحليل بيانات المسار الزمني (كما هو موضح في بيانات الفوسفاتيز القلوية).
    3. الإدخال 100 في المربع عدد من بكسل أعلى يعني أنه سيتم استخدام 100 بكسل أعلى فقط من كل عائد الاستثمار لحساب شدة المتوسط من قطرة المقابلة. إذا كان الإدخال 0 في عدد البكسل العلوي، سيتم استخدام جميع وحدات البكسل لكل عائد استثمار لحساب متوسط شدة القطرات المقابلة.
      ملاحظة: قد يكون هناك انحراف عدة بكسل بين BF والصورة المفلورة، مما يعني أن بعض وحدات البكسل داخل ROIs قد تنتمي إلى خلفية صورة الفلوريسنسي. وبالتالي ، يوفر البرنامج المساعد خيارًا لتحديد عدد وحدات البكسل الأعلى مرتبة في الكثافة لحساب متوسط شدة كل قطرة.
    4. لتحليل صورة نقطة النهاية (أي، حدد طلقة واحدة في الخطوة 7.4.2)، انقر على زر قياس كثافة لحساب الشدات المتوسطة لجميع القطرات المكتشفة. يتم تحديث جدول ROITable مع البيانات الجديدة من صورة الفلوريسنس. وفي الوقت نفسه، يتم عرض الرسم البياني في إطار منبثق جديد مدرج الرسم البياني ( الشكل4E).
      ملاحظة: يمكن تغيير حجم سلة في المربع رقم سلة تحسين عرض الرسم البياني. يمكن إنجاز تركيب لمجموع من التوزيعات الغاوسية في واجهة المستخدم الرسومية المتقدمة. نافذة سجل المنبثقة فيجي يعرض نتائج مناسبة. بدلا من ذلك، تصدير البيانات عن طريق النقر على زر حفظ كنص وإجراء مختلف التحليلات الإحصائية مع برامج أخرى(الشكل 4F, G).
    5. لتحليل الصورة الزمنية (أي، حدد الفاصل الزمني في الخطوة 7.4.2)، النافذة المنبثقة هي دورة وقت الكثافة بدلاً من الرسم البياني، الذي يحتوي على مخطط مدرج زمني مطابق لنقطة زمنية محددة ومؤامرة كثافة الوقت(الشكل 5). يمكن أيضاً تصدير البيانات النصية باستخدام القائمة ملف من النافذة المنبثقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تتكون عملية microfabrication من تنظيف الركيزة ، وظيفية السطح ، طلاء CYTOP ، التصوير الضوئي ، النقش الجاف ، تجريد ضوئي ، والتنظيف النهائي. الأهم من ذلك، سمح البروتوكول المقدم إزالة كاملة من البوليمر CYTOP المياه داخل microchambers الشكل 3A)،وإنتاج هيكل موهب ماء في ماء على الركيزة الزجاجية غطاء القياسية. بمساعدة بروتوكول ختم النفط ، تم التحقق من البعد الموحد للقطرات الناتجة عن ذلك عن طريق تغليف محلول الفلورسنت في الزخرق الصغير (الشكل 3B). كثافة الفلوريسنس المستخرجة باستخدام البرمجيات المتقدمة هي مؤشر جيد لحجم القطرات. السيرة الذاتية من كثافة fluorescence، 3٪، يعكس التوزيع الضيق لحجم قطرات على مجموعة كاملة (الشكل 3C). كما أظهرت الصورة ثلاثية الأبعاد التي أعيد بناؤها من المجهر confocal حجم قطرات متسقة مع مرور الوقت (الشكل 3D، فيلم تكميلي 1)44. وبالمقارنة، فإن زيت FC-40 المستخدم على نطاق واسع قد ولد القطرات التي تظهر فارقًا متعدد الأوجه في كثافة الفلوريسنس45. وكانت قطرات شكلت في FemDA مستقرة في RT لمدة 24 ساعة على الأقل (الشكل 3E). شكلت الجودة العالية من قطرات في نهاية المطاف الأساس للقياس الكمي.

تتطلب البيانات عالية الإنتاجية أدوات تحليل البيانات عالية الإنتاجية46,47. البرنامج المساعد المتقدمة تبسيط كبير وسرعة تحليل البيانات الصورة. استنادا إلى نظرية معالجة الصور الرقمية48، يمكن أن تكون صورة فرنك بلجيكي مصححة وتستخدم لتوفير معلومات تنسيق كل قطيرة بعد تصحيح الخلفية والحد من الضوضاء(الشكل 4A-C). جعلت هذه الفكرة من التعريب الدقيق للقطرات الداكنة ممكنًا.

تم تصنيع البروتين الفلورسنت mNeonGreen في FemDA. تم توزيع الحمض النووي للقالب بتركيز 0.05 جزيئًا لكل قطرة عشوائيًا في كل قطرة لبدء توليف البروتين مع النسخ غير الخلوي والتفاعلات الترجمية. ولأن متوسط عدد جزيئات الحمض النووي لكل قطرة كان أصغر من 1، فإن بعض القطرات تحتوي على حمض نووي قالب صفري، في حين احتوت أخرى على جزيء أو أكثر من جزيئات الحمض النووي. بعد 6 ساعات من الحضانة في RT، تم التقاط صورة نقطة النهاية باستخدام المجهر. تم تحليل بيانات صورة المكدس من قبل البرامج المتقدمة بمساعدة صورة BF متزامنة(الشكل 4A-E). كثافة الفلوريسنس لكل قطرة هو مقياس لغلة البروتين في القطيرة المقابلة. وأظهر الرسم البياني لكثافات الفلوريسنس توزيعاً مُنَوعاً وتم تركيبه بشكل جيد بواسطة مجموعة من التوزيعات الغاوسية لفواصل متساوية من الذروة إلى الذروة(الشكل 4F)،مما يشير بقوة إلى شغل أعداد مختلفة من جزيئات الحمض النووي لكل قطرة. على غرار لعبة التقليب العملة المتكررة، يتم وصف عدد الأحداث العشوائية المستقلة التي تحدث رياضياً من قبل توزيع بواسون. كان احتمال حدوث قطرات تحتوي على أرقام مختلفة (تصل إلى 3 في هذا المثال) من جزيئات الحمض النووي مناسبا تماما لتوزيع بواسون (P =λ y • λk / k! حيث λ هو العدد المتوسط المتوقع من جزيئات الحمض النووي لكل قطرة و ك هو العدد الفعلي لجزيئات الحمض النووي في قطرات) بمتوسط 0.05 جزيئات الحمض النووي لكل قطرة(الشكل 4G)31، كما هو متوقع لتوزيع عشوائي لجزيئات الحمض النووي. لأن تركيز التحميل من قالب الحمض النووي الحل هو نفسه λ المجهزة النهائي (أي 0.05)، وكان كفاءة التفاعل CFPS في FemDA لدينا 100٪ (أو بالقرب من 100٪). وبعبارة أخرى، جزيء واحد الحمض النووي يكفي لتحريك رد فعل CFPS في قطرات femtoliter بكفاءة.

تم تسجيل رد فعل CFPS من الفوسفاتيز القلوية كل 5 دقائق. ويدعم البرنامج المطور أيضا تحليل البيانات الوقت المسار (الشكل 5). أظهر التفاعل الفلوري المقترن توزيعًا منفصلًا مماثلًا لكثافة الفلورانس في القطرات في نقاط زمنية سابقة. كما تحققت نتائج الرسم البياني من إشغال أعداد مختلفة من جزيئات الحمض النووي في القطرة. في نهاية المطاف تقاربت كثافة الفلوريسين إلى قيمة جنبا إلى جنب مع الاستنفاد التدريجي للركيزة الفلورية DiFMUP.

Figure 1
الشكل 1: عملية المعالجة الدقيقة لركيزة مجموعة الـ microchamber فائقة الكثافة. (أ) الرسم التقني من تشاك فراغ مخصصة. الوحدة: mm. (B) CYTOP الفيلم سمك مقابل بيانات سرعة الدوران. (C) Spin-طلاء PERFLUORopolymer CYTOP على الركيزة الزجاجية سيلانيز. وأظهرت الصور مثالا جيدا على الطلاء المتجانس ومثال سيء على الطلاء غير المتجانس، على التوالي. أشار السهم الأسود إلى الموضع المحدد لفيلم CYTOP غير المتواز. (D) تدور طلاء من ضوئي على الركيزة CYTOP المغلفة. بعد طلاء الدوران ، يجب إزالة ضوئية بالقرب من حافة الركيزة باستخدام ممسحة نظيفة غارقة في الإيثانول (صورة وسط). وأظهرت الصور مثالا جيدا على الطلاء المتجانس ومثال سيء على الطلاء غير المتجانس، على التوالي. أشار السهم الأبيض إلى الموضع المحدد للفيلم المصور غير المتهوّر. (E) التعرض لضوئي المغلفة باستخدام قناع محاذاة. (F) تطوير جهاز التصوير المكشوف في المطور. الجزء المكشوف من ضوئية قابل للذوبان في حل المطور. (G) التفاعلية أيون النقش من CYTOP. تم إزالة CYTOP غير المكشوف بواسطة البلازما O2. (H) إزالة قناع ناسخة. تمت إزالة مُنَسَرّة التصوير بواسطة الأسيتون. تم تنظيف الركيزة باستخدام 2-propanol وH2O. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: إعداد واستخدام جهاز الصفيف microchamber. (أ) وزن وكيل علاج وprepolymer من PDMS. (B) صب خليط مختلط و deaerated في طبق بيتري الشريط منقوشة. كانت هناك بعض فقاعات الهواء التي تم إنشاؤها حديثا في خليط البوليمر. (C)deaerating الخليط مرة أخرى في غرفة فراغ. كانت فقاعات الهواء ترتفع وانفجرت على السطح العلوي. (D) وdaerated وعالج الراتنج PDMS. (E) تقشير قبالة الشفاء PDMS استومر من طبق بيتري. (F) قطع كل قطعة من كتل قناة PDMS باستخدام قاطع كابل مسطح. (G) الثقوب اللكم في كل نهاية قناة PDMS باستخدام لكمة خزعة. (H) الجهاز المجمع. يمكن للراتنج PDMS التمسك سطح CYTOP. (I) شفافة microchamber مجموعة المنطقة داخل قناة PDMS مليئة حل مائي قبل تقشعر لها الأبدان. (J) شفافة microchamber مجموعة المنطقة داخل قناة PDMS بعد تقشعر لها الأبدان. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: قطرات femtoliter فائقة الاتساق والثبات. (A) 3D الليزر المسح المجهري التصوير confocal لركيزة ملفقة. وأظهرت الزرق المجهرية الأسطوانية في الصورة المثال ارتفاع 3 ميكرومتر وقطرها 4 ميكرومتر. (ب)قطرات femtoliter موحدة على مساحة كبيرة من مجموعة من الألواح. تم عرض مساحة جزئية فقط من الصفيف بأكمله في هذه الوثيقة. تم إغلاق محلول فلوري (10 ميكرومتر أتو-514) في كل قطرة. (C) توزيع حجم قطرات على مجموعة واحدة كاملة. واستخدمت شدة الفلوريسين كمؤشر لحجم القطرات. السيرة الذاتية كانت 3 فقط. (D)القياس الحجمي باستخدام بيانات مسار الوقت confocal z-المكدس. وقد أعطيت حجم قطرات على مجموعة من قبل برنامج المجهر (NIS-Elements، نيكون). (ه) الاستعادة Fluorescence بعد photobleaching. بعد الإطار الأول، تم وضع عدة قطرات ضوئية بالكامل باستخدام شعاع ليزر محصور من مجهر confocal. تم تسجيل كثافة الفلورس لمدة 24 ساعة ، ولم يلاحظ أي استرداد للفلور (الخط الأحمر). تم تسجيل كثافة الفلوريسنس من قطرات أخرى غير م photobleached في نفس مجال الرؤية في الخط الأسود. كانت أشرطة الخطأ (الألوان الشفافة) 1 SD لكل نقطة وقت. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: إجراء تحليل بيانات الصورة المجهرية لنقطة النهاية. تم استخدام صورة المجال الساطع غير المتراجع لاستخراج الإحداثي لكل 300 دقيقة /قطرات. استناداً إلى الفرق كثافة بين حافة microchambers (كما الأمامية) وغيرها من المناطق (كخلفية)، يمكن استخراج حافة مستمرة وشبه دائرية من الخلفية. بسبب توزيع الخلفية غير المستوية عبر مجال الرؤية (A)، فإن بعض المعالجة المسبقة للصورة مطلوبة بشكل عام لتحسين جودة مخرجات binarizing. بعد طرح الخلفية (B) ، تم توحيد خلفية كل إطار. تجريبيا، قيمة الإدخال في نصفقطر الكرة المتداول" (الخطوة 1) كان 20-50 ل2048 بكسل × 2048 صور بكسل و 10-20 ل 512 بكسل × 512 بكسل الصور. كلما كانت القيمة أكبر، كلما كان وقت المعالجة أقصر. لتقليل الضوضاء في الصورة التي تم طرحها في الخلفية، قم بتطبيق مرشح متوسط على الصورة (C). بشكل عام، قيمة الإدخال في نصف القطر (الخطوة 3) 1-2 بكسل. كما هو مبين في إدراج مكبرة ، يمكن أن تكون صورة مطرح والخلفية وتصفية بشكل جيد binarized باستخدام بناء في عتبة البرنامج المساعد بحيث يمكن التعرف بدقة على المقدمة المقابلة للحواف وكذلك منطقة المصالح (ROIs). تم الكشف عن ROIs لجميع إطارات الصورة من خلال استخدام تثبيت البرنامج المساعد محلية الصنع FemDA تحليل (D). حجم بكسل (الخطوات 5 و 6) و دائرية (الخطوتين 7 و 8) من ROIs الإطارات التي نريد وضعها في الحساب (الخطوات 9 و 10) تم يدوياً تعريف وفقاً للبيانات الفعلية. بعد النقر على إنشاء عائد الاستثمار (الخطوة 11) والانتظار، تم تحديد تنسيق كل عائد استثمار عبر إطارات الإدخال. بعد النقر على قناع تطبيق عائد الاستثمار (الخطوة 12)، تم تضمين كل عائد استثمار تم اكتشافه وتمييزه بخط أصفر. بعد فتح صورة الفلوريسنس والنقر على قناع تطبيق ROI مرة أخرى، تم تطبيق قناع ROIs المحدد على صورة الفلوريس. عدد وحدات البكسل العليا (الخطوة 14) حدد عدد وحدات البكسل الأعلى مرتبة في كل عائد استثمار لحساب متوسط شدة القطرات المعنية. بعد النقر على كثافة القياس (الخطوة 15) والانتظار، تم إنشاء الرسم البياني (E). يمكن تركيب الرسم البياني مع مجموعة من التوزيعات الغاوسية باستخدام المعلمات المتاحة في إطار المدرج التكراري. بدلاً من ذلك، يمكن تصدير بيانات شدة الوسط إلى ملف نصي (الخطوة 16) وتحليلها بواسطة برامج أخرى (F). (G) احتمال حدوث قطرات تحتوي على أعداد مختلفة من جزيئات الحمض النووي في الصفيف المعطى. تم تركيب الرسم البياني (اللون الرمادي) بشكل جيد من قبل توزيع بواسون (خط أحمر متقطع) بمتوسط 0.05 جزيئات الحمض النووي لكل قطرة ، كما هو متوقع لتوزيع عشوائي لجزيئات الحمض النووي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تحليل بيانات الصور المجهرية في الوقت. تم تطبيق ROIs المكتشفة (باتباع الخطوات 1-12 من الشكل 4)مباشرة على بيانات المسار الزمني. في الخطوة 13 من الشكل 4، حدد الفاصل الزمني وإدخال الفاصل الزمني الفعلي (بالدقائق) بين الإطارات المجاورة في الفاصل الزمني [دقيقة]. بعد النقر على كثافة القياس (الخطوة 15 من الشكل 4)والانتظار ، تم إنشاء مخطط كثافة الوقت والمرسم البياني (نفس الشكل 4E). حدد موضع Hist نقطة الوقت من الرسم البياني، الذي تم إظهاره كخط أحمر عمودي. يدعم البرنامج المساعد أيضًا تحديد الألوان لكل خط تتبع. أصفر: 0 الحمض النووي؛ 0 الأزرق كان 1 الحمض النووي، و أحمر: 2 الحمض النووي؛ أسود: 3 الحمض النووي. يمكن أيضاً تصدير بيانات الدورة الزمنية إلى ملف نصي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيلم تكميلي 1. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الفيلم. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

إن القياس الكمي للغاية القائم على قطرات موحدة ومستقرة وعالية الاتساق في FemDA، مكّن التوزيع المنفصل، وهي السمة الفريدة لدراستنا التي تختلف عن غيرها. نحن بشكل منهجي الأمثل ومفصلة microfabrication و عمليات تكوين قطرات في هذه الورقة. 10- هناك عدة خطوات حاسمة في البروتوكول القائم.

أولا ، طلاء موحد من البوليمر CYTOP لزجة للغاية على الركيزة الزجاج رقيقة مستطيلة يحدد إلى حد كبير نوعية الركيزة الناتجة. ونظرا لمسافة العمل قصيرة عموما من عدسة الهدف مع التكبير عالية (انظر الخطوة 6.1)، يجب استخدام الزجاج غطاء رقيقة. طلاء عالي الجودة على ركيزة رقيقة ومرنة هو صعب بشكل عام. لم نختبر بعد جميع التصاميم الممكنة ولكن وجدت أن فراغ متعددة الفتحات مع نفس البعد المستطيل لم تعمل بشكل جيد لطلاء تدور. من المهم إسقاط البوليمر CYTOP في وسط الركيزة الزجاجية غطاء والبدء فورا في طلاء تدور (انظر الخطوة 1.3.2). درجة صعوبة أقل صلة على شكل الركيزة ولكن لزوجة البوليمر. خط إنتاج CYTOP يقدم العديد من التركيزات المختلفة للحزمة المتاحة تجاريا. ويمكن أيضا أن يكون المذال المصاحب في الحزمة يستخدم لتخفيف المنتج الأصلي إلى أقل لزوجة إذا لزم الأمر. CYTOP 816 التي استخدمناها في التجربة هو المنتج التجاري مع أعلى تركيز قادر على حل مستقر البوليمر في المذيبات. يتطلب الطلاء الأكثر سمكًا سرعة دوران أقل أو جولات متعددة من الطلاء والعلاج. ينصح بشدة مؤامرة من سمك مميزة مقابل منحنى سرعة الدوران عند استخدام معطف تدور جديدة في بيئة جديدة.

ثانياً، الرطوبة المناسبة للحمامات النظيفة أمر بالغ الأهمية بالنسبة للطباعة الضوئية المثالية وكذلك الإزالة الكاملة للتصوير الضوئي في الموضع المحدد. التفاعل الكيميائي الضوئي في التصوير الضوئي يستخدم H2O كأحد المتفاعلين. ومع ذلك، فإن softbake في درجة حرارة أعلى من درجة حرارة الغليان من H2O يزيل H2O المحتوى من photoresist المغلفة. يجب أن يستغرق جهاز الفوترس "المجفف" وقتًا لاستيعاب H2O مرة أخرى من الجو (انظر الخطوة 1.4.6). وكثيرا ما يتم تجاهل هذه النقطة. وبالنظر إلى أن العديد من المختبرات قد يكون لديها فقط بعض مرافق غرف التنظيف المبسطة دون مراقبة الرطوبة، فإن الرطوبة سوف تتقلب بشكل كبير خلال الموسم أو تتأثر بالطقس. الحل منخفض التكلفة هو استخدام مرطب أو مزيل الرطوبة للاستخدام المنزلي في غرفة التنظيف. يمكن أن تكون طبقة CYTOP المكشوفة بالكامل بعد التطوير انتقائية ومزيلة بالكامل من قبل RIE ، مما يعرض قاع الزجاج بالكامل. في نهاية المطاف، وهيكل هجين من قاع الزجاج المائي وCYTOP مبيد الماء الجدار الجانبي مهم لطعن محاصرة محلول مائي لمساحة femtoliter.

ثالثا، أظهرت الزيوت التي تم العثور عليها حديثا (ASAHIKLIN AE-3000، فومبلين Y25) والسطحي (SURFLON S-386) أداء ختم لم يسبق له مثيل لمفاعل الفلوروبوليكر13. يجب أن يتم حقن النفط دافق على كتلة معدنية مسطحة مبردة (انظر الخطوة 5.2)؛ خلاف ذلك، لا يمكن أن تشكل قطرات بالقرب من مدخل القناة. ويمكن حقن النفط ختم الثانية في RT (انظر الخطوة 5.5). هذه الزيوت والمواد الراكعة السطحي لم تستخدم في البحوث البيولوجية من قبل. ولم يتم العثور على بدائل أفضل في الوقت الراهن. لتوسيع ترسانة من مزيج مفيد من الزيوت والمواد الراكعة السطحية لإعداد قطرات، وعضو جديد من الزيوت (أو مماثلة منها في نفس خط الإنتاج) والسطحية (أو تلك مماثلة في خط الإنتاج نفسه) تستحق أن تحاول أن تطبق في أنظمة قطرات microfluidic.

فيما يلي نقطتين إضافيتين للملاحظة. واحد هو حقيقة أن هناك فارق زمني بين ROIs أثناء التصوير المجهري. يعتمد وقت التصوير الكلي لدورة واحدة بشكل رئيسي على حجم الصفيف وتكبير العدسة الموضوعية. كما أن وقت التعرض، وسرعة الغالق، وسرعة الحركة في المرحلة الآلية، هي عوامل ثانوية أيضاً. كقاعدة عامة، التصوير 106 قطرات في 60 × التكبير يتطلب على الأقل 10-20 دقيقة. هذا التأخير الزمني لا مفر منه يدخل بعض الأخطاء في تحليل البيانات، والتي ينبغي دائما أن تؤخذ بعين الاعتبار بعناية. والآخر هو حقيقة أن العدد الإجمالي من قطرات على الركيزة واحدة لن يتجاوز 108-109، حتى زيادة كثافة قطرات أو الحد من حجم الفرد من قطرات. وذلك لأن حجم الركيزة الزجاجية التي يمكن التعامل معها بواسطة قناع محاذير (لوافر 4 بوصة) محدودة. زيادة حجم الزجاج غطاء لا ينصح به لأن الركيزة الزجاجية كبيرة ورقيقة وهشة من الصعب التعامل معها.

FemDA يمكن اعتبارها لوحة مصغرة فائقة. أي التفاعلات الكيميائية الحيوية التي أجريت في 96 جيدا لوحات microtiter يمكن أن يحاكم على إجراء باستخدام FemDA. ويمكن بالتأكيد أن تستخدم لقياس نشاط الانزيم دون معقدة تنقية البروتين. ويمكن أيضا أن تكون متوافقة مع تفاعل البوليميراز الرقمية سلسلة (PCR الرقمية) والرقمية ذات الصلة الانزيم المناعة المقايسة (ELISA الرقمية)31،49. ومن شأن الحجم الصغير، ومجموعة كبيرة، والاستقرار عالية جلب بعض المزايا على أساليب bioassay الرقمية القائمة. نظام FemDA قادرة على حل أعداد مختلفة من الجزيئات الحمض النووي قالب في قطرات femtoliter أظهرت بالفعل السلطة على فحص دقيق للبروتين13. FemDA هو نظام جديد في المختبر تقسيم قادرة على التطور السريع مجموعة متنوعة من الإنزيمات. مع التقدم في المعلوماتية الحيوية وتقنيات البناء المكتبة، عصر خلق فوري بناء على الطلب من البروتينات عالية الأداء سيكون بالتأكيد القادمة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل رقم منحة JSPS KAKENHI JP18K14260 وميزانية الوكالة اليابانية لعلوم وتكنولوجيا البحار والأرض. نشكر شيجيرو ديغوتشي (JAMSTEC) وتيتسورو إيكوتا (JAMSTEC) على توفير مرافق التوصيف. نشكر كين تاكاي (JAMSTEC) على دعم البرمجيات التجارية. أجريت عملية القياس الدقيقة في Takeda Sentanchi Supercleanroom، جامعة طوكيو، بدعم من "برنامج منصة تكنولوجيا النانو" التابع لوزارة التعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا (MEXT)، اليابان، رقم المنحة JPMXP09F19UT087.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-aminopropyl)triethoxysilane Sigma-Aldrich 440140
1 mL syringe Terumo SS-01T
2-propanol Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
3D laser scanning confocal microscope Lasertec OPTELICS HYBRID Other similar microscopes (e.g., Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) are also applicable.
50 mL syringe Terumo SS-50LZ
6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate Thermo Fisher Scientific D6567 Prepare a 5 mM stock solution in dimethyl sulfoxide
Acetone Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
Purity 99.8%.
Air blower Hozan Z-263
Aluminum block BIO-BIK AB-24M-02
Aluminum microtube stand BIO-BIK AB-136C
ASAHIKLIN AE-3000 AGC (Test sample) Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
BEMCOT PS-2 wiper Ozu 028208
Biopsy punch with plunger Kai BPP-10F
Cover glass Matsunami Glass No. 1 (24 mm × 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness) Size-customized.
Cover glass staining rack Nakayama 803-131-11
CRECIA TechnoWipe clean wiper Nippon Paper Crecia C100-M
Cutting mat GE Healthcare WB100020
CYTOP AGC CTL-816AP
Deaeration mixer Thinky AR-100
Desktop cutter Roland STIKA SV-8
Developer AZ Electronic Materials AZ 300 MIF AZ Electronic Materials was now acquired by Merck.
Other alkaline developers may be also applicable but should require optimization of development conditions (time, temperature, etc.)
Double-coated adhesive Kapton film tape Teraoka Seisakusho 7602 #25
Ethanol Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
Purity 99.5%.
Fiji Version: ImageJ 1.51n
Flat-cable cutter Tokyo-IDEAL MT-0100
Fomblin oil Solvay Y25, or Y25/6 Free test sample may be available upon inquiry to Solvay. Fomblin Y25/6 is an alternative if Y25 is not readily available.
Hot plate AS ONE TH-900
Injection needle Terumo NN-2270C 22G × 70 mm
Inverted fluorescence microscope Nikon Eclipse Ti-E Epifluorescence specification, CCD or sCMOS camera, motorized stage, autofocus system, and high NA objective lens are required.
KaleidaGraph Synergy Version: 4.5
Mask aligner SUSS MA-6 Other mask aligners are also applicable as long as the vacuum contact mode is avaliable.
MICROMAN pipette GILSON E M250E Capillary piston tip: CP250
Microsoft Excel Microsoft Version: 16.16.15
Mini vacuum chamber AS ONE MVP-100MV
Nuclease-free water NIPPON GENE 316-90101
Parafilm Amcor PM-996
PCR tube NIPPON Genetics FG-021D/SP
Petri dish AS ONE GD90-15 Diameter 90 mm, height 15 mm.
Photoresist AZ Electronic Materials AZ P4903 AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. AZ P4620 is an alternative.
Plate reader BioTek POWERSCAN HT
Polyethelene gloves AS ONE 6-896-02 Trade name: Saniment.
PURExpress in vitro protein synthesis kit New England Biolabs E6800S or E6800L For cell-free protein synthesis reaction.
Reactive-ion etching system Samco RIE-10NR Other RIE systems are also applicable but should require optimization of RIE conditions (gas flow rate, chamber pressure, RF power, etching time, etc.)
RNase inhibitor New England Biolabs M0314S
Scotch tape 3M 810-1-18D
Sodium hydroxide solution FUJIFILM Wako Pure Chemical 194-09575 8 M concentration; danger.
Spin coater Oshigane SC-308
SURFLON S-386 surfactant AGC (Test sample) Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
SYLGARD 184 silicone elastomer Dow Sylgard184 Chemical composition: polydimethylsiloxane. The default mixing ratio is base : curing agent = 10 : 1 (m/m).
Tweezers Ideal-tek 2WF.SA.1
2A
Ultrasonic cleaner AS ONE ASU-2M
Vacuum chuck Oshigane (Customized) Material: delrin; rectangular sample stage with multiple holes (48 holes, each with 1 mm diameter); the size is customzied to fit the size of the cover glass (24 mm × 32 mm).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chiu, D. T., Lorenz, R. M., Jeffries, G. D. M. Droplets for ultrasmall-volume analysis. Analytical Chemistry. 81 (13), 5111-5118 (2009).
  2. Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77 (3), 977-1026 (2005).
  3. Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. Droplet microfluidics for high-throughput biological assays. Lab on a Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).
  4. Zhu, P. A., Wang, L. Q. Passive and active droplet generation with microfluidics: a review. Lab on a Chip. 17 (1), 34-75 (2017).
  5. Griffiths, A. D., Tawfik, D. S. Miniaturising the laboratory in emulsion droplets. Trends in Biotechnology. 24 (9), 395-402 (2006).
  6. Tran, T. M., Lan, F., Thompson, C. S., Abate, A. R. From tubes to drops: droplet-based microfluidics for ultrahigh-throughput biology. Journal of Physics D: Applied Physics. 46 (11), 114004 (2013).
  7. Zhang, Y., Jiang, X. Microfluidic tools for DNA analysis. DNA Nanotechnology. Fan, C. , Springer. Heidelberg. 113-153 (2013).
  8. Dubuc, E., et al. Cell-free microcompartmentalised transcription-translation for the prototyping of synthetic communication networks. Current Opinion in Biotechnology. 58, 72-80 (2019).
  9. Damiati, S., Mhanna, R., Kodzius, R., Ehmoser, E. K. Cell-free approaches in synthetic biology utilizing microfluidics. Genes. 9 (3), (2018).
  10. Lee, K. H., Kim, D. M. Applications of cell-free protein synthesis in synthetic biology: Interfacing bio-machinery with synthetic environments. Biotechnology Journal. 8 (11), 1292-1300 (2013).
  11. Supramaniam, P., Ces, O., Salehi-Reyhani, A. Microfluidics for artificial life: techniques for bottom-up synthetic biology. Micromachines. 10 (5), (2019).
  12. Bowman, E. K., Alper, H. S. Microdroplet-assisted screening of biomolecule production for metabolic engineering applications. Trends in Biotechnology. , (2019).
  13. Zhang, Y., et al. Accurate high-throughput screening based on digital protein synthesis in a massively parallel femtoliter droplet array. Science Advances. 5 (8), 8185 (2019).
  14. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. , (2019).
  15. Sakane, Y., Suzuki, Y., Kasagi, N. The development of a high-performance perfluorinated polymer electret and its application to micro power generation. Journal of Micromechanics and Microengineering. 18 (10), 104011 (2008).
  16. Sakakihara, S., Araki, S., Iino, R., Noji, H. A single-molecule enzymatic assay in a directly accessible femtoliter droplet array. Lab on a Chip. 10 (24), 3355-3362 (2010).
  17. Watanabe, R., et al. Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity. Nature Communications. 5, 4519 (2014).
  18. Chiu, C., Lisicka-Skrzek, E., Tait, R. N., Berini, P. Fabrication of surface plasmon waveguides and devices in Cytop with integrated microfluidic channels. Journal of Vacuum Science & Technology B. 28 (4), 729-735 (2010).
  19. Krupin, O., Asiri, H., Wang, C., Tait, R. N., Berini, P. Biosensing using straight long-range surface plasmon waveguides. Optics Express. 21 (1), 698-709 (2013).
  20. Hanada, Y., Ogawa, T., Koike, K., Sugioka, K. Making the invisible visible: a microfluidic chip using a low refractive index polymer. Lab on a Chip. 16 (13), 2481-2486 (2016).
  21. Berry, S., Kedzierski, J., Abedian, B. Low voltage electrowetting using thin fluoroploymer films. Journal of Colloid and Interface Science. 303 (2), 517-524 (2006).
  22. Lin, Y. Y., et al. Low voltage electrowetting-on-dielectric platform using multi-layer insulators. Sensors and Actuators B-Chemical. 150 (1), 465-470 (2010).
  23. Kimura, H., Yamamoto, T., Sakai, H., Sakai, Y., Fujii, T. An integrated microfluidic system for long-term perfusion culture and on-line monitoring of intestinal tissue models. Lab on a Chip. 8 (5), 741-746 (2008).
  24. Yang, T. J., Choo, J., Stavrakis, S., de Mello, A. Fluoropolymer-coated PDMS microfluidic devices for application in organic synthesis. Chemistry-a European Journal. 24 (46), 12078-12083 (2018).
  25. de Gennes, P. G. Wetting: statics and dynamics. Reviews of Modern Physics. 57 (3), 827-863 (1985).
  26. Holtze, C., et al. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a Chip. 8 (10), 1632-1639 (2008).
  27. Wagner, O., et al. Biocompatible fluorinated polyglycerols for droplet microfluidics as an alternative to PEG-based copolymer surfactants. Lab on a Chip. 16 (1), 65-69 (2016).
  28. Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, D. A., van Oijen, A. M. Droplet microfluidics: a tool for biology, chemistry and nanotechnology. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 82, 118-125 (2016).
  29. Mazutis, L., et al. Droplet-based microfluidic systems for high-throughput single DNA molecule isothermal amplification and analysis. Analytical Chemistry. 81 (12), 4813-4821 (2009).
  30. Galinis, R., et al. DNA nanoparticles for improved protein synthesis in vitro. Angewandte Chemie-International Edition. 55 (9), 3120-3123 (2016).
  31. Zhang, Y., Noji, H. Digital bioassays: theory, applications, and perspectives. Analytical Chemistry. 89 (1), 92-101 (2017).
  32. Mazutis, L., et al. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nature Protocols. 8 (5), 870-891 (2013).
  33. Courtois, F., et al. An integrated device for monitoring time-dependent in vitro expression from single genes in picolitre droplets. ChemBioChem. 9 (3), 439-446 (2008).
  34. Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
  35. Agresti, J. J., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4004-4009 (2010).
  36. Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab on a Chip. 12 (5), 882-891 (2012).
  37. Duncombe, T. A., Dittrich, P. S. Droplet barcoding: tracking mobile micro-reactors for high-throughput biology. Current Opinion in Biotechnology. 60, 205-212 (2019).
  38. Qin, D., Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
  39. Mukhopadhyay, R. When PDMS isn't the best. Analytical Chemistry. 79 (9), 3248-3253 (2007).
  40. Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nature Methods. 10 (5), 407-409 (2013).
  41. Bradshaw, R. A., et al. Amino acid sequence of Escherichia coli alkaline phosphatase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (6), 3473-3477 (1981).
  42. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
  43. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  44. Mantilla, C. B., Prakash, Y. S., Sieck, G. C. Volume measurements in confocal microscopy. Techniques in Confocal Microscopy. Conn, P. M. , Academic Press. Oxford, UK. 143-162 (2010).
  45. Noji, H. Single-molecule counting of biomolecules with femtoliter dropret chamber array. The 17th International Conference on Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems (TRANSDUCERS & EUROSENSORS XXVII. , 630-632 (2013).
  46. Zhang, Y., et al. Matrix-localization for fast analysis of arrayed microfluidic immunoassays. Analytical Methods. 4 (10), 3466-3470 (2012).
  47. Zhang, Y., et al. Two dimensional barcode-inspired automatic analysis for arrayed microfluidic immunoassays. Biomicrofluidics. 7 (3), 034110 (2013).
  48. Gonzalez, R. C., Woods, R. E. Digital image processing. , Pearson. New York, NY. (2018).
  49. Cohen, L., Walt, D. R. Single-molecule arrays for protein and nucleic acid analysis. Annual Review of Analytical Chemistry. 10 (1), 345-363 (2017).

Tags

الكيمياء، العدد 160، Microfabrication، قطرات، femtoliter، تخليق البروتين خالية من الخلايا، البروتين الفلورسنت، إنزيم، جزيء واحد، توزيع بواسون، تحليل الصور، في تجزئة المختبر
A مجموعة القطيفة Femtoliter تخليق البروتين موازية على نطاق واسع من جزيئات الحمض النووي واحد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Y., Kurosawa, K., Nishiura,… More

Zhang, Y., Kurosawa, K., Nishiura, D., Tei, M., Tsudome, M. A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules. J. Vis. Exp. (160), e60945, doi:10.3791/60945 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter